Modificação de linhagens Modificação de linhagens industriais de industriais de

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae para o aumento da para o aumento da

produtividade de álcool e produtividade de álcool e floculação condicionalfloculação condicional

Silvia Kazue MissawaSilvia Kazue Missawa

Orientador: ProfOrientador: Profoo Dr Gonçalo Amarante Guimarães Dr Gonçalo Amarante Guimarães PereiraPereira

IntroduçãoIntrodução

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiaeUtilizado processo fermentativoUtilizado processo fermentativo EtanolEtanol CachaçaCachaça CervejaCerveja VinhoVinhoO que é fermentação??O que é fermentação??

Vias Vias MetabólicasMetabólicas

GLICÓLISEGLICÓLISE

FERMENTAÇÃOFERMENTAÇÃO

RESPIRAÇÃORESPIRAÇÃO

(Schüller, 2003)

Processo Fermentativo Processo Fermentativo IndustrialIndustrial

(Meleiro & Maciel-Filho, 2000)

Genes FloculaçãoGenes Floculação

Proteína de membranaProteína de membranaFLO1 e FLO5: agregados são FLO1 e FLO5: agregados são

reprimidos por manosereprimidos por manoseFLO10: agregados são reprimidos na FLO10: agregados são reprimidos na

presença de açucares (maltose, presença de açucares (maltose, sacarose e glicose)sacarose e glicose)

Processo FloculaçãoProcesso Floculação

FloculaçãoFloculação

[ ] cálcio [ ] cálcio [ ] etanol[ ] etanolnutrientesnutrientestemperatura temperatura pHpHatividade mitocondrialatividade mitocondrial

Atividade MitocondrialAtividade Mitocondrial

Deficiência genoma da mitocôndria Deficiência genoma da mitocôndria Altera características da superfície Altera características da superfície

da célulada célulaPET191 - PET191 - gene nuclear gene nuclear (Hutter &Oliver, (Hutter &Oliver,

1998)1998)montagem subunidades citocromo montagem subunidades citocromo

C oxidaseC oxidaseRompimento Rompimento PET191 – PET191 – aumento na aumento na

produção de etanol (43%)produção de etanol (43%)

CONTROL OF CONTROL OF SACCHAROMYCES CEREVISIAESACCHAROMYCES CEREVISIAE FLOCCULATION BY SUGAR FOR INDUSTRIAL FLOCCULATION BY SUGAR FOR INDUSTRIAL

ETHANOL PRODUCTIONETHANOL PRODUCTION Cunha, A.F. Cunha, A.F. 11 , Missawa, S.K. , Missawa, S.K.11 , Gomes, L.H. , Gomes, L.H.22, Reis, S. F., Reis, S. F.33 and Pereira, G.A.G. and Pereira, G.A.G. 11

(1(1) ) Laboratório de Genômica e Expressão - Departamento de Genética e Laboratório de Genômica e Expressão - Departamento de Genética e Evolução Instituto de Biologia –Universidade Estadual de Campinas - Evolução Instituto de Biologia –Universidade Estadual de Campinas - Campinas – São Paulo – BrazilCampinas – São Paulo – Brazil

(2) Universidade de São Paulo – ESALQ – Laboratório de Genética de (2) Universidade de São Paulo – ESALQ – Laboratório de Genética de Leveduras –Piracicaba, SPLeveduras –Piracicaba, SP

(3) Departamento de Parasitologia - Instituto de Biologia - Universidade (3) Departamento de Parasitologia - Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas – Campinas - São Paulo – BrazilEstadual de Campinas – Campinas - São Paulo – Brazil

Submitted to: FEMS YEAST RESEARCHSubmitted to: FEMS YEAST RESEARCH

Objetivos ArtigoObjetivos Artigo

Floculantes condicionaisFloculantes condicionaisProcesso pedido patente Processo pedido patente

(INPI n(INPI no o 0001122)0001122)Transferir a tecnologia para indústriaTransferir a tecnologia para indústria

Engenharia genéticaEngenharia genéticaUso promotor forte e condicionalUso promotor forte e condicional

Construção com o promotor Construção com o promotor MoxBBMoxBB

Northern blotNorthern blot

Construção com o promotor Construção com o promotor ADH2ADH2

Transformação de linhagem industrialTransformação de linhagem industrial

ProblemasProblemas

Desfloculação dos agregados do Desfloculação dos agregados do gene gene FLO5FLO5

Floculação antecipada na linhagem Floculação antecipada na linhagem industrialindustrial

ObjetivosObjetivos

Avaliar o gene Avaliar o gene FLO10FLO10Analisar crescimento das células e Analisar crescimento das células e

produtividade de etanol em produtividade de etanol em linhagens de laboratório e industriaislinhagens de laboratório e industriais

Deletar o gene Deletar o gene PET191PET191 para para aumentar a produtividade de etanolaumentar a produtividade de etanol

Materiais e MétodosMateriais e Métodos

Linhagens S. cerevisiae:Linhagens S. cerevisiae: W303-1a, JD7-7C, HD9315bW303-1a, JD7-7C, HD9315b Pedra2, Fleishman, UvarumPedra2, Fleishman, Uvarum

PlasmídeosPlasmídeos YEp352-FLO5, pYADE4, pYADE4-YEp352-FLO5, pYADE4, pYADE4-

FLO5FLO5

Amplificação e Clonagem do Amplificação e Clonagem do gene gene FLO10FLO10

Amplificação por PCRAmplificação por PCRClonagem em P-gem (Promega)Clonagem em P-gem (Promega)DigestãoDigestãoClonagem no pYADE4Clonagem no pYADE4

Extração de RNA e Northern BlotExtração de RNA e Northern BlotTestes Floculação: Tempo de Testes Floculação: Tempo de

sedimentaçãosedimentação Isolamento e caracterização de Isolamento e caracterização de

linhagens selvagens: RAPDlinhagens selvagens: RAPDTeste produtividade: Cromatógrafo a Teste produtividade: Cromatógrafo a

gás, ou destilação e desimetriagás, ou destilação e desimetria

Resultados ParciaisResultados Parciais

Amplificação do gene Flo10 Amplificação do gene Flo10 FLO10BamF 5´ CGCFLO10BamF 5´ CGCGGATCCGGATCCATGCCTGTGGCTGCTCG 3´ATGCCTGTGGCTGCTCG 3´ FLO10SalR 5´ ACGCFLO10SalR 5´ ACGCGTCGACGTCGACCTATTAAACGATTG CCAG 3´. CTATTAAACGATTG CCAG 3´.

Clonagem do gene Flo10 em PgemClonagem do gene Flo10 em Pgemhind FLO10

3,5KB

hind FLO10

3,5KB4361

23222027

564

bp

λ hind 1 2 3

(1) SalI (3 e 3,5Kb)

(2) BamHI/SalI (3 e 3,5Kb)

(3) ScaI/SalI (1,1; 1,5; 1,8; 2,0Kb)

pYADE4-FLO10

FLO10PromotorADH2

pGEM-FLO10BamH I

FLO10

Sal I

pYADE4BamH I Sal I

Promotor ADH2

Construção do pYADE4-Construção do pYADE4-FLO10FLO10

Extração RNA e NorthernExtração RNA e Northern

0 20 40 0 20 40

pYADE4pYADE4 -FLO10

Tempo (horas)

Concentração de glicose (%) 4 1 0 4 1 0

A

B

0 20 40 0 20 40

pYADE4pYADE4 -FLO10

Tempo (horas)

Concentração de glicose (%) 4 1 0 4 1 0

A

B

Seleção por canavanina emSeleção por canavanina em linhagens industriais linhagens industriais

Célula cresceCAN1canavanina

arginina

Permease da arginina

XX

CAN1

canavanina

arginina Célula não cresce

XXXX Célula cresceCAN1

canavanina

arginina

Permease da arginina

XX

CAN1

canavanina

arginina Célula não cresce

XXXX

Cassete integrativoCassete integrativo

pYADE4-FLO10

ATGFLO10ADH2

Promoter FLO10CAN1

CAN1ADH2

ATGADH2

PromoterCAN1’ CAN1’’

CAN1(Genomic Locus)

+ 205 + 1467

4361

2322

λ hind

3,7 kb

pb

4361

2322

λ hind

3,7 kb

pb

Próximas EtapasPróximas Etapas

Clonar o gene Clonar o gene FLO10 FLO10 com seu com seu próprio promotorpróprio promotor

Transformação de linhagens Transformação de linhagens industriais com cassete integrativoindustriais com cassete integrativo

Desenvolver estratégia de Desenvolver estratégia de desfloculação (FLO10)desfloculação (FLO10)

Deleção de Deleção de PET191PET191Testes de floculação e produtividadeTestes de floculação e produtividade