MODULO 4 - red-ralaca.net

MODULO 4

Disertante:Prof. Dra. Lucía Pareja

Parte IIICONTENIDO

✓ Optimización de un método de cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas en tándem

LC-MS/MS (QqQ) (Triple cuadrupolo)

HPLCMuestra

Analizador

SoftwareAnálisis de datos

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

• Q1 Selecciona el [M+H]+

• Q2 Fragmenta el ion seleccionado.

• Q3 Monitorea sólo el ión fragmento

Q0 Q1 Q2 Q3

N2 CAD Gas

Precursor ion

selection

Ion accumulation

Fragmentation

Exit lensSteps MS2: 1 2 3 &4

LC-MS (QQQ)

Sistema de Inyección

Fuente de ionización

Analizador DetectorRegistro de

datos

Espectro de masas

Inyector

✓Inyección directa.

✓ Inyección indirecta.

❑ A partir de un cromatógrafo

-Cromatografía gaseosa (GC).

-Cromatografía líquida (LC).

Modo de introducción de muestra

• Inyección directa

• FIA

• Cromatografía

Modo de introducción de muestra – inyección directa

• Útil para el análisis de compuestos puros

• Determinación de Masa exacta

• Optimización de compuestos en triple cuadrupolo

Usos•Ej: Optimización de compuestos en triple cuadrupolo

(QqQ)

Modo de introducción de muestra –inyección directa

Flujo: 10 µL min-1


¿Qué implica “optimizar” un compuesto?

Al optimizar un compuesto se crea un método de adquisición demasas. Lo que se busca es lograr una reducción del ruido y unaumento de la señal.

Son parámetros exclusivamente del analizador y son dependientesdel compuesto.


Modo de introducción de muestra – cromatografía

Modo de introducción de muestra – FIA

FIA = Análisis por Inyección en Flujo

• En la práctica, se realiza con un cromatógrafo

• Con la diferencia que no se utiliza la columna

• Se reproducen las condiciones de flujo y FM reales


• Exclusivo para optimizar parámetros de la fuente de ionización

• Voltaje del electrodo

• Temperatura y gases (de secado, de electrodo y cortina)


Tener en cuenta que las condiciones de ingreso de muestra,para inyección directa (infusión) y a partir del cromatógrafo noson idénticas, lo que puede generar una diferencia en laionización de los compuestos

Sistemas de ionización

✓El rol de la fuente en un espectrómetro de masas es generar ionesen fase gaseosa

✓La elección de la fuente depende de la aplicación

Se alimenta la fuente de ionización(ESI) con una solución quecontenga al compuesto puro.

Dependiendo el modelo delequipo, el fabricante recomiendauna concentración inicial

Optimización de compuestos

✓ Se trabaja monitoreando la intensidad de la señal en función de losvoltajes aplicados

✓ Para DP y EP únicamente trabajamos con Q1

✓ Para CE, posterior a la optimización de DP y EP se trabaja en modoProduct Ion

Optimización

• El voltaje de fragmentación, el entrance potential (EP) y la energía decolisión se optimizan individualmente para cada plaguicida.

• En algunos casos se inyecta cada plaguicida a cuatro voltajes defragmentación diferentes (60, 90, 120, 150 V) y se selecciona el óptimopara aislar el ión precursor deseado.

• Se preparan disoluciones patrón individuales de 1 mg/L en MeCN:H2O1:1 (v/v) y se inyectan mediante el sistema FIA (Flow injection Analysis)o inyección directa

• Se seleccionan como mínimo dos transiciones: una de cuantificación(la más intensa), y otra de confirmación.

Optimización del Voltaje de Fragmentación

PM 424,4

[M+Na]+ 447,1[M+H]+ 425,1

Optimización de la Energía de Colisión

Optimización de DiazinónN

N

O

P

S

O

[M+H]+

N

N

O

P

S

O

Voltaje de Fragmentación

Energía de Colisión

N

N

O

P

S

O

M+ 153,1

M+ 169

P es tic ide T rans ition

F rag mentor

(V)

C ollis ion

E nerg y (V)

R etention

time (min)

312→270 15

312→236 15

230→174 15

230→146 20

291→72 20

291→218 20

331,1→268,2 20

331,1→259,1 20

378→159 20

378→70 20

208,1→95,0 10

208,1→152,1 5

268,2→226,2 5

268,2→180,2 15

249→160 20

249→182 15

378,1→184,1 20

378,1→150,2 20

303→145 5

303→85 15

304→217 20

304→234 15

293→204 20

293→182 15

404→372 10

404→344 20

328,2→282,2 15

382,2→254,2 20

330,9→127,1 10

330,9→205,0 20

318,1→160,2 10

339,0→253,7 5

208→151 5

208→109 15

289,2→125,1 20

289,2→70,2 15

302→97 25

302→55 30

376,1→349,2 20

376,1→307,1 20

294,2→225,0 10

294,2→197,1 10

308→70 20

308→125 20

341,1→205,1 20

341,1→189,2 20

311→158 10

311→141 20

369,3→149,2 15

369,3→133,1 20

Terbuthylazine ¿20,3?120

Chloroxuron 20,4

Fenarimol 20,5

120

150

Bromuconazole 20,5 y 21,58

Fenobucarb 20,6

120

90

Diethofencarb 20,6

Linuron 20,6

90

90

Pyrimidifen 20,7

Methidathion 20,760

120

Fenamiphos 20,8

Chlorbromuron 21

120

120

Azoxystrobin 21,06

Fluazifop 20,3

120

150

Dimethylvinphos 21,1

Phosmet 21,190

90

Promecarb 21,14

Myclobutanil 21,2

60

150

Fenhexamid 21,3

Fluquinconazole 21,5

90

150

Triadimefon 21,6

Tebuconazole 21,67

150

90

21,7

Diflubenzuron 22,2

120

120

Methoxyfenozide 22,390

90Isocarbofos 20,3

Pyridaphenthion


F rag mentor

(V)

C ollis ion

E nerg y (V)

R etention

time (min)284→159 20

284→70 15

302,2→116,2 5

302,2→88,2 20

395,2→175,1 10

395,2→339,2 5

330→245 15

330→101 20

314,1→286,2 10

314,1→162,2 20

400,1→238,1 5

400,1→150,2 20

284→252 10

284→176 20

346→278 5

346→73 10

305,1→221,1 10

305,1→263,2 5

284,3→256,3 15

284,3→95,0 20

331→127 10

331→99 20

368,1→160,2 10

368,1→132,2 15

270→238 15

270→162 15

311,0→283,1 10

311,0→173,0 5

275→88 15

275→114 10

265,1→248,1 15

365,1→218,1 20

406→337 15

406→251 20

353,2→296,9 5

353,2→133,1 15

359→155,1 10

359→126,9 15

359→156 15

359→139 20

299,1→163,2 20

299,1→147,2 20

326→294 5

326→208 15

336,2→246,2 15

336,2→229,2 20

437,3→368,2 15

437,3→315,3 20

327→152,2 30

327→77,2 35

292→264 5

292→236 10

368,0→199,0 10

368,0→171,0 20

315→162 20

315→128 15

Penconazole 22,490

Fenoxycarb 22,6

Chromafenozide 22,7

90

90

Iprodione 22,7

Triazophos 22,8

90

150

Alanycarb 22,8

Metolachlor 22,96120

90

Triflumizol 22,9

Propaphos 23

90

90

Procymidone 23

Malathion 23,03

150

90

Azinphos-ethyl 23,1

Alachlor 23,18

150

90

Edifenphos 23,3

Neburon 23,3120

120

Aclonifen 23,5

Difenoconazole

23,59 pico

doble arriba

120

120

Tebufenozide 23,7

Chlorfenvinphos

23,7 (y 24,5

pequeño)

150

120

Triflumuron 24,08

Quinalphos 24,1

120

150

Benalaxyl 24,1

Kresoxim-methyl 24,2

120

150

Fipronil 24,3

TPP 24,6

150

120

Parathion 24,67

Anilofos 24,7

90

120

Triclocarban 24,8120


F rag mentor

(V)

C ollis ion

E nerg y (V)

R etention

time (min)303,0→137,9 5

303,0→102,2 20

306→201 10

306→116 15

461→158 15

461→141 15

306,2→164,2 20

306,2→108,2 20

305→169 15

305→153 20

381→158 20

381→141 20

231→199 15

231→121 15

308,1→196,9 35

308,1→271,9 25

384,1→197,1 20

384,1→171,1 20

528,1→249,1 15

528,1→150,2 15

334,1→171,1 20

334,1→145,1 20

409,2→206,2 10

409,2→186,2 20

427,1→145,1 20

427,1→205,1 5

511→158 20

511→141 20

322→96 10

322→185 20

489→306 15

489→158 15

307,3→161,3 15

307,3→147,2 15

353,1→228,2 10

353,1→168,2 20

385,1→199,0 5

385,1→171,0 10

373,2→175,0 20

373,2→81,0 30

365,2→309,2 10

365,2→147,3 20

385,2→329,2 20

385,2→287,1 20

256→88 20

256→57 20

371→273 5

371→255 20

Clofentezine 24,9150

Buprofezin 24,9

Hexaflumuron 25,06

120

120

Pirimiphos-methyl 25,3

Diazinon 25,3

150

120

Teflubenzuron 25,4

Isofenfos Metil 25,490

90

Quinoxyfen 25,9

Tolfenpyrad 26,1

150

120

Indoxacarb 26,2

Tebufenpyrad 26,3

150

150

Trifloxystrobin 26,4

Fluacrypyrim 26,6

120

90

Lufenuron 26,8

Pyriproxyfen 27,4

120

120

Flufenoxuron 27,5

Fenazaquin 27,8

120

150

Hexythiazox 28,3

Ethion 28,6

120

90

Propargite 29

Pyridaben 29,6

150

120

Spiromesifen 30,3660

Diafenthiuron 29,7

Cartap ¿29,9?120

120

249→160 20

249→182 15 20,690Linuron

376,1→349,2 20

376,1→307,1 20Fluquinconazole 21,5150

Condiciones de Operación de LC-MS/MS

Pesticide Transition

Fragmentor

(V)

Collision

Energy (V)

Retention

time (min)224→167 5

224→109 15

202→145 10

202→127 20

216→174 15

216→146 20

233→72 20

233→160 20

732,5→142 20

732,5→98 20

280→220 10

280→160 20

287→123 20

287→72 20

192,1→119,0 15

192,1→91,1 20

207→72 20

207→165 10

417→227 20

417→159 20

233→160 20

233→72 20

226→164 5

226→107 15

215→148 15

215→126 15

Spinosyn D 746,5→142 120 20 18,3

886,5→158,2 20

886,5→302,4 20

260→149 10

260→171 20

194,1→95,1 15

194,1→152,0 5

388→301 20

388→165 20

226,2→92,9 40

226,2→76,9 40

371,1→325,1 10

371,1→151,1 20

408→182 20

408→301 10

376→308 10

376→266 15

296,2→227,0 5

296,2→70,2 10

207,0→190,1 15

207,0→160,1 20

230→188 20

230→146 20

317→166 20

317→108 20

396,9→351,0 15

396,9→255,1 20

292→125 20

292→70 20

226→169 5

226→121 20

Bendiocarb 16,6

Carbaryl 17,2

90

140

Atrazine 17,3

Fluometuron 17,3120

120

Spinosyn A 17,5

Metalaxyl 17,5

150

120

Difenoxuron 17,56

Deet 17,6

90

120

Isoproturon 17,6

Miconazole 17,7

120

120

Diuron 17,7

Ethiofencarb 17,860

120

Monolinuron 17,9

Emamectin benzoate 18,5 y 19,2

120

90

Metobromuron 18,58

Isoprocarb 18,7

120

90

Dimethomorph 18,8 y

Cyprodinil 18,8

150

150

Thiophanate-ethyl 18,9

Flazasulfuron 19 afinar120

90

Prochloraz 19,5

Triadimenol 19,5 y 19,9

90

60

Dicloran 19,6

Propazine 19,78120

150

Bupirimate 19,85

Ethiprole 20,1

150

120

Cyproconazole 20,13

Methiocarb 20,27

120

90


F rag mentor

(V)

C ollis ion

E nerg y (V)

R etention

time (min)167→85 20

167→125 15

182→137 15

182→73 20

184,1→143,0 5

184,1→125,0 15

189,2→144,1 10

189,2→102,1 15

142,1→125,0 10

142,1→94,1 10

214,1→183,0 5

214,1→125,0 20

214,0→171,8 5

214,0→153,9 15

192→160 15

192→132 20

207→132 5

207→89 10

202→175 5

202→131 10

203,1→129,1 5

203,1→157,1 5

199→128 15

199→171 10

271→225 10

271→99 10

218→202 20

218→190 20

223→166 5

223→106 5

224→127 10

224→98 15

237→72 10

237→90 5

223→148 5

223→86 10

185→128 5 6,2

185→99 10

no se ve 2ª

transición

239,2→182,1 15

239,2→72,2 20

292→211 10

292→181 20

242→185 10

242→170 20

303→261 15

303→217 20

203→175 15

203→104 20

222→104 20

222→92 20

165→120 15

165→72 20

256→209 15

256→175 15

316→191 20

316→284 15

Cyromazine 2,3120

Thiocyclam 2,9

Acephate 3,1790

90

Propamocarb 3,2

Methamidophos 3,2

150

90

Omethoate 3,3

Chlorpropham 3,3

90

90

Carbendazim 3,38

Aldicarb sulfoxide 3,4

150

60

Thiabendazole 3,6

Dinotefuran 3,890

90

Cymoxanil 3,87

Nitempyram 4,57

90

90

Ethoxyquin 4,7

Butoxycarboxin 4,8

150

90

Monocrotophos 4,8

Oxamyl 5,05

60

60

Aldicarb sulfone 5,28

Methomyl

Pirimicarb 6,6150

120

90

Thiametoxam 7,48

Methiocarb sulfoxide 8,14

90

90

Cambendazole 9,1

Metamitron 9,17 y 14,45

120

120

Chloridazon 9,98

Fenuron 10,02

120

90

Imidacloprid 10,32

Oxfendazole 10,34

90

120


F rag mentor

(V)

C ollis ion

E nerg y (V)

R etention

time (min)230→199 5

230→171 10

223→126 20

223→56 15

213→75 15

213→156 5

253→126 20

253→186 10

266→234 20

266→192 20

296→264 20

296→105 20

297→255 15

297→159 20

213→116 10

213→89 15

261→205 10

261→188 20

255→209 15

255→181 20

279→219 5

279→133 20

199→126 20

199→72 15

202→132 20

202→124 20

235→153 10

235→136 20

166→109 5

166→91 20

202→146 15

202→110 20

231→89,2 10

231→61 20

221,1→144,9 10

221,1→109,0 15

200→107 20

200→183 20

298→144 20

298→100 20

242→200 90 20

242→158 90 20

180,1→123,0 5

180,1→95,1 20

300→268 20

300→159 20

242→186 120 20

242→158 90 20

222→165 10

222→123 20

213→72 20

213→140 20

Dimethoate 11,290

16,59

Acetamiprid 11,3

Butocarboxin 13120

120

Thiacloprid 13,28

Albendazole 13,6

120

120

Mebendazole 13,7

Imazalil 13,9

120

150

Aldicarb 13,9

Bromacil 14,23

120

90

Fluroxypyr 14,5

Oxadixyl 14,5

120

90

Monuron 14,58

Simazine 14,5

120

120

Lenacil 15,11

Metolcarb 15,15

90

60

Desethylterbutylazine 15,2

Demeton-S-Metil 15,2780

120

Dichlorvos 15,5

Pyrimethanil 15,6

150

120

Spiroxamine 16,17

Prometryn 16,35

16,4, 16,9 y 17,5

Fenbendazole 16,47

60

120

Chlorotoluron 120

Terbutrin 16,48

Carbofuran 16,5890

XMC

120

242→200 90 20

242→158 90 20Prometryn 16,35

242→186 120 20

242→158 90 20Terbutrin 16,48

233→72 20

233→160 20Fluometuron 17,3120

233→160 20

233→72 20Diuron 17,7120

Spinosyn D 746,5→142 120 20 18,3

Condiciones de Operación de LC-MS-MS

Programa Gradiente

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

AcN

(%

)

Selección de las condiciones cromatográficas

Tipo de columna: Agilent Zorbax, Eclipse XDB – C8 4,6 x 150 mm;5µm

Fase móvil: mezclas de H2O (0,1% ácido fórmico), MeCN, MeOH,entre otros

Flujo de la fase móvil: 0,3-0,6 mL/min

Volumen de inyección: 5-20 µL/min

Ejemplo de gradiente:

Creación del método

Ventana de tiempo 1 2 3 4 5

Tiempo (min) 0-14,1 14,1-18,1 18,1-20,9 20,9-23,4 23,4-33

Cada ventana de tiempo permite 99 transiciones 5 segmentos de tiempo para los 150 plaguicidas.

Inyector Bomba Columna

Analizador

Cromatograma de iones totales en mix de estándares a 100 µg/L

O

CH3

CH3O

O

P

S

O

NH

CH3

H3C

CH3

Carbendazim

Imidacloprid

Imazalil

Pyrimethanil

Atrazine

Triflumizole

Isofenphos methyl

Isocarbophos

LC-QqQ-MS

Estandar Scheduled

Modos Adquisición

•Aumenta el duty cycle, el tiempo en que monitorea un

determinado analito.

•Permite monitorear un mayor número de transiciones.

Optimización instrumental

Herbicida Polaridad tR (min) SRM 1 SRM 2

Imazetapir +/- 7,8 288/244 288/201

Dicamba - 11,2 219/174,8 219/144,8

Quinclorac + 10,8 242/224 242/196

Metsulfurón metil + 11,9 382/167,1 382/141,1

Bentazone - 13,6 239/132 239/197

Penoxsulam + 15,1 484/195,2 484/444,1

Clomazone + 15,9 240/125 240/99,1

Bispiribac Sodio + 16,0 431/275,1 431/119,1

Propanil + 16,3 218/162 218/127

Pirazosulfurón etil + 17,2 415/182,2 415/139,2

Cihalofop butil + 23,7 358,4/256,2 358,4/120,1

LOD del Carbendazim a 0.1 µg/L

Standard mode

Scheduledmode

Triciclazol en muestra real y solución estándar a 0,1 µg/L

Agua cañada

Estándar en matriz

190,1/163,1

190,1/136,1

Ratio 0.8 Ratio 0.8

¡Gracias!

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