Molecular Biology Presentation
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Molecular Biology Presentation
生醫三 Group 13
992334 林思慧992339 黃珮瑄
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LB plate
Negative control
Ligation 13-1 Ligation 13-2
Positive control
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Plasmid DNA13 M P L1 L2 13* P* L1* L2* 13 P L1 L2 13* P* L1* L2*
M:markerL:ligationP:positive
Black:person 1 (思慧 )Blue:person 2 (珮瑄 )* : treated with restriction enzyme
3.0 kb
0.5 kb
1.0 kb
8.0 kb
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Discussion
• 塗菌的時候沒有塗均勻, colonies 沒有分散,挑菌的時候不易找到單一的菌落。
• 塗菌時取的菌液量 (300μl) 太多,菌長得很密。• 跑 DNA 電泳時,因為在 load DNA 不小心太快,
部分 DNA 會被沖到 well 外,使得跑出來的兩組band 亮度稍微不同。
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Summary
• 塗盤– Negative control 知道 Ampicillin 有效抑制雜菌生
長– Positive control 中攜帶抗 Amp gene 的細菌能夠生
長– Ligation 的 LB plate 上都是攜帶抗 Amp gene 的DH5α 菌株
• DNA 電泳– 經酵素切過後, ligation1&2 在 1kb 的位置都有跑出band ,即 transformation 有成功將帶有 DNA 片段的vector 轉入 DH5α 菌株中。
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SDS-PAGE (CBR)
M GST GST
GST-D
GST-D
GST GSTGST
-DGST
-D
Purification No PurificationGST GST-D
+- +-
IPTG
+- +- +- +-
- : No Purification+ : Purification
75kDa
28kDa
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PVDF membrane (Antibodies)
M GST GST
GST-D
GST-D
GST GSTGST
-DGST
-D
Purification No Purification
75kDa
28kDa
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PVDF membrane (CBR)
M GST GST
GST-D
GST-D
GST GSTGST
-DGST
-D
Purification No Purification
75kDa
28kDa
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Discussion
• 在封膠的時候有小泡泡,所以膠有龜裂的現象• 可能配膠時沒有做好,所以不管是 maRker 還是蛋
白跑的結果中會看到糊掉的 maRker 或染出直線狀痕跡
• Transfer 過程沒有完全趕掉泡泡,阻擋protein 與 PVDF 結合,但是在這裡不影響實驗結果的觀察
• 可能 Transfer 到 PVDF membrane 上的蛋白量很少,或者抗體作用不完全,導致免疫染色的結果不佳
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Summary
• 經過 IPTG 誘導基因表達並加以純化, western blot 結果在 ~28kDa 有大量蛋白的表現。
• 由 PVDF membrane 上的 CBR 檢測結果可知PVDF membrane 上是有蛋白成功transferred 。利用免疫染色更容易探討單一個蛋白的表現。這個部分實驗可以再次做確認。
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References
• 慧眾生物科技有限公司 -1kb DNA Ladder DL1000 http://www.bioman.com.tw/pr_cont.asp?id=3&myarea=1
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