Molekulare Effekte der Herztroponin I - Phosphorylierung ... · abhängige Proteinkinase die...

Molekulare Effekte der Herztroponin I - Phosphorylierung

und der Calciumfreisetzung von Herztroponin C

untersucht mit Kernresonanzspektroskopie

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Forschungslabor Molekulare Kardiologie

des Herz- und Kreislaufzentrums

in der Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Sascha Deppermann

aus Bochum

Bochum

Juli 2005

Alle Abbildungen in dieser Arbeit wurden digital erstellt.

Eingereicht am 01.07.2005

Referent: Prof. Dr. K. E. Jaquet

Korreferent: Prof. Dr. W. Hengstenberg

The more I live - the more I learn

The more I learn - the more I realize

The less I know

(A Piece Of Sky, Yentl, 1983)

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ................................................................................1

1.1 Muskelkontraktion – Zusammenspiel von Proteinen................................................. 1

1.2 Muskelkontraktion - Die Rolle der intrazellulären Calcium-Konzentration.............. 8

1.3 Muskelkontraktion – Feinregulierung der Kontraktion im Herzen durch reversible

Phosphorylierung ..................................................................................................... 11

1.4 Fragestellung dieser Arbeit ...................................................................................... 14

2 Material und Methoden .......................................................16

2.1 Molekularbiologische Methoden.............................................................................. 16

2.1.1 Zelllinien .............................................................................................................. 16

2.1.1.1 Kultur von Bakterien auf agarhaltigem Nährboden ................................... 16

2.1.2 Flüssigkultur von Bakterien ................................................................................. 16

2.1.3 Lagerung von Bakerienstämmen.......................................................................... 17

2.1.4 Herstellung von kompetenten Zellen ................................................................... 17

2.1.4.1 Herstellung von elektrokompetenten Zellen .............................................. 17

2.1.4.2 Herstellung von Calcium-kompetenten Zellen .......................................... 17

2.1.5 Transformation von E. coli................................................................................... 18

2.1.5.1 Transformation von elektrokompetenten Zellen........................................ 18

2.1.5.2 Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Zellen......................... 18

2.1.6 Expression von Proteinen in BL21(DE3)-E. coli-Bakterien ................................ 18

2.1.6.1 Überprüfung der Proteinexpression ........................................................... 18

2.1.6.2 Expression von unmarkierten rekombinanten Proteinen ........................... 19

2.1.6.3 Expression von 15N,2H-markierten rekombinanten Proteinen ................... 19

2.1.6.3.1 Herstellung von markiertem Minimalmedium....................................... 20

2.1.6.3.2 Adaption der Bakterien an 15N,2H-markiertes Medium......................... 20

2.2 Präparative biochemische Methoden ....................................................................... 20

2.2.1 Isolierung und Reinigung von rekombinantem hcTnT aus E. coli....................... 20

2.2.2 Isolierung und Reinigung der Deletions-Proteinmutante hcTnT 185 - 291......... 21

2.2.3 Isolierung und Reinigung von rekombinantem hcTnI aus E. coli........................ 23

2.2.4 Isolierung und Reinigung von rekombinantem hcTnC aus E. coli ...................... 23

2.2.5 Isolierung und Reinigung von Aktin, Myosin und Tropomyosin ........................ 25

Inhaltsverzeichnis II

2.2.6 Isolierung von Proteinphosphatase 2A aus Rinderherz........................................ 25

2.2.7 Isolierung und Reinigung von Holotroponin aus Rinderherz .............................. 25

2.2.8 Kopplung von hcTnC an Sepharose-4B Säulenmaterial ...................................... 25

2.2.9 Präparation des Myosin-S1-Fragments ................................................................ 25

2.2.10 Polymerisation von G-Aktin ................................................................................ 26

2.2.11 Rekonstitution des trimeren hcTn-Komplexes aus den rekombinanten

hcTn-Untereinheiten............................................................................................. 26

2.2.12 Rekonstitution dünner Filamente aus F-Aktin, Tm und Tn ................................. 27

2.2.13 Auftrennung der Untereinheiten aus dem rekonstituierten trimeren

hcTn-Komplex...................................................................................................... 28

2.2.14 Isolierung der hcTnI-Untereinheit aus dem hcTn-Komplex mittels HPLC ......... 28

2.2.15 Phosphorylierung von hcTnI isoliert oder im Komplex mit der katalytischen

Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase.............................................. 28

2.2.16 Dephosphorylierung von hcTn-Komplexen mit an CNBr-Sepharose

gekoppelter Proteinphosphatase 2A (PP2A) ........................................................ 29

2.2.17 Dephosphorylierung von hcTnI in rekonstituierten dünnen Filamenten.............. 29

2.3 Analytische biochemische Methoden....................................................................... 30

2.3.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen ............................................................ 30

2.3.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................................................... 30

2.3.3 Nicht-denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese ..................................... 31

2.3.4 Überprüfung der Ca2+-abhängigen Mobilität von Herztroponin C allein und in

cTn-Komplexen.................................................................................................... 31

2.3.5 Überprüfung des hcTnI-Phosphorylierungszustandes mittels isoelektrischer

Fokussierung ........................................................................................................ 31

2.3.6 Überprüfung des hcTnI-Phosphorylierungszustandes mittels ELISA ................. 32

2.3.7 Western-Blot von Proteinen ................................................................................. 33

2.3.8 Quantitative Auswertung von Proteinbanden in Gelen........................................ 34

2.3.9 Elektrospray Ionisations (ESI) Massenspektrometrie .......................................... 34

2.3.10 Konzentrierung von proteinhaltigen Lösungen.................................................... 34

2.3.11 Aktivitätsbestimmung der Aktomyosin-S1-ATPase ............................................ 35

2.3.11.1 Prinzip ........................................................................................................ 35

2.3.11.2 Durchführung ............................................................................................. 36

2.3.11.3 Analyse der Messdaten .............................................................................. 37

2.3.12 Bestimmung der Cysteinreaktivität ...................................................................... 38

Inhaltsverzeichnis III

2.3.13 Dynamische Lichtstreuung................................................................................... 39

2.3.13.1 Prinzip ........................................................................................................ 39

2.3.13.2 Durchführung ............................................................................................. 40

2.3.14 Circulardichroismus-Spektroskopie ..................................................................... 40

2.3.14.1 Prinzip ........................................................................................................ 40

2.3.14.2 Durchführung ............................................................................................. 41

2.3.15 Magnetische Kernresonanz-Spektroskopie .......................................................... 42

2.3.15.1 Eindimensionale NMR-Spektroskopie....................................................... 42

2.3.15.1.1 31P- und 19F-NMR Spektroskopie ........................................................ 42

2.3.15.1.2 Durchführung ....................................................................................... 43

2.3.15.1.3 Überprüfung des Phosphorylierungszustandes von hcTnI mittels 31P-

NMR ..................................................................................................... 44

2.3.15.2 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie ................................................... 44

2.3.15.2.1 Prinzip .................................................................................................. 44

2.3.15.2.2 15N- und 15N,2H-NMR-spektroskopische Untersuchung ..................... 45

3 Ergebnisse .............................................................................46

3.1 Molekulare Effekte der Herztroponin I Phosphorylierung, untersucht mit Hilfe der 19F-NMR-Spektroskopie .......................................................................................... 46

3.1.1 Expression und Reinigung von Wildtyp-Proteinen und den entsprechenden

hcTnI- und hcTnC-Cystein Proteinmutanten ....................................................... 47

3.1.2 Rekonstitution von trimeren hcTn-Komplexen.................................................... 49

3.1.3 Phosphorylierung von hcTnI im Holotroponin-Komplex und Überprüfung des

Phosphorylierungszustandes ................................................................................ 50

3.1.4 Funktionelle Untersuchung der verschiedenen Troponin-Komplexe durch

ActoS1-ATPase-Aktivitätsbestimmung ............................................................... 52

3.1.5 Überprüfung der Cystein-Reaktivität in den hcTnI-Proteinmutanten.................. 57

3.1.6 Überprüfung der Homogenität der Proteinlösungen ............................................ 58

3.1.7 19F-NMR-spektroskopische Untersuchungen an hcTn......................................... 60

3.1.8 Temperatur-Abhängigkeit der chemischen Verschiebung und Zuordnung der 19F-Resonanzen .................................................................................................... 63

3.1.9 Auswirkung von PKA-abhängiger hcTnI-Phosphorylierung und reversibler

Calciumbindung am hcTnC.................................................................................. 64

Inhaltsverzeichnis IV

3.2 Strukturänderungen im hcTnC durch Einbindung in den hcTn-Komplex und durch

hcTnI-Phosphorylierung, untersucht mit Hilfe mehrdimensionaler NMR .............. 66

3.2.1 Expression und Reinigung des markierten hcTnC C35/84S ................................ 67

3.2.2 Überprüfung des Markierungsgrades des hcTnC C35/84S.................................. 69

3.2.3 Probenvorbereitung für mehrdimensionale NMR-Untersuchungen .................... 72

3.2.4 Mehrdimensionale NMR-Untersuchungen am hcTnC C35/84S.......................... 76

3.2.5 Zuordnung einiger Resonanzen in Spektren des 15N,2H-hcTnC C35/84S ........... 82

4 Diskussion .............................................................................91

4.1 Charakterisierung von 19F-NMR-Proben und 19F-NMR-Experimente .................... 91

4.2 Charakterisierung der Proben für mehrdimensionale NMR und Analyse der

Spektren von markiertem hcTnC C35/84S .............................................................. 99

4.3 Hypothese und Ausblick ........................................................................................ 106

5 Zusammenfassung..............................................................109

6 Anhang ................................................................................110

6.1 Literaturverzeichnis................................................................................................ 110

6.2 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... 120

6.3 Firmen- und Herstellerverzeichnis ......................................................................... 124

6.4 Lebenslauf .............................................................................................................. 125

6.5 Danksagung............................................................................................................ 127

1. Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Muskelkontraktion – Zusammenspiel von Proteinen

„Bewegung ist Leben“ und „Alles was lebt, bewegt sich“ sind zwei chinesische Sprichwörter,

welche die Bedeutung von Bewegungsabläufen ausdrücken. Dabei steht „Bewegung“ nicht

nur für die Kontraktion großer Muskeln bei höheren Lebewesen, sondern auch für

mikroskopisch kleine intrazelluläre Bewegungsvorgänge in Pro- und Eukaryot, wie z.B. die

Ausbildung von Stressfasern, des kontraktilen Ringes bei der Zellteilung, sowie Plasma-

strömungen, Vesikel- und Organellentransport oder amöboide Fortbewegung. Bei Eukaryoten

wird Bewegung durch dynamischen Auf- und Abbau von Filamenten und Interaktion von

Aktinfilamenten und Mikrotubuli mit spezifischen Begleitproteinen (Motorproteine,

Adaptorproteine, etc.) erzeugt.

Das Zusammenspiel von Aktinfilamenten und seinen assoziierten Motorproteinen, den

Myosinen, ermöglicht auch die Bewegung von Muskeln.

Muskelkontraktionen bei Vertebraten können von der vegetativen Muskulatur, welche

hauptsächlich in den Eingeweiden vorzufinden ist und zum Beispiel die Blutdruckregulation

in den Innenwänden der Arterien ermöglicht, ausgeführt werden. Die Kontraktion dieser

Muskulatur, die auf Grund ihres Aufbaus auch als glatte Muskulatur bezeichnet wird, ist nicht

willkürlich beeinflussbar. Muskelkontraktionen werden auch von quergestreifter Muskulatur

ausgeübt, welche in Herz- und Skelettmuskulatur bzw. somatische Muskulatur unterteilt

werden kann. Die Differenzen zwischen Skelettmuskulatur und dem Herzen liegen nicht nur

in der bewussten Steuerung der Muskelbewegungen, sondern auch in ihren Strukturen

begründet. So sind Skelettmuskelfasern parallel angeordnete, langgestreckte und mehrkernige

Zellen und bilden ein anatomisches Synzitium, im Gegensatz zu den nur einen Zellkern

besitzenden Myokardzellen. Myokardzellen stehen über sogenannte „gap junctions“ im

Glanzstreifen („Interkalationsscheibe“) in Kontakt und bilden ein funktionelles Synzitium.

Der Name „quergestreifte Muskulatur“ ist auf die regelmäßige Anordnung der Myofibrillen,

welche die Grundstruktur der Muskelfasern bilden, zurückzuführen. Unter dem Mikroskop

betrachtet, weisen die Myofibrillen aufgrund der abwechselnden regelmäßigen Anordnung

von isotropen und anisotropen Banden das typische Querstreifenmuster auf (Abbildung 1 A).

Diese unterschiedlichen Strukturen sind Bestandteil der kleinsten kontraktilen Einheit, dem

Sarkomer. Sarkomere haben eine Länge von 2,0 – 2,2 µm, werden von Z-Membranen

begrenzt und enthalten regelmäßig angeordnete dicke und dünne Filamente.

1. Einleitung 2

Aktinfilamente stellen den Hauptbestandteil der in den Z-Scheiben verankerten dünnen

Filamente dar. Sie überlappen sich in der A-Bande (anisotroper Bereich) mit den dicken

Filamenten, welche hauptsächlich von dem Motorprotein Myosin der Klasse II gebildet

werden. Bereiche, in denen nur Myosinmoleküle und keine Aktinfilamente lokalisiert sind,

bilden die H-Bande, Bereiche mit nur Aktinfilamenten die I-Bande (isotroper Bereich). Mit

Hilfe dieser optischen Eigenschaft der Sarkomere konnte von [Huxley & Hanson, 1954 und

Huxley & Niedergerke, 1954] das Gleitfilamentmodell postuliert werden. Es besagt, dass bei

der Kontraktion die dicken und dünnen Filamente aneinander vorbeigleiten und so das

Sarkomer verkürzt wird. Die Länge der Filamente ändert sich nicht.

Das Aneinandervorbeigleiten wird durch die Motoraktivität der Myosinmoleküle (Myosin II)

ermöglicht, welche aus zwei schweren („myosin heavy chain“ (MHC); 220 kDa) und je zwei

leichten essentiellen („essential light chain“ (ELC); 20 kDa) und leichten regulatorischen

(„regulatory light chain“ (RLC); 20 kDa) Ketten aufgebaut sind [Übersicht: Levitsky, 2004].

Jede schwere Kette bildet N-terminal einen Kopf und C-terminal einen ca. 150 nm langen

α-helikalen Schwanz. Jeweils zwei filamentöse Schwanzteile sind spiralförmig als Superhelix

(„coiled coil“) umeinander gewunden. Mehrere Myosinmoleküle lagern sich über den

Schwanzabschnitt zum dicken Filament zusammen. Verdau des Myosins mit Chymotrypsin

resultiert in einem leichten, hydrophoben, sogenannten „light meromyosin“ (LMM) Anteil,

welcher regelmäßig angeordnet den anderen, schwer wasserlöslichen Anteil, das sogenannte

„heavy meromyosin“ (HMM), im Filamentrückgrat verankert. Durch einen partiellen Verdau

mit Papain können der bewegliche Hals, als Subfragment 2 bezeichnet (S2) und der

katalytisch aktive globuläre Kopf (Subfragment 1; S1) des Myosins gewonnen werden

[Margossian & Lowey, 1982]. Das Myosin S1 besteht aus einer oberen 50 kDa und unteren

50 kDa großen Domäne (Abbildung 4), welche durch eine Spalte getrennt sind, wobei die

Motor-Domäne mit der ATP-Bindungsstelle und den Nukleotidbindungsstellen von den

Aktinbindungsstellen in der unteren Domäne durch die Spalte getrennt wird. An seinem

α-helikalen C-terminalen Bereich besitzt das S1 zudem je eine der beiden leichten Ketten.

Dieser α-helikale Halsbereich des S1 enthält am Übergang von der Motor-Domäne zur

Bindungsdomäne der ELC die sogenannte Konverter-Domäne, welche als übertragendes

Gelenk für die Bewegung des Myosin-Kopfes von Bedeutung ist [Dominguez et al., 1998;

Rayment et al., 1993]. Ausser Myosin II sind zusätzlich mit Myosin assoziierte Proteine, wie

Myomesin, das H- und M-Protein, Titin und das Myosin-Bindeprotein C, im dicken Filament

vorzufinden (Abbildung 1 B; C).

1. Einleitung 3

Viele der an Myosin bindenden Proteine haben strukturelle Funktionen, so ist das größte

bekannte Protein, Titin (3.000 kDa), eine Art Anker, welches sich von Z- zu Z-Scheibe

erstreckt und durch Interaktion mit dem dicken Filament dieses vermutlich während der

Kontraktion in der Mitte des Sarkomers positioniert hält [Keller, 1995] (Abbildung 1 B). Das

Myosin-Bindeprotein C (150 kDa), welches im „A-Banden – H-Banden“-Bereich liegt [Starr

& Opfer, 1971; Jeacocke & England, 1980] und nach Phosphorylierung durch die cAMP-

abhängige Proteinkinase die Aktin-aktivierte Myosin-Mg2+-ATPase Aktivität bei niedriger

Ionenstärke inhibiert [Lim & Walsh, 1986] und zur Erhöhung der Relaxationsrate beiträgt

[Strang et al., 1994], gehört zu den regulatorischen Proteinen des Sarkomers. Das dünne

Filament, welches von der Z-Scheibe bis zum Beginn der H-Bande reicht, besteht

hauptsächlich aus dem filamentösen Aktin (F-Aktin) und den Phosphoproteinen Troponin

[Leavis & Gergely, 1984; Zot & Potter, 1987] und Tropomyosin [Mak et al., 1978]. Alle drei

Proteine liegen in einem stöchiometrischen Verhältnis von Aktin : Tropomyosin : Troponin

wie 7 : 1 : 1 vor. F-Aktin besteht aus 42 kDa großen Monomeren (G-Aktin) [Farah &

Reinach, 1995], die sich bei Vorhandensein von zweiwertigen Kationen unter Spaltung von

ATP zu den parallel angeordneten helikalen und pseudodimeren Filamenten polymerisieren.

G-Aktin besteht aus einer kleinen (I) und einer großen Domäne (II), die je aus zwei

Subdomänen (I A und I B, sowie II A und II B) aufgebaut sind. Zwischen der kleinen und

großen Domäne sind in einer Spalte die Bindungsstellen für zweiwertige Kationen (Mg2+ oder

Ca2+) und Nukleotide (ATP oder ADP) lokalisiert.

In der Furche des F-Aktins, welche durch die spezifische Anordnung der G-Aktinmonomere

gebildet wird, ist das kooperativ bindende Tropomyosin (Tm) lokalisiert, welches durch Kopf

zu Schwanz Überlappung benachbarter Moleküle zu langen Ketten polymerisiert (66 kDa,

[Lewis & Smillie, 1980]). Ein Tm-Molekül liegt als superspiralisiertes Homo- oder

Heterodimer vor und überspannt sieben der polymerisierten Aktinmonomere. Grundbausteine

des α-helikalen Dimers sind α- oder β-Isoform (MW: 33 kDa), wobei die Zusammensetzung

des Dimers variiert. Im Herzen des Menschen zum Beispiel liegt Tm als Homodimer aus

2 α-Ketten vor [Tobacman, 1996].

An das Tm bindet der heterotrimere Troponin-Komplex (Tn, 77,5 kDa). Tn stabilisiert die

Tropomyosinbindung an Aktinfilamente [Mak & Smillie, 1981]. Es hemmt sterisch die Aktin-

Myosin Wechselwirkung bei einer intrazellulären Calcium-Konzentration von ~ 10-6 M. Die

Hemmung wird durch Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration aufgehoben

[Übersicht: Farah & Reinach, 1995].

1. Einleitung 4

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus quergestreifter Muskel

Abbildung 1 A zeigt eine Myofibrille mit regelmäßig angeordneten Sarkomeren. Der Aufbau eines Sarkomers ist schematisch in Abbildung 1 B dargestellt. Es erstreckt sich zwischen 2 Z-Scheiben, welche aus einer Vielzahl von Proteinen zusammengesetzt sind, wie z. B. α-Aktinin (190 kDa), welches Aktin quervernetzt und in der Z-Scheibe verankert, MLP (Muskel-Lim-Protein) oder Telethonin. Titin und u.a. Nebulin, welche als „molekulare Lineale“ des dünnen Filamentes gelten, sind in der Z-Scheibe verankert. Abbildung 1 C zeigt detaillierter die Organisation der dicken und dünnen Filamente. Das dünne Filament besteht aus dem Aktinfilament, dem Troponinkomplex, aufgebaut aus der inhibitorischen Untereinheit (TnI), der Calcium-bindenden (TnC) und der Tropomyosin-bindenden Untereinheit (TnT) und dem zu einer Superhelix gewundenen Tropomyosin. Abbildung aus [Morita et al., 2005] entnommen und modifiziert.

Der Troponin-Komplex besteht aus den drei im äquimolaren Verhältnis vorliegenden

Untereinheiten TnC, der calciumbindenden Untereinheit (MW: 18,5 kDa), TnI, der inhibitori-

schen Untereinheit (MW: 24 kDa) und TnT, der Tropomyosin-bindenden Untereinheit

(MW: 35 kDa) [Greaser & Gergeley, 1971; 1973] (Abbildung 2), welche untereinander und

mit den anderen Proteinen des dünnen Filamentes interagieren. Tn ist einmal pro sieben

Aktinmonomere, was einem Abstand von 38,5 nm entspricht, an das dünne Filament

Sarkomer

α.Aktinin

MLP

Telethonin

A

B

C

Myofibrille

dickes Filament

dünnes Filament A-Bande

M-Linie Titin

H-Bande I-Bande

Z-Scheibe Z-Scheibe

Nebulin

Troponin T Troponin I Troponin C Tropomyosin

Myosin-Bindeprotein C Myosin Leichte Kette Myosin Schwere Kette

Aktin Ca2+

1. Einleitung 5

gebunden, wobei der Troponin-Komplex über TnT am dünnen Filament verankert ist [Leszyk

et al., 1987].

TnT ist in zwei Domänen gliederbar, T1 und T2. Die N-terminale T1-Domäne (Reste 1 – 158)

ist langgestreckt (ca. 95 Å lang und nur 35 Å breit) und besteht hauptsächlich aus α-Helix

[Übersicht: Perry, 1998]. Es bindet u.a. an der Überlappungsregion von 2 Tm-Molekülen und

fördert so die Kopf-Schwanz-Interaktion der Tm-Moleküle [White et al., 1987]. Die Inter-

aktionsregion in der T1-Domäne mit der C-terminalen α-helikalen Domäne des Tropomyo-

sins, wahrscheinlich im Bereich 190 – 284 [Perry, 1998], liegt im Bereich zwischen den

Resten 71 – 151 des TnT [Hinkle et al., 1999] und fördert die Tropomyosinbindung an Aktin

[Fisher et al., 1995].

Die mehr carboxyterminal gelegenen globuläre Region (T2; Reste 159 – 259) interagiert mit

TnI und TnC (Abbildung 2). Die Wechselwirkung der Troponin-Untereinheiten in diesem

Bereich wird als sogenannter IT-Arm beschrieben, an dessen Struktur die Helix 2 der T2

Domäne des TnT (Region der Reste 203 – 271) und die Helices 1 und 2 des TnI (Region der

Reste 42 - 136) und Reste 93 – 161 des TnC (C-terminale Domäne) beteiligt sind [Takeda et

al., 2003] (Abbildung 2). Der C-terminale Bereich der Superhelix (Reste 256 – 270 des TnT)

interagiert mit den Calciumbindungs-Schleifen des TnC, wobei diese Interaktion des

C-Terminus der T2-Domäne mit TnC Calcium-unabhängig ist, wohingegen die Interaktion

des N-Terminus der T2-Domäne mit TnC Calcium-abhängig ist [Tanokura et al., 1983].

Die T2-Domäne des TnT (C-TnT, Reste 243 – 259, [Tanokura et al., 1983]) steht auch in

Wechselwirkung mit Tropomyosin, wahrscheinlich im Bereich von Cys190 des Tm [Chong &

Hodges, 1982; Morris & Lehrer, 1981] und wird nicht durch Calcium beeinflusst [Pearlstone

& Smillie, 1982].

Mögliche Wechselwirkungen von TnT mit Aktin werden postuliert [Perry, 1998]. Unter-

suchungen deuteten auf eine Interaktion von Resten 176 – 259 des TnT mit Aktin hin. TnI

und TnC sollen diese Interaktion des TnT mit Aktin schwächen [Heeley & Smillie, 1988]. Die

TnT Bindung an Aktin soll für die starke Troponin-Tropomyosin-Bindung an Aktin in der

Anwesenheit von Calcium mit verantwortlich sein [Dahiya et al., 1994].

TnI [Übersicht: Perry, 1999] inhibiert bei niedrigen Calcium-Konzentrationen die Bindung

der Myosinköpfe an Aktin, interagiert mit den beiden anderen Tn-Untereinheiten und mit

Aktin und Tropomyosin [Ohtsuki et al., 1986; Leszyk et al., 1988]. Die inhibitorische Unter-

einheit besteht aus α-Helices und Zufallsknäuel-Strukturen, wie mit Hilfe von Kristallisa-

1. Einleitung 6

tionsexperimenten [Takeda et al., 2003], FRET- [Dong et al., 1997] und NMR-Messungen

[Krudy et al., 1994; Kleerekoper et al., 1995] gezeigt werden konnte.

Es kann in mehrere funktionelle Regionen gruppiert werden; so kann die inhibitorische Funk-

tion des TnI den Regionen der Reste 137 - 148 [Takeda et al., 2003] und Reste 169 - 210

[Takeda et al., 1997] bzw. Reste 173 - 181 [Tripet et al., 1997] zugeordnet werden, welche

mit Aktin interagieren und die Bindung des Myosins sterisch behindern. Die Reste 43 – 65 im

aminoterminalen Bereich des TnI interagieren mit der C-terminalen Domäne des TnC über

van der Waals Wechselwirkung. Desweiteren steht die amphiphile Helix 3 des TnI (Reste

150 – 159) über van der Waals Bindungen mit der bei Calciumbindung in der N-terminalen

Domäne des TnC exponierten hydrophoben Tasche in Wechselwirkung. Helix 3 des TnI soll

einen molekularen Schalter darstellen, welcher das Signal der Calciumbindung in der

N-terminalen Domäne des TnC zu den andern Komponenten des dünnen Filamentes weiter-

leitet [Takeda et al., 2003].

Wechselwirkung mit TnT entsteht durch Wassertstoffbrückenbindungen und hydrophoben

Interaktionen im C-terminalen Bereich der Helix 1 des TnI (Reste 66 – 79), wodurch dieser

Bereich des TnI stabilisiert wird. Der C-terminal anschließende Bereich des TnI (Reste

80 - 89) weist eine gestreckte Konformation auf und bildet durch Wechselwirkung mit TnT

einen hydrophoben Kern, bei dessen Bildung die Aminosäuren Leu83, Leu85, Leu88, Leu93

und Leu96 von TnI und Ala233, Arg230 und Leu229 von TnT involviert sind.

Die Wechselwirkung der Helix 2 des TnI (Reste 90 – 135) mit Helix 2 des TnT (Reste

226 - 271) resultiert im sogenannten IT-Arm [Takeda et al., 2003] (Abbildung 2).

Intermolekulare Wechselwirkungen der inhibitorischen Regionen mit dem Aktinfilament

konnten im inhibierenden Zustand des TnI auf einen Bereich um den Aminosäurerest 47

(Met47) des G-Aktins eingegrenzt werden [Luo et al., 2002]. Wahrscheinlich wird durch

diese Interaktion die Tm-Bindungsstelle gebildet und seine im inhibierten Zustand am Rand

der Aktinfurche lokalisierte Position stabilisiert.

TnC, zur Superfamilie calciumbindender Proteine gehörend [Van Eerd & Takahashi, 1975] ist

der Calciumsensor des Troponins, welcher Calcium an EF-Hand-Strukturen („Helix-Loop-

Helix-Motif“) [Collins et al., 1973; Kretsinger & Nockolds, 1973] binden kann.

Die Struktur von TnC wurde durch röntgenkristallographische Untersuchungen als hantelför-

mig mit zwei globulären Domänen, welche über eine lange zentrale Helix als Linkerregion

verbunden sind, beschrieben [Herzberg et al., 1986; Satyshur et al., 1988], wobei je zwei

Calciumbindungsstellen pro Domäne vorhanden sind. Die Bindungsstellen für Calcium in der

aminoterminalen Domäne, welche man auch als Bindungsstellen I (Reste 30 – 41) und

1. Einleitung 7

IT-Arm

regulator.Kopf- Domäne

II (Reste 66 - 77) bezeichnet, binden ausschließlich Calcium mit geringer Affinität (Kapp Ca2+

~ 105 M-1) [Potter & Gergeley, 1975; Leavis et al., 1978], sodass sie im ruhenden Muskel

unbesetzt vorliegen. Sie werden als regulatorische Bindungsstellen bezeichnet. Die in der

COOH-gelegenen Domäne lokalisierten Bindungsstellen III (Reste 106 - 117) und IV (Reste

142 - 153) sind hochaffin, aber nicht spezifisch gegenüber Calcium (Kapp Ca2+ ~ 107 M-1)

[Potter & Gergeley, 1975; Leavis et al., 1978] und binden im ruhenden Muskel bei niedriger

intrazellulärer Calcium-Konzentration Magnesiumionen (Kapp Mg2+ ~ 103 M-1) [Farah & Rei-

nach, 1995]. Die Calciumbindungsstellen III und IV werden als strukturelle Bindungsstellen

bezeichnet [Negele et al., 1992]. So sind die Calciumbindungsstellen III und IV des TnC in

Kontakt mit TnT; die Reste Tyr259, Val263, Asn266, Arg267 und Asp270 des TnT stehen in

Wechselwirkung mit den Resten Phe101, Arg102, Asp105, Asp109 und Tyr111 in der

Calciumbindungsschleife III und mit Asp149, Tyr150 und Asp151 in der Calciumbindungs-

schleife IV des TnC. Durch Wasserstoffbrücken des Asp270 von TnT mit der Hydroxyl-

gruppe des Tyr111 von TnC wird zum Beispiel das Calciumion in der Bindungsstelle III

koordiniert [Takeda et al., 2003].

Abbildung 2: Struktur der hcTn-Kerndomäne

Abbildung 2 zeigt die Kristallstruktur eines 52kDa-Moleküls des menschlichen Herztro-ponins in Calcium-gebundenen Zustand. Nur das Rückgrat ist dargestellt. TnC ist rot, TnT gelb, TnI hellblau mit dunkelblauen TnC-Inter-aktionsregionen. Schwarze gefüllte Kreise kenn-zeichnen gebundenes Calcium. Helices in TnI und TnT sind durch Zahlen, in TnC durch Buchstaben gekennzeichnet. Die Gliederung in die 2 Domänen ist angedeutet. Abbildung aus [Takeda et al., 2003].

1. Einleitung 8

Generell kann der Troponin-Komplex in zwei strukturell distinkte Subdomänen gegliedert

werden (Abbildung 2), die regulatorische Kopf-Domäne, welche die Reste 3 – 84 des TnC

und Reste 150 – 159 des TnI umfasst und den IT-Arm. Dieser umfasst TnC Reste 93 – 161,

TnI Reste 42 – 136 und TnT Reste 203 – 271 [Takeda et al., 2003].

1.2 Muskelkontraktion - Die Rolle der intrazellulären Calcium-Konzentration

Calcium (Ca2+) ist einer der wichtigsten Botenstoffe bei allen bekannten Lebewesen. Es ist an

vielen zellulären Prozessen beteiligt, wie interzelluläre Kommunikation, Zellstoffwechsel,

Zellteilung oder Zelltod. Es reguliert zum Beispiel Enzymaktivitäten und die Muskelkontrak-

tion. Die Ca2+-Konzentration im Cytosol der ruhenden Zelle ist mit ca. 80 – 100 nM

ca. 10.000 x niedriger als im Extrazellulärraum. In erregbaren Zellen, wie zum Beispiel der

Muskelzelle, wird das elektrische Signal an den zellulären Prozess der Kontraktion durch

Ca2+-Einstrom durch spannungsabhängige Calciumkanäle gekoppelt.

Nach Depolarisation der Plasmamembran infolge nervöser Impulse strömt Calcium durch

L-Typ Ca2+-Kanäle (DHP-Rezeptoren) in den transversalen Tubuli. Dadurch wird eine

Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Reticulum durch Aktivierung der Rhyanodin-

rezeptoren in das Cytosol induziert [Übersicht in: Bers, 2002].

Bei höheren intrazellulären Calcium-Konzentrationen werden zum Beispiel der Na+/Ca2+-

Austauscher (NCX) in der Plasmamembran und die im sarko-/endoplasmatischen Retikulum

lokalisierte SR-Ca2+-ATPase (SERCA) aktiviert, welche Calcium aus dem Cytosol befördern

und so die intrazelluläre Calcium-Konzentration senken.

Der temporäre Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration von nanomolaren

(ca. 10-7 M) zu mikromolaren (ca. 10-5 M) Konzentrationen [Marban et al., 1980] führt zur

Bindung und Sättigung der calciumbindenden Untereinheit des Troponin-Komplexes (TnC)

mit Calcium an seine regulatorischen Bindungsstellen I und II, wobei Änderungen der

Wechselwirkungen zwischen den Troponin-Untereinheiten miteinander und mit den Proteinen

des dünnen Filamentes erfolgen. Die Wechselwirkung zwischen TnC und TnI und zwischen

TnI und TnT wird gestärkt, wohingegen die Interaktion zwischen der inhibitorischen Unter-

einheit TnI und dem Aktin-Tropomyosin-Komplex gelöst wird [Gordon et al., 2001]. So kann

das Tropomyosin vom oberen Rand der Furche des Aktinfilamentes [Bacchiochi & Lehrer,

2002] weiter in die Furche hinein rutschen. Dadurch entfällt die sterische Blockierung der

Myosinbindungsstellen, und die Myosin-S1-Köpfe können mit Aktin eine schwache stereo-

spezifische Bindung eingehen, welche wiederum zu regionalen Konformationsänderungen

1. Einleitung 9

führt. Diese Konformationsänderungen setzten sich kooperativ bei angrenzenden Aktin-

monomeren fort, was zu weiteren Positionsänderungen des Tropomyosins in die Furche führt

(Abbildung 3). Daraus resultiert eine festere Bindung des Myosin-S1 an das Aktinfilament

und der kraftgenerierende Schritt kann erfolgen [Übersicht in: Rüegg, 1998]. Tropomyosin

zeigt hierbei calciumabhängig ein sehr flexibles, dynamisches Verhalten, wobei es eine „vor-

und zurückrollende Bewegung“ [Bacchiochi & Lehrer, 2002; Gordon et al., 2001] durchführt.

Abbildung 3: Troponin im dünnen Filament

A) TnC B) TnI

Aktin Tropomyosin

Der Aufbau des dünnen Filamentes aus Aktinfilamenten, dem zweisträngigen, α/β-heterodimeren Tropomyosin und dem trimeren Troponin-Komplex ist schematisch in Abbildung 3 A dargestellt. Angedeutet ist die Kopf-zu-Schwanz Überlappung benachbarter Tm-Moleküle und die Lokalisation der N-terminalen TnT-Domäne in diesem Bereich. Aus [Gordon et al., 2000] entnommen und modifiziert. Abbildung 3 B zeigt die calciumvermittelte Regulation der Aktomyosin Interaktion. Calciumbindung an TnC resultiert in intramolekularen und intermolekularen Konformationsänderun-gen, wodurch Tropomyosin sich vom Rand der Aktinfurche mehr in die Furche verlagert und Myosin an Aktin binden kann. Dies bewirkt wiederum für das Tropomyosin eine erneute Positionsänderung weiter in die Aktinfurche, sodass die Bindungsstelle des Aktins für eine starke Wechselwirkung mit Myosin-S1 frei wird und der kraftgenerierende Schritt erfolgen kann.

So werden drei Zustände des dünnen Filamentes definiert, „blockiert“, „geschlossen“ und

„offen“ [McKillop & Geeves, 1993]. Im „blockierten“ Zustand sind die Myosin-S1-

Bindungsstellen auf dem Aktin durch das Tropomyosin blockiert [Luo et al., 2002]. Bei der

„geschlossenen“ Konformation erfolgt eine schwache Wechselwirkung des Myosin-S1 nach

Freigabe der Bindungsstelle durch Tropomyosin mit Aktin. Der „geöffnete“ Zustand liegt vor,

wenn Tropomyosin tiefer in die Aktinfurche wandert und so Bindungsstellen auf dem

Aktinmonomer für eine starke Wechselwirkung mit Myosin-S1 frei werden. Der Prozess von

Bindung und Ablösung des Myosin-S1 wird im Querbrückenzyklus (auch „Lymn-Taylor-

Zyklus“ [Lymn & Taylor, 1971]) beschrieben (Abbildung 4).

TnT Myosin

TnCMyosin- Binde- stelle

Tropomyosin

Aktin

Calcium-

Ionen

TnT

TnI

Tropomyosin- Überlappungs-region

1. Einleitung 10

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Querbrückenzyklus

Der Querbrückenzyklus ist in acht Schritte gegliedert (I – VIII). Die Interaktionsstärken zwischen Elementen des dünnen Filamentes (Aktin) und des dicken Filamentes (Myosin) werden durch die Farbgebung verdeutlicht: keine Interaktion: Aktin - grau, Myosin - rot; schwache Interaktion: Aktin - Rosa, Myosin - grün; starke Interaktion: Aktin - rot, Myosin - blau. Aus [Gordon et al., 2001] entnommen und modifiziert.

In Abwesenheit von ATP erfolgt eine starke Wechselwirkung zwischen Aktin und ATP-

freiem Myosin-S1, das sogenannte „Rigor-Stadium“ (I). Durch Bindung von ATP an die

ATP-Bindungsstelle des Myosins löst sich Myosin-S1 vom Aktin ab (II und III). ATP wird

durch die Myosin-ATPase in ADP + Pi gespalten, wodurch Konformationsänderungen im

Halsbereich des Myosin-S1 induziert werden. Myosin-S1 verändert seine Position zum Aktin

(IV) und kann eine schwache Wechselwirkung mit Aktin eingehen (V). Bis zur Freisetzung

des Hydrolyseproduktes Pi wird die aus der Spaltung des ATP gewonnene Energie erhalten

(VI). Die Freisetzung des Pi, welche durch Aktinbindung beschleunigt wird, induziert durch

Konformationsänderungen eine starke Interaktion zwischen Myosin-S1 und Aktinfilament

und führt zudem zu Konformationsänderungen in der Konverterdomäne des S1, sodass der

Kraftschlag ausgeführt werden kann (VII). Hierbei wird das dicke Filament um ca. 10 nm

gegen das dünne Filament verschoben und Kraft bzw. Bewegung wird generiert. Als ab-

schließender Schritt des Zyklus wird für eine erneute Bindung von ATP an die Nukleotid-

Bindungsstellen das ADP abgespalten (VIII).

ADP

obere 50 kDa Domäne

ATP

S2 ATP-Hydrolyse

untere 50 kDa Domäne

S1

ATP-Bindestelle S1-Hals

dickes Filament

Tropomyosin

Aktin

Pi

1. Einleitung 11

Dieser Kontraktionsprozess wird erst calciumabhängig durch das Hauptregulatorprotein des

dünnen Filamentes, das Troponin.

Die Calciumbindung an die Bindungsstellen I und II in der NH2-terminalen Domäne des TnC

induziert die Exponierung einer hydrophoben Tasche mit geladenen Resten im TnC. Dies ist

verbunden mit einer Reorientierung der Helices bei den Calciumbindungsstellen I und II

zueinander. Die N-terminalen Calciumbindungsdomänen des TnC gehen vom geschlossenen

in den offenen Zustand über. Hierdurch wird eine calciumabhängige Wechselwirkung

zwischen TnI und TnC ermöglicht [Herzberg et al., 1986].

1.3 Muskelkontraktion – Feinregulierung der Kontraktion im Herzen durch

reversible Phosphorylierung

Die spezifischen Aufgaben von Skelettmuskel und Herz bedingen makroskopische und mi-

kroskopische Unterschiede. So liegen in den beiden Geweben Proteine in distinkten Iso-

formen vor. Troponin T liegt durch alternatives Spleißen verschiedener Gene in unterschiedli-

chen Muskeltypen in vielen Isoformen vor, wobei die Herzisoform durch eine zusätzliche

spezifische Sequenz (FMPNLVPPKI) größer als die Skelettmuskelisoform ist und einen län-

geren N-terminalen Bereich aufweist. Weiterhin sind alle TnT-Isoformen Phosphoproteine,

wobei es Unterschiede bei den Phosphorylierungen zwischen Herz und Skelettmuskel gibt.

Die verschiedenen Isoformen des TnT weisen strukturelle und funktionelle Variationen auf,

die Unterschiede in der Calcium-Regulation der Kontraktion zwischen Skelettmuskel und

Herz ermöglichen [Huang et al., 1999].

TnC weist in der Herzisoform aufgrund geänderter Aminosäuresequenz (Einfügung von V28

und Austausch von Resten D30 und D32 in sTnC zu Resten L29 und A30 in cTnC) innerhalb

der Calciumbindungsstelle I in der N-terminalen Domäne nur drei funktionsfähige Bindungs-

stellen auf, da diese Änderung bewirkt, dass Calcium nicht mehr koordiniert werden kann

[van Eerd & Takahashi, 1975; Collins et al., 1977]. So erfolgt bei Calciumbindung an die ein-

zige regulatorische Calciumbindungsstelle II der Übergang von geschlossener zu offener

Form des Proteins in abgeschwächter Form im Vergleich zum Skelettmuskel-TnC [Sia et al.,

1997; Li et al., 1998].

Kardiales Troponin I weist eine N-terminale Verlängerung von 32 Aminosäureresten auf

[Grand & Wilkinson, 1976; Leszyk et al., 1988; Vallins et al., 1990; Hastings et al., 1991;

Murphy et al., 1991], welche zwei benachbarte Serinreste an Positionen 22 und 23 (Amino-

1. Einleitung 12

säuresequenz des Menschen) bzw. Serinreste 23 und 24 (Aminosäuresequenz des Rindes)

trägt. Diese Serinreste werden endogen phosphoryliert [Swiderek et al., 1988; Mittmann et

al., 1992]. Durch neurohumorale Aktivität können die Serinreste 22 und 23 in vivo nach

β-adrenerger Stimulierung [England, 1975; Garvey et al., 1988; Venema & Kuo, 1993] durch

die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) phosphoryliert werden. Dies korreliert mit einem

Kraftanstieg (positiv inotroper Effekt) [England, 1975] und einer erhöhten Relaxationsrate

[Zhang et al., 1995a]. Neben Herztroponin I werden u.a. der L-Typ Calciumkanal, der

Rhyanodinrezeptor, Phospholamban und das Myosinbinde Protein C durch die PKA phos-

phoryliert. Die Phosphorylierung dieser Zielproteine stellt in ihrer Gesamtheit einen

Mechanismus dar, die Pumptätigkeit des Herzens an hämodynamische Erfordernisse anzupas-

sen [Übersicht: Solaro & Rarick, 1998]. Hierbei ist der Beitrag der einzelnen Proteine zu den

beobachteten Effekten noch nicht völlig geklärt.

Es lassen sich vier verschiedene Phosphorylierungszustände bei Vorliegen zweier phospho-

rylierbarer Reste generieren. Zum Einen kann cTnI („cardiales“ TnI) unphosphoryliert oder

an beiden Serinresten phosphoryliert („bisphosphoryliert“) vorliegen, zum Anderen können

auch Phosphorylierungszustände definiert werden, bei denen entweder der distale Serinrest 23

oder der proximale Serinrest 22 alleine phosphoryliert vorliegen („monophosphoryliert“).

Alle vier möglichen Phosphorylierungszustände des cTnI wurden in frisch isoliertem TnI des

Rinderherzen gefunden [Ardelt et al., 1998]. Die vier verschiedenen Phosphorylierungsfor-

men können durch unterschiedliche Geschwindigkeiten bei der Phosphorylierung durch die

PKA und bei der Dephosphorylierung durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A) gebildet

werden. So wird der distale Serinrest 23 des hcTnI 12 mal schneller durch die PKA

phosphoryliert als der proximale Serinrest 22, aber die Dephosphorylierung des Serinrestes 23

erfolgt auch doppelt so schnell, wie die des Serinrestes 22 [Mittmann et al., 1992; Jaquet et

al., 1995].

Die Verteilung dieser vier unterschiedlichen Phosphorylierungszustände des cTnI variiert

zwischen den Organismen (Mensch, Rind, Kaninchen) und den einzelnen Herzkompartimen-

ten (rechter und linker Ventrikel, linker und rechter Vorhof). Die bisphosphorylierte Form des

cTnI ist zum Beispiel eher in den Vorhöfen, als in den Ventrikeln vorzufinden [Ardelt et al.,

1998]. Anhand dieser unterschiedlichen Verteilungen der verschiedenen Phosphorylierungs-

zustände des cTnI im Herzen kann auf die Varianzen bei der Funktion der Phospho-

rylierungsformen des cTnI für die Regulation der Muskelkontraktion geschlossen werden. Die

biologische Rolle der verschiedenen Phosphorylierungszustände ist jedoch noch nicht

1. Einleitung 13

gänzlich geklärt. Phosphorylierung des Troponins verringert die Affinität zwischen den

Tn-Untereinheiten; je höher der Phosphorylierungsgrad ist, desto geringer ist die Affinität der

Tn-Untereinheiten zueinander [Reiffert et al., 1998]. Auch die Aktin-Myosin-Wechselwir-

kung wird beeinflusst, so wurde eine Reduktion der maximalen Aktomyosin-S1-ATPase-

Aktivität bereits nach Monophosphorylierung am Serinrest 23 beobachtet [Deng et al., 2001].

Nach Bisphosphorylierung ließ sich zusätzlich eine Abnahme der Calciumaffinität des cTnC

im Troponin-Komplex nachweisen [Zhang et al., 1995b; Reiffert et al., 1996], was mit einer

Erhöhung der Relaxations- und Querbrückenzyklusrate korreliert [Zhang et al., 1995a;

Kentish et al., 2001; Turnbull et al., 2002]. Es ließ sich zudem zeigen, dass Phosphorylierung

der Serinreste im N-terminalen Arm des cTnI die Eigenschaften des Aktinfilaments verändert

[van den Boom, 2003].

Bisphosphorylierung an Serin 22 und Serin 23 induziert auch Strukturänderungen in cTnI und

im cTn-Komplex, so wurde eine Reorientierung des cTnC und cTnT im Gesamtkomplex

beschrieben [Heller et al., 2003] und nach [Liao et al., 1994] und [Dong et al., 1997] geht

cTnI von einer gestreckten in eine mehr globuläre Form durch Annäherung der N- und

C-terminalen Domäne des Proteins über. Nach Vorstellung dieser Autoren ist dafür eine

Interaktion des bisphosphorylierten cTnI-Arms mit cTnI selber verantwortlich, was bis heute

noch nicht nachgewiesen worden ist und kontrovers diskutiert wird. Circular Dichroismus

(CD)-Experimente zeigten, dass Monophosphorylierung im isolierten hcTnI eine Änderung

der Sekundärstruktur bewirkt [Reiffert et al., 1998]. Das führte zusammen mit Erkenntnissen

aus 31P-NMR-spektroskopischen Untersuchungen zunächst zu der Annahme, dass Mono-

phosphorylierung zu einer Freisetzung des flexiblen N-terminalen Armes von hcTnI selber

führt. Im Tn-Komplex ist aber der nicht-phosphorylierte cTnI-Arm an cTnC gebunden [Finley

et al., 1999; Abbott et al., 2001] und wird durch Phosphorylierung von cTnC freigesetzt. 31P-NMR-Untersuchungen zufolge muss der bisphosphorylierte cTnI-Arm eine andere

Wechselwirkung innerhalb des Troponin-Komplexes eingehen [Jaquet et al., 1993], wobei

cTnC als Wechselwirkungspartner in Übereinstimmung mit [Finley et al., 1999; Abbott et al.,

2001] ausgeschlossen werden konnte [Schmidtmann et al., 2002].

Eine genaue Identifizierung des Interaktionspartners des bisphosphorylierten cTnI-Armes ist

bislang jedoch nicht erfolgt, da in der kürzlich publizierten Kristallstruktur des Herztroponins

funktionell essentielle Bereiche nicht aufgelöst werden konnten, bzw. zur Kristallisation

entfernt wurden, wie z.B. der N-terminale cTnI-Arm [Takeda et al., 2003].

1. Einleitung 14

1.4 Fragestellung dieser Arbeit

Die Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten des heterotrimeren Troponin-

Komplexes, aber auch zwischen Troponin, Tropomyosin und Aktin im dünnen Filament, sind

von marginaler Bedeutung für ein Verständnis des Kontraktionsprozesses. Änderungen in

diesen Wechselwirkungen resultieren in den beobachteten Änderungen im Ablauf des

Querbrückenzyklus. Phosphorylierung von Proteinen als posttranslationale Modifikation kann

Wechselwirkungen dieser Proteine mit anderen Strukturen beeinflussen. So scheint auch die

Phosphorylierung am Serin 22 und Serin 23 im flexiblen N-terminalen Arm von cTnI die

Wechselwirkung des Troponin-Komplexes im dünnen Filament zu verändern. Weder die

biologischen Funktionen, noch die molekularen Veränderungen durch die Phosphorylierung

sind vollständig verstanden. Die Frage, wie Bisphosphorylierung an Ser22 und Ser23 im cTnI

die Calciumaffinität des cTnC verringert, ist besonders interessant, auch in medizinischer

Hinsicht. Zumindest einige der Mutationen in Genen, die für cTnI und cTnC kodieren und

eine familiäre hypertrophe Kardiomyopathie verursachen, zeigen keine Calcium-

affinitätserniedrigung des cTnC nach Bisphosphorylierung des cTnI [Deng et al., 2001,

2002]. Bei diesen Mutationen scheint die Weiterleitung des Phosphorylierungssignals gestört

zu sein.

Aus diesem Grund sollten Untersuchungen zu Bewegung und Wechselwirkung des

N-terminalen Armes des cTnI durchgeführt werden.

Im Rahmen meiner Doktorarbeit wurde untersucht, welche Rolle der flexible N-terminale

Arm des cTnI in der Weiterleitung des Phosphorylierungssignals an seinen beiden Serinresten

(Ser22 und Ser23) einnimmt und ob er in einer Übermittlung des Signals direkt zu den

Calciumbindungsstellen im cTnC involviert ist oder die Transduktion des Signals über alle

Troponin-Untereinheiten, also indirekt, vermittelt wird.

Zur Klärung der Fragestellung wurde die Kernresonanzspektroskopie verwendet. So wurde in

dieser Arbeit die 19F-NMR-Spektroskopie als Hauptmethode angewandt, um Bewegungen

und Wechselwirkungen des cTnI-Armes zu detektieren. Die Resonanzen von 19F-Kernen sind

sehr sensitiv gegenüber Veränderungen der chemischen Umgebung. Um diese Messungen

durchführen zu können, wurden Fluorsonden an verschiedenen Stellen im cTnI eingebracht.

Es wird gezeigt werden, dass die C- und N-terminalen Bereiche des cTnI-Armes unter-

schiedliche Wechselwirkungen eingehen und auch unterschiedlich auf die Phosphorylierung

von Serin 22 und Serin 23 reagieren.

1. Einleitung 15

Weiterhin wird mit 19F-NMR gezeigt, dass durch Phosphorylierung die Wechselwirkung

zwischen den Tn-Untereinheiten beeinflusst wird.

Mehrdimensionale NMR-Analysen an 15N,2H-markiertem cTnC im trimeren Tn-Komplex

zeigen punktuelle Veränderungen in der C- wie in der N-terminalen Domäne des cTnC. Die

Beobachtungen führen zur Formulierung einer Hypothese, wie das Phosphorylierungssignal

von cTnI zu den Calciumbindungsdomänen im cTnC weitergeleitet werden könnte.

2. Material und Methoden 16

2 Material und Methoden

2.1 Molekularbiologische Methoden

Sämtliche molekularbiologischen Arbeiten werden ausschließlich unter Verwendung von

sterilen Gefäßen, Lösungen sowie Pipettenspitzen durchgeführt. Der Reinheitsgrad aller

verwendeten Chemikalien entspricht dem für Analysen (p.A.). Abweichungen von den

molekularbiologischen Vorgehensweisen nach [Sambrook et al., 1989] werden gesondert

vermerkt.

2.1.1 Zelllinien

Die humanen Herztroponin-Untereinheiten werden einzeln in der Zelllinie E. coli BL21

(DE3) exprimiert (außer gesondert aufgeführt) ( 2.1.6). Die für hcTnI und hcTnC codierenden

cDNS werden in einen pET3c- (Strategene) und die für hcTnT codierende cDNS wird in

einen pSBET-Vektor [Schenk et al., 1995; Lohmann et al., 2001] kloniert.

2.1.1.1 Kultur von Bakterien auf agarhaltigem Nährboden

Die Bakterien (E. coli BL21 (DE3)) werden mit einem Drigalskispatel auf einem agarhaltigen

Nährboden (LB-Medium (Gibco-BRL) mit 10 % (w/v) AgarAgar (Gibco-BRL)) ausgestri-

chen und bei 37 °C für 14 - 16 h inkubiert. Zur Selektion der Bakterien beinhaltet der

Nährboden entweder Ampicillin (100 µg/ml; Endkonzentration) oder Kanamycin (50 µg/ml;

Endkonzentration).

2.1.2 Flüssigkultur von Bakterien

Je nach Verwendungszweck werden die Bakterien in verschiedenen Medien angezüchtet.

Sollen Proteine in E. coli exprimiert werden, wird zur Anzucht der Bakterien NZCYM-

Medium (Gibco-BRL) verwendet. Soll eine Plasmidisolierung aus den Bakterien erfolgen

oder werden Zellen für die Herstellung von kompetenten Bakterien benötigt, so werden Bak-

terien in LB-Medium (Gibco-BRL) kultiviert. Medien (< 500 ml) werden mit einer einzelnen

Bakterienkolonie von einer Agarplatten-Kultur oder einem Aliquot einer Glycerinstammkul-

tur angeimpft und im Schüttelinkubator bei einer Temperatur von 30 °C oder 37 °C und

170 - 200 Upm bis zu einer optischen Dichte, OD600, von 0.6 - 1.0 inkubiert. Zum Animpfen

größerer Medienvolumina (> 500 ml) wird eine 10 ml Flüssigvorkultur verwendet.


2.1.3 Lagerung von Bakerienstämmen

Zur Erstellung von Glycerinstammkulturen werden die sich noch in der exponentiellen

Wachstumsphase befindlichen Bakterien (OD600 = 0,6 - 0,8) einer Flüssigkultur bei 4 °C und

2.500 x g pelletiert und anschließend in 30 % (v/v) Glycerin enthaltendem LB-Medium mit

entsprechendem Antibiotikum aufgenommen. Die Bakteriensuspensionen werden mit flüssi-

gem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

2.1.4 Herstellung von kompetenten Zellen

2.1.4.1 Herstellung von elektrokompetenten Zellen

Die Herstellung von elektrokompetenten Bakterienzellen erfolgt nach den Angaben des

Elektroporationsgeräte-Herstellers BTX Inc.. Die Bakterien einer 1 l - Flüssigkultur werden

nach dem Erreichen einer OD600 von 0,5 – 0,8 insgesamt 4 x für 15 min bei 4 °C und

4.000 x g abzentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird das Bakterienpellet jeweils 2 x in 1 l

und 2 x in 500 ml kaltem, sterilen A. bidest resuspendiert. Anschließend werden die resuspen-

dierten Bakterien für 5 min bei 4 °C und 5.000 x g sedimentiert. Das mit kaltem, sterilen

A. bidest resuspendierte Pellet wird für 5 min bei 4 °C und 2.500 x g zentrifugiert, in 20 ml

kaltem, sterilen 10 % (v/v) Glycerin gelöst und erneut zentrifugiert. Abschließend wird das

Bakteriensediment in 2 ml kaltem, sterilen 10 % (v/v) Glycerin aufgenommen und zu 50 µl

Aliquots bei -80 °C gelagert.

2.1.4.2 Herstellung von Calcium-kompetenten Zellen

Calcium-kompetente Zellen werden im Wesentlichen nach [Cohen et al., 1972] hergestellt.

10 ml LB-Medium werden mit 50 µl einer Glycerinstammkultur von E. coli BL21(DE3)

angeimpft und ü. N. bei 37 °C im Schüttelinkubator bei 180 Upm inkubiert. Mit 1 ml der

ü. N.-Kultur werden 100 ml LB-Medium angeimpft und die Bakterien bei 37 °C im Schüttel-

inkubator bei 180 Upm inkubiert. Nachdem eine OD600 von 0,5 erreicht ist, werden die Zellen

in sterilen Zentrifugenbechern für 10 min bei 4 °C und 2.000 x g sedimentiert. Das Bakterien-

pellet wird in 10 ml sterilfiltrierter kalter 100 mM Natriumchlorid-Lösung resuspendiert und

für 30 min auf Eis inkubiert. Die Suspension wird abschließend für 10 min bei 4 °C und

2.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 4 ml 100 mM kalter Calciumchlorid-Lösung

resuspendiert und bis zur Transformation bei -80 °C gelagert.


2.1.5 Transformation von E. coli

2.1.5.1 Transformation von elektrokompetenten Zellen

Die auf 4 °C vorgekühlte Elektroporationsküvette (2 mm, Eurogentec) wird mit einem

Gemisch aus 50 µl der auf Eis aufgetauten elektrokompetenten Zellen ( 2.1.4.1) und der zu

transformierenden cDNS (8 ng/µl) beladen. Die Elektroporation der Zellmembran von E. coli

Zellen wird durch einen Impuls mit 2,5 kV (Spannug) bei 20 µF (Kapazität des Kondensators)

und 200 Ω (Resistenzwiderstand) vom Elektroporator (Electro Cell Manipulator 600, Fa.

BTX Inc.) erreicht. Danach werden 200 µl eisgekühltes SOC-Medium (20 mM Glucose,

20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2,)

zu dem Transformationsansatz gegeben. Der Ansatz wird 30 min bei 37 °C inkubiert, danach

auf agarhaltigem Nährboden, dem zuvor das entsprechende Antibiotikum zugegeben wird,

ausgestrichen und für ca. 16 h bei 37 °C bebrütet ( 2.1.1.1).

2.1.5.2 Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Zellen

50-80 ng Plasmid-DNS werden mit 200 µl CaCl2-kompetenten Zellen 30 min auf Eis und

anschließend für 90 s bei 42 °C im Wasserbad inkubiert. Nach kurzzeitiger Kühlung des

Ansatzes im Eisbad werden 200 µl SOC-Medium ( 2.1.5.1) hinzugefügt und für 45 min bei

37 °C mit 180 - 200 Upm geschüttelt. Eine Selektion erfolgt durch Kultur der transformierten

Bakterien auf agarhaltigem Nährboden, dem zuvor das entsprechende Antibiotikum zugesetzt

wurde ( 2.1.1.1).

2.1.6 Expression von Proteinen in BL21(DE3)-E. coli-Bakterien

2.1.6.1 Überprüfung der Proteinexpression

5 - 10 ml NZCYM-Medium mit entsprechendem Antibiotikum werden mit einem Aliquot

einer Glycerinstammkultur oder 50 µl einer Bakterienvorkultur angeimpft und bis zu einer

optischen Dichte bei 600 nm Wellenlänge von ca. OD600 = 0,6 - 1,0 im Schüttler bei 37 °C

und 150 - 200 Upm inkubiert. Zur Induktion der Proteinexpression wird die Kultur mit IPTG

versetzt (0,4 mM Endkonzentration; AppliChem), bei 37 °C und 150 - 200 Upm im Schüttler

inkubiert und in bestimmten Zeitabständen (z.B. direkt vor der Induktion sowie 30, 60, 120,

180 und 240 min nach Induktion mit IPTG) werden Aliquots (0,5 ml) entnommen und 3 min

bei 16.000 x g zentrifugiert. Die Pellets werden in 50 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen.


Die Suspension wird 10 min bei 100 °C inkubiert und kann bis zur gelelektrophoretischen

Auftrennung bei -20 °C gelagert werden.

2.1.6.2 Expression von unmarkierten rekombinanten Proteinen

Die Proteinexpression wird durch die Zugabe von IPTG (AppliChem) (Endkonzentration von

0,4 mM) ( 2.1.2) zur Flüssigkultur induziert. Nach 4 h wird die Proteinexpression durch

Sedimentation der Bakterienzellen bei 8.300 x g für 15 min bei 4 °C gestoppt. Die pelletierten

Bakterien werden bis zur Präparation bei –20 °C aufbewahrt. Diesem Standardprotokoll

[Reiffert et al., 1998; Reiffert et al., 1999] kann für die Expression unmarkierter rekombinan-

ter Proteine gefolgt werden.

2.1.6.3 Expression von 15N,2H-markierten rekombinanten Proteinen

Zur Erhöhung der Expressionsrate von markiertem (15N bzw. 15N,2H) hcTnC C35/84S erfolgt

die Expression in E. coli Zellen des Stamms BL21 Gold (DE3) pLysS (Stratagene) unter

Verwendung eines Bioreaktors der Firma FairMenTec (Model Fermenter 219; Kontrollein-

heit: FairMenTec FCE 03 mit Service Module 1 und angeschlossenem Wasserbad Haake K20

mit Kontrolleinheit Haake DC30).

Zur Markierung der Proteine mit 15N bzw. 15N und 2H erfolgt die Anzucht in Minimalmedium

( 2.1.6.3.1), welches als Stickstoffquelle 15N-Ammoniumchlorid (Spectra Stable Isotopes)

bzw. zusätzlich 80 % Deuterium für eine Markierung des Proteins mit 15N und 2H enthält. Mit 15N (Spectra 9-N) bzw. 15N;2H (Spectra 9-dN) angereichertes Minimalmedium konnte auch

käuflich bei „Spectra Stable Isotopes“ erworben werden. Aufgrund erschwerter Kultivie-

rungsbedingungen der Bakterien in markiertem Minimalmedium wird die Vorkultur in

Vollmedium aufgezogen und vor dem Animpfen der Minimalmedium-Kultur 2 x mit

Minimalmedium gewaschen (2 x 5-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 8300 x g und Resus-

pension in Minimalmedium). Zur Optimierung der Proteinexpression werden die Temperatur

(37 °C), die Sauerstoffversorgung (80 % pO2), die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rühr-

werks (250 - 300 Upm) und der pH-Wert (>7) konstant gehalten. Nach dem Erreichen der

OD600 von 1,0 - 1,4 wird die Expression durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,4 –

0,6 mM) induziert. Nach 12 h werden die Zellen geerntet und bei -80 °C aufbewahrt.


2.1.6.3.1 Herstellung von markiertem Minimalmedium

Rezept für Minimalmedium: In 900 ml werden

15,0 g Na2HPO4 6,0 g KH2PO4

1,0 g NaCl 0,5 g MgSO4 x 7 H2O 0,028 g CaCl2 x 2 H2O

gelöst und autoklaviert. Nach dem Abkühlen werden 40 ml SL-Mix, 4,0 g Glucose, ent-

sprechendes Antibiotikum (für Expression von markiertem hcTnC: Ampicillin mit 100 µg/ml

Endkonzentration) und 1,0 g 15N-markiertes NH4Cl sterilfiltrierte Lösung zugegeben.

Der SL-Mix wird für ein Endvolumen von 40 ml aus 3,6 ml 10 x SL-4 und 4,0 ml SL-6

Lösung gemischt und mit A. bidest aufgefüllt.

SL-6: 100 mg ZnSO4 x 7 H2O 30 mg MnCl2 300 mg H2BO3 200 mg CoCl2 x 6 H2O 10 mg CuCl2 x 2 H2O 20 mg NiCl x 6 H2O 30 mg Na2MoO4 ad 1000 ml A. bidest

10 x SL-4: 500 mg EDTA 200 mg FeSO4 x 7 H2O ad 90 ml A. bidest

2.1.6.3.2 Adaption der Bakterien an 15N,2H-markiertes Medium

Zur Selektion von E. coli Bakterien, die gut in markierten Minimalmedien wachsen, werden

E. coli Bakterien auf agarhaltigem Nährboden ( 2.1.1.1) aus 15N- oder 15N,2H-markiertem

Minimalmedium ( 2.1.6.3.1) mit entsprechendem Antibiotikum kultiviert. Um die Aus-

tauschrate von 2H gegen 1H möglichst gering zu halten, wird der Agar bzw. die Agarose bei

der niedrigst möglichen Temperatur als 2 x konzentrierte Suspension gelöst und anschließend

mit frischem D2O-enthaltenen Medium auf einfache Konzentration verdünnt.

2.2 Präparative biochemische Methoden

2.2.1 Isolierung und Reinigung von rekombinantem hcTnT aus E. coli

Die Isolierung und Reinigung von rekombinantem Wildtyp hcTnT aus E. coli erfolgt im

Wesentlichen nach der Methode von [Deng et al., 2001]. Bakterienpellets werden in 10 ml

Lyse-Puffer pro Liter Zellkulturansatz aufgenommen und für mindestens 20 h bei -80 °C

eingefroren. Nach dem Zerstören der Bakterienwände mit Hilfe einer French Press (SLM


Aminco) werden 5 M ultrapurer Harnstoff und 0,1 % (v/v) Triton X100 zugegeben. Nach

einstündiger Inkubation bei 4 °C unter Rühren wird die Probe 1 h bei 120.000 x g und 4 °C

zentrifugiert. Der Überstand wird 1 : 10 mit dem Äquilibrierungspuffer für das DE52

Ionenaustauschermaterial verdünnt und 2 h unter Rühren bei 4 °C mit 100 ml des äquilibrier-

ten DE52 Materials inkubiert. Anschließend wird diese Suspension in eine Säule (Durchmes-

ser 2,5 cm) gegossen und nicht gebundenes Protein durch Waschen des Säulenmaterials mit

100 ml 80 mM NaCl in DE52-Äquilibrierungspuffer bei 0,5 ml/min entfernt. Gebundenes

Protein wird in einem linearen Salzgradienten von 80 mM auf 350 mM NaCl mit 400 ml

Volumen bei 0,5 ml/min eluiert. Die 4 ml großen Fraktionen werden mittels Bradford-

Reagenz auf Proteingehalt ( 2.3.1) und mittels SDS-PAGE ( 2.3.2) auf das zu reinigende

Protein (cTnT) überprüft. Nach Vereinigung der hcTnT enthaltenden Fraktionen und

Einengung des Volumens ( 2.3.10) wird eine Gelfiltrationschromatographie mit Sephadex G75

Material (Amersham-Bioscience) durchgeführt [Deng et al., 2001]. So gereinigtes cTnT wird

bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

Lyse-Puffer: 25 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

20 % (w/v) Succrose 1 mM EDTA 0,3 mM PMSF 0,2 M NaCl 0,1 mM TPCK 0,1 mM TLCK

DE52-Äquilibrierungspuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C) 5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 1 mM DTT 5 M Harnstoff

Gelfiltrationspuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

0,5 M NaCl 5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 2 mM DTT

2.2.2 Isolierung und Reinigung der Deletions-Proteinmutante hcTnT 185 - 291

Für die Reinigung von hcTnT 185 - 291 (hcTnT ∆ 1 - 184) aus E. coli-BL 21 (DE3) wird eine

2 Liter Bakterienkultur nach der Ernte in 10 ml Lyse-Puffer pro Liter Zellkulturansatz

aufgenommen und für mindestens 20 h bei -80 °C eingefroren ( 2.2.1). Nach dem Zerstören

der Bakterienwände mit Hilfe der French Press wird das Lysat mit Aufnahmepuffer auf


35 ml aufgefüllt und Protein teilweise durch Zugabe von 22,5 % (w/v) Ammoniumsulfat

gefällt. Dafür wird die Suspension 1 h bei 4 °C unter Rühren inkubiert und anschliessend mit

20.000 x g 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Im hcTnT 185 - 291-beinhaltenden Überstand wird

ein Gehalt von 60 % (w/v) Ammoniumsulfat eingestellt. Das ausgefällte Protein wird mit

48.750 x g bei 4 °C 15 min abzentrifugiert, das Pellet in DE52-Dialysepuffer aufgenommen

und gegen diesen 3 x 1 l je 1 h bei 4 °C dialysiert. 100 ml DE52-Ionenaustauschermaterial

wird mit dem DE52-Dialysepuffer äquilibriert und anschließend mit dem Proteindialysat,

welches vorher in seinem pH-Wert und seiner Leitfähigkeit an den DE52-Dialysepuffer

angeglichen wird, 2 h bei 4 °C unter Rühren inkubiert und die Suspension anschließend in

eine Säule (Durchmesser 2,5 cm) gegossen. Nach dem Auswaschen ungebundener Proteine

mit 150 ml Dialysepuffer mit 0,5 ml/min wird das Troponin T-haltige Proteingemisch in

einem linearen Salzgradienten von 50 mM bis 525 mM NaCl bei einem Volumen von

insgesamt 300 ml eluiert.

Anschließend wird die NaCl-Konzentration linear auf 1 M NaCl in 100 ml erhöht. Die

Fraktionen (4 ml) werden mittels Bradford-Reagenz auf Proteingehalt ( 2.3.1) und mittels

SDS-PAGE ( 2.3.2) auf das zu reinigende Protein überprüft. Die hcTnT 185 - 291

enthaltenden Fraktionen werden gegen 3 x 1 l HA-Dialysepuffer 1 h bei 4 °C dialysiert und

eine weitere Chromatographie angeschlossen. Dazu wird Hydroxyapatit (Hydroxyapatit Bio-

Gel, HTP Gel, Bio-Rad Laboratories), das Säulenmaterial für die zweite chromatographische

Reinigung, durch 5 – 10-maligen Wechsel von Inkubation und Dekantation mit dem

HA-Dialysepuffer äquilibriert und in eine Säule (Durchmesser 2,5 cm, ca. 80 ml

Hydroxyapatit-Volumen) gegossen. Bevor die Proteinlösung auf das Hydroxyapatitmaterial

mit 0,5 ml/min aufgetragen wird, wird die Leitfähigkeit von Proteinlösung und

Hydroxyapatitsuspension überprüft und gegebenenfalls angepasst. Die Elution des Proteins

erfolgt in einem linearen Gradienten aus HA-Dialyse- und HA-Elutionspuffer von 1 mM bis

400 mM Kaliumphosphat in 150 ml Volumen mit 0,5 ml/min in 5 ml Fraktionen.

Proteinhaltige Fraktionen ( 2.3.1) werden mittels SDS-PAGE ( 2.3.2) auf Reinheit getestet.

Enthalten die vereinigten Proteinfraktionen mehr als 10 % Verunreinigungen, wird eine

Gelfiltration über Sephadex G75 ( 2.2.1) angeschlossen.


Lyse-Puffer: 25 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

20 % (w/v) Succrose 1 mM EDTA 0,3 mM PMSF 0,2 M NaCl 0,1 mM TPCK 0,1 mM TLCK

Aufnahmepuffer : 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 1 mM DTT

DE52-Dialysepuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 1 mM DTT 50 mM NaCl

HA-Dialysepuffer: 1 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 6,8 (4 °C)

100 mM KCl 2 mM DTT

HA-Elutionspuffer: 400 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 6,8 (4 °C)

100 mM KCl 2 mM DTT

2.2.3 Isolierung und Reinigung von rekombinantem hcTnI aus E. coli

Die Isolierung und Reinigung von rekombinantem Wildtyp hcTnI und hcTnI, in denen

Aminosäuren ausgetauscht worden sind (Aminosäureaustausch: hcTnI S4C/C79S; hcTnI

A27C/C79S, hcTnI C79S und hcTnI S22/23D), werden nach [Reiffert et al., 1999]

durchgeführt. Die säulenchromatographischen Reinigungsschritte erfolgen mit CM-Sepharose

„fast flow“ (Amersham-Bioscience) und mit einer cTnC-Affinitäts-Säule (30 ml

Säulenvolumen; 2.2.8) in Harnstoff-haltigem Puffer. Gereinigtes hcTnI kann nach Dialyse

gegen einen Harnstoff-freien Puffer ca. 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.

2.2.4 Isolierung und Reinigung von rekombinantem hcTnC aus E. coli

Die Reinigungen von rekombinantem Wildtyp hcTnC, von hcTnC C35/84S und des 15N/2H-markierten hcTnC C35/84S werden nach einer modifizierten Methode von [Babu et

al., 1992] bei 4 °C durchgeführt. Das Bakterienpellet aus einem 2 Liter Kulturansatz wird in

11 ml Lyse-Puffer aufgenommen und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 44 ml


Verdünnungspuffer und einer weiteren 20 minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen

mechanisch (Fench Press) aufgeschlossen. Das Bakterienlysat wird 15 min mit 39.500 x g bei

4 °C zentrifugiert. Nach Zugabe von CaCl2 zu einer Endkonzentration von 5 mM wird der

Überstand auf einen pH-Wert von 7,5 mit Tris eingestellt und 2 h bei 4 °C unter Rühren mit

50 ml äquilibriertem DE52 Material inkubiert. Das in eine Säule (Durchmesser 2,5 cm)

gegossene Säulenmaterial wird mit 300 ml DE52-Äquilibrierungspuffer gewaschen und das

gebundene Protein durch Zugabe von 0,6 M NaCl zum DE52-Äquilibrierungspuffer mit

0,5 ml/min eluiert. hcTnC-haltige Fraktionen werden vereinigt und gegen je 1 l Dialysepuffer

ohne NaCl und daraufhin 2 x gegen Dialysepuffer mit 50 mM NaCl jeweils 1 h dialysiert.

Phenylsepharose CL 4B (Amersham-Bioscience), äquilibriert in Dialysepuffer mit 50 mM

CaCl2, wird in eine Säule gegossen (100 ml, Säulendurchmesser 2,5 cm). Die dialysierte

Probe wird mit 0,5 ml/min auf das Säulenmaterial (100 ml, Phenylsepharose CL 4B

(Amersham-Bioscience) gepumpt. Das Säulenmaterial wird mit 300 ml Phenylsepharose-

Waschpuffer gewaschen und gebundenes Protein mit Phenylsepharose-Elutionspuffer eluiert.

Das gereinigte hcTnC (2.3.2) wird bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

Lyse-Puffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C) 0,2 mM PMSF 1 mM EDTA 20 % Succrose

Verdünnungspuffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

0,2 mM PMSF 1 mM EDTA 1 mM DTT

DE52-Äquilibrierungspuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 1 mM DTT 50 mM NaCl

Dialysepuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C) 5 mM CaCl2 1 mM MgCl2 1 mM DTT

Phenylsepharose-Waschpuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C) 2 mM CaCl2

1 mM DTT 1 M NaCl


Phenylsepharose-Elutionspuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

5 mM EDTA 1 mM DTT

2.2.5 Isolierung und Reinigung von Aktin, Myosin und Tropomyosin

Das Skelettmuskelaktin wird aus Skelettmuskel-Azeton-Trockenpulver des Kaninchens

[Teubner & Wegner, 1998] isoliert und von Prof. Dr. Wegner (Institut für Physiologische

Chemie, Ruhr-Universität Bochum) zur Verfügung gestellt. Aus dem Skelettmuskel von

Kaninchen isoliertes Myosin und Tropomyosin werden von Dr. Thieleczek (Institut für

Physiologische Chemie, Ruhr-Universität Bochum) zur Verfügung gestellt. Die Isolierung

von Tropomyosin erfolgt nach einer Methode von [Smillie, 1982]. Die Präparation des

Myosins erfolgt nach einer Methode von [Margossian & Lowey, 1982].

2.2.6 Isolierung von Proteinphosphatase 2A aus Rinderherz

Proteinphosphatase 2A (PP2A) wird nach einer Methode von [Mumby et al., 1987] aus

Rinderherz isoliert und mittels Gelfiltrationschromatographie über Sepharose CL-6B

(Amersham-Bioscience) und anschließender Ionenaustauschchromatographie mit EAH-

Säulenmaterial (Amersham-Bioscience) gereinigt.

2.2.7 Isolierung und Reinigung von Holotroponin aus Rinderherz

Der trimere Troponin-Komplex wird nach einer von [Beier et al., 1988] modifizierten

Methode von [Tsukui & Ebashi, 1973] aus dem Rinderherzen isoliert.

2.2.8 Kopplung von hcTnC an Sepharose-4B Säulenmaterial

Humanes Herztroponin C wird nach einer von [Ardelt et al., 1998] modifizierten Methode

von [Syska et al., 1974] an CNBr-aktivierte Sepharose-4B (Amersham-Bioscience)

gekoppelt.

2.2.9 Präparation des Myosin-S1-Fragments

Um katalytisch aktive Myosin-S1-Fragmente zu erhalten, wird natives Myosin durch die

Endopeptidase Papain, wie bei [Margossian & Lowey, 1982] beschrieben, gespalten. Durch

die Verwendung von Mg2+ bei der Präparation bleiben beide mit dem S1-Fragment


assoziierten leichten Ketten erhalten. Nach der Dialyse des Myosins (Konzentration

18 mg/ml, ca. 2 ml; 2.2.5) bei 4 °C gegen 2 x 1 l Dialysepuffer A wird die Proteinlösung bei

RT 7 - 8 min mit Papain (0,4 U/ml; Fluka) in Gegenwart von 5 mM Cystein und 2 mM

K2EDTA (pH-Wert 6,0) inkubiert und die Reaktion anschließend durch Zugabe von Iodacetat

(Endkonzentration 100 mM) gestoppt. Um Myosin-S1-Fragmente von unverdautem Myosin

zu trennen, wird der Ansatz 120 min bei 4 °C mit 85.000 x g zentrifugiert. Nach der Dialyse

des S1-Myosin enthaltenen Überstandes gegen 3 x 1 l Dialysepuffer B (16 h bei 4 °C) wird

die zweifache Menge der S1-Konzentration an Sucrose (w/w) zur Probe gegeben und bei

–80 °C bis zur Verwendung gelagert.

Dialysepuffer A: 0,2 mM Amoniumacetat, pH 7,2 (4 °C)

2 mM MgCl2 Dialysepuffer B: 20 mM KH2PO4 / K2HPO4, pH 6,5 (4 °C)

40 mM KCl 2 mM MgCl2 2 mM DTT

2.2.10 Polymerisation von G-Aktin

Monomeres Aktin (G-Aktin) wird durch zweistündige Inkubation bei 4 °C in Polymeri-

sations-Puffer zur filamentösen Form des Aktins (F-Aktin) polymerisiert.

Polymerisations-Puffer: 5 mM Tri-Ethanolamin, pH 7,5 (4 °C)

100 mM KCl 1 mM MgCl2 0,2 mM CaCl2 0,5 mM ATP

2.2.11 Rekonstitution des trimeren hcTn-Komplexes aus den rekombinanten

hcTn-Untereinheiten

Die drei einzeln isolierten und gereinigten Untereinheiten des Troponins werden in den

Rekonstitutionspuffer mit 6 M Harnstoff, welcher vorher mit dem Ionenaustauscher Serdolit

MB-3 (5 g/L Harnstoff; Serva) gereinigt worden ist, überführt und anschließend in

äquimolaren Mengen vereint. Dieser Rekonstitutionsansatz wird 2 h bei RT unter

vorsichtigem Rühren inkubiert, anschließend je 2 x 4 h gegen 2 l Dialysepuffer dialysiert,

welcher erst 4 M und dann 2 M Harnstoff enthält, um den Harnstoff stufenweise aus der

Proteinlösung zu entfernen. Anschließend wird je 4 h gegen Dialysepuffer ohne Harnstoff mit


je 2 l Volumen dialysiert, wobei die Konzentration an KCl von 1 M auf 0,3 M in Schritten

von 1 M, 0,7 M, 0,5 M und 0,3 M reduziert wird. Das Dialysat wird zur Reinigung der

rekonstituierten hcTn-Komplexe mittels Gelfiltrationschromatographie mit Sephadex G75

Material (ca. 280 ml, Säulendurchmesser 2,5 cm) von dimeren Komplexen und einzelnen

Untereinheiten getrennt ( 2.2.1). Bei der Verwendung von hcTn-Komplexen, welche mit

hcTnT 185 - 291 rekonstituiert werden, wird Sephadex G50 Material für die Gelfiltration

eingesetzt. Die gesammelten Fraktionen werden mit Hilfe der SDS-PAGE ( 2.3.2) auf Reinheit

und mit Hilfe von „Scanning densitometry“ (2.3.8) auf das molare Verhältnis von

cTnT : cTnI : cTnC = 1 : 1 : 1 im rekonstituierten Komplex überprüft. Nur solche Fraktionen

werden vereinigt, welche im äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegen.

Rekonstitutionspuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

5 mM CaCl2 7 mM DTT

0,5 M NaCl 6 M gereinigter Harnstoff Dialysepuffer: 10 mM MOPS, pH 7,0 (4 °C)

1,25 mM CaCl2 1,25 mM MgCl2 1,5 mM DTT

1 M KCl 4 M, 2M oder 0 M gereinigter Harnstoff

2.2.12 Rekonstitution dünner Filamente aus F-Aktin, Tm und Tn

Für die Bestimmung der AktoS1-ATPase-Aktivität ( 2.3.11) werden dünne Filamente aus

F-Aktin ( 2.2.10), phosphorylierten hcTn-Komplexen ( 2.2.15) [Reiffert et al., 1996] und

Tropomyosin ( 2.2.5) rekonstituiert. Nach der Dialyse der jeweiligen hcTn-Komplexe und des

Tropomyosins für 16 h bei 4 °C gegen 3 x 1 l Dialysepuffer werden filamentöses Aktin

(Endkonzentration 8 µM), Tropomyosin (Endkonzentration 2 µM) und hcTn

(Endkonzentration 2 µM) in einem molaren Verhältnis von 4 : 1 : 1 für mindestens 16 h bei

4 °C miteinander inkubiert. Die rekonstituierten dünnen Filamente werden bis zur weiteren

Verwendung maximal 3 Tage bei 4 °C gelagert.

Dialysepuffer: 20 mM HEPES, pH 7,5 (4 °C)

150 mM KCl 2 mM DTT


Rekonstitutionspuffer: 20 mM HEPES, pH 7,5 (4 °C)

70 mM KCl 5 mM MgCl2 0,5 mM EGTA 2 mM DTT

2.2.13 Auftrennung der Untereinheiten aus dem rekonstituierten trimeren

hcTn-Komplex

Die Auftrennung des rekonstituierten trimeren hcTn-Komplexes in seine Untereinheiten

erfolgt nach einer Methode von [Greaser & Gergely, 1971] über DEAE A25 Sephadex

Säulenmaterial in einem 6 M Harnstoff-haltigem Puffer.

2.2.14 Isolierung der hcTnI-Untereinheit aus dem hcTn-Komplex mittels HPLC

Die hcTnI-Untereinheit wird aus dem hcTn-Komplex durch „reversed-phase“ HPLC

[Swiderek et al., 1988] über eine HD-Gel-RP-7S-300 Säule (Länge 24 cm, Durchmesser

0,8 cm; Organogen) [Swiderek et al., 1988] in einem linearen Acetonitril-Gradienten isoliert.

hcTnI eluiert in ungefähr 58 – 61 % Puffer B.

Puffer A: 0,09 % (v/v) TFA in A. bidest Puffer B: 0,08 % (v/v) TFA und 84 % (v/v) Azetonitril in A. bidest

2.2.15 Phosphorylierung von hcTnI isoliert oder im Komplex mit der katalytischen

Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase

Rekombinantes Wildtyp hcTnI als auch andere verwendete hcTnI-Mutantenproteine werden

mit Hilfe der von Prof. F. Herberg freundlicherweise zur Verfügung gestellten rekombinanten

katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (Cα-PKA) [Herberg et al.,

1993] phosphoryliert. Hierzu wird das Protein gegen Phosphorylierungspuffer dialysiert und

anschließend werden 3 mM ATP (Endkonzentration) zugegeben. hcTnI in rekonstituierten

hcTn-Komplexen wird mit 120 mU Cα-PKA pro mg Troponin-Komplex und isoliertes hcTnI

mit 70 – 90 mU Cα-PKA pro mg hcTnI 2 h bei 30 °C im Wasserbad phosphoryliert. Nach der

Inkubation werden zur Inaktivierung der Cα-PKA die Phosphorylierungsansätze mit

hcTn-Komplexen bei -20 °C eingefroren und mit isoliertem hcTnI gegen einen MgCl2- und

ATP-freien Puffer dialysiert.


Phosphorylierungspuffer: 15 mM MOPS, pH 7,0 0,3 M KCl 5 mM MgCl2 1 mM DTT

2.2.16 Dephosphorylierung von hcTn-Komplexen mit an CNBr-Sepharose

gekoppelter Proteinphosphatase 2A (PP2A)

PP2A (1 mg/ml PP2A : 200 mg/ml cTn) wird bei 4 °C 3 x 1 h gegen je 1 l Kopplungspuffer

dialysiert und mit in 1 mM HCl gequollener und im Kopplungspuffer äquilibrierter

CNBr-Sepharose 16 h bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Nach Zentrifugation mit 1.500 x g

wird das PP2A-gekoppelte Säulenmaterial abwechselnd in insgesamt 7 Schritten mit

Kopplungspuffer und dem Dephosphorylierungspuffer gewaschen. Verbliebene freie

Bindungsstellen der Sepharose werden durch Inkubation mit Kopplungspuffer, dem 0,2 M

Glycin hinzugefügt worden ist, bei RT 2 h abgesättigt. Nach erneutem Waschen wird

schließlich die hcTn-Proteinlösung (ca. 1,5 mg/ml) in Dephosphorylierungspuffer mit 2 mM

MnCl2 hinzugefügt und mit der PP2A-Sepharose-Suspension 16 h bei 4 °C unter Rühren

inkubiert. Danach wird das Säulenmaterial durch Zentrifugation sedimentiert und mit 2 ml

Dephosphorylierungspuffer resuspendiert. Dieser Vorgang wird 3 x wiederholt. Die

Überstände, die dephosphoryliertes hcTn enthalten, werden vereinigt.

Kopplungspuffer: 0,1 M NaHCO3, pH 8,3 (4 °C) 0,5 M NaCl 1 mM CaCl2 Dephosphorylierungspuffer: 0,1 M Na-acetat, pH 4,0 (4 °C) 0,5 M NaCl

2.2.17 Dephosphorylierung von hcTnI in rekonstituierten dünnen Filamenten

Rekonstituierte dünne Filamente enthalten phosphoryliertes hcTnI ( 2.2.12). Um dünne

Filamente mit nicht phosphoryliertem hcTnI zu erhalten, werden die Filamente 19 h bei RT

unter leichtem Rühren mit PP2A und 2 mM MnCl2 in einem Verhältnis von 1 : 300 (w/w) der

PP2A zu hcTn [Reiffert et al., 1996] inkubiert. Zur Termination der

Dephosphorylierungsreaktion und zur Entfernung störenden Phosphats und MnCl2 werden die

Ansätze bei 4 °C gegen 3 x 1 l Rekonstitutionspuffer ( 2.2.12) dialysiert.


2.3 Analytische biochemische Methoden

2.3.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen

Proteinkonzentrationen werden nach [Lowry et al., 1951] in einem Technicon Autoanalyzer

(Technicon AII; Technicon Instruments) bei 20 °C bestimmt und die Extinktion bei 610 nm

gemessen. Als Standards wird Rinderserumalbumin (30, 60 und 90 µg/ml) verwendet.

Zur Identifizierung von proteinhaltigen Lösungen, zum Beispiel nach

säulenchromatographischen Trennungen, wird die Proteinbestimmung nach [Bradford, 1976]

durchgeführt.

Für die Bestimmung der Myosin-S1 Proteinkonzentration wird die optische Dichte bei

280 nm (A280) und 340 nm (A340) Wellenlänge bestimmt und die Proteinkonzentration nach

[Margossian & Lowey; 1982] mittels folgender Gleichung berechnet:

[S1] = (A280 − A340) × b x a280

-1 (Gleichung 1) Die Konzentration von Myosin-S1 [S1] wird in [mg/ml] angegeben. „b“ entspricht dem

Verdünnungsfaktor der Myosin-S1-Fragment-Lösung ( 2.2.9) und „a280“ dem Mg2+-S1-

Umrechnungsfaktor (0,83 ml/mg).

2.3.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese wird nach [Laemmli, 1970] mit

Hilfe des „Mini-Protean II“ Minigelsystems von Bio-Rad (100 x 80 x 4 mm; Bio-Rad Labo-

ratories) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die TCA gefällten Proteine werden in

Probenpuffer aufgenommen (10 % (w/v) Glycin, 5 % (v/v) β-2-Mercapto-ethanol, 2,3 %

(w/v) SDS, 0,002 % (w/v) Bromphenolblau (AppliChem, Deutschland), 0,0625 % (w/v)

Tris/HCl, pH 6,8 (RT) für 6-fache Stocklösung) und bei 100 °C für 5 – 10 min gekocht. Nach

der Elektrophorese werden die Gele ca. 20 min in Coomassie brilliant blue R (0,5 % (w/v)

Serva blue R (Serva), 45 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure) schüttelnd gefärbt und

anschließend mit 45 % (v/v) Methanol und 10 % (v/v) Essigsäure bis zur Entfärbung des

Hintergrundes inkubiert.


2.3.3 Nicht-denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Untersuchung der Homogenität von trimeren Holotroponin-Komplexen in Lösung erfolgt

mit Hilfe einer nicht-denaturierenden Gelelektrophorese nach einer modifizierten Methode

von [Ornstein, 1964; Davis, 1964]. Die diskontinuierlichen Acrylamid-Gele auf Tris/Glycin-

Basis werden im Wesentlichen nach Anleitung hergestellt. Allerdings werden schwächer

vernetzte Gele verwendet, um die Darstellung des 77,5 kDa großen Troponinkomplexes zu

verbessern. Anstelle von 12 % Acrylamid für das Trenngel werden 5 % Acrylamid und für

das Sammelgel werden 4 % Acrylamid verwendet. Für die Gelelektrophorese werden

Proteinlösungen, die Proteine in µg-Mengen enthalten, mit Probenpuffer (62,5 mM Tris/HCl,

pH 6,8, 10 % (v/v) Glycerin und 0,002 % (w/v) Bromphenolblau) versetzt, einige Minuten bei

RT inkubiert und auf das Gel aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgt für 5 – 6 h in

gekühltem Laufpuffer (30,3 g Tris und 144,0 g Glycin ad 1 l A. bidest, pH im Bereich von pH

8,3, nicht eingestellt) auf Eis bei konstanten 15 – 18 mA, 12 Watt und einer nicht limitierten

Spannung. Als Standard wird Rinder Catalase (MW: 240 kDa) und Rinder Serumalbumin

(MW: 67 kDa) aufgetragen, da beide ähnliche Laufeigenschaften wie der Troponinkomplex

besitzen. Zur weiteren Verwendung wird das Gel entweder geblottet ( 2.3.7) oder wie SDS-

Gele gefärbt und entfärbt ( 2.3.2).

2.3.4 Überprüfung der Ca2+-abhängigen Mobilität von Herztroponin C allein und

in cTn-Komplexen

Gelproben für denaturierende SDS-PAGE ( 2.3.2) als auch für nicht-denaturierende PAGE

( 2.3.3) werden entweder mit einem Überschuss an Calcium (Endkonzentration 200 µM) oder

EGTA und EDTA (Endkonzentration 4 mM) versetzt und ca. 30 min bei RT inkubiert.

Anschließend werden die Proben, wie unter 2.3.2 bzw. 2.3.3 beschrieben, weiter behandelt

bevor sie gelelektrophoretisch aufgetrennt werden.

2.3.5 Überprüfung des hcTnI-Phosphorylierungszustandes mittels isoelektrischer

Fokussierung

Die verschiedenen Phosphorylierungszustände (dephosphoryliert, monophosphoryliert und

bisphosphoryliert) des hcTnI weisen aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladungen spezifische

isoelektrische Punkte (pI) auf, welche durch isoelektrische Fokussierung (IEF) nach der

NEPHGE-Methode (Non Equilibrium pH Gradient Elektrophoresis) [O´Farrell et al., 1977]


nachgewiesen werden können. Nicht-komplexiertes hcTnI muss vor dem Auftrag auf das Gel

durch Dialyse gegen 2 mM Ammoniumbicarbonat salzfrei gemacht werden. Das Dialysat

wird in einer Vakuumzentrifuge (Zentrifuge RC 10.22 und Kühlfalle RCT 90 von Jouan,

Frankreich, RZ5 Drehschieber Vakuumpumpe von Vacuubrand) eingetrocknet. Liegt hcTnI

im Holotroponinkomplex vor, wird hcTnI durch „reversed phase“ HPLC ( 2.2.14) isoliert und

ebenfalls in einer Vakuumzentrifuge eingetrocknet. Das eingetrocknete hcTnI wird so in

Probenpuffer aufgenommen, dass eine Endkonzentration von 1,5 – 2,0 µg/ml eingestellt wird.

Bei 4 °C in einer feuchten Kammer gelagerte IEF-Gele (45 x 45 x 1,5 mm), hergestellt nach

nach Herstellerangaben SDA 17 V.8/89 (Phast-System, Amersham-Bioscience), werden 1 h

in 1 ml Rehydratationspuffer inkubiert und anschließend für die isoelektrische Fokussierung,

wie bei [Ardelt et al., 1998] beschrieben, verwendet. Als Marker dient der IEF-Marker 3 - 10,

Serva Liquid Mix (Serva) und als Standard zur Identifizierung der verschiedenen

Phosphoformen von Troponin I wird Rinderherztroponin I aufgetragen. Rinderherztroponin

wird aus dem Rinderherzen gereinigt ( 2.2.7) und die cTnI-Untereinheit isoliert ( 2.2.14).

Probenpuffer: 9 M ultrapurer Harnstoff 2 % Servalyte, pH 3 – 10 Rehydratationspuffer: 9 M ultrapurer Harnstoff 50 mM DTT 10 % Sorbitol 1,2 % Servalyte, pH 3 – 10 4,8 % Servalyte, pH 7 – 9 ad 1 ml A. bidest

2.3.6 Überprüfung des hcTnI-Phosphorylierungszustandes mittels ELISA

In Mikrotiterplatten (12 x 8 Kammern) werden Verdünnungsreihen der entsprechenden

Proteinlösungen erstellt. Ausgehend von 100 µl unverdünnter Proteinlösung (ca. 1 mg/ml)

wird diese mit TBS-Puffer (1,5 mM Tris, 150 mM KCl, pH 7,4) konsekutiv 1 : 2 verdünnt.

Alle nachfolgenden Schritte werden wie bei [Coligan et al., 2000] beschrieben durchgeführt.

Für die Detektion von phosphoryliertem hcTnI wird der monoklonale IgG Antikörper 1G11

(HyTest) verwendet. Dephosphoryliertes hcTnI kann mit dem monoklonalen IgG Antikörper

22B11 (HyTest) nachgewiesen werden. Beide Erstantikörper werden mit einer 1 : 10.000

Verdünnung in TBS-Puffer eingesetzt. Bei dem Zweitantikörper handelt es sich um einen

Peroxidase-gekoppelten Kaninchen-anti-Maus-IgG Antikörper (Sigma-Aldrich), der 1 : 2.000

verdünnt wird. Der Nachweis der Immunreaktionen erfolgt über eine Farbreaktion, welche

durch Inkubation mit 100 µl der Peroxidase-Substratlösung (120 µg/ml Endvolumen


Tetramethylbenzidin (Fluka), gelöst in 0,5 – 1 ml Ethanol, 100 µl H2O2, ad 25 ml 0,1 M Na-

Azetat, pH 5,0) induziert wird. Zum Stoppen der Reaktion werden nach 5 min 100 µl 1 M

H2SO4 in jede Kammer gegeben und die Absorption bei 450 nm Wellenlänge im

Mikrotiterplatten-Photometer EAT AT, 400 der Firma SLT-Labinstruments gemessen.

2.3.7 Western-Blot von Proteinen

Um eine Immunnachweisreaktion gelektrophoretisch aufgetrennter Proteine ( 2.3.2; 2.3.3)

durchzuführen, werden diese mit dem Bio-Rad Blotsystem nach Herstellerangaben in einem

Puffer aus 50 mM Tris/HCl, pH 8,2 - 8,8 mit 50 mM Borsäure auf eine PVDF-Membran

(Immobilon-P, Millipore) transferiert. Der Transfer erfolgt bei RT mit konstanten

0,06 Ampere bei Grenzwerten von 12 Watt und 200 Volt. Nach dem 2 stündigen Blotvorgang

erfolgt eine Überprüfung des Transfers, indem das SDS-Gel mit Coomassie Blau-Färbung

( 2.3.2) und die Membran mit Ponceau S (0.2 % (w/v) Ponceau S (Sigma), 1 % (v/v)

Essigsäure in A. bidest) angefärbt werden. Anschließend wird Ponceau S mit A. bidest wieder

ausgewaschen, da die Ponceau S-Färbung die Immunoreaktion stören würde. Einzelne

Bearbeitungsschritte, wie Sättigung freier Bindungsstellen mit Milchpulver in TBS (2.3.6)

und Waschschritte mit TBS-Puffer, werden wie bei einer Immunreaktion im ELISA

durchgeführt ( 2.3.6). Bei den Immunreaktionen werden spezifische Antikörper gegen die

einzelnen hcTn-Untereinheiten eingesetzt (Tabelle 1).

Tabelle 1: Antikörper gegen hcTn-Untereinheiten, welche im Westernblot eingesetzt werden

hcTn-UE AK Einsatz im Westernblot hcTnI Wildtyp und Mutantenproteine

Tn I III 1B8 (anti-cTnI) 3 ml mAK

hcTnI Wildtyp und Mutantenproteine

11G1 (anti-phospho cTnI) 22B11 (anti-dephospho cTnI)

1: 5.000

hcTnC Wildtyp und Mutantenproteine

Monoclonal mouse anti-hcTnC; Hytest, Fl; # 4T27; Clone 7B9

1:10.000

hcTnT Wildtyp Monoklonal anti-mouse anti-cTnT; Serum; HII88 C 12.1; A.

Dahm, AG Falkenberg

4 ml Serum

hcTnT Wildtyp Monoclonal mouse anti-troponin T; Hytest, Fl; # 4T19; Clone 7A9

1 : 10.000

Verdünnungen werden mit TBS-Puffer erstellt.

Als Zweitantikörper (10.000fach verdünnt) wird in allen Fällen ein polyklonaler anti-Maus

IgG („whole molecule“, developed in goat; A-3688; Sigma-Aldrich) mit gekoppelter alka-


lischer Phosphatase eingesetzt. Der Nachweis der Antigen-Antikörperbindungen erfolgt über

eine Farbreaktion 1 h bei 37 °C mit 90 µl MTT (45 mM MTT; Sigma-Aldrich), gelöst in 70 %

(v/v) DMF, 20 µl MgCl2 (1 M MgCl2) und 90 µl BCIP (45 mM BCIP; Sigma-Aldrich) in

20 ml TBS eingesetzt.

2.3.8 Quantitative Auswertung von Proteinbanden in Gelen

Digitale Aufnahmen von Gelen (SDS-; IEF-, nicht denaturierende-) werden mit einer

Olympus Digitalkamera in einem Biozym Geldokumentationssystem erstellt und die

Proteinbanden mit der Software „AlphaEaseFC Software“, Version 3.2.3 von AlphaInnotech

quantitativ ausgewertet. Rinderherz Tn-Standard ( 2.2.7) wird für die Überprüfung der

Rekonstitution von Troponin-Untereinheiten zum trimeren Komplex als auch für die

Mengenbestimmung verschiedener Phosphorylierungszustände von hcTnI als Referenz

verwendet.

Molekulargewichtsbestimmungen können mit Hilfe des Rf-Wertes (Laufstrecke des

Proteins : Gesamtlaufstrecke) durchgeführt werden, da ein linearer Zusammenhang zwischen

dem Rf-Wert und dem Logarithmus des Molekulargewichtes besteht. Anhand einer

Eichgeraden, erstellt aus Rf-Werten verschiedener Markerproteine auf demselben Gel gegen

ihr logarithmisch aufgetragenes Molekulargewicht, kann das apparente Molekulargewicht der

Proteine über ihre Rf-Werte in dem Gel bestimmt werden.

2.3.9 Elektrospray Ionisations (ESI) Massenspektrometrie

Die Massen der für die mehrdimensionalen NMR-Messungen markierten (15N bzw. 15N;2H)

hcTn-Komplexe werden entweder im „Medizinischen Proteom Center“ der RUB (Leitung:

Prof. Dr. H. E. Meyer) mit dem Triple Quadrupol Elektrospray-Ionisations

Massenspektrometer (ESI-MS, TSQ 700, Thermo Finnigan) oder von Prof. M. Geeves (Dept.

Of Biosciences, University of Kent, England) durch Kevin Howland (Biomolecular Science

Facility Manager, Department of Biosciences, University of Kent, England), ebenfalls per

ESI-MS, bestimmt.

2.3.10 Konzentrierung von proteinhaltigen Lösungen

Proteinhaltige Lösungen werden auf verschiedene Art und Weise konzentriert. NMR-Proben

werden entweder nach Dialyse gegen 2 mM Ammoniumbicarbonat in einer


Vakuumzentrifuge ( 2.3.5) eingetrocknet und im entsprechenden Puffer aufgenommen oder

mit Hilfe einer „Amicon-Zelle“, ausgestattet mit einer Filtermembran, die eine

Ausschlußgröße von 10 - 30 kDa aufweist (Filter der PM-Serie, Millipore), nach

Herstellerangaben eingeengt. Eine weitere Methode zur Konzentrierung proteinhaltiger

Lösungen ist die Zentrifugation der Proteinlösung in Mikrokonzentratoren der Firmen

Amicon (CentriconTM Mikrokonzentrator) bzw. Millipore (Amicon Ultra, Centrifugal Filter

Devices), wobei je nach Protein ein entsprechendes Auschlußvolumen der Membranfilter

gewählt wird. Der Durchlauf wird standardmäßig auf seine Proteinkonzentration hin überprüft

( 2.3.1).

2.3.11 Aktivitätsbestimmung der Aktomyosin-S1-ATPase

2.3.11.1 Prinzip

Das Prinzip dieser Untersuchung basiert auf der Aktivierung der Myosin S1-ATPase und ihrer

Wechselwirkung mit dem dünnen Filament. Diese Interaktion ist in Gegenwart von

Tropomyosin und Troponin abhänig von der Calcium-Konzentration. Die dünnen Filamente

werden mit verschiedenen Troponinkomplexen, in denen entweder hcTnI C79S, S4C/C79S,

A27C/C79S oder das Wildtyp-TnI-Protein vorliegt, rekonstituiert. Die Aktomyosin-S1-

ATPase-Aktivität wird mit diesen Filamenten jeweils mit dephosphorylierten und

phosphorylierten (PSer22 und PSer23 des cTnI) Troponinkomplexen bei pCa Werten von 9,8

bis 4,8 (pCa 9,8; pCa 6,5; pCa 6,3; pCa 6,0; pCa 5,5 und pCa 4,8) gemessen. Als Kontrolle

dienen Messungen unter Verwendung von jeweils Myosin-S1 in A. bidest oder Puffer ohne

Zusatz der dünnen Filamente, sowie Messungen mit F-Aktin ohne Regulatorproteine. Das von

der Myosin-S1-ATPase freigesetzte Phosphat wird in einem gekoppelten Enzymassay nach

[Webb; 1992] bestimmt. Das anorganische Phosphat wird zur phosphorolytischen Spaltung

des Substrates 2-Amino-6-Mercapto-7-Methylpurin Ribosid (MESG) zu Ribose-1-phosphat

und 2-Amino-6-mercapto-7-methylpurin durch das Enzym Purinnukleosidphosphorylase

(PNP) verwendet. Dieser Ca2+-unabhängige Effekt [Deng et al., 2002] führt zu einer

Verschiebung des Absorptionsmaximums von 330 nm für das Substrat zu einem

Absorptionsmaximum von 360 nm für die entstandene Produkt [Webb, 1992]. Zur

Bestimmung des anorganischen Phosphats wird der EnzCheck Phosphate Assay Kit (E6647)

von Molecular Probes Inc. und PNP (Sigma) verwendet.


2.3.11.2 Durchführung

Die Konzentration an freiem Calcium in den Lösungen wird durch spezielle

Mischungsverhältnisse (Tabelle 2) einer Ca2+EGTA- (pCa 4,8) und einer EGTA-haltigen

(pCa 9,8) Lösung (20 x Reaktionspuffer) nach [Moisescu & Thieleczek, 1978] eingestellt. Bei

den Reaktionspuffern nach [Moisescu & Thieleczek, 1978] werden die totalen Mg2+- und

Ca2+-Konzentrationen mit Hilfe der apparenten Bindungskonstanten für ATP und EGTA aus

[Fabiato & Fabiato, 1979] (Tabelle 3) berechnet.

Tabelle 2: Mischungsverhältnisse der Basis-Reaktionspuffer mit pCa 4,8 und 9,8 für definierte

pCa-Werte

pCa 20 x Reaktionspuffer mit pCa 4,8 20 x Reaktionspuffer mit pCa 9,8 9,8 0,00 % 100,00 % 6,5 86,19 % 13,81 % 6,3 90,79 % 9,21 % 6,0 95,12 % 4,88 % 5,5 98,40 % 1,60 % 4,8 100,00 % 0,00 %

Es erfolgt eine Nachtitration des pH Wertes gemischter Puffer auf pH 7,5. Tabelle 3: Bindungskonstanten verschiedener Kationen für EGTA und ATP

EGTA ATP Ca2+ 2,429 x 107 7,12 x 103 Mg2+ 110 1,40 x 104 K+ 0 6 Na+ 0 7,5

(bei 20°C und pH 7,5)

20 x Reaktionspuffer pCa 4,8: 200 mM HEPES 40 mM Na-ATP 100 mM (H4)EGTA

100 mM CaCO3 28,624 mM MgCl2 5,13 mM CaCl2

20 x Reaktionspuffer pCa 9,8: 200 mM HEPES 40 mM Na-ATP 100 mM (H4)EGTA

47,68 mM MgCl2

Die beiden Basis-Reaktionspuffer mit der entsprechend höchsten (pCa 4,8) und niedrigsten

(pCa 9,8) Calcium-Konzentration werden bei RT mit KOH auf einen pH-Wert von 7,5


eingestellt. Durch das äquimolare Mischen von H4EGTA und CaCO3 entsteht CaEGTA. Um

das zusätzliche EGTA aus dem Rekonstitutionspuffer der dünnen Filamente ( 2.2.12) zu

binden, welche die Hälfte des Reaktionsansatzvolumens ausmachen, muss zur Erreichung des

pCa 4,8 Calcium zugegeben werden (s. 20 x Reaktionspuffer). Auch wird die Menge an

MgCl2 aus dem Rekonstitutionspuffer ( 2.2.12) bei der Einstellung von freiem Magnesium auf

2 mM im Reaktionsansatz berücksichtigt.

Die Reaktionsansätze werden mit A. bidest auf 200 µl aufgefüllt, inklusiv des Myosin-S1

(Endkonzentration 0,5 µM), welches zum Starten der Reaktion verwendet wird. Myosin-S1

wird vor dem Einsatz 3 x 4 h gegen je 1 l S1-Dialysepuffer dialysiert.

Die Absorption der Reaktionsansätze ohne Myosin-S1 wird in einer Quartz-Küvette

(105.200-QS, Hellma) mit einem Uvikon 933-Spektrophotometer (Kontron Instruments) bei

360 nm für ca. 30 s gemessen. Ändert sich die Absorption nicht mehr, wird die ATPase-

Reaktion durch Zugabe von Myosin-S1 gestartet und die Absorptionsänderung 3 min verfolgt.

Die übrigen Kontrollmessungen ( 2.3.11.1) werden bei pCa 9,8 durchgeführt.

S1-Dialysepuffer: 20 mM MOPS, pH 7,0 (4 °C) 40 mM KCl 2 mM MgCl2 2 mM DTT Reaktionsansatz für Aktomyosin-S1-ATPase-Aktivitätsmessung:

40 µl MESG (40 pmol) (Molecular Probes) 10 µl entsprechender 20 x Reaktionspuffer

(pCa 9,8; 6,5; 6,3; 6,0; 5,5 oder 4,8) 1 µl 1 M DTT 100 µl der dünnen Filamente (8 µM polymerisiertes G-Aktin) 25 µl 100 U/ml PNP (Sigma-Aldrich)

+ 0,5 µM Mg-Myosin-S1 (ad 200 µl A. bidest)

2.3.11.3 Analyse der Messdaten

Die Aktomyosin-S1-ATPase-Aktivität wird aus der Steigung des gemessenen

Absorptionsanstiegs bestimmt. Die Umsatzrate von 0,0103 Absorptionseinheiten pro µM Pγ

wurde vorher mit Hilfe von KH2PO4-Standardlösungen (Molecular Probes, EnzCheck

Phosphate Assay Kit) nach Herstellerangaben bestimmt.

Die als Grundaktivität ermittelte Myosin-S1-ATPase-Aktivität, bei deren Bestimmung

A. bidest anstelle des dünnen Filamentes eingesetzt wurde, wird von den berechneten Werten

subtrahiert. Die Aktomyosin-S1-ATPase-Aktvität von rekonstituierten dünnen Filamenten


wird auf diejenige von unregulierten Aktinfilamenten, welche mit identischen Bedingungen

untersucht werden, normalisiert. Nach Bildung von Mittelwert und Standardabweichung der

normalisierten ATPase-Aktivität wird die maximale durch rekonstituierte, regulierte dünne

Filamente aktivierte Aktomyosin-S1-ATPase-Aktivität mithilfe der Hill-Gleichung berechnet.

y ( pCa ) = a + b / ( 1 + 10 n x ( pCa –pCa50 ) ) (Gleichung 2 (Hill-Gleichung))

„a“ beschreibt die normalisierte mittlere Aktomyosin-S1-ATPase-Aktivität bei pCa >> pCa50

und „b“ die Amplitude der Ca2+-abhängigen Aktomyosin-S1-ATPase-Aktivität, „n“ den Hill-

Koeffizienten und „pCa50“ den pCa bei halbmaximaler Ca2+-abhängiger Aktivierung.

Durch Festlegung der bei pCa 4,8 berechneten Werte als 1 und der bei pCa 9,8 als 0 und einer

prozentualen Angleichung der anderen pCa Werte werden relative Aktomyosin-S1-ATPase-

Aktivitäten erhalten, welche die Grundlage bilden, den pCa-Wert, bei dem die Filamente mit

halbmaximaler Aktivierung vorliegen (pCa50) und die Steilheit des Aktivierungspozesses (n)

mit folgender Gleichung zu berechnen:

y ( pCa ) = 1 / ( 1 + 10 n x ( pCa – pCa50 ) ) (Gleichung 3) Die Mittelwerte werden soweit nicht anderweitig vermerkt als ± SEM angegeben. Die

Kurvenanpassungen werden mit dem Programm Sigma Plot 2001 (SPSS Inc., USA)

durchgeführt. Zur Bestimmung von Signifikanzen wird der ungepaarte Student´s t-Test mit

dem Progamm GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software, Inc., USA) durchgeführt. Eine

Signifikanz liegt bei p < 0,05 vor.

2.3.12 Bestimmung der Cysteinreaktivität

Da die 19F-PFP-Sonde, mit der Troponin für 19F-NMR-spektroskopische Untersuchungen

markiert wird, kovalent an die Sulfhydrylgruppen von Cysteinen bindet, wurde getestet, ob

die Cysteinreste frei zugänglich sind. Die zu untersuchenden Proteine werden mit DTNB

(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), Ellman's reagent) (Sigma-Aldrich, Prod.No.: D8130),

welches mit den reduzierten Sulfhydrylgruppen des Cysteins unter Freisetzung von 5-thio-2-

nitrobenzoic acid (TNB) reagiert (Abbildung 5), inkubiert. Die Freisetzung von TNB wird

bei RT über eine Absorptionsänderung bei 412 nm im Photometer Lambda Bio UV/VIS

Spektrophotometer (Perkin Elmer) 30 min verfolgt und korreliert mit der Menge an

reduzierten Sulfhydrylgruppen im Protein.


Da DTT in höheren Konzentrationen stört, werden die Proteinkomplexe vor Messung gegen

3 x 1 l DTT-freien Puffer (10 mM MOPS, pH 7,0; 0,7 M KCl; 1,5 mM CaCl2; 1,5 mM

MgCl2) je 1 h dialysiert. Der Leerwert, erhalten mit dem Reaktionsansatz ohne Protein, wird

von den mit Protein erhaltenen Ergebnissen subtrahiert. Da die Messergebnisse abhängig sind

von der eingesetzten Proteinmenge, wird die Proteinkonzentration vorher genau bestimmt

( 2.3.1). Alle Reaktionsansätze enthalten 1 mM DTNB und Proteine in verschiedenen

Konzentrationen zwischen 3 und 10 nM. Die Ergebnisse der Absorptionsmessungen werden

mit Hilfe der Software „GraphPad Prism 3.0“ (GraphPad Software, Inc.) als nicht-lineare

Regression angepasste Kurven dargestellt.

Abbildung 5: Reaktionsschema des DTNB mit Sulfhydrylgruppen

2.3.13 Dynamische Lichtstreuung

2.3.13.1 Prinzip

Die dynamische Lichtstreuung (DLS; „dynamic light scattering“) wird zur

Partikelgrößenbestimmung verwendet, wobei die zeitlichen Fluktuationen der

Streulichtintensität detektiert werden. Die Streulichtintensitätsfluktuationen sind abhängig

von den zeitlichen Fluktuationen der Anzahldichte der Streuteilchen im Streuvolumen und

somit vom Diffusionskoeffizienten. Die Verteilung der Diffusionskoeffizienten wird

bestimmt und die hydrodynamischen Radien der diffundierenden Teilchen mit Hilfe der

Stokes-Einstein-Beziehung errechnet.

S S ON 2

- OC 2

NO2

C -O2

S-

NO2

CO 2 -

R S S NO2

CO 2 -

RS -

+ +

DTNB TNB


Somit eignet sich die DLS zur Bestimmung der Homogenität von Proteinlösungen, da sie es

erlaubt, eine Verteilung von Proteinmonomeren oder Aggregaten über die gemessenen

Diffusionskoeffizienten aus den hydrodynamischen Radien zu bestimmen.


Nach 10 minütiger Zentrifugation mit 16.000 x g, um Staubpartikel zu sedimentieren und

abzutrennen, werden die verschiedenen Troponin-Proben in 18 µl Probenvolumen in einer

Quarzküvette der Firma Protein Solutions Inc. (Cat.No. 003030A) mit dem Gerät „DynaPro“

der Firma Protein Solutions Inc. (mit „Temperature Controlled Micro Sampler“) bei 4 °C

nach Herstellerangaben untersucht. Die Darstellung der Messungen und die Berechnung des

Molekulargewichts aus dem hydrodynamischen Radius erfolgt mit der Software „Dynamics“

(Version 5.25.44; DynaPro Dynamic Light Scattering Instrument Control Software, Firma

Protein Solutions Inc.).

2.3.14 Circulardichroismus-Spektroskopie

2.3.14.1 Prinzip

Die Circulardichroismus (CD) Spektroskopie ist eine der empfindlichsten (niederauflösenden)

Methoden, Sekundärstrukturen von Proteinen und Nukleinsäuren zu bestimmen. Es wird die

Absorptionsdifferenz von rechts-/links zirkular polarisiertem Licht gemessen. Voraussetzung

ist das Vorhandensein von Chiralität, also der Asymmetrie in der Elektronenverteilung durch

die Struktur oder räumliche Anordnung des Moleküls, wie es zum Beispiel für Peptide oder

Proteine zutrifft. Diese optisch aktiven Moleküle weisen unterschiedliche

Extinktionskoeffizienten für links- bzw. rechts-polarisiertes Licht auf. Als Referenzen dienen

die Spektren verschiedener Sekundärstrukturen (α-Helix, β-Faltblatt, Zufallsknäuel) in

Proteinen, gemessen in einem Wellenlängenbereich von 170 – 250 nm. Die Kombination von

Sekundärstrukturelementen in Proteinen ergibt Spektren, die sich aus den einzelnen für die

jeweilige Sekundärstruktur typischen Absorptionsmustern zusammensetzen. Unter

Zuhilfenahme der Referenzspektren können mittels intensiver mathematischer Verfahren

prozentuale Anteile der im Protein vorkommenden Sekundärstrukturelemente abgeschätzt

werden. Daher ist die CD-Spektroskopie eine schnelle Methode, um Änderungen im Rückgrat

von Proteinen, zum Beispiel durch Aminosäureaustausch, zu detektieren.



CD-Spektren von isoliertem hcTnC C35/84S (unmarkiert und 15N;2H-markiert) oder

rekonstituiert zu verschiedenen trimeren Troponin-Komplexen und von hcTn (TnI-WT, Tn-

WT, TnC-WT) werden im Wesentlichen wie bei [Reiffert et al., 1999] beschrieben in

Abhängigkeit vom Calciumbindungszustand des hcTnC mit einem Jasco 710

Spektropolarimeter (Jasco; Software: spectra managment 1.51.00) von 190 – 240 nm bei einer

Auflösung von 1 nm und einer Scangeschwindigkeit von 50 nm / min mit je

10 Akkumulationen bei RT aufgenommen.

Die Proteinlösungen werden 5 x gegen je 1 l CD-Puffer (50 mM K-Phosphat, pH 7,4 (22 °C);

20 mM KCl; 0,2 mM DTT) 45 min dialysiert, filtriert, um Staubpartikel zu entfernen und die

Proteinkonzentrationen (Doppelbestimmung) nach [Lowry et al., 1951] ermittelt ( 2.3.1).

Zu den Proteinlösungen wird 100 µM Calcium oder 2 mM EDTA hinzugegeben. Um Unge-

nauigkeiten der Messungen durch Absorption von Puffersubstanzen (z.B. DTT) zu vermei-

den, wird nach Eichung des Spektrometers mit Camphersulfonsäure, welche ein Absorp-

tionsmaximum bei 291 nm zeigt, der CD-Puffer alleine gemessen und die erhaltenen Werte

von den Ergebnissen für Proteinlösungen subtrahiert.

Die aufgenommenen Daten (Elliptizität (θ) in [mdeg]) werden mit Hilfe folgender Gleichung

umgerechnet:

θMRW = ( θ x MRW x 100 ) / (c x d ) [deg x cm2 x dmol-1] (Gleichung 4) „θ“ beschreibt die gemessene Elliptizität [degree]; „MRW“ („mean residue weight“) das

Molekulargewicht des Proteins [Da] dividiert durch die Aminosäureanzahl [n], „c“ die Kon-

zentration der Proteine [mg/ml] und „d“ die Schichtdicke der Küvette [cm]. θMRW wird gegen

die Wellenlänge aufgetragen und die so erhaltenen Spektren werden mit Hilfe der Software

GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software, Inc.) geglättet, wobei jeweils 9 Messpunkte gemit-

telt werden.

Anteile verschiedener Sekundärstrukturelemente im Protein werden mit Hilfe des im Internet

verfügbaren Programms „SOMCD“, welches Elliptizitäten in der Einheit [l mol-1 cm-1] be-

nötigt, in einem Wellenlängenbereich zwischen 200 - 240 nm bestimmt [Unneberg et al.,

2001] (http://geneura.ugr.es/cgi-bin/somcd/som.cgi?start=1). θMRW wird durch den Faktor

3.298 dividiert, welcher durch die Umrechnung der molaren Elliptizität (θMRW) in molare

„circular dichroismus“-Einheiten (∆ε) durch [θ] = 3.298 ∆ε gegeben ist. Nach [Unneberg et


al., 2001] ist die berechnete Verteilung der verschiedenen Sekundärstrukturelemente

(α-Helix, β-Faltblatt, Zufallsknäuel) dann verlässlich, wenn die relative Distanz zwischen

Originaldaten und Kurvenanpassung <0,25 ist.

2.3.15 Magnetische Kernresonanz-Spektroskopie

Bei der magnetische Kernresonanz-Spektroskopie (NMR; „nuclear magnetic resonance“)

setzt man eine Probe einem äußeren starken Magnetfeld aus und misst die Energie in Abhän-

gigkeit zu der Frequenz eines angelegten magnetischen Wechselfeldes, welche von den Ker-

nen absorbiert wird. Die größte Absorption liegt bei der jeweiligen Resonanzfrequenz vor.

Alle Resonanzfrequenzen werden durch einen Puls gleichzeitig angeregt. Das Emissionssig-

nal wird mit Hilfe der Fourier-Transformation umgewandelt. So werden die üblichen Spekt-

ren erhalten. Es können nur solche Kerne untersucht werden, welche in ihrem Grundzustand

einen von Null verschiedenen Kernspin, mit dem ein magnetisches Moment µ verbunden ist,

besitzen. Zwei Drittel der natürlichen Isotope sind magnetresonanzfähig, sodass in Proteinen 1H, 13C, 15N und 31P Isotope untersucht werden können.

Aus den NMR-Experimenten erhält man zum Beispiel Informationen über die chemische

Umgebung der Kerne, welche durch die chemische Verschiebung (angegeben in „ppm“) be-

schrieben wird. Aussagen über chemische Bindungen im Molekül und ihrer Eigenschaften

können über die J-Kopplung (in Hz) gemacht werden.

Die Kernspins werden auch durch das Magnetfeld anderer Kerne beeinflusst, sodass man über

den Parameter der Dipol-Kopplung (in kHz) (Nuclear Overhauser Effekt) Informationen über

die Entfernung zu anderen Kernen, über den Winkel zum Magnetfeld und über eine Bewe-

gung des Kerns selber erhält. So lassen sich die Geometrie aber auch Bewegungsprozesse von

Molekülen bestimmen.

2.3.15.1 Eindimensionale NMR-Spektroskopie

2.3.15.1.1 31P- und 19F-NMR Spektroskopie

Für die Untersuchung von Phosphoproteinen bietet sich die 31P-NMR-Spektrosopie an, wo-

durch Änderungen in der chemischen Umgebung von Phosphorkernen detektiert und somit

Aussagen über die chemische Umgebung von Phosphoaminosäuren getroffen werden können.

Die Proben wurden wie unter ( 2.3.15.1.3) beschrieben vorbereitet.

Durch Einbringung spezieller Sonden in Proteine, welche die Aufnahme von NMR-Spektren

erlauben, kann die Limitierung der Beobachtung natürlich vorkommender Isotope umgangen


werden. Die hier verwendete 19F-PFP-Sonde ( 2.3.15.1.2) wird kovalent über Sulfhydrylgrup-

pen der Aminosäure Cystein an das Protein gekoppelt, um Aussagen über die chemische Um-

gebung der Cysteine im Protein und Rückschüsse auf die Strukturen in diesem Bereich zu er-

möglichen.

2.3.15.1.2 Durchführung

Markierung von hcTnI Wildtyp und den Cystein-Proteinmutanten mit der 19F-PFP-Sonde Nach einer modifizierten Methode von [Kalbitzer et al., 1992] wird diese von Prof. Kalbitzer

zur Verfügung gestellte 19F-PFP (4-Perfluortert-butyl-phenyliodacetamid)-Sonde über

Sulfhydrylgruppen an Cysteine in der hcTnI-Untereinheit des Troponin-Komplexes kovalent

gebunden. Die verwendeten verschiedenen Troponin-Komplexe enthalten nur Cysteinreste im

hcTnI an verschiedenen Positionen. Folgende hcTnI-Proteinmutanten wurden verwendet:

hcTnI C79S (Cystein an Position 96), hcTnI S4C/C79S (Cysteine an Positionen 4 und 96) und

hcTnI A27C/C79S (Cysteine an Positionen 27 und 96). Die Cysteine in hcTnC in Position 35

und 84 sind durch Serinreste ersetzt worden (hcTnC C35/84S). hcTnT besitzt keine

Cysteinreste. Alle hcTn-Komplexe werden 3 x 1 h bei 4 °C gegen 1 l Dialysepuffer dialysiert

und nach Zugabe von 20 mM PFP, welches in einem Minimalvolumen von DMF gelöst und

vorsichtig unter ständigem Rühren in einem 7-fachen molaren Überschuß pro SH-Gruppe

hinzugegeben wird, 1,5 h abgedunkelt bei RT inkubiert. Anschließend wird der Ansatz 24 h

bei 4 °C inkubiert. 19F-markiertes Holotroponin kann bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C

gelagert werden.

Dialysepuffer: 10 mM Tris/HCl, pH 7,5 (4 °C)

200 mM KCl 0.3 mM EDTA 0,5 mM DTT

Probenbereitung Nach Markierung der gewünschten Proteine mit der Sonde wird das Protein 4 x gegen 1 l

NMR-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,3, 0,2 M KCl und 0,5 mM DTT) dialysiert und

anschließend in Amicon-Zellen konzentriert ( 2.3.10). Der Proteinlösung wird 10 % D2O

(Deutero GmbH) als Frequenzlock zugesetzt; der pH-Wert wird nicht D2O korrigiert. Die 19F-

NMR-Messungen werden in einem 5 mm Probenröhrchen an einem 500 MHz Spektrometer

(Bruker) am Lehrstuhl von Herrn Prof. Dr. H.-R. Kalbitzer (Institut für Biophysik und

physikalische Biochemie; Universität Regensburg) durchgeführt.


2.3.15.1.3 Überprüfung des Phosphorylierungszustandes von hcTnI mittels 31P-NMR

Für die Aufnahme von 31P-NMR-Spektren wird, wie bei [Jaquet et al., 1993] beschrieben,

phosphoryliertes Protein auf ca. 15 – 20 mg/ml ankonzentriert ( 2.3.10). Die phosphorylierten

Proteinkomplexe in 700 µl NMR-Puffer (144 nMol Protein in 20 mM Tris/HCl, pH 7,3;

0,2 M KCl; 0,5 mM DTT und 10 % D2O) werden bei 283 K mit ca. 9.000 aufaddierten

Einzelmessungen untersucht. Als interner Standard, auf den die Spektren referenziert werden

können, wird anorganisches Phosphat zur Probe hinzugefügt. Die 31P-NMR-Messungen

erfolgen in einem 5 mm Probenröhrchen an einem 600 MHz NMR-Spektrometer (Bruker)

bzw. an einem 500 MHz NMR-Spektrometer (Bruker).

2.3.15.2 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie

2.3.15.2.1 Prinzip

Eindimensionale NMR-Experimente zeigen eine zunehmende Resonanzüberlagerung bei

größeren Molekülen und eine Korrelation einzelner Signale aufgrund räumlicher Nähe,

welche auf die skalare Kopplung (J-Kopplung) oder den chemischen Austausch

zurückzuführen sind. Erzeugt man eine zweite Dimension im NMR-Experiment, so lässt sich

das Problem der Resonanzüberlagerung hinauszögern. Es liegt ein Gewinn an Auflösung mit

jeder weiteren Dimension vor. Dies ermöglicht, die Struktur von Proteinen bis zu einem

Molekulargewicht von ca. 40 kDa aufzuklären. Die Vielzahl der Signale kann in einem

mehrdimensionalen NMR Experiment über verschiedene Mechanismen korreliert werden,

wobei Magnetisierung von einem Kern A zu einem Kern B transferiert wird.

Mehrdimensionale NMR Experimente unterscheiden sich in der Abfolge von Pulsen und

Verzögerungen („Delays“), wobei aber der Aufbau aus 1) Vorbereitung, 2) Entwicklung

(Evolutionszeit, t1), 3) Mischung und 4) Detektion (t2) charakteristisch ist. Ein

zweidimensionales NMR Experiment kann als eine Aneinanderreihung von mehreren

eindimensionalen Experimenten mit unterschiedlich langen Evolutionszeiten t1, wobei t1

schrittweise erhöht wird, interpretiert werden. Nach sukzessiver Fourier-Transformation

erhält man ein aus zwei Frequenzdimensionen bestehendes Spektrum.


2.3.15.2.2 15N- und 15N,2H-NMR-spektroskopische Untersuchung

Es werden hohe Anforderungen (Reinheit, Homogenität, Markierung) an die Probenbereitung

gestellt. Die Proteine werden gegen je 1 l NMR-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5; 150 mM

KCl; 0,5 mM DTT) 5 x je 1 h dialysiert und in der Amicon-Zelle ( 2.3.10) konzentriert, bis

eine Konzentration von ca. 200 µM erreicht ist. Die Proben werden bis zur Messung

bei -20 °C gelagert. Vor der NMR-Messung wird nochmals der pH-Wert der Probe bestimmt

und der Probe 5 – 10 % D2O (Frequenzlock) und 100 µM DSS (interner Protonen-Standard)

und 1 % eines Proteinaseinhibitorgemisches (100 mM NaN3, 100 µM Leupeptin, 100 µM

Pepstatin, 10 µM BPTI) zugegeben. Die mehrdimensionalen NMR-Messungen werden,

soweit nicht anders angegeben, in einem 5 mm Probenröhrchen an einem Bruker DRX

600 Spektrometer mit 600 MHz Protonenresonanzfrequenz und 60,81 MHz

Stickstoffresonanzfrequenz am Lehrstuhl von Herrn Prof. Dr. H.-R. Kalbitzer (Institut für

Biophysik und physikalische Biochemie; Universität Regensburg) bei konstanten 296 K und

konstantem Druck durchgeführt. 1D-1H-Spektren und 1H-15N-TROSY Spektren werden

aufgenommen.

TROSY Spektren nach [Pervushin et al., 1997] haben eine digitale Auflösung von 2048 x 256

Punkten und eine Frequenzweite von 8389 x 2433 Hz. Alle Spektren wurden mit Hilfe des

XWINNMR-Pakets von Bruker aufgenommen und prozessiert; die Software „AUREMOL“

(http://www.auremol.de) wurde für die Darstellung und Analyse der Spektren verwendet. Die

chemische Verschiebung der 15N-Resonanzen wurde indirekt auf DSS nach [Wishart et al.,

1995] referenziert.

3. Ergebnisse 46

3 Ergebnisse

3.1 Molekulare Effekte der Herztroponin I Phosphorylierung, untersucht mit

Hilfe der 19F-NMR-Spektroskopie

Um zu untersuchen, wie die Phosphorylierung der beiden benachbarten Serinreste (Ser22 und

Ser23) im flexiblen N-terminalen Arm des hcTnI eine Reduktion der Calciumaffinität im

hcTnC bewirkt, sollten Konformationsänderungen im Proteinkomplex und Positions- und

Interaktionsänderungen des N-terminalen Arms des hcTnI mittels magnetischer

Kernresonanzspektroskopie mit 19F-Kernen untersucht werden. Die verwendete Fluorsonde

wurde kovalent an Cysteinreste gebunden.

Daher wurde im N-terminalen Arm des cTnI an Position 4 ein Cystein anstelle von Serin oder

an Position 27 ein Cystein anstelle eines Alanins eingeführt (Abbildung 6).

Abbildung 6: Rückgrat-Struktur von cTnI 31 – 210

Die Aminosäuresequenz des flexiblen N-terminalen Armes des Herztroponins wurde hinzugefügt. Die für die Fluor-Markierung wichtigen Aminosäurereste wurden rot hervorgehoben. Dies sind Serin 4 und Alanin 27 im N-terminalen Arm, welche gegen Cysteine ausgetauscht wurden und Cystein 79, welches gegen Serin ausgetauscht wurde und Cystein 96. Die beiden benachbarten, durch die Proteinkinase A phosphorylierbaren Serinreste 22 und 23 im N-terminalen Arm sind grün hervorgehoben. Wichtige Interaktionsregionen wurden gekennzeichnet, Helices wurden von H1 bis H4 durchnummeriert. Die inhibitorische Domäne des cTnI wurde durch eine violette Verbindung der Helix 2 mit Helix 3 gekennzeichnet. In der Kristallstruktur konnte dieser Bereich nicht aufgelöst werden. (Aus [Takeda et al., 2003] entnommen und modifiziert.)

3. Ergebnisse 47

Von den beiden nativ im hcTnI vorhandenen Cysteinen wurde das Cystein an Position 79

gegen ein Serin ausgetauscht, um die Anzahl der markierten Stellen für eine leichtere

Signalzuordnung zu minimieren. Das Cystein an Position 96 wurde zur Charakterisierung des

Kernbereichs von hcTnI belassen. So konnten Proteinmutanten erstellt werden, welche ein

einziges Cystein an Position 96 oder zwei Cysteine beinhalteten, nämlich eins an Position 96

im Kernbereich von hcTnI und eins entweder am N- oder C-Terminus des flexiblen N-

terminalen Arms von hcTnI (Abbildung 6).

3.1.1 Expression und Reinigung von Wildtyp-Proteinen und den entsprechenden

hcTnI- und hcTnC-Cystein Proteinmutanten

Die Sequenzen aller verwendeten cDNS zur Expression der WT- und Cystein-Protein-

mutanten wurden durch automatisierte DNS-Sequenzierung überprüft. Die cDNS für hcTnC

C35/84S (bereitgestellt von Dr. T. Greis) und hcTnI C79S, hcTnI S4C/C79S und hcTnI

A27C/C79S (bereitgestellt von Dr. A. Schmidtmann), sowie die cDNS für Wildtyp-Proteine

wurden in E. coli BL21 (DE3) transformiert und die Proteine exprimiert.

Alle Wildtyp-Untereinheiten und die Proteinmutanten konnten nach den entsprechenden

Standardprotokollen gereinigt werden, wobei die Ausbeuten der einzelnen Proteine zum Teil

erheblich voneinander abwichen (Tabelle 4). Die Proteinmutanten konnten bis auf eine

Ausnahme in vergleichbaren Mengen wie die entsprechenden WT-Proteine erhalten werden.

Nur die Ausbeute an hcTnI C79S war um ca. 60 – 70 % geringer als die von hcTnI-WT

(Tabelle 4).

Tabelle 4: Mittlere Proteinausbeuten [mg / l Bakterienkultur]

Protein Ausbeute pro 1 l Bakterienkultur in [mg] n hcTnI-WT 13 ± 7 7 hcTnI-C79S 4 ± 1 11 hcTnI-S4C/C79S 16 ± 5 9 hcTnI-A27C/C79S 17 ± 6 5 hcTnC-WT 51 ± 3 3 hcTnC-C35/84S 44 ± 7 5 hcTnT-WT 12 ± 4 6

Ausbeuten nach Reinigung der verschiedenen Troponin-Untereinheiten. n gibt die Anzahl der Reinigungen an. Die Ausbeuten wurden gemittelt und mit Standardabweichung angegeben. Einzig hcTnI C79S wurde in deutlich geringerer Menge erhalten als Wildtyp hcTnI. Die Ausbeuten der anderen Proteinmutanten waren mit denen der jeweiligen Wildtyp Proteine vergleichbar.

3. Ergebnisse 48

Entsprechend war auch die Expressionsrate des hcTnI C79S viel geringer, als die von

hcTnI-WT oder den anderen beiden Cystein-Proteinmutanten, welche ähnliche

Expressionsraten zeigten (Abbildung 7). Nach Isolierung und Reinigung der Troponin-

Untereinheiten konnte zu mehr als 98 % gereinigtes Protein erhalten werden (s. Abbildung 8

A). Die zusätzliche Bande (Spur Iwt) bei ca. 23 kDa ließ auf ein proteolytisches Spaltprodukt

des hcTnI schließen. Diese Bande machte nach densitometrischer Auswertung aber nur 2 %

des gesamten hcTnI aus.

Abbildung 7: Expressions-Überprüfung von hcTnI mittels SDS-PAGE

Aufgetragen wurden Aliquots von Expressionschecks verschiedener hcTnI-Proteine. WT kennzeichnet Spuren mit Wildtyp hcTnI, 79 hcTnI C79S, 4 hcTnI S4C/C79S und 27 hcTnI A27C/C79S. Spuren mit Aliquots von Expressionschecks mit IPTG sind durch +, solche mit Aliquots nicht induzierter Kulturen durch - gekennzeichnet. Spur M enthielt den Molekulargewichtsstandard (3 µl; MBI Fermentas, Protein Ladder 20 - 120kDa). Molekulargewichte in kDa sind angegeben. Tn bezeichnet Spuren mit nativem Rinderherz Troponin (15 µg) als Standard.

Die verwendete Austausch-Proteinmutante des hcTnC (C35/84S) zeigte wie Wildtyp hcTnC

(Daten nicht gezeigt) eine Calcium-abhängige Mobilität in SDS-Gelen (Abbildung 8 B).

Calcium-gebundene hcTnC-Proteine weisen dabei eine längere Laufstrecke in SDS-Gelen

auf, als die mit EGTA versetzten Proben, welche Calcium-freies hcTnC C35/84S enthielten.

47 kDa

34 kDa

26 kDa

20 kDa

79 79 bcTn M 27 27 WT WT 4 4 - + - + - + - +

TnI (24 kDa)

3. Ergebnisse 49

Abbildung 8: Überprüfung der Proteinreinigung mittels SDS-PAGE;

Calciummobilität von hcTnC mittels SDS-PAGE

In Teilabbildung A ist in Spur Iwt gereinigtes Wildtyp hcTnI (15 µg), in Spur I27 exemplarisch die hcTnI A27C/C79S Cystein-Proteinmutante (10 µg) aufgetragen. Ebenso wurde hcTn aus hcTnC C35/84S, hcTnT-WT und hcTnI A27C/C79S (Tn27, 25 µg) bzw. hcTnI-WT (Tnwt, 21 µg) aufgetragen. Wildtyp hcTnT (13 µg) ist in Spur Twt und hcTnC C35/84S (20 µg) in Spur C gezeigt. Teilabbildung B zeigt die unterschiedlichen Laufweiten von hcTnC C35/84S Proben mit 200 µM CaCl2 (C+) oder mit 4 mM EGTA (C-), je zu 5 µg. Molekulargewichte in kDa sind angegeben. In beiden Teilabbildungen kennzeichnet bcTn Rinderherztroponin (je 12 µg) und M den Molekulargewichtsmarker (je 3 µl). Molekulargewichte der Marker (MBI Fermentas, Protein Ladder 20 - 120kDa (A) bzw. 10 - 200kDa (B)) sind in kDa angegeben.

3.1.2 Rekonstitution von trimeren hcTn-Komplexen

Die gereinigten Untereinheiten wurden zu den verschiedenen Holotroponin-Komplexen

rekonstituiert (Tabelle 5). Nach Rekonstitution der verschiedenen trimeren Komplexe wurde

das Verhältnis der Troponin-Untereinheiten von 1 : 1 : 1 durch densitometrische Auswertung

der Proteinbanden in einem SDS-Gel verifiziert. Dabei wurden Aliquots von gesammelten

Fraktionen einer Gelfiltration auf das SDS-Gel aufgetragen. Nur solche Fraktionen wurden

vereinigt, welche das richtige Verhältnis aufwiesen (2.3.8). Die drei Banden aller

rekonstituierten Troponin-Komplexe zeigten fast identische Intensitätsverhältnisse wie die

von nativem Protein (Tabelle 5).

TnT

TnI

TnC

30 kDa

25 kDa

20 kDa

50 kDa

40 kDa

30 kDa

25 kDa

20 kDa

15 kDa

A B

bcTn Iwt I27 Tn27 Tnwt Twt C M bcTn C+ C- M

3. Ergebnisse 50

Tabelle 5: Molare Verhältnisse der Untereinheiten im rekonstituierten hcTn-Komplex

TnT TnI TnC bcTn 1 1 1 hcTn 1 0.99 ± 0.02 0.91 ± 0.02

Intensitäten von SDS-Gelbanden wurden densitometrisch analysiert (2.3.8). Die Werte für hcTn repräsentieren Mittelwerte aller rekonstituierten Komplexe, aus Wildtyp oder Proteinmutanten. Werte wurden ± SEM angegeben, wobei die Anzahl der berücksichtigten Analysen 51 betrug. Sie wurden in Bezug gesetzt zu den Werten für Rinderherz Troponin (bcTn; 11 durchgeführte Analysen).

3.1.3 Phosphorylierung von hcTnI im Holotroponin-Komplex und Überprüfung

des Phosphorylierungszustandes

Jeweils eine Hälfte der rekonstituierten hcTn-Komplexe wurde mit Proteinkinase A

phosphoryliert ( 2.2.15). Der Phosphorylierungszustand von hcTnI im hcTn wurde durch

ELISAs mit spezifischen Antikörpern gegen entsprechende Phosphorylierungszustände des

hcTnI ( 2.3.6), durch isoelektrische Fokussierung ( 2.3.5) und 31P-NMR Untersuchungen

( 2.3.15.1.3) überprüft. Hierbei zeigt Abbildung 9 beispielhaft für einen rekonstituierten

Holotroponin-Komplex aus hcTnT-WT, hcTnC-C35/84S und hcTnI-A27C/C79S das

Ergebnis eines ELISA.

Abbildung 9: ELISA-Experiment mit hcTn (TnI-A27C/C79S, TnC-C35/84S, TnT-WT)

Der Antikörper gegen die dephosphorylierte Form des hcTnI reagierte nur mit dem

dephosphorylierten Protein. Nach Phosphorylierung des Proteins durch die Proteinkinase A

zeigte nur noch der Antikörper gegen die phosphorylierte Form des Proteins eine

Die Immunreaktionen wurden mit Antikörper gegen die phosphorylierte Form des hcTnI (1G11; rechtes Diagramm) bzw. gegen die dephosphorylierte Form des hcTnI (22B11; linkes Diagramm) durchgeführt. In beiden Diagrammen repräsentieren schwarze Linien Immunreaktionen mit hcTn-Komplexen, die dephosphoryliertes hcTnI, und rote Linien solche, die phosphoryliertes hcTnI enthielten.

0 1 2 3 40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Protein [µg]

OD

450n

m

0 1 2 3 40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Protein [µg]

OD

450n

m

Dephos AK Phos AK

3. Ergebnisse 51

Immunreaktion. Der Antikörper gegen dephosphoryliertes hcTnI dagegen reagierte nicht.

Eine Unterscheidung zwischen mono- und bisphosphorylierten Proteinen ist damit nicht

möglich. Daher wurden die Untereinheiten mittels HPLC getrennt ( 2.3.5) und hcTnI durch

isoelektrische Fokussierung untersucht.

Die verschiedenen Phosphoformen des hcTnI weisen einen um ca. 0,1 unterschiedlichen IP

auf. Die densitometrische Analyse der IEF-Gele (Abbildung 10) ergab je 50 % Mono- und

50 % Bisphosphorylierung für Wildtyp hcTnI in Spur (WT) und hcTnI A27C/C79S in Spur

(27). hcTnI S4C/C79S (Spur (4)) war vollständig bisphosphoryliert. Dephosphoryliertes

Protein war nicht nachzuweisen. Triphosphorylierung und höher phosphoryliertes hcTnI

wurde nicht detektiert.

Abbildung 10: Isoelektrische Fokussierung verschiedener Proben von hcTnI

4 WT bcTn1 27 bcTn2

Natives Troponin, aus Rinderherzen isoliert, enthält eine Mischung aller hcTnI Phosphoformen und wurde als Standard (Spuren bcTn1 (50 µg) bzw. bcTn2 (40µg)) eingesetzt. Spuren 4, WT und 27 enthalten rekombinantes hcTnI: (4) hcTnI S4C/C79S-P (20 µg), (WT) Wildtyp hcTnI-P (20µg), (27) hcTnI A27C/C79S-P (25 µg).

Diese Ergebnisse wuden mit Hilfe der 31P-NMR-Spektroskopie bestätigt. Abbildung 11 zeigt

beispielhaft ein Spektrum von hcTn mit cTnI A27C/C79S. Jeweils ein Signal für jede

Monophosphoform des hcTnI (phospho-Ser23 (Signal bei 4,1 ppm) und phospho-Ser22

(Signal bei 3,9 ppm)) wurde erhalten. Das dritte Signal bei 3,7 ppm, das sogenannte

„Interaktionssignal“, repräsentiert bisphosphoryliertes hcTnI A27C/C79S im korrekt

gefalteten, rekonstituierten cTn-Komplex. Nur wenn der bisphosphorylierte Holotroponin-

Komplex in nativer Konformation vorliegt, befinden sich die beiden Phosphoserine im hcTnI-

Arm in gleicher chemischer Umgebung und erzeugen durch Überlagerung nur ein Signal im 31P-NMR-Spektrum. Das Fehlen überzähliger Signale zeigte, dass keine unspezifische

Phosphorylierung der Proteinkomplexe vorlag. Die Summe der Integrale der beiden Signale

für die entsprechenden monophosphorylierten Proteine ist annähernd gleich dem Integral des

Signals für bisphosphoryliertes Protein, sodass eine 1 : 1 Verteilung an mono- und

bisphosphoryliertem hcTnI im hcTn-Komplex vorlag.

-

+

Bisphos Monophos Dephos

3. Ergebnisse 52

Im 31P-NMR-Spektrum des hcTn-Komplexes mit hcTnI S4C/C79S, welches bei

isoelektrischer Fokussierung nur eine Bande bei einem charakteristischen IP für

bisphosphoryliertes hcTnI aufweist, ist nur das Interaktionssignal bei ungefähr 3,7 ppm

vorzufinden (nicht gezeigt). Für weitere Untersuchungen wurden nur solche Komplexe

verwendet, welche im 31P-NMR-Spektrum dieses Interaktionssignal aufwiesen.

Abbildung 11: 31P-NMR von hcTn (TnI A27C/C79S, TnC C35/84S, TnT-WT)

hcTn (16 mg/ml; in 700 µl NMR-Puffer (144 nMol Protein in 20 mM Tris/HCl, pH 7,3; 0,2 M KCl; 0,5 mM DTT und 10% D2O)) wurde bei 283 K mit 9.000 addierten Einzelmessungen untersucht. Das Signal bei 2.3 ppm resultierte von anorganischem Phosphat (Pi). Der Holotroponin-Komplex hatte nur an seiner hcTnI-Untereinheit Phosphate gebunden. Das Signal bei 4.1 ppm resultierte aus dem Phosphoserin 23, das Signal bei 3.9 ppm aus dem Phosphoserin 22 und das sogenannte Interaktionssignal bei 3.7 ppm (IS) war auf beide Phosphoserine zurückzuführen. Die Linienbreiten für die Signale beliefen sich auf 4.5 Hz für das anorganische Phosphat, 19.8 Hz für das P-Ser22, 24.1 Hz für das P-Ser23 und 10.2 Hz für das Interaktionssignal (IS). Die integrierten Flächen unter den Signalen (in arbiträrer Einheit) für die verschiedenen Proteinsignale betrugen 1.43 für P-Ser23, 0.48 für P-Ser22 und 1.89 für das Interaktionssignal.

3.1.4 Funktionelle Untersuchung der verschiedenen Troponin-Komplexe durch

ActoS1-ATPase-Aktivitätsbestimmung

Es wurde geprüft, inwieweit die Cystein-Proteinmutanten des hcTnI die funktionellen

Eigenschaften des Troponinkomplexes beeinflussen. Dafür wurde die Fähigkeit der hcTn-

Komplexe, die ActoS1-ATPase-Aktivität im dünnen Filament zu regulieren, in

photometrischen Messansätzen mit PNP/MESG ( 2.3.11) untersucht. Die dünnen Filamente

wurden aus polymerisiertem Skelettmuskel-G-Aktin, nativem Skelettmuskel-Tropomyosin

und phosphorylierten Troponin-Komplexen rekonstituiert. Bei der Rekonstitution wurden die

Proteine in einem molaren Verhältnis von 4 : 1 : 1 an Aktin : Tropomyosin : Troponin

PSer23

PSer22

IS

Pi

5 4 3 2 (ppm)

3. Ergebnisse 53

anstelle des natürlichen Verhältnisses von 7 : 1 : 1 eingesetzt, um zu gewährleisten, dass die

Aktinfilamente mit den regulatorischen Proteinen gesättigt vorlagen. Die rekonstituierten

dünnen Filamente wurden vor der Bestimmung der ActoS1-ATPase-Aktivität SDS-

gelelektrophoretisch überprüft (Abbildung 12). Die mit verschiedenen cTn-Komplexen

rekonstituierten dünnen Filamente zeigten ein fast identisches Verhältnis aller Komponenten

zueinander.

Abbildung 12: Kontrolle der Rekonstitution dünner Filamente mittels SDS-PAGE

Aufgetragen wurden dünne Filamente mit hcTnI A27C/C79S (27), mit hcTnI C79S (79), mit hcTnI S4C/C79S (4) und mit hcTnI-WT (WT) im Troponinkomplex, einen Rinderherz Troponin-Standard (bcTn, 12 µg), monomeres G-Aktin (Ac, 5 µg), natives Tropomyosin (Tm, 8 µg) und 5 µl des 10 - 200 kDa-MW Markers (M). Molekulargewichte sind in kDa angegeben.

Dephosphorylierte Filamente wurden erhalten, indem die rekonstituierten Filamente mit

PP2A inkubiert ( 2.2.17) und der Phosphorylierungszustand im ELISA ( 2.3.6) bestimmt wurde

(Abbildung 13). Dünne Filamente mit phosphoryliertem hcTnI im Holotroponin-Komplex

wurden nur von anti-phospho-Antikörpern erkannt (Abbildung 13 A) und wiesen keine

Reaktion mit anti-dephospho-Antikörpern auf. Im Gegensatz dazu wurden nach

Dephosphorylierung der dünnen Filamente mit PP2A nur noch Immunreaktionen im ELISA

mit entsprechenden anti-dephospho-Antikörpern erhalten und keine Reaktion mehr mit anti-

phospho-Antikörpern (Abbildung 13 B). Es wurden also für ActoS1-ATPase-Aktivitäts-

messungen dünne Filamente mit ausschließlich phosphoryliertem oder dephosphoryliertem

hcTnI im Troponinkomplex verwendet.

Alle durch die verschiedenen Filamenttypen aktivierten ActoS1-ATPase-Aktivitäten zeigten

in Bezug auf ihre Calciumabhängigkeit von pCa 9,8 bis pCa 4,8 einen sigmoidalen

Kurvenverlauf (Abbildung 14).

40 kDa 30 kDa 25 kDa 20 kDa

G-Aktin hcTnT Tm hcTnI

hcTnC C35/84S

27 79 4 WT bcTn Ac Tm M

3. Ergebnisse 54

Es konnte mit dünnen Filamenten, welche dephosphoryliertes hcTn (TnI-WT, TnT-WT, TnC

C35/84S) enthielten, ein Anstieg der normierten ActoS1-ATPase-Aktivität um ca. 3,9 pmol

Pi/s von niedriger freier Calcium-Konzentration (pCa 9,8; y0 = 1,80 ± 0,14 pmol Pi/s) auf

hohe Calcium-Konzentration (pCa 4,8; ymax = 5,74 ± 0,06 pmol Pi/s) beobachtet werden

(Tabelle 6). Mit bisphosphoryliertem hcTn (TnI-WT, TnT-WT, TnC C35/84S) reduzierte

sich die minimale ActoS1-ATPase-Aktivität signifikant (p < 0,0001) um ca. 60 % (y0 = 0,67 ±

0,05 pmol Pi/s) und die maximale ActoS1-ATPase-Aktivität signifikant um 78 %

(ymax = 1,23 ± 0,11 pmol Pi/s, Tabelle 6).

Abbildung 13: Kontrolle des Phosphorylierungszustandes von dünnen Filamenten im ELISA

Dargestellt sind Immunreaktionen von hcTnI Wildtyp und Mutanten im dünnen Filament mit spezifischem anti-dephospho Antikörper (A) und anti-phospho Antikörper (B) im ELISA ( 2.3.6). Durchgezogene Linien repräsentieren die Immunreaktion von dünnen Filamenten mit phosphoryliertem hcTnI im hcTn-Komplex und unterbrochene Linien solche von Filamenten mit dephosphoryliertem hcTnI. Die entsprechenden hcTnI-Proteine (Wildtyp oder Proteinmutanten) wurden farblich gekennzeichnet:

TnI A27C/C79S; TnI A27C/C79S-Phos; TnI S4C/C79S; TnI S4C/C79S-Phos; TnI-WT; TnI-WT-Phos; TnI C79S; TnI C79S-Phos.

Eine signifikante Reduktion der ActoS1-ATPase-Aktivität nach hcTnI-Phosphorylierung

wurde auch mit allen hcTnI-Proteinmutanten beobachtet, sowohl bei inhibierenden (um ca.

47 %) und maximal aktivierenden Calcium-Konzentrationen (um ca. 70 %) (Tabelle 6). Die

Werte für y0 und ymax, erhalten mit den verschiedenen dephosphorylierten dünnen Filamenten,

waren nicht signifikant unterschiedlich (Tabelle 6). Auch mit den verschiedenen

phosphorylierten Filamenten wurden ähnliche Werte für y0 und ymax erhalten.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Protein [mg]

OD

450n

m

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Protein [mg]

OD

450n

m

Anti-dephospho AK Anti-phospho AK

A B

3. Ergebnisse 55

Tabelle 6: Parameter der ActoS1-ATPase-Aktivitätsmessungen cTnI-Proteinmutante y 0 y max Amp pCa50 n TnI-WT 1,80 ± 0,14 5,74 ± 0,06 3,94 ± 0,19 6,15 ± 0,02 3,04 ± 0,28 TnI-WT-P 0,67 ± 0,05s 1,23 ± 0,11s 0,56 ± 0,08 5,96 ± 0,06s 1,67 ± 0,32 TnI C79S 1,34 ± 0,20 n 5,40 ± 0,09 s 4,07 ± 0,27 6,16 ± 0,02 n 2,37 ± 0,29 TnI C79S-P 0,74 ± 0,04s

n 1,37 ± 0,09sn 0,63 ± 0,08 5,73 ± 0,05ss 1,71 ± 0,25

TnI S4C/C79S 1,15 ± 0,11 s 5,12 ± 0,05 s 3,96 ± 0,16 6,09 ± 0,01 n 2,08 ± 0,14 TnI S4C/C79S-P 0,67 ± 0,06s

n 1,78 ± 0,16ss 1,11 ± 0,22 5,78 ± 0,07sn 1,14 ± 0,19

TnI A27C/C79S 1,15 ± 0,12 s 4,29 ± 0,06 s 3,14 ± 0,16 6,13 ± 0,02 n 2,62 ± 0,24 TnI A27C/C79S-P 0,71 ± 0,03s

n 1,62 ± 0,07ss 0,91 ± 0,08 5,77 ± 0,04ss 1,29 ± 0,13

Die Parameter wurden wie unter 2.3.11 beschrieben aus den Daten für Filamente mit hcTn aus hcTnT-WT, hcTnC C35/84S und den verschiedenen hcTnI-Untereinheiten errechnet. Unter cTnI-Proteinmutante sind die zur Rekonstitution verwendeten hcTnI-Proteine angegeben. –P kennzeichnete bisphosphoryliertes hcTnI im dünnen Filament im Gegensatz zum dephosphorylierten hcTnI. (n) kennzeichnet den Hill Koeffizienten, der basale Level der ActoS1-ATPase-Aktivität bei pCa 9,8 in [pmol Pi/s] wurde durch (y0) und die maximale ActoS1-ATPase-Aktivität bei maximaler Calciumaktivierung in [pmol Pi/s] durch (ymax) gegeben. (Amp) entsprach der Amplitude der calciumabhängigen ActoS1-ATPase-Aktivität in [pmol Pi/s] und der pCa-Wert, bei dem die Filamente halbmaximale ActoS1-ATPase-Aktivität zeigten, wurde durch (pCa50) wiedergegeben. Die Anzahl der Experimente betrug für alle untersuchten dünnen Filamente 3. Unterschiede zwischen Parametern eines dephosphorylierten zum entsprechenden bisphosphorylierten Filamentes sind in blau, solche zwischen Proteinmutanten des hcTnI im Vergleich zum hcTnI-WT sind in rot angegeben. Hierbei repräsentierten s signifikante, n nicht signifikante Unterschiede.

Die Calciumsensitivität der dünnen Filamente verringerte sich durch Phosphorylierung des

hcTnI in allen Filamenten signifikant um im Mittel 0,3 pCa-Einheiten, wohingegen keine

signifikanten Unterschiede (P < 0,05) in den pCa50-Werten bestanden, wenn nicht-phosphory-

lierte hcTn-Komplexe mit den entsprechenden verwendeten Proteinmutanten des hcTnI ver-

glichen wurden. Im phosphorylierten Komplex wurden signifikante Unterschiede im pCa50-

Wert zwischen den Proteinmutanten hcTnI A27C/C79S, hcTnI C79S zu Wildtyp hcTnI im

hcTn-Komplex beobachtet.

Die bestimmten Hill-Koeffizienten lagen alle über 1,1 und zeigten wie erwartet die

Kooperativität an.

Insgesamt verhielten sich Filamente mit hcTnI-Proteinmutanten wie solche mit hcTnI-WT.

Alle hergestellten Tn-Komplexe waren funktionell und konnten für 19F-NMR-Untersuchun-

gen eingesetzt werden.

3. Ergebnisse 56

Abbildung 14: Calciumabhängige Regulation der ActoS1-ATPase Aktivität

Dargestellt ist die normierte mittlere (A – D) bzw. die entsprechende relative (a – d) ActoS1-ATPase Aktivität bei verschiedenen pCa Werten reguliert durch dünne Filamente. Die Messungen und Kurvenanpassungen wurden wie im Kapitel für Material und Methoden ( 2.3.11) beschrieben durchgeführt. Die Diagramme zeigen Daten, welche durch Verwendung dünner Filamente,

pCa45678910

rela

tive

Akt

omyo

sin-

S1-

ATP

ase-

Akt

ivitä

t

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

pCa45678910

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

pCa

45678910

rela

tive

Akt

omyo

sin-

S1-

ATP

ase-

Akt

ivitä

t

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

pCa

45678910

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

pCa

456789100

1

2

3

4

5

6

7

pCa

456789100

1

2

3

4

5

6

7

pCa

45678910

norm

ierte

Akt

omyo

sin-

S1-

ATP

ase-

Akt

ivitä

t

0

1

2

3

4

5

6

7

pCa45678910

norm

ierte

Akt

omyo

sin-

S1-A

TPas

e-A

ktiv

ität

0

1

2

3

4

5

6

7

A B TnI-WT TnI S4C/C79S

C D TnI C79S TnI A27C/C79S

a b TnI-WT TnI S4C/C79S

c d TnI C79S TnI A27C/C79S

3. Ergebnisse 57

rekonstituiert mit verschiedenen hcTn-Komplexen erhalten wurden. Zur Rekonstitution des hcTn wurden jeweils hcTnT-WT und hcTnC(C35/84S) und verschiedene hcTnI-Proteine, wie in den Diagrammen genannt, verwendet. bezeichnet Kurven, welche aus dephosphorylierten dünnen Filamenten, welche aus phosphorylierten dünnen Filamenten erhalten wurde. Die Mittelwerte der ActoS1-ATPase-Aktivitäten bei den distinkten pCa-Werten wurden in Diagrammen A – D +/- SEM angegeben und bezüglich der ActoS1-ATPase Aktivität für unreguliertes F-Aktin ( 2.3.11) normalisiert.

3.1.5 Überprüfung der Cystein-Reaktivität in den hcTnI-Proteinmutanten

Vor der Markierung der Cysteine im Troponin I mit der PFP-Sonde wurde die Zugänglichkeit

der Cysteinreste photometrisch untersucht ( 2.3.12).

Nach Abzug des Leerwertes wurden zum Teil zu Beginn der Messungen negative

Absorptionswerte erhalten. Da kurz nach Zugabe des DTNB, welches die Reaktion startet,

größere Absorptionsschwankungen (zurückzuführen auf die Durchmischung des

Reaktionsansatzes) auftraten, waren negative Werte möglich. Als Negativ-Kontrolle wurde

hcTnC C35/84S eingesetzt, welches keine Cysteine enthielt. Wie erwartet fand keine

Reaktion statt (Abbildung 15). Wird die Proteinkonzentration verdoppelt, erhöht sich auch

die maximale Absorption um den Faktor 2. Dies ist in beispielhaft für hcTnI A27C/C79S

gezeigt.

Abbildung 15: Überprüfung der Cysteinreaktivität mit DTNB

Wie in Kapitel 2.3.12 beschrieben, wurden photometrische Messungen bei 412 nm Wellenlänge durchgeführt. Die verwendeten Proteinmutanten bzw. Wildtyp-Proteine wurden durch verschiedene Farben gekennzeichnet und die jeweilige Proteinkonzentration im Messansatz angegeben.

Die maximale Absorption für hcTnI C79S, welches nur noch ein Cystein an Position 96

enthielt, war bei gleicher eingesetzter Konzentration in der Probe ungefähr nur halb so groß

wie die der hcTnI-Proben, welche zwei Cysteine enthielten (Wildtyp-hcTnI, hcTnI

10 20 30-0.010.000.010.020.030.040.050.060.07

Zeit [min]

OD

412n

m

hcTnI A27C/C79S [10 nM]hcTnI A27C/C79S [ 5 nM]hcTnI-WT [ 5 nM]hcTnI S4C/C79S [ 5 nM]hcTnI C79S [ 5 nM]hcTnC C35/84S [10 nM]

2 Cys

1 Cys

3. Ergebnisse 58

A27C/C79S und hcTnI S4C/C79S) (Abbildung 15). Die Absorption und die Menge des

verwendeten Proteins und die Anzahl der Cysteinreste verhalten sich also proportional. Somit

schienen alle Cysteine in den Proteinen zugänglich zu sein.

3.1.6 Überprüfung der Homogenität der Proteinlösungen

Da die NMR-Spektroskopie hohe Anforderungen an die Qualität der zu untersuchenden

Proteine zum Beispiel bezüglich Reinheit und Homogenität stellt, wurde die Homogenität der

Proteine mit zwei verschiedenen Methoden, der dynamischen Lichtstreuung ( 2.3.13) und der

nicht-denaturierenden Gelelektrophorese ( 2.3.3), überprüft.

Nur eine Bande konnte für die verschiedenen hcTn-Komplexe detektiert werden, wobei sie

sich in den Laufweiten leicht unterschieden (Abbildung 16, Spuren 4 D, 27 D und WT D).

Alle an hcTnI phosphorylierten hcTn-Komplexe zeigten eine längere Laufstrecke, als die

entsprechenden nicht-phosphorylierten Komplexe (Abbildung 16, Spuren 4 P, 27 P und WT

P). Diese Laufweitenunterschiede, wie zum Beispiel zwischen dephosphorylierten und

phosphorylierten Troponin-Komplexen könnten mit ihrer unterschiedlichen Ladung durch die

zusätzlichen Phosphatgruppen erklärt werden. Da jeweils nur eine relativ distinkte Bande

detektiert wurde, sind die Proteinlösungen homogen.

Nach Konzentrierung der Proben auf NMR-typische Volumina von unter 1 ml und

Konzentrationen von 10 – 20 mg/ml trat jedoch mit hcTn (TnI A27C/C79S, TnT-WT, TnC

C35/84S) eine weitere Proteinbande (Abbildung 16 B; Pfeil) auf. Die densitometrische

Analyse der Intensität der zusätzlichen Bande relativ zur Hauptbande ergab, dass die

zusätzliche Bande nur 12 % der Hauptbande ausmachte, wenn hcTnI A27C/C79S

bisphosphoryliert vorlag (Abbildung 16 B, 27 P). Mit dem entsprechend nicht-

phosphorylierten hcTnI betrug der Anteil der zusätzlichen Bande ca. 23 % (Abbildung 16 B,

27 D). Die zusätzliche Bande deutet darauf hin, dass hcTn (TnI A27C/C79S, TnT-WT, TnC

C35/84S) zu einem geringen Anteil aggregiert. Weitere Reinigung mittels Gelfiltration und

erneutes Konzentrieren der Proteinlösung resultierte in keiner signifikanten Verbesserung der

Homogenität und wurde daher vor den NMR-Messungen nicht durchgeführt.

Übereinstimmende Ergebnisse wurden auch mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung

erhalten. Der Komplex mit dephosphoryliertem hcTnI A27C/C79S (Abbildung 17 A) schien

Aggregate zu enthalten, im Gegensatz zum Komplex mit hcTnI-WT (Abbildung 17 B).

3. Ergebnisse 59

Abbildung 16: Homogenitätstest durch native PAGE

4 4 27 27 bC WT WT 4 4 bC 27 27 WT WT D P D P D P D P D P D P

Gezeigt sind die für die 19F-NMR-Messungen verwendeten Proben der Troponin-Komplexe aus hcTnT-WT, hcTnC C35/84S und entweder hcTnI S4C/C79S (4); hcTnI A27C/C79S (27) oder hcTnI-WT (WT). Nicht-phosphorylierte Proben werden mit dem Buchstaben (D), bisphosphorylierte Proben mit dem Buchstaben (P) bezeichnet. In Abbildung A wurde je ca. 8,5 µg Protein (von ca. [c] = 1 mg/ml) pro Spur aufgetragen. Abbildung B zeigt die gleichen Proben nach dem Ankon-zentrieren der Proteinlösungen auf ca. 15 mg/ml. Folgende Proteinmengen wurden aufgetragen: 4 D = 4 µg; 4 P = 8 µg; 27 D = 8 µg; 27 P = 8 µg; WT D = 7 µg; WT P = 8 µg. bC kennzeichnet Rinder Catalase (MW: 240 kDa, in Probenpuffer gelöst) als Laufweitenstandard (Abbildung A: 4 µg, Abbildung B: 3 µg).

Abbildung 17: Homogenitäts-Überprüfung mittels dynamischer Lichtstreuung

Beispielhaft gezeigt sind die Verteilungen an Partikeln unterschiedlicher hydrodynamischer Radii der Proben hcTn (TnI A27C/C79S, TnT-WT, TnC C35/84S) in dephosphorylierter (A) und hcTn (TnI-WT, TnT-WT, TnC C35/84S) in phosphorylierter Form (B). Die berechneten Parameter waren 6,6 % Häufigkeit und 4,02 nm Radius (entspricht ca. 87 kDa MW) für die Probe mit hcTnI-WT und 12 % Häufigkeit und 6,6 nm Radius (entspricht ca. 278 kDa MW) für die Probe mit hcTnI A27C/C79S.

A B

A B

3. Ergebnisse 60

Das Spektrum, erhalten mit phosphoryliertem hcTn (TnI-WT, TnT-WT, TnC C35/84S)

(Abbildung 17 B) zeigte Größenverteilungen, wie sie auch für die anderen Proben erhalten

werden konnten. Die Menge an aggregiertem Protein war sehr gering; auch im nicht-

denaturierenden Gel wurde nur eine überaus schwache zusätzliche Bande detektiert.

3.1.7 19F-NMR-spektroskopische Untersuchungen an hcTn

Zunächst wurde auch für zwei markierte Cysteinreste nur ein sehr breites Signal mit

Linienbreiten um 80 - 100 Hz erhalten. Eine derartige Linienverbreiterung kann durch die

Bildung von Proteinaggregaten oder durch Austauschphänomene entstehen.

In Abbildung 18 (Spalte B) ist z.B. ein 19F-NMR-Spektrum von hcTn (TnI S4C/C79S, TnC

C35/84S, TnT-WT) aufgenommen bei 283 K gezeigt. Nur ein inhomogen verbreitertes

Fluorsignal von ca. 77 Hz Linienbreite wurde erhalten, welches die zwei Signale von PFP-

Cystein 4 und PFP-Cystein 96 enthielt. Das Protonenspektrum (Spalte A; 283 K) wies auf

einem kleinen Berg eine kleine Anzahl scharfer Linien (Kernprotein) auf (Abbildung 18,

Spalte A, 283 K, rote Markierung), welche in einem Bereich im 1H-Spektrum lagen, welcher

typisch für Peptide mit Zufallsknäuel („random-coil“)-Struktur ist.

Es ließen sich zwar signifikante Verkleinerungen der Linienbreiten um ca. 15 % bzw. 60 %

durch Verringerung der Proteinkonzentration um den Faktor 5 x bzw 10 x erreichen. Da aber

Messzeiten in Bezug zur Konzentration exponentiell verändert werden, wurden die

Messzeiten viel zu lang (nicht gezeigt). Daher wurde in einem nächsten Schritt geprüft, ob

durch Zugabe von Harnstoff und durch Temperaturerhöhung für jedes PFP-Cystein ein Signal

erhalten werden kann. So wurde schrittweise zunächst die Harnstoffkonzentration auf 8 M

und dann die Temperatur auf 333 K erhöht. Erst in Puffer mit 8 M Harnstoff konnten 2

Signale erhalten werden, daher ist nur das Spektrum für cTn in 8 M Harnstoff gezeigt

(Abbildung 18, Spalte B, 298 K, 8 M). Selbst bei diesen Bedingungen waren die

Linienbreiten der Signale mit 20 Hz und 15 Hz noch immer zu groß für Signale eines

denaturierten Proteins.

Anhand der Protonenspektren (Spalte A) konnte man die Denaturierung des Proteins

verfolgen. Nach Zugabe von 8 M Harnstoff waren kleine Änderungen u.a. im

Resonanzbereich der NH-Protonen zu erkennen, obwohl die meisten Resonanzen noch

erkennbar waren (Vergleich Abbildung 18, Spalte A, Spektrum 298 K mit Spektrum 298 K,

8 M). Dies zeigte, dass das Protein selbst in 8 M Harnstoff nicht vollständig denaturiert ist.

3. Ergebnisse 61

283 K

298 K;

8 M

313 K;

8 M

333 K;

8 M

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

(ppm)

283 K

298 K;

8 M

313 K;

8 M

333 K;

8 M

15.5 15.0 14.5

(ppm)

Cys96 Cys4

Die anschließende Erhöhung der Temperatur auf 313 K bzw. 333 K führte zu einer weiteren

Verbesserung der Signalauflösung im 19F-Spektrum (Abnahme der Linienbreite um

25 % - 45 %) (Abbildung 18, Spalte B, 313 K / 333 K, 8 M).

Abbildung 18: NMR-Spektren von PFP-markiertem hcTn A B

1H-NMR (Spalte A) und 19F-NMR (Spalte B) Spektren von PFP-markiertem hcTn (TnI S4C/C79S, TnC C35/84S, TnT-WT), gemessen bei 500 MHz (1H) und 470.5 MHz (19F) sind in Abhängigkeit von Temperatur und Harnstoffkonzentration wiedergegeben. 32 Einzelmessungen wurden für die Protonen- und 500 Einzelmessungen für die 19F-NMR-Spektren aufsummiert. 4 mg hcTn (TnI S4C/C79S, TnC C35/84S, TnT-WT) wurde in vacuo getrocknet und anschließend in 500 µl NMR-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7.3; 0.2 M KCl; 0.5 mM DTT; 10% D2O und 1% DSS als internem Standard) aufgenommen. 8M Harnstoff wurde hinzugefügt und die Temperatur (283K, 298K, 313K and 333K) erhöht.

Allerdings wurden jetzt auch in den zugehörigen Protonenspektren weniger distinkte

NH-Signale im Bereich um 7 ppm erhalten und die Signale bei 8 ppm verschwanden fast

völlig bei 333 K (Abbildung 18, Spalte A, 313 K / 333 K, 8 M). Auf diese Art und Weise

3. Ergebnisse 62

konnte zusätzlich für jeden Komplex nachgewiesen werden, dass alle Cysteine PFP gebunden

hatten. Um jedwede Denaturierung des Proteins bei den 19F-NMR-Untersuchungen zu

vermeiden, wurde versucht, allein durch Temperaturerhöhung ohne Harnstoffzusatz die

Linienbreite so zu verringern, dass die erwartete Anzahl der Signale im Spektrum erhalten

wird (Abbildung 19). Tatsächlich konnten zwei distinkte Signale schon bei Messung der

Proben bei 308K beobachtet werden (Abbildung 19).

Abbildung 19: Temperatur-Abhängigkeit der Linienbreite der 19F-NMR-Signale

19F-NMR Spektren von phosphoryliertem hcTn mit TnC C35/84S, TnT-WT und TnI S4C/C79S (A/a) oder TnI A27C/C79S (B/b) wurden bei 283K (A/B) oder 308K (a/b) aufgenommen. In Spektrum A ist ein Signal mit einer Linienbreite von 77 Hz (integrierte Signalfläche: 1,578931 x 1010) zu sehen. Spektrum a zeigt die gleiche Probe bei 308K gemessen mit zwei Signalen bei 15,16 ppm (24 Hz, 2,680522 x 1010) und ein weiteres bei 15,11 ppm (21 Hz, 2,084037 x 1010). Spektrum B, mit 2.000 aufaddierten Einzelmessungen aufgenommen, zeigt ein Signal mit einer Linienbreite von 280 Hz. Das Integral des Signals ergibt 1,137012 x 1011. Spektrum b mit 1.000 aufaddierten Einzelmessungen zeigt ein Signal bei 15,33 ppm mit einer Linienbreite von 95 Hz (integrierte Signalfläche: 5,713313 x 1010) und ein weiteres Signal bei 15,06 ppm mit einer Linienbreite von ungefähr 33 Hz (integrierte Signalfläche: 2,583737 x 1010).

Die Reduktion der Linienbreite war mit einem Faktor von 1,9 größer als erwartet für eine

temperaturabhängige Verringerung der Probenviskosität. Obwohl die erhaltenen Linienbreiten

noch nicht mit dem Molekulargewicht der monomeren Troponinkomplexe korrelierten, war

die Auflösung für die geplanten Untersuchungen ausreichend.

15,5 15,0

(ppm)

Cys96

Cys96/4

Cys4

16,0 15,0 14,0

(ppm)

Cys96

Cys96/27

Cys27

283K

308K

A B

a b

3. Ergebnisse 63

3.1.8 Temperatur-Abhängigkeit der chemischen Verschiebung und Zuordnung

der 19F-Resonanzen

19F-Resonanzen sind äußerst temperaturempfindlich; die Messung bei höherer Temperatur

resultiert in einer Verschiebung der Signale zu höheren ppm-Werten (Abbildung 20). Alle

verwendeten hcTn-Komplexe, rekonstituiert aus hcTnC C35/84S, hcTnT-WT und entweder

hcTnI-WT, hcTnI A27C/C79S, hcTnI S4C/C79S oder hcTnI C79S, zeigten eine lineare

Abhängigkeit der chemischen Verschiebung der Signale von der Temperatur. Alle 19F-NMR-

Signale einer NMR-Probe verschoben sich parallel bei Temperaturänderung. Unterschiede in

der Steigung wurden nur zwischen Proben unterschiedlicher Zusammensetzung beobachtet.

Das Signal des ebenfalls beobachteten freien Labels verhielt sich in seiner

Temperaturabhängigkeit ähnlich den Kurven für die Proteinsignale der gleichen Probe und

zeigte ebenfalls Unterschiede in der Steigung beim Vergleich verschiedener Proben

miteinander.

Die Zuordnung der Signale in den 19F-NMR-Spektren wurde durch Vergleiche der erhaltenen

Spektren unterschiedlicher Troponin-Komplexe unter unterschiedlichen Bedingungen

erreicht. Die Zuordnung des Signals von PFP-Cys96 war eindeutig, da es das einzige Signal

im Spektrum des hcTn-Komplexes mit hcTnI C79S war (Daten nicht gezeigt). Dieses Signal

verschiebt sich zu niedrigeren ppm-Werten nach Phosphorylierung des hcTn an Ser22 und

Ser23 des hcTnI. Diese phosphorylierungsabhängige Verschiebung musste auch in den

Spektren der Komplexe mit zwei Cysteinen beobachtet werden, da alle hcTn-Komplexe

Cystein 96 enthalten.

Die Zuordnung der Signale im Spektrum zu ihren jeweiligen Cysteinen im hcTnI erfolgte

schrittweise durch Vergleich der chemischen Verschiebung der Signale und ist in

Abbildung 21 A dargestellt. Durch Identifizierung des Signals für Cystein 96 konnte das

entsprechend zweite Signal in den Komplexen entweder dem Cystein 79 (Wildtyp hcTnI),

dem Cystein 4 (hcTnI S4C/C79S) oder dem Cystein 27 (hcTnI A27C/C79S) zugeordnet

werden. Die Signalzuordnung innerhalb einer Probe bei unterschiedlichen Messbedingungen

erfolgte ebenfalls über einen Vergleich der Änderungen des gemeinsamen PFP-Cystein 96

Signals zwischen den Proben verschiedener cTn-Komplexe. So konnten die Signale im

Spektrum der nicht- und phosphorylierten, ionengebundenen und -freien hcTn-Komplexe

zugeordnet werden.

3. Ergebnisse 64

Abbildung 20: Temperatur-Abhängigkeit der chemischen Verschiebung [ppm]

Die Werte der chemischen Verschiebungen bei ver-schiedenen Temperaturen wurden mit einer linearen Regression angepasst. Die Temperaturabhängigkeit des PFP-Cys96 Signals ist dargestellt durch ( ), das Signal für PFP-Cys4 / -Cys27 durch ( ) und das Signal für freies PFP in der Probe durch ( ). Die Schriftfarben der hcTn-Komplexe (rekonstituiert mit hcTnT-WT, hcTnC C35/84S und verschiedenen hcTnI-Proteinen) kennzeichnen die Kurven. s bezeichnet die ermittelte Steigung mit Angabe des Fehlers.

3.1.9 Auswirkung von PKA-abhängiger hcTnI-Phosphorylierung und reversibler

Calciumbindung am hcTnC

Durch Phosphorylierung der beiden Serine (Ser 22 und Ser23) im N-terminalen Arm des

hcTnI und durch Freisetzung oder Bindung divalenter Kationen an hcTnC konnten

signifikante Änderungen im NMR-Spektrum beobachtet werden. Hierbei zeigten die

verschiedenen untersuchten hcTn-Komplexe unterschiedliche Auswirkungen auf die

chemische Verschiebung der Signale (Abbildung 21 B) und auf ihre Linienbreiten.

Ionenfreisetzung an der calciumbindenden Untereinheit des Troponins, dem hcTnC, führte in

dephosphorylierten hcTn-Komplexen zur Verschiebung des Signals PFP-Cys96 um 0,08 ppm

zu höheren Feldern (niedrigere ppm-Werte). Mit phosphorylierten Komplexen wurde das

Signal von PFP-markiertem PFP-Cys96 um 0,06 ppm zu höheren Feldern verschoben.

hcTnC C35/84S war vollständig Ionen-frei, da eine zusätzliche Gabe von EDTA keine

weiteren signifikanten Änderungen der chemischen Verschiebung für das Signal des PFP-

Cys96 in nicht- als auch phosphorylierten Komplexen zeigte (Daten nicht gezeigt).

PFP-Cys in cTn-Komplexen Steigung [x 10-3] mit TnI-WT; Cys96 16,63 ± 0,887 mit TnI-WT; Cys79 16,90 ± 0,529 mit TnI-WT; freies PFP 20,53 ± 0,598 mit TnI S4C/C79S; Cys96 17,25 ± 0,601 mit TnI S4C/C79S; Cys4 16,89 ± 0,296 mit TnI S4C/C79S; freies PFP 19,25 ± 0,421 mit TnI A27C/C79S; Cys96 16,32 ± 0,462 mit TnI A27C/C79S; Cys27 11,35 ± 0,143 mit TnI C79S; Cys96 11,59 ± 0,669 mit TnI C79S; freies PFP 12,56 ± 0,963

285 300 315 330 3452.0

2.5

3.0

3.5

4.014.5

15.0

15.5

16.0

16.5

Temp [K]

chem

isch

e V

ersc

hieb

ung

[ppm

]

3. Ergebnisse 65

15.6 14.8 (ppm)

96 4

+Ionen de-P

- Ionen de-P

+Ionen P

- Ionen P

9627

16 15 14 (ppm)

96 4

96 4

96 4

9627

9627

9627

Cys 96

Cys 4

Cys 27

Abbildung 21: 19F-NMR-Spektren in Abhängigkeit von hcTnI-Phosphorylierung

oder Ionenbindung/Freisetzung am hcTnC

A B

C

19F-NMR Spektren von nicht- (de-P) und von phosphoryliertem (P) hcTn (TnI S4C/C79S, TnC C35/84S, TnT-WT) (Abbildung 21 A, linke Spalte) und hcTn (TnI A27C/C79S, TnC C35/84S, TnT-WT) (Abbildung 21 A, rechte Spalte) in Ionen-gebundenem (+Ionen) oder Ionen-freiem (-Ionen) Zustand des hcTnC werden gezeigt. Alle Spektren wurden bei 308 K mit 1.000 aufaddierten Einzelmessungen aufgenommen (Ausnahme: dephosphoryliertes hcTn mit TnI A27C/C79S, Spektren aus 20.480 aufsummierten Einzelmessungen). Für die Messungen wurde ca. 30 µMol nicht-phosphorylierter und 60 µMol phosphorylierter hcTn-Komplex mit hcTnI S4C/C79S bzw. 40 µMol nicht-phosphorylierter und 90 µMol phosphorylierter Komplex mit hcTnI A27C/C79S eingesetzt. Abbildung B gibt die Änderungen der chemischen Verschiebung der 19F-Resonanzen symbolisch durch Pfeile in Richtung der Verschiebung für die drei verschiedenen Signale (Cystein 96; Cystein 4 und Cystein 27) wieder. Hierbei sind Änderungen durch Phosphorylierung mit roten, durch eine vollständige Ionenfreisetzung am hcTnC in dephosphorylierten Komplexen mit schwarzen und in phosphorylierten Komplexen mit blauen Pfeilen visualisiert. Die Länge der Pfeile deutete das Ausmaß der chemischen Verschiebung an. Werte für das Cystein 96 Signal wurden aus den beiden unterschiedlichen Komplexen gemittelt. Teilabbildung C gibt die chemische Verschiebung der PFP-Resonanzen in [ppm] für die zwei Signale (Cys96 / Cys4 oder Cys96 / Cys27) der entsprechenden Proben wieder.

Durch Phosphorylierung des hcTnI verschob sich das Signal des PFP-Cys96 nur geringfügig

(0,04 ppm) zu höheren Feldern (Abbildung 21 B und C).

Die Resonanz des PFP-Cys4 verschob sich um 0,10 ppm zu niedrigeren Feldern (höhere ppm-

Werte) infolge Bisphosphorylierung des hcTnI im hcTn-Komplex (Abbildung 21 B und C).

Probe: hcTn (TnT-WT; TnC C35/84S; TnI …

Cys96 [ppm]

Cys4/27 [ppm]

S4C/C79S)+Ionen 15,156 15,007 S4C/C79S)–Ionen 15,123 14,997 S4C/C79S-P)+Ionen 15,111 15,160 S4C/C79S-P)–Ionen 15,014 15,102 A27C/C79S)+Ionen 15,085 15,297 A27C/C79S)–Ionen 14,950 15,137 A27C/C79S-P)+Ionen 15,058 15,322 A27C/C79S-P)–Ionen 15,010 15,182

3. Ergebnisse 66

Ionen-Freisetzung am hcTnC beeinflusste die chemische Verschiebung des PFP-Cys4-Signals

nur dann, wenn hcTnI bisphosphoryliert vorlag. Das Signal wurde um 0,10 ppm zu höheren

Feldern verschoben. Dagegen hatte in nicht-phosphoryliertem hcTn die Ionenfreisetzung

keine Auswirkung auf das Signal (Abbildung 21 B).

Das Signal des PFP-Cystein 27 wurde nur geringfügig, nämlich um 0,025 ppm zu niedrigeren

Feldern durch die Phosphorylierung des hcTnI verschoben. Im Gegensatz dazu führte Ionen-

freisetzung am hcTnC zu signifikanten Verschiebungen der PFP-Cys27 Resonanz zu höheren

Feldern; in dephosphoryliertem hcTn wurde die Resonanz um 0,16 ppm und in

phosphoryliertem hcTn um 0,14 ppm verschoben.

Aussagen über Änderungen der Linienbreite der Signale waren nicht in allen Spektren

möglich, da sich zum Einen teilweise die Signale überlappten, oder die Auflösung nicht gut

genug war (Abbildung 21 A). In Spektren von nicht-phosphoryliertem hcTn (cTnI

S4C/C79S, cTnC C35/84S, TnT-WT) erfolgte eine Abnahme der Linienbreite des PFP-Cys96

Signals um ca. 35 % bei Ionenfreisetzung am hcTnC. Die Linienbreite des PFP-Cys4 Signals

in nicht-phosphoryliertem hcTn änderte sich nicht durch Ionen. Die Auswirkungen der

Ionenfreisetzung am hcTnC in phosphoryliertem hcTn auf die Linienbreite des PFP-Cys4

Signals konnten nicht untersucht werden. Auswirkungen der hcTnI-Phosphorylierung lagen in

einer tendenziellen Verringerung der Linienbreite, konnten jedoch aufgrund der nicht

optimalen Auflösung nicht eindeutig bestimmt werden.

Für nicht-phosphoryliertes hcTn mit hcTnI A27C/C79S konnte eine Änderung der Linien-

breite des PFP-Cys96 Signals durch Ionen nicht detektiert werden. Infolge hcTnI-Phosphory-

lierung reduzierte sich die Linienbreite des PFP-Cys96 Signals deutlich (Reduktion um ca.

40 %), was tendentiell in den Spektren beider hcTn-Komplexe beobachtet werden konnte.

Änderungen der Linienbreite des PFP-Cys27 Signals ließen sich nicht eindeutig nachweisen,

es zeigte jedoch die Tendenz einer Verringerung der Linienbreite sowohl im nicht-, als auch

im phosphorylierten hcTn-Komplex bei Ionenfreisetzung. Durch Phosphorylierung schien das

Signal des PFP-Cystein 27 eine geringe Linienbreitenverringerung um 17 % zu erfahren.

3.2 Strukturänderungen im hcTnC durch Einbindung in den hcTn-Komplex

und durch hcTnI-Phosphorylierung, untersucht mit Hilfe mehrdimen-

sionaler NMR

Um molekulare Änderungen im Troponin-Komplex infolge der hcTnI-Phosphorylierung

detektieren zu können, sollten Strukturanalysen mit Hilfe mehrdimensionaler NMR-

3. Ergebnisse 67

Experimente durchgeführt werden. Da der Holotroponin-Komplex für eine

Strukturaufklärung in Lösung zu groß ist, müssen sukzessiv die einzelnen Untereinheiten im

Komplex analysiert werden. So sollten Änderungen in der Struktur der hcTnC-Untereinheit

durch Phosphorylierung untersucht werden. Zur vollständigen Zuordnung der Signale müsste

hcTnC mit 15N, 2H und 13C markiert werden. Zunächst wurde hcTnC 15N-markiert, dann

zusätzlich mit 2H. Um den trimeren Troponinkomplex für die NMR-Untersuchungen so klein

wie möglich zu halten und um Aggregation zu verhindern, wurde außerdem eine Deletions-

Proteinmutante des hcTnT verwendet, hcTnT 185-291. Ferner wurde zur Rekonstitution eine

Serin-Aspartat-Austausch-Proteinmutante des hcTnI, hcTnI S22/23D, verwendet. Diese

Proteinmutante imitierte bisphosphoryliertes hcTnI und ließ unvollständige oder sogar

unspezifische Phosphorylierungen bei der in vitro Phosphorylierung mit der Proteinkinase A

vermeiden.

3.2.1 Expression und Reinigung des markierten hcTnC C35/84S

Die Ausbeute an 15N-markiertem hcTnC C35/84S in gekauftem Minimalmedium war so

gering (ca. 3 mg / Fermentation in 1,5 l Kulturmedium), dass sich die hohen Kosten für dieses

Medium nicht rentierten und eine Optimierung der Proteinexpression durch

Medienoptimierung und Verwendung anderer Bakterienstämme vonnöten war.

Zum Einen wurde ein spezieller Bakterienstamm, nämlich E. coli BL21Gold(DE3) pLysS

(Stratagene), verwendet, welcher besser geeignet ist, in markiertem Minimalmedium zu

wachsen. Zudem wurden die geeignetsten Bakterien für die Kultivierung im Minimalmedium

selektiert ( 2.1.6.3.2). Zum Anderen wurden Minimalmedien mit 15N-NH4Cl nach einem

Standardprotokoll selbst zusammengesetzt ( 2.1.6.3.1). Aber auch in diesen Medien wuchsen

die Bakterien nur sehr langsam und die Expression des hcTnC C35/84S verringerte sich

drastisch. So wurden weiterhin die Wuchsbedingungen der Bakterien optimiert, indem einige

Salze (z.B. NaCl, MgSO4, CaCl2), sowie Glukose und SL-Mix, in doppelter Menge eingesetzt

wurden. Das Anwachsen der Bakterien konnte von einer Dichte von OD600 = 0,3 in 20 h bei

Standardexpressionsbedingungen auf OD600 = 1,2 in 18 h unter Verwendung des optimierten

Minimalmediums im Bioreaktor verbessert werden. Daraufhin mussten Expressionsraten und

Ausbeute an 15N-hcTnC C35/84S erhöht werden. Es zeigte sich für eine möglichst hohe

Expressionsrate als günstig, die Inkubationszeit auf mindestens 8 - 10 h zu verlängern und die

IPTG-Konzentration auf 0,6 mM IPTG zu erhöhen. Die zusätzliche Markierung mit

Deuterium resultierte zunächst erneut in einer drastischen Reduktion des Bakterienwuches

3. Ergebnisse 68

und der Proteinmenge. Zur Optimierung wurden erneut Bakterienklone von E. coli BL21

Gold(DE3) pLysS selektiert ( 2.1.6.3.2), welche besser als andere in dem 15N,2H-markierten

Minimalmedium wuchsen und eine gute Expressionsrate zeigten (Tabelle 7). Auch eine

Reduktion des Deuteriumgehalts im Medium von 100 % auf 80 % resultierte in einer

deutlichen Verbesserung des Bakterienwuchses und der Expressionsrate (Abbildung 22).

Abbildung 22: Überprüfung der Expression von 15N,2H-hcTnC C35/84S mittels SDS-PAGE

A B

0h 2h 4h 6h 6h üN üN bcTn bcTn üN - + + + - + - +

Abbildung A zeigt die hcTnC C35/84S Expression in kleinen Testvolumina von Expressionschecks ( 2.1.6.1), Abbildung B die Expression im Bioreaktor ( 2.1.6.3). Die erste Beschriftungszeile gibt die Zeit der IPTG-Induktion in Stunden bzw. als Zeitraum über Nacht (üN) (ca. 10 – 12 h) an. „-„ kennzeichnete nicht induzierte, „+“ mit IPTG induzierte Proben. bcTn kennzeichnet Rinderherz-Troponin als Standard (in A: 17 µg, in B: 24 µg aufgetragen).

Die Reinigung des markierten hcTnC C35/84S konnte nach Standardprotokoll für hcTnC

C35/84S durchgeführt werden ( 2.2.4). Es konnten durchschnittliche Proteinmengen von

hcTnC C35/84S von 34 mg / l Minimalmedium bei 15N-Markierung und von 15 mg / l

Bakterienkultur bei 15N,2H-Markierung erhalten werden (Tabelle 7).

Tabelle 7: Mittlere Proteinausbeuten [mg / l Bakterienkultur] bei der Reinigung

Protein Ausbeute pro 1l Bakterienkultur in [mg] n hcTnI-WT 13 ± 7 7 hcTnI-S22/23D 4 ± 1 4 hcTnT 185 - 291 23 ± 8 5 hcTnC-C35/84S 44 ± 7 5 hcTnC-C35/84S-15N 34 ± 20 (Fermentation) 4 hcTnC-C35/84S-15N-2H 15 ± 11 (Fermentation) 3

Spalte „Protein“ bezeichnet die verschiedenen Wildtyp- oder Proteinmutanten der verwendeten Troponin-Untereinheiten, „n“ gibt die Anzahl der gemittelten Reinigungen an.

bcTnT

bcTnI

bcTnC

3. Ergebnisse 69

Die Reinigung der hcTnI-Proteine wurden nach Standardprotokoll ( 2.2.3) durchgeführt. Die

Ausbeute der hcTnI S22/23D-Proteinmutante war um ca. 60 -70 % geringer als die des hcTnI-

WT-Proteins (Tabelle 7).

Dies konnte, wie schon für hcTnI C79S beobachtet, auf eine geringere Expressionsrate

zurückgeführt werden (Daten nicht gezeigt). Die Proteinausbeute an hcTnT 185 – 291

(Tabelle 7) zeigte nach Reinigung ( 2.2.2) ähnliche Ausbeuten wie das Wildtyp-Protein

(Tabelle 4).

Alle Isolierungen und Reinigungen der für die mehrdimensionalen NMR-Untersuchungen

verwendeten hcTn-Untereinheiten resultierten in ca. 98 % sauberem Protein (Abbildung 23).

Abbildung 23: Überprüfung der Proteinreinigung für 2D-NMR mittels SDS-PAGE

bcTn hcTn TnC TnT∆ TnI M

Das Gel zeigt neben Rinderherztroponin (14 µg) als Standard (bcTn) einen rekonstituierten hcTn-Komplex (hcTn; 12 µg) aus 15N,2H-hcTnC C35/84S (TnC; 18 µg), hcTnI S22/23D (TnI; 11 µg) und hcTnT 185 – 291 (TnT∆; 11 µg) und die einzelnen Tn-Untereinheiten vor Rekonstitution. „M“ kennzeichnet den Molekulargewichtsstandard (3 µg; MBI Fermentas, Protein Ladder 20 – 120 kDa). Molekulargewichte sind angegeben.

3.2.2 Überprüfung des Markierungsgrades des hcTnC C35/84S

Gereinigtes markiertes hcTnC C35/84 wurde mit Hilfe der Massenspektrometrie auf seinen

Markierungsgrad überprüft (Abbildung 24). Die durch Berechnung erwarteten Massen von

hcTnC C35/84S wurden in Tabelle 8 wiedergegeben, ebenso wie die gemessenen Werte. Die

gemessenen Werte für die Proteindoppelmutante des hcTnC (hcTnC C35/84S) stimmten sehr

gut mit den berechneten überein. 92,5 % des Proteins waren mit 15N- markiert. Die gemessene

Masse war nur 15,6 Da geringer, als die berechnete (Tabelle 8).

bcTnT

bcTnI

bcTnC

30 kDa

25 kDa

20 kDa

3. Ergebnisse 70

Der Markierungsgrad mit den einzelnen Isotopen im 15N,2H-hcTnC C35/84S ist nur

abschätzbar. Unter der Annahme, dass die Markierung des Proteins mit 15N- im doppelt

markierten hcTnC ähnlich verlief wie im 15N-markierten Protein, erfolgte die 2H-Markierung

zu 52,4 %.

Tabelle 8: Massen von verschiedenen hcTnC-Proteinen

Probe Errechnete Masse in [Da] gemessene Masse in [Da] hcTnC-WT 18401,5 - hcTnC C35/84S 18369,5 18369,9 15N-hcTnC C35/84S 18578,5 18562,9 2H;15N-hcTnC C35/84S 19820,5 19213,8

Abbildung 24: Massenbestimmung von hcTnC C35/84S-Proben

Die Spektren zeigen die gemessene Masse von unmarkiertem (A), 15N-markiertem hcTnC C35/84S (B) und von zwei Proben mit doppelt markiertem 15N,2H-hcTnC C35/84S (C; D). Massen wurden in Da angegeben.

Sowohl bei der nativen Gelelektrophorese (Abbildung 25 A), als auch bei der SDS-PAGE

(Abbildung 25 B) konnte ein Laufweitenunterschied zwischen unmarkierten und 15N,2H-

markierten hcTnC C35/84S-Proben beobachtet werden. Hierbei war festzustellen, dass sich

die Markierung des hcTnC C35/84S sowohl in regulären SDS-Gelen als auch bei nicht-

denaturierenden Gelen in einer Verringerung der Laufweite auswirkte (Abbildung 25).

# 1 RT: 0.00 P: + NL: 1.30E6T: + p Full m s [ 500.00-2000.00]

17600 17800 18000 18200 18400 18600 18800 19000 19200 19400 19600 19800 20000 20200 20400m as s

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

19210.3

C: 19.210,3 Da 15N,2H-

# 1 RT: 0.00 P: + NL: 5.74E6T: + p Full m s [ 500.00-2000.00]

17000 17200 17400 17600 17800 18000 18200 18400 18600 18800 19000 19200 19400 19600 19800 20000m ass

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

18369.9

18474.3

18545.9

A: 18.369,9 Da

unmarkiert

# 1 RT: 0.00 P: + NL: 2.83E6T: + p Full m s [ 500.00-2000.00]

17600 17800 18000 18200 18400 18600 18800 19000 19200 19400 19600 19800 20000 20200 20400m as s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

19208.7

D: 19.208,7 Da 15N,2H-

B: 18.562,9 Da 15N-

# 1 RT: 0.00 P: + NL: 2.43E6T: + p Full m s [ 500.00-2000.00]

17000 17200 17400 17600 17800 18000 18200 18400 18600 18800 19000 19200 19400 19600 19800 20000m ass

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

18562.9

18000 20000

18000 20000Masse [Da] 18000 20000

100

15

Masse [Da]

rela

tive

Häu

figke

it [%

]

100

10

100

0 18000 20000

100

0

rela

tive

Häu

figke

it [%

]

3. Ergebnisse 71

Wurden die unterschiedlichen hcTnC-Proteine in molaren Verhältnissen von 1:3, 1:1 und 3:1

von doppelt-markiertem zu unmarkiertem Protein gemischt, veränderten sich auch die

Laufweiten, da die Banden auf den Gelen anteilsmäßig entsprechend Zwischenstufen der

Laufweiten zwischen der maximalen Laufweite bei markierter und minimaler Laufweite bei

unmarkierter Probe aufwiesen. Die Molekulargewichtsbestimmung der Proteine im SDS-Gel

(Abbildung 25 B) ergab Werte von 15,67 bis 16,44 kDa für das unmarkierte hcTnC C35/84S

und 16,48 bis 17,30 kDa für das markiert Protein.

Abbildung 25: Überprüfung der Markierung von 15N,2H hcTnC C35/84S mittels PAGE

BSA bC CL C CL:C CL:C CL:C CL C CL:C CL:C CL:C CL C M bcTn 3: 1 1:1 1:3 1:3 1:1 3:1

Auf nativen Gelen (A) und SDS-Gelen (B) wurde 15N,2H-hcTnC C35/84S (CL) und nicht markiertes hcTnC C35/84S (C) aufgetragen. Die Proteinproben wurden auf nativen Gelen (A, je 5 µg) wie auf SDS-Gelen (B, je 8 µg) entweder als reine Probe oder in den angegebenen Mischungsverhältnissen (3:1, 1:1 bzw. 1:3) aufgetragen. Als Laufweitenstandard auf nativen Gelen (A) kennzeichnet „BSA“ Rinder Serum Albumin [10 µg] und „bC“ Rinder Catalase [12 µg]. 10 µg Rinderherztroponin wurde als Standard „bcTn“ auf das SDS-Gel aufgetragen. Spur „M“ kennzeichnet 2 µl Molekulargewichtsstandard; Molekulargewichte sind auf dem SDS-Gel in [kDa] angegeben, Laufweiten der Markerbanden durch rote Markierungen gekennzeichnet.

Der gemittelte Laufweitenunterschied zwischen un- und doppelt-markierten Proben resultierte

in einer Größendifferenz von 0,84 kDa, was auch durch Massenspektrometrie als Differenz

zwischen gemessenen Proben mit 15N,2H- und unmarkiertem hcTnC C35/84S bestimmt

werden konnte (Tabelle 8).

Nach Überprüfung des Markierungsgrades des hcTnC C35/84S wurden die verschiedenen

Komplexe für die mehrdimensionalen NMR-Experimente rekonstituiert und gereinigt ( 2.2.11;

Abbildung 26).

Alle verwendeten hcTn-Komplexe konnten wie nicht-markierte Wildtyp Komplexe

rekonstituiert werden und zeigten molare Verhältnisse von 1 : 1 : 1 für hcTnT : hcTnI : hcTnC

(Daten nicht gezeigt).

A B

40

30

25 20

TnT

TnI

TnC

3. Ergebnisse 72

Abbildung 26: Rekonstitutions-Überprüfung von 15N,2H-markiertem hcTn mitels SDS-PAGE

Das SDS-Gel zeigt Fraktionen von hcTn (TnI-WT, TnT 185 – 291; 15N,2H-TnC C35/84S) nach Gelfiltrationsreinigung, 5 µl eines 10 – 200 kDa MW-Markers (M), wobei Molekulargewichte in [kDa] angegeben wurden. Rinderherztroponin wurde als Standard aufgetragen (18 µg, bcTn).

3.2.3 Probenvorbereitung für mehrdimensionale NMR-Untersuchungen

15N,2H-markiertes hcTnC C35/84S zeigte wie das unmarkierte Protein ( 3.1.1, Abbildung 8)

eine calciumabhängige Mobilität in SDS-Gelen (Abbildung 27 A); diese lag sowohl in

isoliertem 15N,2H-hcTnC C35/84S vor, als auch nach Rekonstitution der entsprechenden

hcTn-Komplexe für die mehrdimensionalen NMR-Untersuchungen (Abbildung 27 A). Die

calciumabhängige Mobilität ist auch in hcTn-Komplexen in nativen Gelen erkennbar, wie

beispielhaft für hcTn (TnI S22/23D, TnT 185 – 291, 15N,2H-TnC C35/84S) gezeigt

(Abbildung 27 B). Die Unterschiede in der Laufstrecke von Calcium-freien und Calcium-

gesättigten Komplexen entsprechen dabei fast den detektierten Differenzen beobachtet mit der

isolierten Untereinheit (Abbildung 27 B). Unterschiede in der Laufweite des internen

Standards BSA waren durch unterschiedliche Laufzeiten der Gelelektrophorese zu erklären

(Abbildung 27 B, BSA). Die Auftrennung von hcTnC C35/84S-Proben auf nicht-denaturie-

renden Gelen erfolgte schneller als mit hcTn-Proben, deswegen wurde eine geringere

Elektrophoresedauer gewählt.

Gelfiltrationsfraktionen M bcTn

bcTnT

bcTnI

bcTnC

hcTnI-WT

hcTnC C35/84S

hcTnT 185-291

50 kDa

40 kDa 30 kDa

25 kDa

20 kDa 15 kDa

3. Ergebnisse 73

Abbildung 27: Untersuchung der Calciummobilität auf SDS- und nativen Gelen

M bcTn WT WT DD DD TnC TnC bcTn DD DD BSA C C bC BSA Std + - + - + - Std + - + -

Teilabbildung A zeigt die calciumabhängigen Laufstrecken (2.3.4) von isoliertem 15N,2H-hcTnC C35/84S (TnC) [10 µg] und von hcTn mit TnT 185 - 291, 15N,2H-TnC C35/84S und entweder hcTnI-WT (WT) [8 µg] oder hcTnI S22/23D (DD) [12 µg]. Spur „M“ kennzeichnet 5 µl des 10 - 200 kDa-MW Markers (Molekulargewichte in kDa angegeben) und „bcTn-Std“ je ca. 15 µg des Rinder cTn-Standards. Teilabbildung B zeigt die Calciummobilität bei nativer Gelelektrophorese ( 2.3.3). Die Spuren „BSA“ enthielten 6 bzw. 8 µg Rinder Serum Albumin und die Spur „bC“ enthielt 10 µg Rinder Catalase. „DD“ kennzeichnete Spuren in denen 4 µg cTn (TnI S22/23D, TnT-WT, 15N,2H-TnC C35/84S), „C“ solche, in denen isoliertes 15N,2H-hcTnC C35/84S (8 µg) aufgetragen wurde. In beiden Teilabbildungen beschreibt „+“ die Zugabe von 200 µM CaCl2 zur Probe und „-“ die Zugabe von 4 mM EGTA und EDTA.

Mit Hilfe der CD-Spektroskopie wurde geprüft, ob die Markierung des Proteins dessen

Sekundärstruktur beeinflusst (Abbildung 28). Die Elliptizität ändert sich linear mit der

Proteinkonzentration (Abbildung 28 A). 1:1-Verdünnungen der Proteinkonzentration in der

Probe führten zu einer 50 %igen Abnahme der Elliptizität. So wurde zum Beispiel das

Minimum bei 208 nm von θ = -1,62 x 10-4, erhalten mit einer Proteinkonzentration von

0,2 mg/ml, auf θ = -0,94 x 10-4 durch Verdünnung der Proteinkonzentration auf 0,1 mg/ml

reduziert. Berücksichtigt man die Konzentration der Probe bei der Berechnung der Elliptizität,

in θMRW („mean residue weight“ = mittleres Residuengewicht der Elliptizität) umgerechnet,

so fallen wie erwartet alle gemessenen CD-Spektren aufeinander (Abbildung 28 B).

Markiertes und nicht-markiertes hcTnC C35/84S ergaben CD-Spektren mit 2 Minima bei

208 nm und 222 nm, charakteristisch für α-Helix (Abbildung 29 A; B). Nur geringfügige

Verschiebungen der Minima wurden detektiert; so lag das Minimum im CD-Spektrum des

nicht-markierten hcTnC C35/84S bei 205 nm, das Minimum erhalten mit 15N,2H-hcTnC

C35/84S bei 207 nm (Vergleiche Abbildung 29 A & B).

TnT

TnI

TnC

50 40 30

25

20 15

A B

3. Ergebnisse 74

Abbildung 28: Konzentrationsabhängigkeit der durch CD bestimmten Elliptizitäten

A B

Spektrum A zeigt die gemessenen Elliptizitäten von 15N,2H-hcTnC C35/84S in verschiedenen Konzentrationen (wie angegeben zwischen 0,2 mg/ml und 0,025 mg/ml). Spektrum B zeigt die gemessenen Elliptizitäten aus dieser Konzentrationsreihe unter Einbeziehung der Proteinkonzentration, in θMRW umgerechnet ( 2.3.14).

Markiertes hcTnC C35/84S wies eine Zunahme der Elliptizitätswerte um ca. 39 % zu

unmarkiertem hcTnC C35/84S auf (Vergleiche Abbildung 29 A & B). Eine Reduktion der

Elliptizitäten (Zunahme der Elliptizitätswerte) infolge der Markierung des hcTnC C35/84S,

wie für isoliertes 15N,2H-hcTnC C35/84S beobachtet, erfolgte nicht in cTn-Komplexen. Hier

wurde nur eine mit 5 % geringfügige Zunahme der Elliptizitätswerte verzeichnet (Vergleiche

Abbildung 29 C & D).

Durch die Einbindung des isolierten hcTnC C35/84S in den hcTn-Komplex wurde bei nicht-

markiertem Protein eine 33 %ige Zunahme und bei markiertem Protein eine 12 %ige Ab-

nahme der Elliptizitätswerte bei 208 nm beobachtet (Vergleiche Abbildung 29 A & C und B

& D). Phosphorylierung des hcTnI im nicht-markierten Holotroponin-Komplex resultierte in

nur einer geringfügigen Zunahme der Elliptizitätswerte um 7 % (Vergleiche Abbildung 29 C

& E). Phosphoryliertes hcTn (TnI-WT, TnT 185 - 291, TnC C35/84S) wies zudem eine sehr

geringe Ausprägung der für α-Helix charakteristischen Minima bei 208 nm und 222 nm auf.

Die Verwendung der hcTnI S22/23D Austausch-Proteinmutante in markiertem hcTn

resultierte in einer 25 %igen Abnahme der Elliptizitätswerte bei Vergleich mit markiertem

hcTn mit hcTnI-WT (Vergleiche Abbildung 29 D & F) und einer 23 %igen Abnahme der

Elliptizitätswerte bei Vergleich mit hcTn mit phosphoryliertem hcTnI (Vergleiche Abbildung

29 E & F).

200 210 220 230 240 250

-2.0×10-4

-1.5×10-4

-1.0×10-4

-5.0×10-3

0

5.0×103

λ [nm]

θ [d

eg D

a cm

-1] 0,025

0,05 0,1

0,2

200 210 220 230 240 250

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

3. Ergebnisse 75

Zudem waren für hcTnI S22/23D enthaltende hcTn-Komplexe die α-Helix kennzeichnenden

Minima bei 208 nm und 222 nm ausgeprägter als im Komplex, welcher PKA-phosphoryliert

wurde (Vergleiche Abbildung 29 E & F).

Ionenfreisetzung am hcTnC C35/84S führte bei der isolierten TnC-Untereinheit als auch bei

hcTnC in hcTn-Komplexen zu einer Zunahme der Elliptizitäten im Bereich 202 nm – 230 nm.

Die Elliptizitäten erhöhten sich bei ca. 208 nm um 16 % und bei ca. 222 nm um 17 %

(gemittelt aus allen Messungen).

Ionenfreisetzung vom hcTnC C35/84S führte in hcTn-Komplexen zu fast identischen

Veränderungen, wie für die isolierten TnC-Untereinheiten beobachtet wurde und auch mit den

verschiedenen hcTn-Komplexen wurden fast identische CD-Spektren erhalten.

Die prozentualen Anteile an α-Helix wurde in einem Wellenlängenbereich von 200 – 240 nm

anhand der Elliptizitäten bei 208 und 222 nm Wellenlänge mit Hilfe des Programms

„SOMCD“ berechnet ( 2.3.14). Die Bestimmung der α-Helix-Anteile wurde in diesem

Bereich, welcher sich durch die Linearität der Spannung [Volt] auszeichnete (Daten nicht

gezeigt), durchgeführt. Die Sekundärstrukturbestimmungen lieferten keine Änderungen in den

Anteilen der prognostizierten Strukturen durch Markierung des hcTnC C35/84S in isoliertem

oder in hcTn eingebundenem Zustand.

Ebenso wurden keine signifikanten Änderungen der berechneten Sekundärstrukturanteile

durch Rekonstitution des hcTnC zum trimeren Komplex, der Phosphorylierung des hcTnI im

Komplex oder der Verwendung von verschiedenen Proteinmutanten festgestellt. Nach

Calciumfreisetzung am hcTnC C35/84S, bestimmt für alle Proteinproben, wurden auch fast

identische Werte an α-Helix-Anteil erhalten, wie im Calcium-gesättigten Zustand.

Es wurden für alle Untersuchungen Werte (inkl. ± Fehlerwert) von ca. 82 % ± 11 %

geschätztem Anteil an α-Helix bei der Sekundärstruktur erhalten. Die Güte der

Sekundärstrukturbestimmung mit Hilfe dieses Programmes wurde als „relative Distanz“

angegeben. Relative Distanzen < 0,25 zeigen eine gute Berechnung und damit verlässliche

Werte an ( 2.3.14).

Einzig die Sekundärstrukturberechnung des isolierten hcTnC C35/84S zeigte einen Wert

knapp größer als 0,25 (Wert = 0,26) für die relative Distanz. Der gemittelte Wert der relativen

Distanz (angegeben mit SEM) lag bei ca. 0,138 ± 0,04.

Die ähnlichen Werte der Parameter (Wellenlänge der Minima und Intensität der Elliptizität)

deuten auf keine signifikanten Unterschiede in der Sekundärstruktur hin. Auswertungen der

Untersuchungen beruhten auf Einzelmessungen.

3. Ergebnisse 76

Abbildung 29: Sekundärstruktur-Untersuchungen mit Hilfe der „Circular Dichroismus“-

Spektroskopie

Gezeigt sind Spektren von isoliertem cTnC C35/84S und Spektren von verschiedenen cTn-Komplexen in nicht- und 15N,2H-markiertem Zustand. Die untersuchten Proteine sind in den einzelnen Spektren angegeben. Proben wurden wie in Kapitel 2.3.14 beschrieben erstellt und untersucht. Die roten Spektren wurden nach Zugabe von 2 mM EDTA (Calciumfreisetzung am hcTnC) erhalten, die schwarzen Spektren stammen von Calcium-gebundenen Proteinen.

3.2.4 Mehrdimensionale NMR-Untersuchungen am hcTnC C35/84S

Als Referenz wurde zunächst 15N-hcTnC C35/84S alleine untersucht (Abbildung 30). In den

TROSY-Spektren von isoliertem 15N-hcTnC C35/84S konnten ca. 75 % der erwarteten 159

Resonanzen (die zwei Proline in der hcTnC Sequenz (161 Aminosäuren) ergeben kein Signal)

aufgelöst werden (Abbildung 30 A).

Die Signale zwischen ca. 7,5 - 8,5 ppm und ca. 118 – 124 ppm chemischer Verschiebung

lagen allerdings besonders dicht beieinander.

A) cTnC C35/84S C) cTn (TnI-WT, TnT 185 - 291, TnC C35/84S) E) cTn (TnI-WT, TnT 185 - 291, TnC C35/84S)-Phos

200 210 220 230 240 250

-3.0×10-4

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

2.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

200 210 220 230 240 250

-3.0×10-4

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

2.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

200 210 220 230 240 250

-3.0×10-4

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

2.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

200 210 220 230 240 250

-3.0×10-4

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

2.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

200 210 220 230 240 250

-3.0×10-4

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

2.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

200 210 220 230 240 250

-3.0×10-4

-2.0×10-4

-1.0×10-4

0

1.0×104

2.0×104

λ [nm]θ MR

W [d

eg c

m2 d

mol

-1]

B) 15N,2H-cTnC C35/84S D) cTn (TnI-WT, TnT 185 - 291, 15N,2H-TnC C35/84S) F) cTn (TnI S22/23D, TnT 185 - 291, 15N,2H-TnC C35/84S)

3. Ergebnisse 77

Abbildung 30: TROSY-Spektren von 15N- und 15N,2H-markiertem cTnC C35/84S

Gezeigt sind TROSY-Spektren von 15N-hcTnC C35/84S (1040 µM; pH 7,4; A) und 15N,2H-hcTnC C35/84S (950 µM; pH 7,3; B). Die Resonanzen der beiden Spektren aus A und B wurden gemeinsam in Spektrum C dargestellt, wobei die Signale des einfach markierten Proteins (blau) auf die des doppelt markierten (rot) verschoben wurden. Das einfach markierte cTnC C35/84S zeigte eine schlechtere Signalauflösung und eine geringere Anzahl an einzelnen Resonanzen als das zusätzlich 2H-markierte. Die Spektren wurden an einem Bruker 600 MHz Spektrometer mit einem QXI Probenkopf bei 296 K gemessen. Abweichend von den Angaben unter 2.3.15.2.2 wurde Spektrum A mit 2048 x 128 und Spektrum B mit 2048 x 1024 Punkten digitaler Auflösung erstellt.

Um die Signale spezifischen NH´s im Protein

zuordnen zu können, muss die Signaldichte

durch weitere Markierung verbessert werden.

So wurde das Protein zusätzlich deuteriert,

um das Rauschen, durch Wasser verursacht,

zu minimieren (Abbildung 30 B). Auf diese

Art und Weise konnte die Auflösung deutlich

verbessert werden. Dies kam besonders in

dem Signal-dichten Bereich um 8 1H-ppm

/ 120 15N-ppm zur Geltung. Insgesamt

konnten so ca. 80 % der Resonanzen

aufgelöst werden. Die Anzahl distinkter

Resonanzen blieb infolge zusätzlicher 2H-

Markierung vergleichbar. Weiterhin zeigten

alle Resonanzen jetzt eine Protonen-

verschiebung zu höheren Feldern um ca. 0,08

ppm und eine 15N-Verschiebung (um ca. 0,34

ppm) zu niedrigeren Feldern (Vergleiche

Spektren 30 A mit B).

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 1H-ppm

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 1H-ppm

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 1H-ppm

A

B

C

3. Ergebnisse 78

Alle Signale zeigten dieselbe Verschiebung, wie durch die Überlagerung der Signale von

Spektren 30 A und B gezeigt wurde (Abbildung 30 C). Dies bedeutete, dass Differenzen in

der chemischen Verschiebung der Signale in den verschiedenen Spektren hauptsächlich auf

Messparameter zurückzuführen waren.

Anschließend wurde die Auswirkung der Rekonstitution des markierten hcTnC C35/84S mit

hcTnI und hcTnT 185 - 291 zum trimeren Tn-Komplex untersucht (Abbildung 31). Wie

erwartet verschlechterte sich die Signalauflösung nach Rekonstitution (um ca. 15 % weniger

distinke Signale), bedingt durch das vergrößerte Molekulargewicht des Komplexes (77.500

Da) (Abbildung 31 A; B). Dieser Effekt war besonders im Bereich hoher Signaldichte bei

ungefähr 8 1H-ppm / 120 15N-ppm zu beobachten gewesen. Auch hier wurde die

Signalauflösung durch zweifache Markierung des hcTnC C35/84S zum 15N,2H-hcTnC

C35/84S verbessert (Abbildung 30 B). Es wurden durch zusätzliche 2H-Markierung ca. 30 %

mehr distinkte Signale erhalten. Wegen der geringen Konzentration der NMR-Probe mit 15N,2H-hcTnC C35/84S im hcTn-Komplex (ca. 63 % geringer als bei 15N-markiertem hcTn

und ca. 80 % geringere Konzentration als bei 15N,2H-hcTnC C35/84S) mussten mehr

Einzelmessungen addiert werden, um gleiche Signal/Rausch-Verhältnisse wie mit der

isolierten 15N,2H-hcTnC-Untereinheit oder dem 15N-markierten Komplex zu erlangen (Daten

nicht gezeigt). Regional nicht dargestellte Signale waren zum Teil auf unterschiedliche

Intensitätsebenen in den zwei Spektren zurückzuführen, zum Teil lagen Signale aufgrund der

geringen Konzentration der Probe im Rauschen.

Rekonstitution des hcTnC C35/84S zum trimeren Komplex resultierte in signifikanten

Änderungen der Resonanzverteilung in den Spektren (Abbildung 31 C; C1). Einige

Änderungen in dem Verteilungsmuster der Resonanzen im TROSY-Spektrum wurden durch

blaue Markierungen kenntlich gemacht.

Isoliertes hcTnC zeigte im Tieffeld bei 10,2 1H-ppm zwei nah beieinanderliegende

Resonanzen, welche im Spektrum des komplexierten hcTnC (nicht-phosphoryliertes hcTn)

nicht auftraten (Abbildung 31 A, siehe Pfeil; C). Die Resonanz bei 8,6 1H-ppm und 107 15N-

ppm änderte ihre chemische Verschiebung durch Komplexierung des hcTnC (Abbildung 31

A, siehe Pfeil; C). Durch Einbindung von hcTnC in den trimeren Komplex wurde eine

Resonanz bei 10,8 1H-ppm und 118 15N-ppm erhalten (Abbildung 31 B, blaue Markierung).

Weiterhin zeigte der Vergleich der Spektren von isoliertem und komplexierten hcTnC

C35/84S, dass sich unter anderem Bereiche um 7,3 1H-ppm und 118 15N-ppm und um

7 1H-ppm und 116 15N-ppm deutlich unterschieden.

3. Ergebnisse 79

Abbildung 31: Änderungen in TROSY-Spek-

tren durch Rekonstitution des 15N-hcTnC C35/84S zum

Holotroponin-Komplex

Vergleich der Spektren von isoliertem 15N- (A; siehe Legende Abbildung 30) markiertem hcTnC C35/84S mit Spektren von 15N- (Β; 480 µM, pH 7,3) markiertem hcTnC C35/84S rekonstituiert zum cTn-Komplex mit hcTnT 185 - 291 und Wildtyp hcTnI. In Spektrum C wurden Resonanzen von isoliertem und komplexierten hcTnC zum direkten Vergleich übereinandergelegt, wobei die Spektren des isolierten hcTnC C35/84S (schwarze Resonanzen) auf die Spektren des rekonstituierten Proteins (rote Resonanzen) verschoben wurden. Blaue Markierungen verdeutlichen beispielhaft Bereiche der Spektren mit signifikanten Abweichungen (B; C). Pfeile zeigen beispielhaft Signale im isolierten hcTnC C35/84S, welche nach Komplexbildung durch Änderung der chemischen Verschiebung verschwinden. C1 stellt den mit einem grünen Quadrat in Spektrum C markierten Bereich bei höherer Signalintensität des isolierten hcTnC dar.

Ebenso zeigte die Signalverteilung im Bereich

um 9,3 1H-ppm und 127 15N-ppm (grüne

Markierung) Differenzen in der chemischen

Verschiebung der Resonanzen (Abbildung 31

C).

Die Resonanzverteilung des isolierten

markierten hcTnC C35/84S (schwarze

Resonanzen) war kompakter als die des zum

Troponin-Komplex rekonstituierten hcTnC

(Abbildung 31 C).

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.00 8.00 7.001H-ppm

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.00 8.00 7.001H-ppm

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.00 8.00 7.001H-ppm

130.00

127.50

125.00

15N-ppm

10.00 9.50 9.00 1H-ppm

A B C

C1

3. Ergebnisse 80

Zur Untersuchung der Auswirkung der hcTnI-Phosphorylierung wurden TROSY-Spektren

von 15N-hcTnC C35/84S in Troponin-Komplexen mit hcTnT 185 – 291 und phosphoryliertem

hcTnI-WT aufgenommen und mit den Spektren des 15N-hcTnC C35/84S in

dephosphoryliertem Troponin verglichen (Abbildung 32 A).

Durch Phosphorylierung der beiden Serinreste im N-terminalen Arm des cTnI wurden

regionale Änderungen in den Spektren des 15N-hcTnC C35/84S erhalten. So zeigte 15N-

hcTnC C35/84S im phosphorylierten Komplex die schon bei isoliertem 15N-hcTnC C35/84S

beobachteten Resonanzen im Tieffeld bei ca. 10,2 1H-ppm und 112 15N-ppm (Abbildung 32

A, siehe Pfeil).

Abbildung 32: Auswirkung der hcTnI-Phosphorylierung auf Spektren von 15N-hcTnC C35/84S

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.00 8.00 7.001H-ppm

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 1H-ppm

Spektrum A zeigt 15N-markiertes hcTnC C35/84S in nicht-phosphorylierten (roten Resonanzen; 480 µM, pH 7,3) und PKA-phosphorylierten (schwarze Resonanzen; 110 µM, pH 7,4) hcTn-Komplexen. Blaue Markierungen kennzeichnen einige der Unterschiede in den Spektren. Grüne Markierungen kennzeichnen Bereiche ähnlicher chemischer Verschiebung von Resonanzen. Spektrum B zeigt einen Vergleich von 15N-hcTnC C35/84S entweder in PKA-phosphorylierten (schwarze Resonanzen) hcTn-Komplexen oder in hcTn mit hcTnI S22/23D (630 µM, pH 7,3; rote Resonanzen). Die übereinandergelegten Spektren zeigen eine annähernd identische Resonanzverteilung.

Weiterhin unterschied sich der Bereich bei 9,5 1H-ppm und 122 15N-ppm oder 7,0 1H-ppm

und 117 15N-ppm Spektren nicht-phosphorylierter und phosphorylierter hcTn-Komplexe

(Abbildung 32 A, blaue Kreise). Bei 10,3 1H-ppm und 113 15N-ppm wurden infolge

Phosphorylierung des hcTnI Resonanzen beobachtet, welche nicht in Spektren von hcTnC in

A B

3. Ergebnisse 81

nicht-phosphorylierten Komplexen erhalten wurden (Abbildung 32 A, siehe Pfeil). Generell

konnte ein sehr ähnliches Verteilungsmuster der Resonanzen nach Phosphorylierung für 15N-hcTnC C35/84S erhalten werden, welches keine so großen Änderungen zeigte, wie

zwischen isoliertem und rekonstituierten 15N-hcTnC C35/84S.

Die Phosphorylierung mit der Proteinkinase A in vitro führt zu heterogenen

Phosphorylierungsformen (mono- und bisphosphorylierte Komplexe). Es ist äußerst

schwierig, vollständig bisphosphoryliertes hcTnI zu erhalten. So stellen die Proteinlösungen

ein Gemisch aus den verschiedenen Phosphorylierungsformen dar, was zu einer schlechteren

Signalauflösung führt. Aus diesem Grund wurden die Serinreste 22 und 23 im hcTnI gegen

Aspartatreste ausgetauscht (hcTnI S22/23D).

Zunächst wurde die Auswirkung der Mutation auf die Spektren des hcTnC C35/84S in

Troponin-Komplexen mit dem hcTnI S22/23D untersucht (Abbildung 32 B).

Es wurde gezeigt, dass sich die Phosphorylierungs-imitierende Aspartat-Proteinmutante des

hcTnI genauso verhält, als wenn eine native Phosphorylierung der beiden Serinreste im

N-terminalen Arm des hcTnI mittels Proteinkinase A vorlag. Die Signale des markierten

hcTnC in den jeweiligen Komplexen zeigten eine fast identische chemische Verschiebung

(Abbildung 32 B). Da die Experimente im Vergleich zeigten, dass keine signifikanten

Unterschiede im TROSY-Spektrum und somit in der Struktur des hcTnC C35/84S bestanden,

wurde für alle weiteren Experimente die hcTnI S22/23D Proteinmutante anstelle des

phosphorylierten hcTnI eingesetzt und in den Komplexen verwendet.

Somit wurden auch beim Vergleich der Spektren nicht-phosphorylierter Komplexe mit

solchen, welche hcTnI S22/23D enthielten (Daten nicht gezeigt), identische Änderungen wie

mit PKA-phosphorylierten Komplexen im Signalmuster erhalten (Abbildung 32).

Ein direkter Vergleich der TROSY Spektren von isoliertem 15N,2H-hcTnC C35/84S mit denen

des 15N,2H-hcTnC C35/84S im bisphosphorylierten Troponin-Komplex (Abbildung 33)

zeigte für beide untersuchten Proben Resonanzen im Tieffeld bei ca. 10,2 1H-ppm und

112 15N-ppm. Dieser Bereich zeigte in vorhergehenden Vergleichen mit hcTnC C35/84S in

nicht-phosphorylierten Troponin-Komplexen keine Signale (Abbildung 31 C bzw.

Abbildung 32 A). Das Signalmuster der hcTnC C35/84S-Spektren phosphorylierter

Komplexe war dem, erhalten mit isoliertem hcTnC, ähnlicher als von hcTnC in nicht-

phosphorylierten Komplexen (Vergleiche Abbildung 31 C mit Abbildung 33 (beispielhaft

wurden entsprechende Bereiche grün markiert)).

3. Ergebnisse 82

Abbildung 33: Vergleich der Spektren von 15N,2H-hcTnC C35/84S, isoliert und in hcTn mit

hcTnI S22/23D eingebunden

Resonanzen von isoliertem 15N,2H-hcTnC C35/84S (950 µM, pH 7,3) sind schwarz, solche von rekonstituiertem 15N,2H-hcTnC C35/84S mit hcTnI S22/23D im Holotroponin (450 µM, pH 7,3) rot. Der Pfeil zeigt ein Signal im Tieffeld, welches in nicht-phosphorylierten hcTn-Komplexen fehlt. Grüne Bereiche kennzeichnen ebenfalls Regionen größerer Ähnlichkeit zwischen den gezeigten überlagerten Spektren, als bei Vergleich mit Spektren nicht-phosphorylierter Komplexe erhalten wurde (Daten nicht gezeigt). Resonanzen von isoliertem hcTnC sind im Bereich um 9,3 1H-ppm und 128 15N-ppm aufgrund zu schwacher Signalintensitäten nicht dargestellt (vergleiche mit Abbildung 31 C1).

3.2.5 Zuordnung einiger Resonanzen in Spektren des 15N,2H-hcTnC C35/84S

Da die Auflösung der Resonanzen in den erhaltenen Spektren nicht ausreichte, um die Signale

vollständig zuordnen zu können, wurden Zuordnungen einzelner Resonanzen mit Hilfe bereits

publizierter Ergebnisse erstellt. Für alle hier untersuchten Formen des cTn-Komplexes gibt es

derzeit noch keine NMR-Analysen. Die in der PDB veröffentlichten NMR-Daten

beschränken sich auf nicht vollständige cTn-Komplexe, bei denen essentielle Regionen

entfernt wurden oder welche aus nur zwei Untereinheiten vorlagen oder beschreiben nur

nicht-phosphorylierte Komplexe.

Es wurden nur solche Daten verwendet, welche aus homologen Proteinen resultierten. So ist

die Sequenz des TnC aus Huhn-Skelettmuskel über 67 % identisch zu der Sequenz von

130.00

125.00

120.00

115.00

110.00

15N-ppm

10.00 9.00 8.00 7.001H-ppm

3. Ergebnisse 83

hcTnC (Abbildung 34). Für die Vergleiche der Daten von hcTnC C35/84S und sTnC vom

Huhn wurden nur solche Sequenzbereiche berücksichtigt, welche zwei oder mehr

zusammenhängende identische Aminosäuren aufwiesen.

Abbildung 34: Vergleich verschiedener TnC-Sequenzen 1 10 20 30 40 50 60 --MDDIYKAAVEQLTEEQKNEFKAAFDIFVLGAEDGCISTKELGKVMRMLGQNPTPEELQEMID ASMTDQQAEARAFLSEEMIAEFKAAFDMFD-ADGGGDISTKELGTVMRMLGQNPTKEELDAIIE 70 80 90 100 110 120 EVDEDGSGTVDFDEFLVMMVRCMKDDSKGKSEEELSDLFRMFDKNADGYIDLDELKIMLQATGET EVDEDGSGTIDFEEFLVMMVRQMKEDAKGKSEEELANCFRIFDKNADGFIDIEELGEILRATGEH 130 140 150 160 ITEDDIEELMKDGDKNNDGRIDYDEFLEFMKGVE VIEEDIEDLMKDSDKNNDGRIDFDEFLKMMEGVQ

Angegeben wurden die Aminosäuresequenzen als Buchstabencode von cTnC des Menschen (obere Zeile, schwarz) und von sTnC des Huhns (untere Zeile, blau). Die Sequenz des sTnC vom Huhn wurde aus [Slupsky et al., 1995] (BMRB Eintrag 4080) übernommen. Gelbe Bereiche kennzeichnen homologe Regionen. Die Identität beträgt 67,1 % bei Überlappung von 161 Aminosäuren.

Eine Einschränkung bereits publizierter Strukturdaten des TnC stellte das Vorliegen von

Strukturdaten als Raumkoordinaten dar. Diese wurden zunächst mit Hilfe von Programmen

zur Errechnung von chemischen Verschiebungen in mehrdimensionalen 15N,1H-NMR-

Spektren umgerechnet. Da die Abweichungen bei den errechneten Verschiebungen von

denen, gewonnen aus NMR-Experimenten, zu drastisch waren, musste auf solche publizierten

Daten verzichtet werden, welche nur als Raumkoordinaten erhältlich waren (Daten nicht

gezeigt). Es wurden nur Daten für die Struktur des TnC verwendet, welche aus

NMR-Experimenten resultierten und als chemische Verschiebungen angegeben waren.

Zur Zuordnung wurde ein TROSY-Spektrum von 15N,2H-hcTnC C35/84S wurde mit

Resonanzen von Skelettmuskel TnC des Huhns, wie sie von [Slupsky et al., 1995] erhalten

wurden, überlagert (Abbildung 35). Die Resonanzen des sTnC, welche distinkten

Aminosäuren des Proteinrückgrats zuzuordnen waren, sind als unterschiedliche Symbole

dargestellt (Tabelle 9), wobei nur Aminosäuren aus den identischen Sequenzbereichen zu

hcTnC als Symbole repräsentiert sind.

3. Ergebnisse 84

Abbildung 35: Zuordnungsversuch einiger Signale im 15N,2H-hcTnC C35/84S Spektrum

10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.50 7.00 1H-ppm

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

10.50

105.0

110.0

115.0

[ N-ppm]

120.0

125.0

130.0

15

Resonanzen von 15N,2H-hcTnC C35/84S im TROSY Spektrum wurden mit Hilfe der veröffentlichten Resonanzen von sTnC vom Huhn, Calcium-gesättigt aus [Slupsky et al., 1995], über die chemische Verschiebung verglichen. Jedes Symbol kennzeichnete die Resonanz einer distinkte Aminosäure (Tabelle 9). Blaue Kreise markieren mögliche Signal-Übereinstimmungen.

Trotz großem identischen Sequenzbereich der verwendeten Proteine wurden beim Vergleich

der chemischen Verschiebungen der Resonanzen keine identischen Spektren erhalten. Das

Verteilungsmuster der Resonanzen zeigte Differenzen, welche im Bereich höherer

Signaldichte bei ca. 7,3 – 9,0 1H-ppm und 115,0 – 124,0 15N-ppm eine Zuordnung unmöglich

machten.

Im Kernbereich des Spektrums war, durch die hohe Signaldichte bedingt, eine sichere

Zuordnung jedoch nicht möglich. Daher wurden nur einzelne distinkte und sehr exponierte

Resonanzen im peripheren Bereich des Spektrums versucht zuzuordnen.

So wurde die Resonanz bei 8,7 1H-ppm und 106,0 15N-ppm dem Signal des Glycin 42

zugeordnet und die Resonanz bei 7,8 1H-ppm und 107,8 15N-ppm wurde dem benachbarten

Signal des Glycin 49 zugeordnet (durch blaue Kreise gekennzeichnet).

Eine Resonanz bei 10,3 1H-ppm und 114,3 15N-ppm (ebenfalls markiert durch einen blauen

Kreis) wurde aufgrund der kürzeren Distanz dem Glycin 146 zugeordnet. Das zweite, nah bei

der Resonanz des Gly146 liegende Signal, wurde dem Gly110 zugeordnet.

G42

G110

G146

G49

G70

3. Ergebnisse 85

Tabelle 9: Zuordnung von Aminosäurereste des sTnC zu Signalen im Punkteplot

Nach Einbindung des cTnC´s in den Troponin-Komplex wurde die Resonanz des Gly146

nicht mehr bei ca. 10,3 1H-ppm und 114,3 15N-ppm beobachtet (Abbildung 31 C).

Die Resonanz des Gly42 schien sich leicht zu ca. 8,4 1H-ppm und 108 15N-ppm zu

verschieben, für das PFP-Gly49 ließ sich keine Änderung der chemischen Verschiebung

infolge Rekonstitution nachweisen. Dafür wurde die Resonanz des Signals Gly70 stark

verschoben, sodass sie jetzt einer Resonanz im Tieffeld zugeordnet werden konnte.

Erst kürzlich wurden von [Blumenschein et al., 2005] NMR-Experimente an binären und

trimeren Komplexen des Skelettmuskel-Troponins des Huhns beschrieben, welche mit

eigenen Spektren verglichen werden konnten (Abbildung 36).

Der untersuchte trimere sTn-Komplex von [Blumenschein et al., 2005] war fast identisch zu

den in dieser Arbeit untersuchten hcTn-Komplexen, jedoch zeichnet sich die Skelettmuskel-

Isoform des TnI durch das Fehlen des herzspezifischen N-terminalen Armes aus

(Abbildung 36, schwarze Resonanzen). Vom Autor zugeordnete Resonanzen des sTnC

weisen eine Aminosäureverschiebung von +1 zu der hier verwendeten Sequenz auf.

Verglich man die Spektren des isolierten TnC (Abbildung 35) mit denen des TnC

rekonstituiert zum trimeren Tn-Komplex (Abbildung 36, schwarze Resonanzen) und mit

denen des TnC im Komplex mit TnI 115 – 131 (Abbildung 36, rote Resonanzen), ließ sich in

7,77 8,68 9,22 7,7 7,94 8,82 8,55 9,64

8,77 9,09 7,93 7,72 8,64 8,62 7,53 8,23

8,07 7,72 7,58 7,84 8,14 8,6 8,48 8,77

7,7 7,94 7,46 7,49 7,98 8,55 8,05 7,74

8,59 10,79 7,7 8,2 8,8 7,82 7,33 7,95

8,05 8,41 8,25 8,08 8,36 8,8 8,32 8,04

8,37 7,47 7,74 7,62 8,03 7,89 8,48 10,42

7,93 8,66 8,94 7,84 7,63 7,8 7,91 7,47

7,53 8,07 7,75 8,46 8,24 7,96 8,09 8,02

8,13 7,71 8,55 10,38 7,77 9,37 9,29 7,75

8,71 9,17 8,28 7,98 7,56 V160G159 L154 F153 E152

D151D149I148 R147G146 D145 N144 N143

K142D141D139K138M13 L136 E134 I133

D132E126G125T124A123 L117 E116 E115

G110D109A108N107K106 D105 F104 L97

E96 E95 E94 S93 K92 R83 V82 M81

M80 V79 L78 F77 E76 T71 G70 S69

G68 D67 E66 D65 V64 E63 L57 E56

E55 T53 N51 Q50 G49 L48 M47 R46

M45 V44 G42 L41 E40 K39 T38 S37

I36 D25 F24 A23 A22 K21 F20 E19

3. Ergebnisse 86

allen Spektren eine identische chemische Verschiebung für die Signale des Gly42, Gly49,

Gly70, Gly110 und Gly146 beobachten.

Abbildung 36: NMR-Spektren von TnC C35/84S, eingebunden in binäre oder trimere Komplexe

Dargestellt ist eine Überlagerung von TROSY-Spektren von 15N-hcTnC C35/84S im Holotroponin-Komplex (blaue Resonanzen; 480 µM, pH 7,3) mit 15N-TROSY-HSQC Spektren von sTnC im calciumgebundenen Zustand, rekonstituiert mit der T2-Domäne des sTnT und sTnI zum trimeren Tn-Komplex (schwarze Resonanzen) oder in binären Komplexen mit sTnI 115 -131 (rote Resonanzen) [Blumenschein et al., 2005]. Zuordnungen erfolgten durch [Blumenschein et al., 2005]. Der blaue Kreis kennzeichnet einen Bereich ohne Resonanzen des 15N-hcTnC C35/84S im hcTn, der gelbe Kreis zeigt eine Resonanz im Tieffeld nahe des Signals von Gly71 (= Gly70) in Skelettmuskel-TnC in sTn. Grüne Kreise kennzeichnen Resonanzen, welche auch in isoliertem hcTnC beobachtet wurden.

Die ungefähren chemischen Verschiebungen betrugen 10,3 1H-ppm und 114 15N-ppm für

Gly110 und Gly146, 8,6 1H-ppm und 107 15N-ppm für Gly42. Die Resonanz des Gly49 hat

eine chemische Verschiebung von 7,8 1H-ppm und 108 15N-ppm; das Gly70 befindet sich im

Tieffeld bei ca. 10,8 1H-ppm und 117 15N-ppm (Abbildung 36).

Die stark exponierten Resonanzen der Glycine, welche in Spektren von isoliertem oder in

hcTn-Komplexen eingebundenem hcTnC zugeordnet werden konnten, boten sich an,

Änderungen in NMR-Spektren von hcTnC C35/84S infolge Phosphorylierung des hcTnI zu

p _ _ g p

105

110

115

[15N- ppm]

120

125

130

11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 [1H-ppm]

3. Ergebnisse 87

untersuchen. Dies war besonders interessant, da anscheinend Phosphorylierung des hcTnI

einige Ähnlichkeiten in NMR-Spektren aufwies, wie isoliertes hcTnC. Vergleiche für einen

begrenzten Bereich im Spektrum sind in Abbildung 37 dargestellt.

Eine Resonanz für hcTnC-Gly70 beobachteten wir ausschließlich in rekonstituierten

Holotroponin-Komplexen (vergleiche Abbildung 35 mit Abbildung 37, gelber Kreis).

Hierbei spielte der Phosphorylierungszustand des hcTnI keine Rolle. Im Spektrum vom

isolierten hcTnC war bei dieser Verschiebung kein Signal zu detektieren.

Das Signal für Gly110 wurde nur in phosphorylierten Komplexen oder isoliertem hcTnC

C35/84S detektiert. hcTnC in nicht-phosphoryliertem hcTn zeigte keine Resonanz in diesem

Bereich (Abbildung 37, blauer Kreis), wie es aber bei [Blumenschein et al., 2005] beobachtet

wurde (schwarze punkförmige Resonanz).

Die Resonanzen für Gly42 in isoliertem hcTnC und sowohl in nicht- wie phosphorylierten

hcTn-Komplexen wiesen leichte chemische Verschiebungen auf, wobei die Auswirkung der

Rekonstitution größer war, als die der hcTnI-Phosphorylierung in Bezug auf die Änderung

der chemischen Verschiebung (Abbildung 37, grüner Kreis).

Das Signal des Gly49 bei 7,8 1H-ppm und 108 15N-ppm veränderte sich weder durch

Rekonstitution des hcTnC zum Holotroponin-Komplex, noch durch PKA-abhängige

Phosphorylierung des hcTnI (Abbildung 37, roter Kreis).

Eine Auswirkung der Phosphorylierung des cTnI auf die Struktur des cTnC mit Hilfe NMR-

spektroskopischer Untersuchungen wurde von [Finley et al., 1999] an binären Komplexen aus

cTnC und cTnI (1 – 80) durchgeführt. In diesen Untersuchungen wurde die

Aspartataustausch-Proteinmutante S22/23D verwendet, Effekte der Phosphorylierung auf die

Resonanzen des cTnC darzustellen (Abbildung 39). Es ließ sich eine verblüffende

Ähnlichkeit in der Resonanzverteilung zwischen Spektren von cTnC gebunden an ein

„phosphoryliertes“ cTnI-Peptid und Spektren mit hcTnC im bisphosphorylierten Tn-Komplex

erkennen. Viele Resonanzen konnten aufgrund gegebener Überlagerung zugeordnet werden

(Abbildung 39, blaue Pfeile).

3. Ergebnisse 88

Abbildung 37: Vergleiche von publizierten NMR-Daten mit verschiedenen hcTnC C35/84S

NMR-Untersuchungen

Dargestellt sind Resonanzüberlagerungen von isoliertem hcTnC C35/84S (schwarze Resonanzen) und von hcTnC rekonstituiert im Komplex mit nicht- (rote Resonanzen) und phosphoryliertem hcTnI (lila Resonanzen). Ebenfalls gezeigt sind Resonanzen von sTnC im trimeren Tn-Komplex (schwarze punkförmige Resonanzen) oder in binären Komplexen mit sTnI 115 -131 (grüne Resonanzen) [Blumenschein et al., 2005]. Eingefügt wurden die Symbole für Gly42 ( ), Gly49 ( ), Gly70 ( ), Gly110 ( ) und Gly146 ( ) (Tabelle 9) entsprechend der chemischen Verschiebung ihrer Resonanzen [Slupsky et al., 1995]. Kreise kennzeichnen die analysierten Bereiche und beinhalten alle entsprechenden Resonanzen.

Insgesamt konnten ca. 20 Resonanzen distinkten Aminosäuren zugeordnet werden

(Abbildung 39).

Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen den Spektren wurden auch NMR-Spektren des hcTnC in

nicht-phosphoryliertem Komplex mit Spektren des nicht-phosphorylierten binären Komplexes

[Finley et al., 1999], wie schon für Vergleiche mit Daten des TnC im trimeren Komplex

[Blumenschein et al., 2005] (Abbildung 36) beschrieben, verglichen (Daten nicht gezeigt).

Es wurden weniger und keine neuen Resonanzzuordnungen erreicht (ca. 10 Zuordnungen), als

im phosphorylierten Komplex, jedoch mehr Zuordnungen, als mit sTnC im sTn-Komplex

erreicht werden konnten. Generell ist die Resonanzverteilung zwischen den Spektren der

kardialen Proteine nicht-phosphorylierter Komplexe nicht so gut übereinstimmend, wie für

solche mit phosphoryliertem cTnI.

Resonanzen, welche keine Abhängigkeit der chemischen Verschiebung von der

Phosphorylierung zeigten, wurden Glycinen 49, 70, 91, 140, Thr124 und Asp149 zugeordnet.

Aufgrund möglicherweise nur leichter chemischer Verschiebung wurde keine eindeutige

117.50

115.00

112.50

110.00

107.50

105.00

15N-ppm

10.50 10.00 9.50 9.00 8.50 8.00 7.501H-ppm

nur rekTn

nur Tn-Phos

& TnC

alle Proben

3. Ergebnisse 89

Zuordnung von Resonanzen Gly42, Gly68, Asp73, Asp113, Gly125, Ile148, Phe153 und

Lys158 welche in Spektren mit bisphosphorylierten Komplexen für cTnC zugeordnet werden

konnten, erreicht.

Abbildung 39: Zuordnung von hcTnC Resonanzen in bisphosphoryliertem hcTn-Komplex

Durch Überlagerung von TROSY-Spektren von 15N-hcTnC C35/84S in bisphosphoryliertem trimeren hcTn-Komplex (630 µM, pH 7,3; rote Resonanzen) mit Resonanzen von 15N,2H-cTnC, gebunden an cTnI (1 – 80)DD [Finley et al., 1999], ebenfalls Bisphosphorylierung imitierend, konnten weitere Zuordnungen der Resonanzen erreicht werden (durch blaue Pfeile gekennzeichnet). Farbige Kreise markieren Bereiche von bereits zugeordneten Resonanzen.

Die chemischen Verschiebungen für die Resonanzen der Glycine 110 und 146 sind nicht

mehr an den entsprechenden Positionen im Spektrum lokalisiert; dies wurde ebenfalls für

Gly34, Val79, Lys106, Lys142 und Glu155 beobachtet. Diese Kerne weisen infolge

Phosphorylierung eine geänderte chemische Umgebung auf.

10,4 10,0 9,6 9,2 8,8 8,4 8,0 7,6 7,2 6,8 [1H-ppm]

105 111 117 [15N-ppm] 123 129

3. Ergebnisse 90

Durch Zuordnung exponierter Signale in verschiedenen Spektren des cTnC C35/84S mit Hilfe

bereits veröffentlichter NMR-Daten wurden Änderungen infolge Einbindung des TnC in den

binären oder trimeren Troponin-Komplex oder infolge Phosphorylierung des cTnI, gebunden

an cTnC in binären oder trimeren Komplexen für einige Aminosäuren im Protein beschrieben.

Diese Vergleiche erlaubten nicht, alle übereinanderliegenden oder in der Nähe befindlichen

Resonanzen zuzuordnen; so wurde keine vollständige Zuordnung erreicht. Jedoch konnte

gezeigt werden, dass die Detektion von Änderungen im cTnC mittels NMR-Experimente für

jede Aminosäure möglich ist. Dies bestätigt die Absicht, weitere Markierungen der Proteine

vorzunehmen, um alle Signale zuordnen zu können und den Mechanismus der

Calciumaffinitätserniedrigung am cTnC infolge Bisphosphorylierung des cTnI zu erklären.

4. Diskussion 91

4 Diskussion

In quergestreiften Muskeln vermittelt Troponin, das Hauptregulatorprotein des dünnen

Filamentes, die Calciumabhängigkeit des Kontraktionsprozesses. Im Herzen wird dieser

Regulationsmechanismus über reversible Phosphorylierung verschiedener am Kontrollprozess

beteiligter Proteine moduliert, um die Regulation der Muskelkontraktion spezifischen

Situationen anpassen zu können.

So wird im Herztroponin I durch Proteinkinase A-abhängige Phosphorylierung der beiden

Serinreste 22 und 23 die Calciumaffinität des cTnC [Zhang et al., 1995b; Reiffert et al., 1996]

reduziert und lusitrope Effekte ausgelöst [Übersicht: Metzger & Westfall, 2004]. Der

molekulare Mechanismus ist noch nicht geklärt. Auch die vor Kurzem veröffentlichte atomare

Struktur eines Troponin-Komplexes im Calcium-gebundenen Zustand trug nicht zur Klärung

dieses Problems bei, da in der Kristallstruktur nur zentrale Domänen aufgelöst wurden

[Takeda et al., 2003]. Da auch der N-terminale Arm des cTnI zur Kristallisation entfernt

werden musste, können phosphorylierungsabhängige Strukturänderungen nicht mit Hilfe der

Kristallographie untersucht werden. So konnten durch Kristallstrukturanalysen keine

Erkenntnisse gewonnen werden, welche Rückschlüsse auf Konformationsänderungen des

N-terminalen Armes infolge Phosphorylierung erlauben.

Wir haben daher versucht, mit Hilfe der magnetischen Kernresonanz Einblicke in den

Signaltransduktionsweg von der Phosphorylierungsregion im N-terminalen cTnI-Arm zu der

regulatorischen Calciumbindungsstelle II in der N-terminalen Domäne des cTnC zu

gewinnen.

4.1 Charakterisierung von 19F-NMR-Proben und 19F-NMR-Experimente

Zum Einen wurde die 19F-Kernresonanzspektroskopie gewählt, da der 19F-Kern, ähnlich in

seiner Größe zum Wasserstoffatom, fast genauso sensitiv wie 1H-Kerne auf Änderungen der

chemischen Umgebung reagiert, und seine Resonanzen einen extrem weiten Bereich an

chemischer Verschiebung aufweisen [Sykes & Hull, 1978; Gerig, 1989; Ropson & Frieden,

1992]. Der PFP-Marker [Kalbitzer et al., 1992] enthält 9 Fluorkerne in äquivalenten

Positionen, wodurch die Sensitivität der Messung deutlich erhöht wird. Nachteilig könnte sich

z.B. die Stärke der Kohlenstoff-Fluor-Dipole oder die Größe der Markersonde selbst auf

Struktur und / oder Funktion von Proteinen auswirken. Dies wurde aber in den meisten Fällen

4. Diskussion 92

nicht beobachtet [Gerig, 1989; Li et al., 1989; Kalbitzer et al., 1992; Danielson & Falke,

1996].

Um den PFP-Marker binden zu können, mussten wir Cysteine an den gewünschten Stellen im

N-terminalen Arm einbringen. So wurde entweder ein Serin am N-terminalen Ende des

Armes oder ein Alanin, C-terminal der Phosphorylierungsregion gelegen, gegen ein Cystein

ausgetauscht. Beide Austausche sind konservativ. Um die Zuordnung der Resonanzen so

einfach wie möglich zu halten, wurde im Kernbereich des cTnI ein Cystein an Position 96

gegen ein Serin ausgetauscht. Alle Austauschmutanten ließen sich wie Wildtyp cTnI

exprimieren, obwohl zum Teil die Expressionsrate verringert wurde, was in geringeren

Proteinausbeuten resultierte. Die Mengen an Protein reichten jedoch, um cTn-Komplexe zu

generieren und zu untersuchen.

Bei der Reinigung verhielten sich die Proteinmutanten des cTnI wie Wildtyp cTnI. Die zu

98 % gereinigten rekombinanten Troponin-Untereinheiten wurden zu trimeren Komplexen

rekonstituiert, welche, anhand densitometrischer Auswertung belegt, annähernd das gleiche

äquimolare Verhältnis der Untereinheiten aufwiesen wie natives Troponin aus Rinderherzen

[Greaser & Gergely, 1971; Greaser & Gergely, 1973].

Ob Mutationen im cTnI die Funktionstüchtigkeit des cTn beeinflussen, wurde geprüft, indem

die Akto-S1-ATPase-Aktivität in vitro in Abhängigkeit von der Calcium-Konzentration

bestimmt wurde. Alle verwendeten Troponin-Komplexe zeigten durch Bisphosphorylierung

eine Verringerung der Calciumsensitivität durch eine Verschiebung des pCa50 Wertes zu

kleineren pCa Werten und eine signifikante Verringerung der maximalen Akto-S1-ATPase-

Aktivität, wie auch bei [Zhang et al., 1995b; Reiffert et al., 1996; Deng et al., 2001]

beschrieben. Das Fehlen einer vollständigen ATPase-Hemmung in Abwesenheit von Calcium

(pCa 9,8) beruhte auf unvollständig oder inkorrekt rekonstituierten dünnen Filamenten [Deng

et al., 2001]. Die beobachtete signifikante Erhöhung des y0-Wertes durch cTnI-

Dephosphorylierung wies auf eine veränderte Inhibitionsfähigkeit hin. Diesen Effekte haben

wir in früheren Messungen [Deng et al., 2001] nicht beobachtet, [Elliott et al., 2000]

beschrieben aber Einflüsse auf die basale Aktivität. Auf Grund dieser kontroversen

Beobachtungen ist es fast unmöglich, eine Aussage über die Bedeutung der Änderungen von

y0 durch reversible Phosphorylierung zu machen. Möglicherweise ist die Qualität des aus

Gewebe gereinigten Aktins entscheidend. So wird Aktin von Reinigung zu Reinigung in sehr

unterschiedlichen Konzentrationen erhalten (4 µM - ca. 30 µM). Da Aktin nicht ankon-

zentriert werden kann, beeinflusst die Aktinkonzentration ganz erheblich das Volumen des

4. Diskussion 93

Messansatzes. Auch unterschiedliche Messtemperaturen, wie z. B. 37 °C bei [Elliott et al.,

2000] oder die Rekonstitutionsabläufe, welche die Zusammenlagerung des dünnen Filamentes

beeinflussen [Reiffert et al., 1996] können zu den Differenzen beitragen. Alle Filamente

regulierten jedoch die Akto-S1-ATPase-Aktivität. Darüberhinaus zeigten alle Filamente die

wohlbekannten Phosphorylierungs-abhängigen Effekte: die Erniedrigung der

Calciumsensitivität (um ca. 0,3 pCa-Einheiten) und der maximalen Akto-S1-ATPase-

Aktivität (um ca. 70 %).

Damit Umgebungsänderungen im Bereich der Cysteine detektiert werden können, mussten

alle Cysteine den Fluormarker binden können. Es war wahrscheinlich, dass Cys4 im äußersten

N-terminalen Bereich des flexiblen Armes markierbar ist, für die Cysteine an Position 27 und

96 war die Zugänglichkeit unbekannt.

Photometrisch wurde gezeigt, dass alle Cysteine zugänglich waren. So konnten alle Cysteine

kovalent mit der PFP-Sonde gekoppelt werden. Die vollständige Markierung der Cysteine im

Protein wurde auch direkt in 19F-NMR-Untersuchungen nachgewiesen, da für jedes Cystein

ein 19F-NMR-Signal erhalten wurde.

Für Strukturuntersuchungen ist die Reinheit und Homogenität der Proteinlösungen von

marginaler Bedeutung. Die Reinheit von >98 % konnte gewährleistet werden. Da aber

Troponin sehr leicht aggregiert, ist die Gefahr bei NMR-Untersuchungen sehr groß, aufgrund

der notwendigen hohen Proteinkonzentrationen, inhomogene Proteinlösungen zu erhalten. So

wurde die Homogenität vor und nach Konzentrierung der Proteinlösung mit Hilfe zwei

verschiedener Methoden überprüft. Die Methode der nativen Gelelektrophorese hat den

Nachteil, keine Aussage über den Aggregatzustand des Proteins in Lösung zu erlauben. Wird

nur eine Bande auf dem Gel erhalten, so ist die Proteinlösung zwar homogen, es zeigt aber

nicht, ob ein Protein als Monomer oder z.B. als Dimer vorliegt. So wurde nach

Konzentrierung der Proben zusätzlich die „dynamische Lichtstreuung“ angewandt, welche

eine Möglichkeit darstellte, Aggregatzustände über die Häufigkeit von Molekülen bestimmter

Größe zu detektieren.

Eine in NMR-Experimenten untersuchte Probe (cTn (TnI A27C/C79S, TnT-WT, TnC

C35/84S) zeigte nach Konzentrierung eine zweite Bande auf dem nativen Gel, die ca. 23 %

ausmachte und auf aggregiertes Protein zurückzuführen war, wie mit Hilfe der DLS

nachgewiesen wurde. Die Aggregate konnten nur durch Verdünnung (mindestens 1 : 10)

gelöst werden. NMR-Untersuchungen waren in dieser Verdünnung nicht mehr möglich.

Aggregate ließen sich auch durch Gelfiltration entfernen. Dies erforderte aber eine

4. Diskussion 94

anschließende Konzentrierung, wobei erneut Aggregate gebildet wurden (ca. 20 %). So war es

nicht möglich, cTn mit cTnI A27C/C79S homogen zu erhalten.

Enttäuschenderweise zeigten erste 19F-NMR-Spektren aller Troponin-Komplexe nur ein

Signal mit einer Linienbreite von 80 – 100 Hz. Dies entsprach weder der erwarteten Anzahl

der Signale im Spektrum, noch der erwarteten Linienbreite eines Signals von einem

Proteinkomplex mit 77,5 kDa Masse. Die Ursache war wahrscheinlich Aggregatbildung. Aber

auch Austauschphänomene führen zur Linienverbreiterung. Um zu prüfen, ob

Aggregatbildung allein für die Linenbreite verantwortlich war, wurde die

Proteinkonzentration in der Probe einmal 5 x und dann 10 x verringert, bzw. eine

Harnstofftitration durchgeführt. Dies resultierte in zwei distinkten Signalen mit Linienbreiten

von ca. 20 Hz bzw. 15 Hz. So konnte das Vorliegen von teilweise aggregiertem Protein

bestätigt werden.

Harnstoff ist als Hilfsmittel zur Verbesserung der Resonanzauflösung weithin bekannt; es

bindet die Seitenketten hydrophober Aminosäuren und wirkt so destabilisierend auf die

Proteinstruktur und verringert Aggregation, was in schmaleren Linienbreiten durch größere

Flexibilität der Gruppen resultiert [Makhatadze & Privalov, 1992; Hibbard & Tulinsky, 1978;

Thayer et al., 1993].

Die Harnstofftitrations-Experimente zeigten auch, dass die Troponin-Komplexe selbst kaum

denaturierten. Zugehörige Protonenspektren wiesen bei 298 K und 8 M Harnstoff generell

noch zu breite Signale für denaturiertes Protein auf und nur einige wenige distinkte Signale

im Bereich von 7 ppm - 9 ppm, ähnlich den Protonenspektren ohne Harnstoffzugabe.

Besonders vermehrtes Auftreten von sehr schmalen Signalen hoher Intensität ist ein Zeichen

für Zufallsknäuel-Strukturen des denaturierten Proteins. Dies konnte nicht beobachtet werden.

Das zeigt, dass alle Troponin-Komplexe, wie Wildtyp Troponin, äußerst stabil sind.

Die großen Linienbreiten konnten aber nicht ausschließlich durch Aggregatbildung verursacht

worden sein, da dies u.a. den Ergebnissen der DLS widersprochen hätte. Daher wurden

zusätzlich Messungen bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. Temperaturerhöhung

resultierte in einer Reduktion der Linienbreite um ca. 25 % - 45 %. Dies zeigte, dass es sich

nicht nur um Aggregatbildung als Verursacher der großen Linienbreiten handelte, sondern

auch Austauschphänomene mit verantwortlich waren.

Bereits durch alleinige Erhöhung der Messtemperatur auf physiologische Werte von 308 K

konnten zwei distinkte Signale dargestellt werden. Die Linienbreite reduzierte sich um 65 % -

85 % und war somit größer, als von der Temperatur-abhängigen Viskositätserniedrigung des

4. Diskussion 95

Lösungsmittels angenommen werden konnte. Die noch immer relativ hohe Linienbreite wurde

durch verbleibende Aggregate bedingt. Da Änderungen in der Proteinstruktur infolge

Phosphorylierung untersucht wurden, wurde jedwede Änderung der Struktur durch Harnstoff

vermieden und nur die Temperatur erhöht.

Es ist bekannt, dass sich die chemischen Verschiebungen der 19F-Resonanzen sehr stark bei

schon geringen Temperaturschwankungen ändern. Daher wurde die Temperaturabhängigkeit

der chemischen Verschiebung für alle markierten Cysteine gemessen. Dies erlaubte, Spektren

verschiedener Messungen trotz geringfügiger Temperaturunterschiede zu vergleichen.

Cystein 96 ist im Kernbereich des cTnI lokalisiert und zwar in der Helix 2 (Reste 90 – 135).

Diese Helix steht in Wechselwirkung mit der Helix 2 des cTnT (Reste 226 – 271) [Li et al.,

1999; McKay et al., 1998; Takeda et al., 2003; Li et al., 2004]. Trotz Bildung einer

Superhelix aus den jeweiligen Helices des cTnI und cTnT kann die Seitenkette des Cys96

selbst nicht direkt in einer Wechselwirkung involviert sein, da die PFP-Sonde gebunden

werden konnte. Laut [Takeda et al., 2003] steht der vorhergehende Rest, Leu95, mit cTnT in

Wechselwirkung. So deutete die Linienbreite des PFP-Cys96-Signals von ca. 90 Hz auf eine

Einschränkung der Beweglichkeit der gebundenen Sonde hin.

Bisphosphorylierung an Serinen 22 und 23 führte zu einer deutlichen Abnahme der

Linienbreite der Resonanz des Cys96. Dies zeigt eine erhöhte Mobilität des 19F-Kerns an,

eventuell verursacht durch eine verringerte Affinität zwischen cTnI und cTnT in diesem

Bereich. Eine Affinitästserniedrigung zwischen diesen Untereinheiten infolge der cTnI-

Phosphorylierung wurde von [Reiffert et al., 1998] mit Hilfe der „Surface Plasmon

Resonance“ beschrieben. Gleichzeitig änderte sich die chemische Verschiebung der Resonanz

des Cys96 minimal und deutete so auf eine geänderte chemische Umgebung im Bereich des

Cys96 in der cTnI-cTnT-Interaktionsregion hin. Ionenfreisetzung von cTnC in

dephosphorylierten Komplexen zeigte eine größere Änderung der chemischen Verschiebung

nach höheren Feldern, sowie eine Verringerung der Linienbreite.

Da der NMR-Puffer kein zusätzliches Magnesium enthielt, welches an die Bindungsstellen III

und IV binden würde, konnte davon ausgegangen werden, dass vollständig Ionen-freigesetzte

cTnC-Untereinheiten vorlagen. Dies wurde durch die Tatsache bestätigt, dass zusätzliche

Gabe von EDTA zu keinen nennenswerten Änderungen in den 19F-Spektren führte.

Eine Ionenfreisetzung an den strukturellen Calciumbindungsstellen III und IV in der

C-terminalen Domäne des cTnC könnte für die beobachteten Effekte verantwortlich sein, da

sich am C-Terminus des IT-Armes alle Troponin-Untereinheiten in räumlicher Nähe befinden

4. Diskussion 96

und auch die Helix 2 des cTnT mit den Calciumbindungs-Schleifen der C-terminalen Domäne

des cTnC wechselwirkt [Takeda et al., 2003]. Eine Änderung des cTnC in diesem Bereich

durch Ionenfreisetzung von Bindungsstelle III und IV könnte auch die Struktur der

interagierenden Superhelix aus cTnI und cTnT beeinflussen und in veränderter chemischer

Umgebung für das Cys96 des cTnI resultieren, sowie die Affinität der C-Domäne des cTnC

mit dem IT-Arm, insbesondere Helix 2 des cTnT, beeinflussen.

Der Einfluss der Ionenabhängigkeit auf die chemische Umgebung des Cys96 war in nicht-

phosphorylierten Komplexen stärker als in bisphosphorylierten. Dies könnte dadurch erklärt

werden, dass infolge Bisphosphorylierung die Wechselwirkung im C-terminalen Bereich des

IT-Armes reduziert war und so nur geringere Effekte durch Ionenfreisetzung von cTnC auf

den IT-Arm übertragen wurden.

Da auch durch Calciumbindung an die Bindungsstelle III und IV eine hydrophobe Tasche ent-

steht, die für die Bindung der Helix 1 des cTnI notwendig ist, führt eine vollständige

Ionenfreisetzung vom cTnC zu einer Lockerung dieser Wechselwirkung. Durch

Phosphorylierung des cTnI wurden ähnliche Effekte auf die Resonanzen beobachtet, wie nach

Ionenfreisetzung. Es wäre zukünftig interessant zu untersuchen, ob nur die Wechselwirkung

der Calciumbindungsschleifen III und IV mit dem IT-Arm oder auch die Wechselwirkung

von cTnI-Helix 1 mit der hydrophoben Tasche des cTnC gestört ist.

Die präsentierten Ergebnisse für die Region um Cysteine 96 stellten eine These von [Li et al.,

2004] in Frage. Diese These, basierend u.a. auf Studien von [Chandra et al., 1997; Ward et

al., 2003], welche Effekte der PKA-Phosphorylierung am cTnI in Abwesenheit von cTnT

untersucht hatten, besagt, dass cTnT nicht an der Signaltransduktion von der

Phosphorylierungsregion im cTnI zu der regulatorischen Calciumbindungsstelle II im cTnC

beteiligt ist.

Unsere Ergebnisse zeigten bereits eindeutig Änderungen in der cTnI-cTnT Interaktionsregion

infolge Bisphosphorylierung (ohne Veränderungen des Calciumbesetzungszustandes im

cTnC), sodass eine indirekte Signaltransduktion unter Einbeziehung aller Troponin-

Untereinheiten wahrscheinlich ist.

Die Ergebnisse für die an N- und C-terminaler Stelle in den cTnI-Arm eingebrachten PFP-

Cysteine waren völlig unterschiedlich.

Die für alle Signale beobachtete geringste Linienbreite (ca. 16 Hz) des PFP-Cys4 deutet auf

eine große Mobilität der 19F-Kerne und einer Beweglichkeit des Armes hin. Wenn dieser

Bereich des N-terminalen Armes für die Übertragung des Phosphorylierungssignals unwichtig

4. Diskussion 97

und frei beweglich wäre, wie von [Ward et al., 2002; 2004] postuliert, sollten sich hier keine

Änderungen infolge Phosphorylierung zeigen. Infolge Bisphosphorylierung erfuhr das

Cystein 4 jedoch eindeutige Änderungen der chemischen Umgebung. Dies wurde durch eine

starke Verschiebung des Signals zu niedrigeren Feldern (um ca. 0,16 ppm) verdeutlicht. Dies

weist auf phosphorylierungsinduzierte Konformationsänderungen im N-terminalen Ende des

cTnI-Armes hin, welche durch eine Positionsänderung des Armes erklärt werden könnten. So

wird von verschiedenen Gruppen die Loslösung des N-terminalen Armes von cTnC infolge

der cTnI-Phosphorylierung beschrieben [Gaponenko et al., 1999; Finley et al., 1999; Ferrieres

et al., 2000; Abbott et al., 2001; Ward et al., 2002; Schmidtmann et al., 2002]. [Chandra et

al., 1997] postulierte eine mögliche Wechselwirkung des Armes mit cTnI, wie sie auch in

eigenen unveröffentlichten Ergebnissen gesehen wurde. Der N-terminale Teil des Armes in

isoliertem cTnI soll nach Bisphosphorylierung 10 – 12 Å durch Faltung mehr zum cTnI-

Körper gelangen [Dong et al., 1997].

Die Interaktionsregion des dephosphorylierten Armes mit cTnC wurde von [Schmidtmann et

al., 2005] anhand von Interaktionsstudien mit Peptidarrays auf einen Bereich von Position 29

– 36 eingegrenzt, welcher durch zwei saure Aminosäuren gekennzeichnet ist. Eine

Umorientierung des Armes und ein Loslösen des N-Terminus von dieser sauren Region

könnte die Ursache für die beobachtete Tieffeld-Verschiebung sein.

Das Signal des PFP-Cys4 zeigte erst nach Bisphosphorylierung eine Ionen-abhängige

chemische Verschiebung, da nur im phosphorylierten cTn das Signal Hochfeld-verschoben

wurde. Dies deutete auch wieder auf eine Positionsänderung des Armes hin, durch die der N-

Terminus des Armes erst nach Phosphorylierung in eine Ionen-abhängige Region gebracht

wird. Im nicht-phosphorylierten Komplex wurden keine Änderungen der Linienbreite und

chemischen Verschiebung des PFP-Cys4 infolge Ionenfreisetzung am cTnC detektiert. Dies

deutete zum Einen darauf hin, dass der Anfang des cTnI-Armes wohl nicht in die

Wechselwirkung mit N-cTnC involviert ist, da die Rotationsfreiheit kaum eingeschränkt ist.

Zum Anderen wird das Cys4 nicht durch Ionen beeinflusst.

Nach [Chandra et al., 1997] soll der bisphosphorylierte Arm mit cTnI selber wechselwirken.

Die Wechselwirkungsregion müsste dann in einem Bereich des cTnI liegen, der durch

Calciumfreisetzung am cTnC beeinflussbar ist, wie z.B. die C-terminale oder inhibitorische

Domäne des cTnI. Aufgrund der Resonanzüberlagerung in Spektren phosphorylierter Proteine

konnten leider keine Linienbreitenänderungen infolge Bisphosphorylierung untersucht

werden, die Aussagen über eine mögliche Einbindung des Cys4 in eine Wechselwirkung

4. Diskussion 98

ermöglichen würden. Diese Regionen des cTnI stellen potentielle Markierungsregionen mit

der hier verwendeten 19F-PFP-Sonde dar, um die Interaktion der C-Domäne des cTnI mit dem

cTnI-Arm und womöglich mit cTnC zu analysieren.

Überraschenderweise zeigte Cystein 27, die andere PFP-Markierungsstelle im cTnI-Arm,

C-terminal zur Phosphorylierungsregion, kaum eine Änderung der chemischen Verschiebung

infolge Phosphorylierung. Die Resonanz von PFP-Cys27 reagierte insbesondere auf

Ionenfreisetzung am cTnC. Das Signal des PFP-Cys27 wurde sowohl in nicht- wie auch

phosphoryliertem cTn zu höheren Feldern verschoben.

Strukturelle Änderungen in diesem Bereich infolge Phosphorylierung der Serinreste 22 und

23 wurden von [Keane et al., 1997; Jaquet et al., 1998] beschrieben, welche eine

Verringerung der Flexibilität des nicht-phosphorylierten Armes durch Bisphosphorylierung

postulierten. Diese war auf eine Konformationsänderung des Bereichs der Aminosäure-Reste

24 – 29 in eine Schleifen-Konformation („loop“) zurückzuführen [Quirk et al., 1995; Jaquet et

al., 1999].

Durch Ionenfreisetzung veränderte chemische Verschiebungen des PFP-Cys27 deuteten auf

eine Einbeziehung dieser Region in den Mechanismus der Calcium-Affinitätsreduktion hin.

Dies korreliert mit der Beobachtung, dass im dephosphorylierten Zustand die cTnI-Region 16

– 31 mit der N-terminalen Domäne des cTnC wechselwirken und die geöffnete, Calcium-

gebundene Konformation des cTnC stabilisieren soll [Ward et al., 2002].

Bisphophorylierung schwächt diese Interaktion der direkt C-terminal von der

Phosphorylierungsregion befindlichen Region des cTnI mit cTnC, entweder direkt durch

elektrostatische Abstoßung oder durch lokale Konformationsänderungen [Ward et al., 2004],

was mit der beobachteten Abnahme der Linienbreite des PFP-Cys27 korreliert. Die jetzt

geringere Abschirmung deutet auf eine verringerte Interaktion mit anderen Gruppen hin. Dies

könnte durch die beobachtete Loslösung des Armes von der regulatorischen Domäne des

cTnC erklärt werden [Ward et al., 2002].

Zusammenfassend konnten Konformationsänderungen im cTnI im Bereich der eingebrachten

Markersonden im N-terminalen Arm des cTnI und in der cTnI-cTnT-Interaktionsregion

infolge der cTnI-Phosphorylierung nachgewiesen werden. Es wurden ebenfalls Änderungen

infolge Calciumfreisetzung am cTnC beobachtet. Die Analyse der wechselseitigen

Beeinflussung von reversibler Calciumbindung und Phosphorylierung deutet auf einen

indirekten Signalübertragungsweg von der Phosphorylierungsregion zur

4. Diskussion 99

Calciumbindungsregion hin. Neben der Positionsänderung des Armes scheint auch die cTnI-

cTnT-Wechselwirkung beeinflusst zu werden.

Da mit der 19F-NMR keine direkten Interaktionspartner des N-terminalen Armes detektiert

werden konnten, mussten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, die die Änderungen

auf atomarer Ebene verstehen halfen.

4.2 Charakterisierung der Proben für mehrdimensionale NMR und Analyse der

Spektren von markiertem hcTnC C35/84S

Da der gesamte trimere Troponin-Komplex mit einem Molekulargewicht von 77,5 kDa zu

groß ist, um die 3D-Struktur in Lösung bzw. Strukturveränderungen infolge der

Phosphorylierung von Serinresten 22 und 23 des cTnI zu bestimmen, müssen die einzelnen

Untereinheiten im Komplex sukzessiv untersucht werden. Daher wurde zunächst die

calciumbindende Untereinheit mit 15N markiert und später deuteriert. Für eine vollständige

Zuordnung aller Resonanzen müsste die C-Untereinheit allerdings noch 13C markiert werden.

Auch die cTnI- und cTnT-Untereinheiten müssen zukünftig 2H markiert werden, um das

Rauschen durch H2O zu verringern und so die Auflösung zu verbessern. Durch Deuterierung

wird die transversale Relaxation reduziert, indem Dipol-Dipol-Interaktionen zwischen 15N-1H

und nicht-kovalent gebundenen Protonen minimiert werden [Blumenschein et al., 2005].

Ebenfalls wird die Streuung der Drehmomente verringert [Massou et al., 1999] und durch

Verlängerung der T2 Relaxationszeiten die heteronukleäre Untersuchung von Amidprotonen

verbessert [Morgan et al., 2000].

Die Expressionsrate 15N,2H-markierter Proteine verringerte sich bekanntermaßen um ca. 2/3.

Dementsprechend ist auch die Proteinausbeute nach Reinigung gering. So musste die

Proteinexpression optimiert werden, um die notwendige Menge an 15N- und 15N,2H-

markiertem Protein zu erhalten. Dies wurde u.a. durch Umstellung der Bakterienanzucht im

Glaskolben auf eine Fermentation im Mini-Bioreaktor erreicht, welche die Vorteile einer

kontrollierten und verlängerten Aufzucht bietet. Insgesamt konnte die Ausbeute an

exprimiertem Protein um mehr als 400 % gesteigert werden.

Zu dieser erhöhten Ausbeute trug auch die Verwendung eines anderen Expressionssystems

bei, nämlich BL21 Gold (DE3) pLysS anstelle des BL21 (DE3)-E. coli-Stammes. Die

Bakterien werden bevorzugt bei NMR-Untersuchungen an rekombinanten Proteinen

eingesetzt, wo die Kultivierungsbedingungen der Bakterien durch Verwendung markierter

4. Diskussion 100

Salze / Zucker erschwert sind [Zhao et al., 2004; Mouillac et al., 2002]. Die Reinigung des 15N- und 15N,2H-markierten cTnC C35/84S konnte nach dem Standardprotokoll durchgeführt

werden [Babu et al., 1992] und ergab vergleichbare Reinheiten wie für nicht-markiertes

Protein. Massenspektroskopische Analysen bestätigten zum Einen den Aminosäureaustausch

C35/84S im cTnC und zum Anderen die erfolgreiche Markierung aller N-Atome mit 15N

sowie eine etwa 50 %ige Deuterierung. Protonen an Kohlenstoffatomen werden im

Allgemeinen nicht mehr bzw. nur sehr langsam gegen 1H getauscht, während 2H an O- und N-

Atomen generell gegen 1H austauschen können. Nur die nicht-austauschbaren Protonen sind

in 2H-markiertem cTnC C35/84S durch 2H ersetzt worden.

Die erfolgreiche Markierung konnte mit einer weiteren Methode, nämlich der Analyse der

Laufweitenunterschiede in SDS-Gelen, bestätigt werden.

Da der Aminosäureaustausch im cTnC C35/84S zu keinen signifikanten Effekten auf die

Sekundärstruktur des cTnC führte [Spyracopoulos et al., 1997], wurden mögliche Einflüsse

der Markierung auf die Sekundärstruktur der Proteine mittels CD-Spektroskopie untersucht.

In dieser Arbeit sind zum ersten Mal Sekundärstrukturuntersuchungen am Holotroponin-

Komplex mit Hilfe der CD-Spektroskopie vorgestellt worden. Bisher wurden so nur einzelne

isolierte Untereinheiten oder binäre Komplexe analysiert [Van Eyk et al., 1991; Gagne et al.,

1994; Li et al., 1995; Hernandez et al., 1999; Reiffert et al., 1999].

Eine Verringerung der Elliptizität zwischen 205 nm und 230 nm durch Bindung von Calcium

an TnC ist charakteristisch für einen erhöhten Anteil α-helikaler Strukturen im Protein

[Greenfield & Fasman, 1969]. Dieser Effekt wurde mit allen hier untersuchten Troponin-

Komplexen und mit den isolierten calciumbindenden Untereinheiten beobachtet. Nach

[Manning, 1989] ist eine solche Änderung im CD-Spektrum von TnC auf die Positions- und

Interaktionsänderungen der α-Helices in der N-terminalen Domäne zurückzuführen. In den

Spektren der verschiedenen Troponin-Komplexe tragen wahrscheinlich auch

Konformationsänderungen in der T- und I-Untereinheit, induziert durch Calicumbindung am

cTnC, zu den erhöhten Elliptizitäten bei. Berechnungen des Anteils von α-Helix im Protein

zeigten insgesamt einen hohen Anteil α-helikaler Strukturen von ca. 82 % für alle

untersuchten Proben. Dies ist in guter Übereinstimmung mit der 3D-Kristallstruktur des

trunkierten Troponin-Komplexes [Takeda et al., 2003].

4. Diskussion 101

Im Rahmen der Ungenauigkeiten der Messungen konnte kein Einfluss der Markierung des

Proteins auf die CD-Spektren und somit auf die Sekundärstruktur des Proteins festgestellt

werden.

Die heteronukleären NMR-Untersuchungen wurden anhand von TROSY (Transverse

Relaxation-Optimized Spectroscopy) Experimenten durchgeführt. Bei diesen Experimenten

wird die transversale Relaxation reduziert, indem über spezifische Pulssequenzen die

Anisotropie der chemischen Verschiebung und Dipol-Dipol-Interaktionen optimiert werden

[Blumenschein et al., 2005]. So werden besonders für Amid-NH-Resonanzen schmalere

Resonanzlinien erhalten und somit die Auflösung verbessert. Eine zusätzliche Verbesserung

des Signal-Rausch-Verhältnisses wird dann durch Markierung der zu untersuchenden Proteine

mit 2H erreicht (siehe oben) [Blumenschein et al., 2005].

Bisherige Strukturuntersuchungen in Lösung wurden an einzelnen Troponin-Untereinheiten,

an binären oder trimeren Komplexen, welche aus Peptiden und / oder einer vollständigen cTn-

Untereinheit rekonstituiert wurden, durchgeführt [Slupsky et al., 1995; Gagne et al., 1994;

Gasmi-Seabrook et al., 1999; Finley et al., 1999; 2004; Li et al., 2002; Ward et al., 2004;

Blumenschein et al., 2005]. Aktuelle Untersuchungen beschreiben heteronukleäre NMR-

Experimente an mehrfach (13C, 15N, 2H) markiertem sTnC des Huhns, rekonstituiert zu

nahezu vollständigen Troponin-Komplexen mit sTnI und der sTnT-T2-Domäne, in

Abhängigkeit der Ionenbindung an TnC oder an isoliertem sTnC in Abhängigkeit zur

Komplexierung mit sTnI-Peptiden [Blumenschein et al., 2005]. Diese Untersuchungen am

Skelettmuskeltroponin erlauben jedoch keine Aussage zu den molekularen Auswirkungen der

Phosphorylierung des TnI, da dem Skelettmuskel TnI der herzspezifische N-terminale Arm

fehlt.

Die erhaltenen TROSY-Spektren von cTnC C35/84S zeigten durch zusätzliche Markierung

des 15N-cTnC C35/84S mit 2H eine Verbesserung der Signalauflösung, resultierend aus einer

Verringerung der Linienbreite der Resonanzen, wie bereits beschrieben [Blumenschein et al.,

2005]. Im TROSY-Spektrum von 15N-markiertem cTnC C35/84S wurden bereits ca. 75 % der

zu erwartenden Resonanzen erhalten. Durch zusätzliche 2H-Markierung wurde die Auflösung

deutlich verbessert. Ca. 80 % der zu erwartenden Resonanzen konnten als distinkte

Resonanzlinien dargestellt werden.

Trotzdem ist eine komplette Zuordnung noch nicht möglich. Weitere Experimente, wie

HSQC-TOCSY und HSQC-NOESY [Gaponenko et al., 1999; Ward et al., 2004] und

4. Diskussion 102

zusätzliche 13C-Markierungen sind noch notwendig, da der Bereich zwischen 7,5 - 8,7 1H-ppm und 117 - 124 15N-ppm noch durch Überlagerung zu vieler Signale gekennzeichnet

ist.

Rekonstitution des cTnC C35/84S zum trimeren Troponin-Komplex mit cTnI und cTnT

185 - 291 (entspricht ungefähr der T2-Domäne des cTnT, welche mit den anderen beiden

Untereinheiten cTnI und cTnC wechselwirkt) resultierte in deutlich verringerter Anzahl

distinkter Signale (um ca. 15 %) – wie erwartet. Dies war auf das größere Molekulargewicht

des trimeren Komplexes und der damit verbundenen geringeren Konzentration an cTnC

zurückzuführen. Durch die Einbindung in den cTn-Komplex wurden deutliche Änderungen

der chemischen Verschiebung der Resonanzen des cTnC beobachtet. Das generelle

Linienmuster im Spektrum wurde von einer mehr kompakten (isoliertes cTnC) zu einer

aufgelockerten, weiter gestreuten Resonanzverteilung verändert. Dies sprach für drastische

Konformationsänderungen im cTnC durch vielfältige Interaktionen des cTnC mit cTnT und

cTnI, sowie durch Ausbildung der hydrophoben Tasche in Anwesenheit von Calcium und

cTnI [Li et al., 1999].

Da die Struktur des cTnC in binären cTnC-cTnI-Komplexen der des cTnC in trimeren cTn-

Komplexen nach [Takeda et al., 2003] ähnelt, könnte ein Großteil der beobachteten

Änderungen durch Rekonstitution auf Interaktionen mit cTnI zurückgeführt werden. Ebenfalls

bedingte die ähnliche Struktur des cTnC´s in binären, wie in trimeren Komplexen ähnliche

NMR-Spektren.

So konnten auch Spektren binärer Komplexe für die Zuordnung von Resonanzen

berücksichtigt werden.

Um Resonanzen in der isolierten cTnC-Untereinheit zuzuordnen, wurden unsere Spektren mit

denen von Skelettmuskel TnC vom Huhn ([Slupsky et al., 1995], PDB-Eintrag: 1TNW) ver-

glichen. So konnten die Resonanzen für die Glycine 42, 49, 110 und 146 zugeordnet werden.

Gly42 ist in der B-Helix (Reste 39 – 48) lokalisiert, Gly49 am Rande dieser Helix. Helix B ist

mit Helix C nach Calciumbindung an Bindungsstelle II an der Ausbildung der hydrophoben

Tasche des cTnC beteiligt [Gagne et al., 1994]. Diese Region wechselwirkt durch van der

Waals-Bindungen calciumabhängig mit der Helix 3 des cTnI (Reste 150 – 159). Helix 3 soll

nach Vorstellungen von [Takeda et al., 2003] als molekularer Schalter wirken und das

Calciumbindungssignal an andere Komponenten des dünnen Filamentes weiterleiten. Im

Herztroponin wird die hydrophobe Tasche teilweise nach Calciumbindung und vollständig

4. Diskussion 103

erst nach Bindung entsprechender cTnI-Regionen ausgebildet. Daher haben wir größere

Veränderungen in der chemischen Verschiebung von Gly42 und Gly49 durch die Einbindung

von calciumgesättigtem cTnC in den Troponin-Komplex erwartet. Die NH-Resonanz von

Gly42 zeigte in der Tat eine geringfügige Verschiebung, die von Gly49 aber keine. Gly49

scheint also nicht mehr an der Wechselwirkung mit cTnI beteiligt zu sein.

Das Gly146 liegt in der Calciumbindungsschleife IV, welche mit der

Calciumbindungsschleife III, in der Gly110 lokalisiert ist, mit TnT im IT-Arm in

Wechselwirkung steht [Takeda et al., 2003]. Nach Rekonstitution zum timeren Komplex sind

die Signale für Gly110 und Gly146 nicht mehr zu beobachten; sie sind also an der

Wechselwirkung mit TnT beteiligt. Im Skelettmuskelkomplex dagegen zeigt die Resonanz für

das entsprechende Glycin (Gly147) [Blumenschein et al., 2005] dieselbe chemische

Verschiebung wie im isolierten Skelettmuskel TnC. Der IT-Arm scheint im

Skelettmuskeltroponin-Komplex [King et al., 2005] mit anderen Gruppen der C-terminalen

Domäne in Wechselwirkung zu stehen, als im kardialen Troponin.

Zur Untersuchung von molekularen Änderungen im cTnC durch PKA-abhängige

Phosphorylierung des cTnI wurde eine Serin-Aspartat-Austauschmutante (cTnI S22/23D)

verwendet, um Inhomogenitäten durch verschiedene Phosphorylierungszustände des cTnI in

einer Probe zu vermeiden. Diese zeigte im TROSY-Spektrum von cTnC C35/84S im cTn-

Komplex eine nahezu identische Überlagerung der Resonanzen zu dem Spektrum des PKA-

phosphorylierten Proteins. Diese Phosphorylierungs-imitierende Proteinmutante wurde bereits

in vielen verschiedenen Untersuchungen verwendet und ist allgemein als

Phosphorylierungsersatz anerkannt [Dohet et al., 1995; Finley et al., 1999; Gaponenko et al.,

1999; Sakthivel et al., 2005].

Bisphosphorylierung des cTnI in rekonstituierten Komplexen resultierte im Vergleich mit

dephosphoryliertem cTn nicht in so drastischen Änderungen des Resonanzmusters im

Spektrum für cTnC C35/84S. Es ließen sich jedoch distinkte lokale Änderungen der

Resonanzverteilung beobachten, welche auf Strukturänderungen im cTnC infolge der cTnI-

Phosphorylierung hinweisen. Im Allgemeinen ähnelte das Spektrum von cTnC C35/84S in

bisphosphoryliertem Komplex dem des isolierten cTnC´s.

Zur Zuordnung von Signalen im trimeren Komplex wurde zunächst versucht, die

Raumkoordinaten der 52 kDa Kerndomäne ([Takeda et al., 2003], PDB 1J1E) mit Hilfe von

4. Diskussion 104

„Proshift“ (Jens Meiler, "PROSHIFT: Protein Chemical Shift Prediction Using Artificial

Neural Networks", www.jens-meiler.de, 2002) in NMR-Spektren umzurechnen. Allerdings

waren die Abweichungen zu groß, sodass stattdessen auf Zuordnungen von Resonanzen

partieller, binärer Komplexe (cTnI (1 – 80) + cTnC) bzw. trimerer Skelettmuskel Komplexe

zurückgegriffen wurde (sTnT-T2 + sTnI + sTnC). Mit Hilfe dieser Spektren konnten neben

Glycinen 42, 49, 110 und 146 eine Anzahl weiterer Resonanzen zugeordnet werden: Glycine

34, 68, 70, 91, 125 und 140, Val79, Asp113 und Asp149, Lysine 106, 142 und 158, Thr124,

Ile148, Phe153 und Glu155.

Das Gly70 Signal konnte nur für cTnC in cTn-Komplexen zugeordnet werden, isoliertes

cTnC zeigte an dieser Position im Spektrum keine Resonanz. Dies bedeutet, dass das Signal

des Gly70 in einer Region im cTnC lokalisiert ist, welche durch Rekonstitution des cTnC zum

vollständigen cTn beeinflusst wurde. Glycin 70, zwischen Helix C und Helix D der N-

Domäne des TnC lokalisiert, liegt in der Schleifenregion (Reste 65 – 71) der regulatorischen

Calciumbindungsstelle II [Gagne et al., 1994; Pääkkönen et al., 1998]. Calciumabhängige

Interaktionen der TnI Schalter-Region (Reste 147 – 163) mit der N-terminalen Domäne des

cTnC [Li et al., 2004] und des nicht-phosphorylierten herzspezifischen N-terminalen Armes

mit N-TnC [Keane et al., 1997; Finley et al., 1999; Gaponenko et al., 1999; Abbott et al.,

2001; Ward et al., 2003] wurden beschrieben. Der cTnI-Arm steht allerdings mit einem

Bereich um Aminosäurerest 30 in Wechselwirkung [Gaponenko et al., 1999; Schmidtmann et

al., 2005]. So hatte die Phosphorylierung des cTnI keinen detektierbaren Einfluss auf die

chemische Umgebung dieser Aminosäure.

Auch die Resonanzen von Gly49, Thr124, Gly140 und Asp149 zeigten keine Änderung ihrer

chemischen Verschiebung infolge der cTnI-Phosphorylierung an Ser22 und Ser23 (bzw. im

Komplex mit cTnI S22/23D). Das Signal von Gly42 verschob sich in die Nähe der Resonanz

für Gly42 im isolierten cTnC. Gly42 liegt außerdem in Nähe der Bindungsstelle des nicht-

phosphorylierten cTnI-Armes. Bisphosphorylierung an cTnI Ser22 und Ser23 führt zur

Ablösung des Armes von cTnC und wahrscheinlich zur Bindung an anderer Stelle [Jaquet et

al., 1993, 1998; Beier et al., 1988; Chandra et al., 1997]. Anhand der geringen Änderung der

chemischen Verschiebung konnte davon ausgegangen werden, dass der Einfluss des cTnI-

Armes auf die Rückgrat-Struktur der Region um Gly42 nur unwesentlich sein musste.

Signale der Glycine 110 und 146 wurden in den veröffentlichten Spektren [Slupsky et al.,

1995; Finley et al., 1999; Blumenschein et al., 2005] bei gleicher chemischer Verschiebung

beobachtet. Dies könnte eine Beeinflussung dieser Regionen durch Rekonstitution oder cTnI-

4. Diskussion 105

Bisphosphorylierung ausschließen. Hierbei mussten allerdings die verschiedenen untersuchten

Proteine (cTnC + cTnI (1 – 80); sTnT2 + sTnI + sTnC; sTnC) berücksichtigt werden. Eigene

Untersuchungen zeigten, dass in Spektren von isoliertem cTnC den Signalen der Glycine 110

und 146 zwei Resonanzen im Tieffeld (1H) zugeordnet werden konnten. Dabei wurde die

Zuordnung des Signals Gly110 aufgrund räumlicher Nähe zur Resonanz des Gly146

erschwert. Möglicherweise waren Unterschiede zwischen der Herkunft der untersuchten

Proteine verantwortlich für die Differenzen, obwohl das Signal in einem identischen

Sequenzbereich der Proteine liegt.

Ebenfalls wurden beide Signale nur für cTnC ausschließlich in phosphorylierten Komplexen

detektiert. Dies deutet auf eine Beeinflussung der Region um Gly110 / Gly146 durch cTnI-

Phosphorylierung hin. Wie Gly146 ist auch Gly110 in einem Interaktionsbereich mit cTnT im

IT-Arm lokalisiert (Calciumbindungsschleife III). So wechselwirken Arg267 und Asp270 der

Helix 2 des cTnT mit Asp109 und Tyr111 des cTnC. Asp270 bildet Wasserstoffbrücken mit

der Hydroxylgruppe des Tyr111 von cTnC aus und koordiniert so mit seinem Sauerstoffatom

der Carbonylgruppe das Calciumion für die Bindungsstelle III [Takeda et al., 2003]. Die

Seitenkette des Asp109 beteiligt sich ebenfalls an der Calciumbindung zu TnC, bildet aber

zusätzlich mit dem Sauerstoffatom der Carbonylgruppe eine Wasserstoffbrücke mit Asn266

von cTnT.

Strukturell befinden sich alle drei Untereinheiten des Troponin-Komplexes im Bereich des

C-terminalen Endes der Superhelix von cTnI-cTnT und der C-Domäne des cTnC als IT-Arm-

Hälfte des cTn-Komplexes in enger Nachbarschaft. So soll Calciumbindung an cTnC nicht

nur ein wichtiger Parameter für die Bindung des cTnC an die amphiphile Helix 1 des cTnI

sein, sondern auch Wechselwirkungen zwischen cTnC und cTnT stabilisieren [Takeda et al.,

2003]. Die Phosphorylierung des N-terminalen cTnI-Armes scheint diese Region zu

destabilisieren; Signale wie in isoliertem cTnC sind zu beobachten (Gly110, Gly146).

Da der IT-Arm in dem binären Komplex aus cTnC und cTnI (1 – 80) nicht vorhanden ist,

konnten [Finley et al., 1999] die oben beschriebenen Änderungen durch Phosphorylierung

nicht detektieren. Schon frühe 31P-NMR-Untersuchungen an phosphoryliertem cTnI, isoliert,

im binären und im Holotroponin-Komplex, zeigten die Notwendigkeit eines (T-T2)-I-C-

Komplexes, um „korrekte“ Veränderungen in der chemischen Umgebung der beiden

Phosphatgruppen zu erhalten [Jaquet et al., 1993].

Auch die Resonanzen von Gly34 (Bindungsstelle des nicht-phosphorylierten cTnI-Armes),

Val79 (Helix D, beteiligt an Ausbildung der hydrophoben Tasche), Lys106 und Lys142

4. Diskussion 106

(Interaktion mit dem IT-Arm) verschieben sich deutlich. [Gaponenko et al., 1999] zeigte an

Untersuchungen des cTnC gebunden an das cTnI (1 – 80)-Peptid, dass z.B. Glycin 34 durch

cTnI-Bindung beeinflusst wird. Es wurden verschiedene Konformationen im Bereich um

Gly34 durch dynamische Wechselwirkungen mit räumlich benachbarten Aminosäreresten

beschrieben, wenn cTnI nicht phosphoryliert war. Diese lagen nicht mehr vor, wenn cTnI

bisphosphoryliert wurde.

Helix D des cTnC soll starke Wechselwirkungen mit dem C-terminalen Bereich von cTnI

(81 - 211) eingehen [Krudy et al., 1994]. Eine Veränderung dieser Wechselwirkung durch

cTnI-Phosphorylierung könnte die Resonanz von z.B. Valin 79 in Helix D verschieben. Eine

solche Verschiebung wurde tatsächlich von uns beobachtet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch Loslösen des nicht-phosphorylierten N-

terminalen cTnI-Armes von cTnC (Region Aminosäurereste 29 - 35 [Gaponenko et al., 1999;

Schmidtmann et al., 2005]) die calciumabhängige Wechselwirkung von der hydrophoben

Tasche des cTnC (Helix D) und die Wechselwirkung der C-terminalen Domäne mit dem IT-

Arm verändert bzw. geschwächt werden. 19F-NMR-Analysen zeigen ferner, dass der

N-terminale Arm in eine calciumabhängige Region positioniert wird und auch

Wechselwirkungen zwischen cTnT und cTnI beeinflusst werden.

Dies lässt auf einen indirekten Mechanismus zur Übertragung des Phosphorylierungssignals

auf die Calciumbindungsdomäne schließen.

4.3 Hypothese und Ausblick

In der Literatur werden zwei gegensätzliche Modelle des Signaltransduktionsmechanismus

der Reduktion der Calciumaffinität am cTnC infolge Bisphosphorylierung des cTnI

kontrovers diskutiert. In einem möglichen direkten Weg interagiert der herzspezifische N-

terminale Arm direkt mit der regulatorischen Domäne des cTnC und stabilisiert die offene,

aktive Konformation. Loslösen infolge Bisphosphorylierung resultiert in einer

Destabilisierung der offenen Konformation, wodurch die Calciumaffinität der regulatorischen

Bindungsstelle reduziert werden soll [Gaponenko et al., 1999; Abbott et al., 2000].

Die andere Theorie beschreibt einen indirekten Weg der Signaltransduktion, wobei cTnI-

Phosphorylierung globale Änderungen in der cTnI-Struktur auslöst, die indirekt die

Calciumsensitivität verringern [Chandra et al., 1997].

4. Diskussion 107

Aufgrund der hier dargestellten Ergebnisse, sowie früherer Beobachtungen [Jaquet et al.,

1993; Reiffert et al., 1998; Schmidtmann et al., 2001; 2005] postulieren wir einen indirekten

Weg. Die Loslösung des N-terminalen cTnI-Armes vom cTnC (Reste 29 - 35) infolge der

Bisphosphorylierung führt zu einer erneuten Wechselwirkung des N-terminalen Abschnittes

des Armes, wahrscheinlich in einer calciumsensitiven Region des cTnI (19F-NMR,

Peptidarrays).

Da von [Dong et al., 1997] eine Stauchung des gesamten Herztroponins, insbesondere des

cTnI´s, infolge Bisphosphorylierung beschrieben wurde, mit einer Annäherung des

bisphosphorylierten Armes um 10 – 12 Å an cTnI, und von [Heller et al., 2003] eine

Interaktion des Armes C-terminal des cTnI Restes 80 postuliert wurde, ist es denkbar, dass

der bisphosphorylierte Arm mit Helix 4 (Reste 164 - 188) des cTnI wechselwirkt. Durch diese

Interaktion könnte Helix 4 näher an den Kernbereich des cTn-Komplexes gezogen werden

und interagiert möglicherweise mit dem IT-Arm. Dies könnte die mit mehrdimensionaler

NMR, bzw. 19F-NMR beobachteten Veränderungen in den Wechselwirkungen der

hydrophoben Tasche des cTnC (Helix D) mit cTnI, der Calciumbindungsdomänen III und IV

mit dem IT-Arm und des cTnI mit cTnT im Bereich des IT-Armes zur Folge haben. Dass eine

derartige Umpositionierung der Helix 4 möglich ist, zeigten einige Kristallstrukturen von

[Takeda et al., 2003], in denen Helix 4 in der Nähe des IT-Armes lokalisiert war.

Ferner ist bekannt [Zot & Potter, 1982; Ogawa, 1985; Jaquet & Heilmeyer, 1987], dass

isoliertes cTnC eine geringere Affinität zu Calcium aufweist als im cTn-Komplex. Auch diese

Beobachtung deutet darauf hin, dass die Affinitätserniedrigung des cTnC für Calcium infolge

der Bisphosphorylierung an cTnI-Ser22 und -23 insbesondere durch veränderte

Wechselwirkungen zwischen cTnC und den beiden anderen Untereinheiten zustande kommt.

Die Beobachtung, dass der N-terminale Bereich des Armes infolge der Bisphosphorylierung

in eine andere Region des cTnI wechselt, sowie die oben beschriebene Hypothese

widersprechen den Überlegungen von Ward et al. [Ward et al., 2002; 2004]. Diese Gruppe

vertritt die Auffassung, dass der N-terminale Bereich des Armes funktionslos ist, während der

C-terminale Teil mit der Phosphorylierungsregion für die Phosphorylierungseffekte

verantwortlich ist. Wie die Gruppe von Rosevear postulieren sie einen direkten

Signaltransduktionsmechanismus. Gegen einen direkten Weg spricht auch, dass eine

Schwächung der Wechselwirkung bereits nach Monophosphorylierung des cTnI-Armes zu

beobachten ist. Die Calciumaffinität des cTnC wird aber nicht beeinflusst [Zhang et al.

1995b; Reiffert et al. 1996; Deng et al., 2001].

4. Diskussion 108

Um diese Hypothese zu falsifizieren, sind weitere Messungen zur Aufklärung der Struktur

aller cTn-Untereinheiten in Lösung, abhängig vom cTnI-Phosphorylierungszustand,

notwendig.

Hilfreich sind auch weitere 19F-NMR- Untersuchungen am N-terminalen Bereich, der

Phosphorylierungsregion des cTnI-Armes oder der Helix 4 des cTnI. Ebenfalls aussagekräftig

sind mehrdimensionale NMR- oder 31P-NMR-Untersuchungen an cTn mit einer Deletion der

Helix 4 des cTnI. Interessanterweise führen auch Aminosäureaustausche in Helix 4, in der

Phosphorylierungsregion und im cTnC (Bindungsregion des cTnI-Armes) zu einer

hypertrophen Kardiomyopathie, welche die Bedeutung dieser Regionen unterstreichen.

Abbildung 40: Hypothetisches Modell des bisphosphorylierten cTn-Komplexes

bisphosphorylierter,

N-terminaler

cTnI-Arm

Präsentiert ist die hypothetische Wechselwirkung des bisphosphorylierten N-terminalen cTnI-Armes (in grün, mit Aminosäuresequenz angegeben) im cTn-Komplex mit Helix 4 des cTnI. Resultierende mögliche Auswirkungen auf die Wechselwirkungen zwischen cTnI-Helix 3 und N-Domäne des cTnC und zwischen cTnI-Helix 4 und den IT-Arm sind angedeutet (vergleiche Abbildung 2). cTnC ist in rot, cTnT in gelb und cTnI in blau dargestellt. Abbildung aus [Takeda et al., 2003] entnommen und modifiziert.

5. Zusammenfassung 109

5 Zusammenfassung

Im Herzen wird die Calcium-kontrollierte Regulation der Muskelkontraktion über reversible Phosphorylierung moduliert, um so die Pumptätigkeit an hämodynamische Gegebenheiten anzupassen. Serine 22 und 23 im herzspezifischen Arm des Herztroponins I (cTnI) werden durch die Proteinkinase A phosphoryliert, wodurch die Calciumaffinität der calciumbinden-den Untereinheit (cTnC) des kardialen Troponins (cTn) reduziert, die Relaxationsrate von Myozyten erhöht wird. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind nur wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit soll zu einem besseren Verständnis, wie cTnI-Phosphorylierung die Calciumaffinität des cTnC erniedrigt, beitragen. Zur Untersuchung von Konformationsänderungen im cTnI infolge der Phosphorylierung mit 19F-NMR-Spektroskopie wurden Cysteine (Positionen 4 und 27) im cTnI-Arm eingebracht; ein Cystein (Position 96) war an der Interaktionstelle (IT-Arm) zwischen cTnI und der Tro-pomyosin-bindenden Untereinheit (cTnT) lokalisiert. An alle Cystein-SH-Gruppen wurde ko-valent eine Sonde gebunden. Die Proteinmutanten waren funktionell; sie regulierten calcium-abhängig die AktoS1-ATPase-Aktivität. Um Konformationsänderungen im cTnC zu detektie-ren, wurden mehrdimensionale NMR-Experimente an Troponinkomplexen mit 15N,2H-mar-kiertem cTnC durchgeführt. Dafür mussten die Expression optimiert und der Markierungs-grad mit Massenspektrometrie bestimmt werden. CD-spektroskopische Analysen zeigten kei-nen wesentlichen Einfluss der Markierung auf die Sekundärstruktur. Mit 19F-NMR Untersuchungen wurde nach Phosphorylierung eine Positionsänderung des cTnI-N-Terminus in eine calciumabhängige Region detektiert; der C-terminale Bereich des Armes wird eher durch Ionenfreisetzung am cTnC beeinflusst. Die Interaktion von cTnI mit cTnC (Loslösung des Armes) und mit cTnT (um Cys96) wird verringert. Alle Troponin-untereinheiten sind also an der Transduktion des Phosphorylierungssignals beteiligt. 15N,1H- / 15N,2H-NMR-Experimente zeigten, dass isoliertes cTnC seine Struktur durch Rekonstitution zum cTn-Komplex deutlich ändert. Bisphosphorylierung des cTnI macht u.a. die durch Rekonstitution beobachteten Resonanzverschiebungen teilweise rückgängig. Einige der Resonanzen konnten durch Literaturvergleiche zugeordnet und Verschiebungen verfolgt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit, zusammen mit früheren Ergebnissen und Literaturvergleichen, führten zu folgender Hypothese: Der Signaltransduktionsmechanismus ist indirekt. Der nach Phosphorylierung vom cTnC losgelöste cTnI-Arm bindet an Helix 4 des cTnI, wodurch die Wechselwirkungen von cTnI mit der hydrophoben Tasche in der cTnC-N-Domäne, von cTnI mit cTnT im IT-Arm und von der cTnC-C-Domäne mit dem IT-Arm geschwächt werden. Dies führt zu einer Erniedrigung der Calciumaffinität am cTnC.

6. Anhang 110

6 Anhang

6.1 Literaturverzeichnis

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6. Anhang 120

6.2 Abkürzungsverzeichnis

Aminosäuren werden im Ein- und Dreibuchstabencode abgekürzt

Å Ångström (10-10 m) AA Aminosäure(n) A. bidest zweifach destilliertes Wasser ADP Adenosin-5´-diphosphat AG Arbeitsgruppe AK Antikörper ATP Adenosin-5´-triphosphat BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-p-Toluidinsalz, X-Phos-p-

Toluidinsalz, X-Phos-pT bcTn Holotroponin aus Rinderherz bcTnC, -I, -T Rinderherztroponin C, -I, -T (Bezeichnung der Untereinheiten) BPTI basischer pankreatischer Trypsin Inhibitor BSA Rinderserumalbumin Cα-PKA katalytische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase cAMP zyklisches Adenosin-3´, 5´-monophosphat CD Circulardichroismus ε molare Circular Dichroismus-Einheit cDNS kopierte Desoxyribonukleinsäure cGMP zyklisches Guanosin-3´, 5´-monophosphat CNBr Cyanbromid Da Dalton DE Diethylaminoethylcellulose DEAE Diethylaminoethyl DHP-Rezeptor 1,4-Dihydropyridinrezeptor D2O deuteriertes Wasser DLS dynamische Lichtstreuung DMF Dimethylformamid DSS Dimethylsilapentansulfonsäure DTNB 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) DTT Dithiotreitol EAH Epoxyaminohexyl E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-N,N,N´,N´-tetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N´,N´- Tetraessigsäure ELC Essentielle leichte Kette („essential light chain“) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Enzym gekoppel ter Immunotest) ESI-MS Elektrospray Ionisations Massenspektrometrie et al. et altera F-Aktin filamentöses Aktin FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

6. Anhang 121

g Gravitationskonstante G-Aktin globuläres Aktin H Helix HA Hydroxyapatit (h)cTn rekombinantes (humanes) kardiales Holotroponin (h)cTnC, -I, -T rekombinantes (humanes) Herztroponin C, -I, -T (Bezeichnung der Untereinheiten) (h)cTnC WT rekombinantes (humanes) Wildtyp Herztroponin C (h)cTnC C35/84S rekombinantes (humanes) Herztroponin C, Cystein 35 und 84 ausgetauscht gegen Serin (h)cTnI WT rekombinantes (humanes) Wildtyp Herztroponin I (h)cTnI S22/23D rekombinantes (humanes) Herztroponin I, Serine 22 und 23

ausgetauscht gegen Alanine (h)cTnI S4C/C79S rekombinantes (humanes) Herztroponin I, Serin 4

ausgetauscht gegen Cystein, Cystein 79 ausgetauscht gegen Serin

(h)cTnI A27C/C79S rekombinantes (humanes) Herztroponin I, Alanin 27 ausgetauscht gegen Cystein, Cystein 79 ausgetauscht gegen Serin

(h)cTnT ∆ 1 - 184 rekombinantes (humanes) Herztroponin T, Aminosäuren 1 – 184 deletiert

(h)cTnT 185 – 291 rekombinantes (humanes) Herztroponin T, Aminosäuren 1 – 184 deletiert

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethan-sulfonsäure HMM schweres Meromyosin [“heavy meromyosin”) HPLC hochauflösende Flüssigkeitschromatographie HSQC Heteronuclear single quantum coherence HSQC = Hz Hertz IEF isoelektrische Fokussierung IgG Immunglobulin G IPTG Isopropylthiogalactosid IS Interaktionssignal K Kelvin kDa Kilodalton LB Luria-Bertani LMM leichtes Meromyosin [“light meromyosin”) M Molar MESG 2-Amino-6-Mercapto-7-Methylpurin Ribosid MHC Myosin schwere Kette („myosin heavy chain“) MHz Megahertz MW Molekulargewicht in Dalton MLP Muskel-LIM-Protein mM Millimolar MOPS 3-Morpholino-propansulfonsäure MRW „mean residue weigth“, d.h. das Molekulargewicht des Proteins dividiert durch die Anzahl der Aminosäuren des Proteins MS Massenspektrometrie MTT Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid

6. Anhang 122

mU Milliunits (spezifische Aktivitätseinheit) n Hill-Koeffizient; Anzahl; nicht signifikant NEPHGE Non Equillibrium pH Gradient Electrophoresis NMR Nuclear Magnetic Resonance, Kernspinresonanz NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy NZCYM-Medium Nährmedium für Bakterien (Sambrook et al., 1989) OD optische Dichte OD600 optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge p.A. zur Analyse PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese pCa negativer dekadischer Logarithmus der Ca2+- Konzentration pCa50 pCa-Wert, bei dem eine Reaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit oder Aktivität erfolgt PDB Protein Datenbank PFP 4-Perfluortert-butylphenyliodacetamid pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzent ration pI isoelektrischer Punkt Pi organisches Phosphat Pγ Gamma-Phosphat PKA cAMP-abhängige Proteinkinase PKC Ca2+/Phospholipid-abhängige Proteinkinase, Proteinkinase C PMSF Phenylmethylsulfonylchlorid PNP Purinnukleotidphosphorylase pO2 Sauerstoffsättigung PP2A Proteinphosphatase 2A ppm parts per million, 1 x 10-6, Einheit der chemischen Verschiebung (P)Ser22 (phosphoryliertes) Serin in der 22. Position der Sequenz des humanen Herztroponin I (P)Ser23 (phosphoryliertes) Serin in der 23. Position der Sequenz des humanen Herztroponins I PVDF Polyvinylidenedifluorid Rf Retentionsfaktor Rh hydrodynamischer Radius RLC regulatorische leichte Kette („regulatory light chain“) RT Raumtemperatur RUB Ruhr-Universität Bochum S1 Myosin-Subfragment-S1 S2 Myosin-Subfragment-S2 SDS Natriumdodecylsulfat SEM Standardfehler des Mittelwerts SERCA im sarko-/endoplasmatisches Retikulum lokalisierte SR-Ca2+-

ATPase SH- Sulfhydryl- S/N-Verhältnis Signal/Rausch-Verhältnis

6. Anhang 123

sTnC, -I, -T Skelettmuskel-Troponin C, -I, -T (Bezeichnung der Untereinheiten)

T1 Troponin T-Fragment, entspricht den AS 1-158 T2 Troponin T-Fragment, entspricht den AS 159-288 TBS Tris-buffered-saline-Lösung TCA Trichloressigsäure TFA Trifluoressigsäure TLCK Nα-p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethyl Keton Tm Tropomyosin TNB 5-Thio-2-nitrobenzoesäure TOCSY Total Correlation Spectroscopy TPCK L-1-Tosylamid-2-phenylethyl-chloromethyl-keton Tris/HCl Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TROSY Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy U Unit (Einheit der Aktivität) UE Untereinheiten ü.N. über Nacht Upm Umdrehung pro Minute UV/VIS Ultraviolett/Visible v/v Volume per Volume w/v Weight per Volume WT Wildtyp

6. Anhang 124

6.3 Firmen- und Herstellerverzeichnis

AlphaInnotech, San Leandro, CA, USA Amersham-Bioscience, Freiburg, Deutschland Amicon Millipore Corp., Bedford, USA AppliChem, Darmstadt, Deutschland Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland Bruker, Rheinstetten, Deutschland BTX Inc., San Diego, USA Deutero GmbH, Kastellaun, Deutschland Eurogentec, Seraing, Belgien Firma FairMenTec, Wald, Schweiz Fluka-Chemie GmbH, Seelze, Deutschland Gibco-BRL, Invitrogen; Karlsruhe, Deutschland GraphPad Software, Inc., San Diego, USA Hellma, Müllheim, Deutschland HyTest, Turku, Finnland Jasco, Groß-Umstadt, Deutschland Jouan, Frankreich (jetzt: Thermo Electron Corporation, Fernwald, Deutschland) Kontron Instruments, Neufahrn, Deutschland MBI Fermentas, Deutschland (jetzt: Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) Millipore, Schwalbach, Deutschland Molecular Probes Inc., Karlsruhe, Deutschland Organogen, Heidelberg, Deutschland Perkin Elmer; Rodgau – Jügesheim, Deutschland Protein Solutions Inc., Charlottesville, USA Serva, Heidelberg, Deutschland Sigma-Aldrich, Seelze, Deutschland SLM Aminco, Büttelborn, Deutschland SLT-Labinstruments, Crailsheim, Deutschland Spectra Stable Isotopes, Columbia, MD, USA SPSS Inc., München, Deutschland Strategene, Amsterdam, NL Technicon Instruments, Tarrytown, USA Thermo Finnigan, Bremen, Deutschland Thermo Haake, Karlsruhe, Deutschland Vacuubrand, Wertheim, Deutschland

6. Anhang 125

6.4 Lebenslauf

Familienname Deppermann

Vorname Sascha

Geburtstag 30.09.1973

Geburtsort Bochum

Nationalität deutsch Schulausbildung 1980 - 1984 Grundschule „Lindenschule“ in Castrop-Rauxel, Frohlinde

1984 - 1993 Adalbert-Stifter-Gymnasium in Castrop-Rauxel; Abitur 1993 Zivildienst 1993 – 1994 Evangelisches Krankenhaus in Castrop-Rauxel Hochschulausbildung WS 1994/95 - SS 2000 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

Frühjahr 1999 Mündliche Diplomprüfungen

Mai 2000 Diplomarbeit in der Medizinischen Fakultät der RUB im Institut für Physiologische Chemie

Juli 2000 - Juli 2005 Anfertigung der Doktorarbeit in der Medizinischen Fakultät der RUB im Institut für Physiologische Chemie später in der Molekularen Kardiologie des St. Josef´s-Hospital, Bochum

Stipendium April 2001 - März 2003 Graduiertenstipendium des Landes Nordrhein-Westfalen (Förderung bis Januar 2003) Anstellungen Juli 2000 - Januar 2004 Wissenschaftliche Hilfskraft am Institut für Physiologische Chemie I

der RUB

Februar 2004 - Mai 2004 Wissenschaftlicher Mitarbeiter der Kardiologie Angiologie, der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Universitätsklinik

August 2004 - Juli 2005 Wissenschaftlicher Mitarbeiter der Medizinischen Klinik II, Kardiologie, Forschungslabor Molekulare Kardiologie, des St. Josefs-Hospitals der Ruhr-Universität Bochum

6. Anhang 126

Posterbeiträge -4th European symposium of the Protein Society, Paris, Institute Pasteur, 18-22.04.01 Phospho-NMR-spectroscopy reveals changes in the chemical environment of P-Thr197 in PKA upon ligand binding

-1st int. conference on Biomedical Spectroscopy, Cardiff, 7-10.07.02 Investigations of structural changes in the human cardiac Troponin (hcTn) complex upon phosphorylation and ion-release from cTnC

-Biophysical Society, San Antonio, 1-5.03.03 Effects of phosphorylation on the function of human cardiac troponin I mutants that cause familial hypertrophic cardiomyopathy (fHCM) and on the structure of the human cardiac Troponin (hcTn) complex

-Forum-Tagung, Bochum, 9.12.03 Kardiales Troponin: Strukturveränderungen durch Phosphorylierung

-33nd European Muscle Conference, 19–23.09.04, Elba, Italy: Structural changes in human cardiac Troponin (cTn) upon phosphorylation and ion-release monitored by 19F-NMR spectroscopy

Sonstige Konferenzen -7. Arbeitstagung Mikromethoden der Proteinchemie, Martinsried, 26-29.06.00

-SFB, Dabringhausen, 23.-25.11.00

-NMR-Tagungen, Bochum, 15.01.01

-GBM (Herbsttagung), Bochum, 9-12.09.01

-SFB, Bochum, 9-10.10.01

-NMR-Tagungen, Bochum, 13-14.01.03

6. Anhang 127

6.5 Danksagung

„Last, but not least“ möchte ich noch einigen wichtigen Menschen herzlichst danken:

Ich danke meiner Betreuerin, Frau Professor Dr. Kornelia Jaquet für ein überaus spannendes und interessantes Forschungsthema, an dem ich arbeiten durfte. Ihre gute Betreuung, Hilfe und Kritik halfen, mich durch die Dissertation zu bringen.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Hengstenberg für die freundliche Übernahme des Koreferates!

Herrn Prof. Dr. L.M.G. Heilmeyer Jr. möchte ich für die anregenden Diskussionen, hilfreichen Ratschläge und stetige Unterstützung danken. Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. A. Mügge für die freundliche Aufnahme in sein Institut.

Ich danke den wechselnden Mitgliedern der Arbeitsgruppe für die kameradschaftliche Atmosphäre. Besonders möchte ich mich bei meiner Kollegin, Dr. Anja Schmidtmann, für eine gute Zeit und Ihre Unterstützung bedanken. Ebenso danke ich explizit Frau P. Goldmann, Frau B. Kachholz und Herrn U. Siemen. Herrn Dr. F. van den Boom danke ich für die Einführung in die Aktomyosin-S1-ATPase-Aktivitäts-Messungen und tatkräftige Unterstützung bei EDV-Problemen.

Bei Herrn Prof. Dr. A. Wegner und der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. R. Thieleczek bedanke ich mich für die kontinuierliche Versorgung mit Proteinen.

Alle Mitarbeiter der AG Jaquet und des Lehrstuhls für Physiologische Chemie der RUB sind für die angenehme Arbeitsatmosphäre zu verantworten! ;-)

Diese Arbeit wurde nur durch die Zusammenarbeit mit anderen Arbeitsgruppen möglich! Hier gilt mein Dank vor allem Herrn Prof. Dr. H.R. Kalbitzer für Anregungen und Kritik bei den NMR-Untersuchungen. Danke auch seiner Arbeitsgruppe, insbesondere Herrn J. Wolf und W. Kremer für die angenehme Zusammenarbeit und Hilfe bei den Messungen. Herrn M. Gartmann und den anderen Mitarbeitern der NMR-Abteilung der RUB danke ich für die Aufnahmen der NMR-Spektren im Hause. Herrn Prof. Dr. F. Herberg danke ich für die stete Bereitstellung von PKA während der Dissertationszeit. Dem Medizinischen Proteom Center der RUB unter der Leitung von Prof. Dr. H. E. Meyer danke ich für die MS-Untersuchungen im Hause und Herrn Prof. Dr. M. Geeves für die freundliche Vermittlung der MS-Untersuchung in England. Herrn Dr. J. Kuhlmann danke ich für die Bereitstellung und Einführung in das CD-Spektrometer und Frau I. Vetter und Herrn M. Seewald für die Bereitstellung des DLS-Spektrometers.

Meiner Familie, besonders meiner Großmutter, danke ich für ihre Unterstützung! Meinem lieben Freund und Partner Jens Mertinkat danke ich für die seelische Unterstützung!

Besonderer Dank gilt meinen Eltern. Sie haben mich während des gesamten Studiums in

jeglicher Form unterstützt und mir so das Studium erst ermöglicht.

Ich danke Euch herzlichst!

Molekulare Effekte der Herztroponin I - Phosphorylierung ... · abhängige Proteinkinase die...

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