学校编码：10384 分类号 密级

学号：200426148 UDC

硕 士 学 位 论 文

Genistein和 Daidzein抑制肝癌细胞HepG2

增殖的分子机理研究

Molecular Mechanism of Growth Inhibition of Human

Hepatocellucar Carcinoma Cell Line HepG2 with Genistein

and Daidzein

李程

指导教师姓名：欧阳高亮 副教授

陈瑞川 副教授

专 业 名 称：细胞生物学

论文提交日期：2007 年 7 月

论文答辩时间：2007 年 8 月

学位授予日期：

答辩委员会主席：王义权 教授

评 阅 人：

2007 年 8 月

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兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文

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声明人（签名）：

年 月 日

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作者签名： 日期： 年 月 日

导师签名： 日期： 年 月 日

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目录

I

目 录

英文缩略表……………………………………………………………… VI

中文摘要………………………………………………………………… VIII

英文摘要………………………………………………………………… X

前言……………………………………………………………………… 1

1. 大豆异黄酮抗癌功能研究进展………………………………… 1

1.1. 大豆异黄酮的结构、组成及特性………………………… 1

1.2. 大豆异黄酮发挥抗癌作用的机制……………………… 1

2. 细胞 DNA 损伤检控点…………………………………………… 4

3. 端粒酶与肿瘤…………………………………………………… 7

3.1. 端粒的结构与功能……………………………………… 7

3.2. 端粒酶的组成及其在细胞癌变中的作用……………… 7

4. 本课题研究的主要内容及其理论意义和实际意义…………… 8

材料与方法……………………………………………………………… 9

1. 材料……………………………………………………………… 9

1.1. 细胞株…………………………………………………… 9

1.2. 主要试剂………………………………………………… 9

1.3. 主要仪器………………………………………………… 10

2. 实验方法………………………………………………………… 10

2.1. 试剂配制………………………………………………… 10

2.2. 细胞培养………………………………………………… 13

2.3. MTT法检测药物对细胞的增殖抑制率………………… 14

2.4. Hoechst33258 染色检测细胞凋亡…………………… 14

2.5. 流式细胞术检测细胞 DNA 含量……………………… 14

2.6. 彗星电泳……………………………………………… 15

2.7. 蛋白质浓度测定……………………………………… 15

2.8. Western Blot………………………………………… 16

2.9. 端粒酶活性检测……………………………………… 17

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目录

II

结果……………………………………………………………………… 22

1. Gen 和 Dai对 HepG2 细胞增殖的影响…………………………… 22

2. Gen 和 Dai 对 HepG2 细胞周期分布的影响……………………… 23

3. Gen 和 Dai 对 HepG2 细胞形态的影响…………………………… 25

4. Gen 和 Dai 对 HepG2 细胞内 Bcl-2 家族蛋白表达的影响……… 26

5. Gen 和 Dai 对 HepG2 细胞 DNA 完整性的影响…………………… 26

6. Gen 和 Dai 对 HepG2 细胞 DNA 损伤检控点相关蛋白磷酸化水平

的影响…………………………………………………………………

27

7. Gen 和 Dai 与 DNA 损伤反应抑制剂 Caffeine 联合作用对 HepG2

细胞周期的影响………………………………………………………

31

8. Gen 和 Dai 对 HepG2 细胞端粒酶活性的影响…………………… 32

9. Gen和Dai对HepG2细胞内c-myc和hTERT表达量的影响……… 33

10. Gen和 Dai对 HepG2细胞内Akt磷酸化程度的影响…………… 33

讨论 ……………………………………………………………………… 35

1. Gen 和 Dai 诱导 HepG2 细胞凋亡的作用………………………… 35

2. Gen 和 Dai 与 DNA 损伤反应……………………………………… 36

2.1. Gen 和 Dai 都可造成 DNA 损伤…………………………… 36

2.2. Gen 和 Dai 通过 DNA 损伤检控点信号通路对细胞周期产

生影响……………………………………………………………

37

3. Gen 和 Dai 与端粒酶活性调控…………………………………… 39

3.1. Gen和Dai都可减少c-myc的表达而抑制hTERT转录…… 39

3.2. Gen 和 Dai 都可通过抑制 Akt 磷酸化来降低端粒酶活性 40

结论……………………………………………………………………… 42

参考文献………………………………………………………………… 43

致谢……………………………………………………………………… 50

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Catalogue

III

Catalogue

Abbreviation…………………………………………………………… VI

Abstract in Chinese………………………………………………… VIII

Abstract in English………………………………………………… X

Foreword………………………………………………………………… 1

1. Research Progress of Bean Isoflavone Antitumous Effect 1

1.1. Structure, Composition and Trait of Bean Isoflavone 1

1.2. Mechanism of Anti-carcinogenesis of Soybean

Isoflavone………………………………………………………

1

2. Cell DNA Damage Checkpoint System…………………………… 4

3. Telomerase and Tumor…………………………………………… 7

3.1 Structure and Function of Telomere…………………… 7

3.2 Composition of Telomerase and Its Function in

Cancinogenesis…………………………………………………

7

4. Aims,Contents and Significance of Our Researches………… 8

Materials and Methods……………………………………………… 9

1. Materials………………………………………………………… 9

1.1. Cell Line………………………………………………… 9

1.2. Reagents…………………………………………………… 9

1.3. Instruments……………………………………………… 10

2. Methods…………………………………………………………… 10

2.1. Recipe……………………………………………………… 10

2.2. Cell Culture……………………………………………… 13

2.3. MTT………………………………………………………… 14

2.4. Hechest33258 Fluor Staining to Detect Apoptosis… 14

2.5. Flow Cytometry to Detect DNA Content………………… 14

2.6. Single Cell Gel Electrophoresis……………………… 15

2.7. Protein Concention Assay……………………………… 15

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Catalogue

IV

2.8. Western Blot……………………………………………… 16

2.9. TRAP………………………………………………………… 17

Results…………………………………………………………………… 22

1. Effects of Gen & Dai on HepG2 Cell Proliferation………… 22

2. Effects of Gen & Dai on HepG2 Cell Cycle…………………… 23

3. Effects of Gen & Dai on HepG2 Cell Shape…………………… 25

4. Effects of Gen & Dai on Bcl-2 Family Proteins Expression… 26

5. Effects of Gen & Dai on the Integrity of HepG2 Cell Genetic

DNA……………………………………………………………………

26

6. Effects of Gen & Dai on the HepG2 Cell DNA damage

Checkpoint Proteins Phosphorylation……………………………

27

7. Effects of Gen & Dai Associated with Caffeine on HepG2

Cell cycle……………………………………………………………

31

8. Effects of Gen & Dai on HepG2 Cell Telomerase Activity…… 32

9. Effects of Gen & Dai on HepG2 Cell c-myc and hTERT Proteins

Expression……………………………………………………………

33

10. Effects of Gen & Dai on the Phosphorlation of Akt………… 33

Discussion……………………………………………………………… 35

1. Function of Gen & Dai Inducing HepG2 cell Apoptosis……… 35

2. Gen & Dai and DNA Damage………………………………………… 36

2.1. Gen & Dai could both induce DNA Damage……………… 36

2.2. Gen & Dai could Affect Cell Cycle via DNA Damage

Checkpoint Pathway……………………………………………

37

3. Gen & Dai and Regulation of Telomerase Activity…………… 39

3.1. Gen & Dai could both repressed the Translation of

hTERT via Reduction of c-myc…………………………………

39

3.2. Gen & Dai could both repressed Telomerase Activity

via Reduction of phosphorylation of Akt…………………

40

Conclution……………………………………………………………… 42

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Catalogue

V

References……………………………………………………………… 43

Acknowledgements…………………………………………………… 50

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英文缩略表

VI

英文缩略语对照表

Abbreviation Full name

ATM Ataxia telangiectasia mutated

ATR ATM and Rad3 related

ATRIP ATR-interacting protein

bFGF basic Fibroblast Growth Factor

Brca1 Breast cancer susceptibility gene 1

Chk1 Checkpoint kinase 1

Chk2 Checkpoint kinase 2

Dai Daidzein

DDR DNA Damage Response

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

DSB Double Strand Breakage

ECL Enhanced chemiluminescence

EDTA Rthylene diaminetetraacetic acid

EGF Epidermal Growth Factor

FBS Fetal bovine serum

FCM Flow cytometry

Gen Genistein

hTEP1 human Telomerase Associated Protein 1

hTERT Human telomerase reverse transcriptase

HTR human Telomerase RNA

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英文缩略表

VII

HU Hydroxyurea

IR Irradiation

MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl

tetrazolium bromide

MRN MRE11/RAD50/NBS1

NBS Nijmegen Breakage Syndrome

NCS Neocarzinostatin

PBS Phosphate-Buffer Saline

PHC Primary Hepatic Carcinoma

PI Propidium Iodide

PI3-K Phosphotidyl Inositol 3-Kinase

PTK Protein Tyrosine Kinase

ROS Reactive Oxygen Species

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SCGE Single Cell Gel Electrophoresis

TF Tissue Factor

TGF-α Transforming Growth Factor-α

TRAP Telomerase Repeat Amplification Protocol

uPA urokinase type Plasminogen Activator

UV Ultraviolet

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

UV Ultraviolet

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中文摘要

VIII

Genistein 和 Daidzein 影响肝癌细胞 HepG2 增殖的分子机理研

究

摘 要

原发性肝癌是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，目前手术治疗

切除率低且复发率高，而肝癌患者对毒副反应大的化疗药物耐受力差，因此从天

然动植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分成为近年来国内外肝癌治疗的发

展方向。Genistein 和 Daidzein 是大豆异黄酮的两种主要成分，二者结构相似

且都具有广泛的生物学功能。目前对二者抗肿瘤增殖的研究主要集中在前列腺

癌、乳腺癌等性激素依赖性肿瘤方面，而针对抑制肝癌细胞增殖的研究较少。本

课题以人肝癌细胞株 HepG2 为研究对象，通过 MTT 分析表明 Genistein 和

Daidzein 都可以时间和剂量依赖的方式抑制肝癌细胞的增殖。流式细胞术和凋

亡相关蛋白检测表明，Genistein和 Daidzein都可通过引发周期阻滞（Genistein

引发 G2-M 期阻滞，Daidzein 引发 G1-S 期阻滞）和细胞凋亡，并且二者诱导凋亡

作用都与Bcl-2家族蛋白表达变化相关。为了进一步探讨 Genistein和 Daidzein

抑制肝癌细胞增殖的作用及其分子机制，我们从二者对 DNA 损伤和端粒酶活性调

控相关信号通路的影响来进行研究。

DNA 损伤是放疗和多种化疗药物抑制肿瘤细胞增殖的生物学基础，其通过激

活细胞内的 DNA 损伤检控点系统来引发周期阻滞和细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤

细胞增殖的目的。我们采用彗星电泳、免疫印记以及与 Caffeine 联合作用来进

行分析，结果表明 Genistein 和 Daidzein 都可不同程度地引发细胞内的 DNA 损

伤并激活 DNA 损伤检控点的多种蛋白，Genistein 引发 G2-M 期阻滞可能主要通过

DNA 损伤活化 ATM-Chk2-Cdc25C-Cdc2 通路来完成，而 Daidzein 如何通过 DNA

损伤信号通路引发 G1-S 期阻滞尚不明了。

我们还分析了 Genistein 和 Daidzein 对端粒酶活性的影响。因为端粒酶活

化是大多数肿瘤细胞维持端粒长度并获得永生化的必要条件，如果某种药物能抑

制端粒酶的活性就可阻断端粒的合成，从而使细胞退出增殖周期，达到抑制肿瘤

细胞增殖的目的。本实验通过 TRAP-银染法检测表明，HepG2 细胞经 Gentein 和

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中文摘要

IX

Daidzein 作用后细胞内端粒酶活性显著降低。进一步的研究表明，Gentein 和

Daidzein 抑制端粒酶活性的原因在于二者都可降低转录因子 c-myc 含量从而抑

制 hTERT 的表达，还可通过降低 Akt 蛋白 473 位点 Ser 的磷酸化来抑制 hTERT 的

活性修饰。

总之，我们的研究表明 Genistein 和 Daidzein 都具有引发 DNA 损伤和抑制

端粒酶活性来的功能，都是极具开发前景的抗肝癌药物。

关键词：大豆异黄酮；Genistein；Daidzein；细胞 DNA 损伤检控点；端粒酶

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Abstract

X

Molecular Mechanism of Growth Inhibition of Human

Hepatocellucar Carcinoma Cell Line HepG2 with

Genistein and Daidzein

Abstract

Primary hepatic carcinoma (PHC) is a kind of malignancies worldwide

of morbidity and mortality.Up to now,surgical resection is still the main

route but usually unsatisfied because hepatoma often accompanies by

cirrhosis and early metastasis in liver. Chemotherapy is also unsatisfied

because of its toxicity and side effects. Therefore, the current study

focuses on finding noncelltoxical drugs which can suppress human hepatoma

and improve the life quality of patients.Genistein and Daidzein are

essential components of soy isoflavone which have similar structures,and

they both have extensive biological function.Most studies focus on

hormone-dependent neoplasms such as prostatic carcinoma and

mastocarcinoma,few studies have addressed about their inhibition effect

on human hepatoma cells,so we took human hepatoma cell line HepG2 as

research object. MTT assay showed that Genistein and Daidzein both

suppressed the proliferation of HepG2 cells in dose and time-dependent

manner. Flow cytometry and detection of apoptosis proteins showed that

Genistein and Daidzein both induced cell cycle arrest(Genistein induced

G2-M phase arrest,and Daidzein induced G1-S phase arrest) and apoptosis

regulated by Bcl-2 protein family. In order to explore molecular mechanism

of their growth inhibition,we studied through analysis of effects of

Genistein and Daidzein on DNA damage and telomerase activity regulation

signal pathway.

As the bio-molecular foundation of chemoradiotherapy of antitumous

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Abstract

XI

effect,DNA damages induce cell cycle arrest and apoptosis via checkpoint

system. SCGE,western blot and analysis associated with Caffeine showed

that Genistein and Daidzein both induced DNA damage and activated several

DNA damage proteins. Genistein may induce G2-M phase arrest though

ATM-Chk2-Cdc25C-Cdc2 pathway,while the mechanism of G1-S phase arrest

induced by Daidzein is still unclear.

We also valued the effects of Genistein and Daidzein on telomerase

activity.Telomerase activation is a key tumor marker which immortalizes

cell.If a medicine blocks telomere prolonging by attenuation of

telomerase activity, it could inhibit tumor cells proliferation. TRAP

silver-staining analysis showed that HepG2 cell telomerase activity were

decreased by treatment of Genistein and Daidzein.On one hand, they both

inhibit expression of c-myc and hTERT.On the other hand, active

modifyication of hTERT are blocked by their inhibition of phosphorylation

of Akt.

In summary,Genistein and Daidzein both inhibit HepG2 cell

proliferatation by inducing DNA damage and decreasing of telomerase

activity,so they are both potential antitumous medicines in the future.

Keywords: Bean isoflavone; Genistein; Daidzein; DNA damage checkpoint;

Telomerase

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前言

1

前 言

1. 大豆异黄酮抗癌功能研究进展

1.1. 大豆异黄酮的结构、组成及特性

大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次生代谢物，其主要成分有3种，即染

料木黄酮(Genistein，简称Gen)、大豆苷元(Daidzein，简称Dai)和大豆黄素

(Glycitein)。它们具有共同的母核结构, 染料木黄酮为母核5、7、4位被羟基取

代的三羟异黄酮, 大豆苷元和大豆黄素均为7、4位被取代的二羟异黄酮（如图1）,

其中大豆黄素母核6位存在甲氧基。在通常情况下, 这3种异黄酮母核与葡萄糖以

β-糖苷键连接, 以异黄酮葡萄糖苷形式存在于大豆中, 分别称为染料木苷

(Genistin)、大豆苷(Daidzin) 和6-甲氧基大豆苷(Glycitin), 占大豆异黄酮的

90%以上。早期推测,大豆异黄酮在动物体内经过一系列的分解作用可能生成雌马

酚(equol)而产生生理作用[1]。但随着分析技术的发展,近期通过对代谢产物的检

测发现,大豆异黄酮经过动物体代谢后,主要以Gen、Den以及它们的葡萄糖醛酸结

合物的形式存在。据分析,葡萄糖醛酸是Gen和Den在体内传递的载体,真正在体内

被吸收而产生生理活性的是游离甙元Gen和Den[2]。

图1：大豆异黄酮两种主要组分结构图

常温下大豆异黄酮性质稳定，易溶于醇类、酯类、酮类溶剂和稀碱中，不

溶于水，难溶于石油醚、苯、正己烷等非极性的有机溶剂。异黄酮分子中含有2～

3个酚羟基，显酸性，易溶于碱性溶液和吡啶中。大豆异黄酮因其具有收敛性和

苦味，往往在豆制品如豆腐、豆奶等中留有干涩和苦味。

1.2. 大豆异黄酮发挥抗癌作用的机制

流行病学调查发信，高消耗大豆的亚洲居民的性激素相关肿瘤如：乳腺癌、

前列腺癌等的发病率较西方国家低（如表1）。

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前言

2

表1：大豆摄食率与癌症发病率比较[3]

国家 大豆食品摄食率

（g/日）

乳腺癌发病率

‰

前列腺癌发病率

‰

日本 29.5 0.6 0.35

韩国 19.9 0.26 0.05

香港 10.3 0.84 0.29

中国 9.3 0.47 不详

美国 可忽略 2.24 1.57

进一步的研究证实，大豆异黄酮可抑制多种肿瘤的生长如乳癌、前列腺癌、胃癌、

结肠癌等的生长，虽然目前有关的研究报道颇多, 但尚未完全阐明, 大豆异黄酮

抗癌作用机制可能与下列因素有关。

1.2.1. 弱的雌激素样作用及拮抗雌激素作用

大豆异黄酮的多种组分的结构与哺乳动物雌激素17－β雌二醇类似，都有

一对羟基且羟基具有相似的距离以及存在一个酚环，这种结构的相似可以解释异

黄酮类化合物的弱雌激素活性的生物学效应[4]。这种雌激素样作用有以下几个方

面: ①竞争性结合雌激素受体。异黄酮与雌激素同时作用于靶器官时, 两者竞争

结合雌激素受体, 从而减轻雌激素的促细胞增殖作用, 降低与雌激素相关的癌

症发病危险。②增加细胞内性激素结合球蛋白(SHBG) 的合成[5]。③增加UDP2葡

萄糖醛酸转移酶的活性。④对催乳素(PRL) 的作用[6]。异黄酮类化合物可用于预

防与雌激素分泌有关的癌症的发生和治疗。

1.2.2. 抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)活性

拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ) 参与DNA的复制、转录和细胞有丝分裂的过程[7], 该

酶受抑制, 可能会影响细胞分裂增殖。Ji等研究表明Genistein是通过稳定DNA-

拓扑异构酶Ⅱ复合物而抑制酶活性, 导致DNA单链或双链断裂, 不能再度连接,

进而引起细胞生长抑制或死亡的[8]。然而, 另有报道大豆异黄酮在抑制肿瘤细胞

增殖IC50时, 很少观察到DNA的损伤, 表明其抑制拓扑异构酶Ⅱ活性无关[9], 此

现象也可能是因为大豆异黄酮抑制拓扑异构酶Ⅱ诱发的DNA损伤程度太轻而不能

检测出来的缘故, 但这种DNA的轻微损伤对细胞生长增殖却是非常关键的, 拓扑

异构酶Ⅱ活性受抑在大豆异黄酮抑制肿瘤细胞增殖中的意义尚需进一步深入探

讨。

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