08.05.2018

1

MOLEKÜLER TEKNİKLERDr. Naşit İĞCİ

Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi

Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

4. Sınıf (2017-2018 Bahar)

2. NOT

Agaroz jel elektroforezi

• PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının (yaklaşık 500 bç’ye kadar) ayrımı ve analizi için kullanışlıdır.

• 200-50000 bç arasındaki DNA ve RNA (<500 bç ) moleküllerinin agaroz jelde ayrılması daha uygundur.

• Bir algden elde edilen agaroz, galaktopiranoz türevlerinin lineer bir polimeridir. *low-melting agarose (geri kazanım)

• Genelde %0.3-2 arasında agaroz yüzdesi kullanılması uygundur

• TBE, TAE

• DNA loading buffer (Tris-HCl, EDTA, Sükroz ve gliserol, BB ve/veya ksilen)

• RNA loading buffer (ek olarak formamid veya formaldehit)

• Jel boyama (EtBr, SYBR Safe)

• Denatüre agaroz jel (formaldehit ile) (Özellikle >500 bç RNA)

• Hangi amaçlarla agaroz jel yapıyoruz?

08.05.2018

2

Agaroz jel elektroforezi

• PCR optimizasyonu

08.05.2018

3

«Pulsed-Field» jel elektroforezi

• Yaklaşık 1 megabazdan daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri agaroz jelde aynı hızda göç ederler. (por büyüklüğü nedeniyle)

• %0.1 lik jel kullanılabilir ama çok kırılgan

• 1984 yılında 1-5 Mb boyutundaki DNA parçalarını ayırabilen «pulsed-field» jel elektroforezi geliştirilmiştir.

• DNA molekülleri belirli zaman aralıklarında birbirlerine farklı açıda iki elektriksel alan etkisinde bırakılır. DNA molekülleri bir elektriksel alana uygun hareket ederken kısa bir süre sonra diğer akıma uygunluk göstermek zorunda kalır.

08.05.2018

4

Kapiller jel elektroforezi

• Kısa analiz süresi

• Düşük numune hacmi

• Az miktarda çözelti harcanması

• Düşük sarf maliyeti (cihazı pahalı)

• Yüksek etkinlik

• Tekrarlanabilirlik

• Geniş kullanım alanı

• Protein, peptit, amino asit, nükleik asit, inorganik iyon, organik asit, organik baz

Kapiller jel elektroforezi

08.05.2018

5

Southern-Blot

Northern-Blot

08.05.2018

6

Western-Blot

RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphism)

08.05.2018

7

Single Strand ConformationalPolymorphism Analysis (SSCP)

08.05.2018

8

Jel Zimografi

08.05.2018

9

Jel zimografi

Hücre Kültürü

• Hücrelerin kontrollü şartlarda in vitro ortamda yetiştirilmesi.

• Hayvan hücre/doku kültürü

• Bitki hücre/doku kültürü

• Model sistemdir

• Primer kültür, Hücre hatları, Kanser hücre hatları

• ATCC (American Type Culture Collection)

• ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures)

• Kanser araştırmaları

• Virüs araştırmaları

• Genotoksisite, Sitotoksisite

• Moleküler Biyoloji Uygulamaları (Transfeksiyon vb.)

• Biyoteknoloji

• Bitkisel sekonder metabolitlerin üretimi

08.05.2018

10

Hücre Kültürü

• Sonlu hücre hatları

• Sonsuz hücre hatları (mutasyon, kanserleşme, TERT)

• Cerrahi müdahale sonrasında alınan, fiziksel ve enzimatikparçalama neticesinde dokuyu oluşturan hücrelerin tek tek hücre haline getirilerek uygun besi yeri ve çevresel koşullarda bir yüzeye tutunması ve çoğaltılması işlemine primer kültürdenilir.

Hücre Kültürü

• Primer hücrelerin yaşamları sınırlı

• Heterojen hücrelerden oluşur genellikle

• Primer hücre kültüründen hücre hatları elde edilir.

08.05.2018

11

Hücre Kültürü

Hücre Kültürü

08.05.2018

12

Hücre Kültürü

Hücre Kültürü

08.05.2018

13

Hücre Kültürü

Hücre Kültürü

08.05.2018

14

Hücre Kültürü

• Aseptik koşullarda çalışma

• Kültür ortamının temel bileşenleri: inorganik tuzlar, karbonhidratlar, amino asitler, vitaminler, yağ asitleri ve lipidler, proteinler ve peptitler

• Besiyeri: temel bileşenler + antibiyotik + FBS (pH 7.4 civarı)

• Besiyeri rengi pH indikatörüdür (fenol kırmızısı)

• DMEM, RPMI 1640…

Hücre Kültürü

• Besleme

• Yıkama (PBS), Pasajlama/alt-kültür (tripsin, tripsin/edta)

• Sayım

• Dondurma (%10 DMSO + %90 besiyeri)

• Adherent olan ve olmayan (süspanse) hücreler

08.05.2018

15

PCR

• PCR tekrarlanan 3 basamak şeklinde gerçekleşir. Bu basamaklar;

• 1.Amplifiye edilecek DNA’nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu(94-95ºC),

• 2.Primerlerin DNA üzerindeki hedef bölgelerle özgül hibridizasyonuna olanak verecek sıcaklıktaki annealing-birleşme reaksiyonu (genelde 55-65 C),

• 3. Taq DNA polimeraz enziminin yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık olan 72ºC’de primerlerin uzaması-tamamlayıcı zincir sentezi olarak tanımlanabilir.

• Sıcaklıklar, farklı uygulamalarda ve farklı polimerazlarkullanıldığında belirtilen değerlerden farklılık gösterebilir.

PCR

• Polimeraz zincir reaksiyonu için,

• Kalıp DNA molekülüne,

• 20-25 baz uzunluğunda ve kalıp zincirin 5’ve 3’ uçlarındaki DNA dizilerine komplementer olan sentetik oligonükleotitlere,

• Serbest dNTP’lere (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

• Taq DNA polimeraz enzimine

• Enzimin çalışacağı uygun koşulları sağlayan tampon sistemine ihtiyaç vardır.

08.05.2018

16

qRT-PCR

• PCR + spektroflorometri

• Gen ifadesi analizleri

• Spesifik olmayan yöntem (Ör: Sybr Green I)

• Specifik problar ile (Ör: TaqMan sistemi) > Multiplex