Modelos experimentales de cáncer: utilidad en elestudio de marcadores de diferenciación celular

en la progresión tumoralA. Cano*, M. Gómez*, P. Navarro*, C. Caulín*, C. Gamallo**

y M. Quintanilla** Instituto de Investigaciones Blomédlcas, CSIC. Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina. UAM. Madrid

y "Departamento de Anatomía Patológica. Hospital La Paz. Facultad de Medicina. UAM. Madrid.

Introducción

Los esfuerzos realizados durante la última dé-cada han permitido establecer de manera ine-quívoca la naturaleza multisecuencial del desa-rrollo tumoral. La identificación de lesionesgenéticas asociadas al desarrollo tumoral ha lle-vado a establecer que se requieren alteracio-nes en varios genes para que se manifieste elfenotipo de las células tumorales malignas. En-tre los tumores humanos, el carcinoma de co-lon representa uno de los pocos sistemas ade-cuados para el análisis secuencia! de los eventosmoleculares implicados en la transición desdeel fenotipo normal a un fenotipo tumoral benig-no y la posterior evolución hacia un fenotipo tu-moral maligno e invasivo1. Los estudios realiza-dos en este sistema han puesto de manifiestoque se requieren alteraciones en al menos 4-5genes diferentes para el desarrollo del fenotipoinvasivo, habiéndose sugerido que la acumula-ción de alteraciones genéticas, más que el or-den preciso en el que éstas ocurren, pueda serel factor determinante en la progresión tumo-ral1. Las alteraciones genéticas identificadas eneste y otros sistemas afectan a dos grandes gru-pos de genes: a) activación de protooncogenes,y b) inactivación de los llamados genes supre-sores del cáncer o antioncogenes23. Uno delos grandes retos actuales de la investigaciónsobre el cáncer reside en la identificación de ge-nes supresores del cáncer y de la metástasis ysu asociación inequívoca con las alteracionescromosomicas detectadas (pérdida total o par-cial o inactivación por mutación).

Una característica fundamental de la trans-formación neopláslca es el desacoplamiento en-tre los procesos de proliferación y diferenciacióncelular, lo que conlleva la alteración de la ar-quitectura y homeostasis de los tejidos afecta-dos. Sin embargo, se desconoce todavía en gran

medida la relación entre las lesiones genéticasy cromosomicas detectadas en diferentes tipostumorales y las alteraciones observadas en ladiferenciación de los tejidos afectados. Los mo-delos experimentales de cáncer proporcionanuna herramienta muy valiosa para profundizaren la comprensión de los eventos genéticos ycelulares subyacentes al desarrollo y progresióntumoral. Entre ellos, la carcinogénesis químicade piel de ratón representa uno de los mejoresmodelos conocidos y de hecho ha contribuidonotablemente a las ¡deas actuales sobre la na-turaleza multisecuencial del cáncer4. En estesistema la formación de tumores ocurre en es-tadios discretos. El tratamiento inicial de la pielde ratón con un carcinógeno químico, como di-metilbenzantraceno (DMBA) produce una po-blación de células «iniciadas» como consecuen-cia de alteraciones genéticas irreversibles. Lascélulas iniciadas pueden ser posteriormente es-timuladas a proliferar mediante tratamiento de¡a piel con un promotor tumoral, como el ésterde forbol TPA, originando lesiones benignas opapilomas. Un pequeño número de papilomasadquieren la capacidad de progresar hacia car-cinomas epidermoides bien diferenciados5. Es-tos tumores pueden sufrir cambios adicionalespara progresar hacia carcinomas fusiformes in-diferenciados con un fenotipo más invasivo ymaligno67. La carcinogénesis química de pielde ratón proporciona, por tanto, un valioso ma-terial biológico representativo de diferentes es-tadios de la progresión tumoral. Además, estesistema proporciona una aproximación experi-mental in vitroya que se pueden obtener líneascelulares derivadas de diferentes tipos de tumo-res (papilomas, carcinomas epidermoides ocarcinomas fusiformes) o por tratamiento dequeratinocitos en cultivo con agentes carcino-génicos o transfección con oncogenes.

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INVESTIGACIÓN SOBRE CÁNCER EN ESPAÑA: DE LA BIOLOGÍA \1CLECULAR A LA CLÍNICA

Los estudios de la última década en este sis-tema han permitido identificar la existencia dealteraciones genéticas asociadas a diferentes es-tadios de progresión. Así, se ha puesto de ma-nifiesto que la activación por mutación puntualdel protooncogén Harvey-ras (H-ras) es uno delos eventos responsables de la iniciación8. Laprogresión maligna parece estar asociada conalteraciones en el cromosoma 7, donde se lo-caliza el gen H-ras, y el cromosoma 11 quecontiene e! gen que codifica por la proteínap539"n, identificado como un gen supresor enotros sistemas12. La inactivación por mutacióndel gen p53 ocurre significativamente en la pro-gresión de papilomas a carcinomas11. Por otraparte, estos estudios sugieren que el incrementoen la dosis alélica H-ras mutado: H-ras normalpuede estar implicado en la progresión haciacarcinomas fusiformes9.

Nuestro grupo viene utilizando el modelo ex-perimental de la carcinogénesis de piel de ra-tón con el objetivo de estudiar la implicación dedos tipos de componentes celulares de gran im-portancia para el mantenimiento de la arquitec-tura y homeostasis de la epidermis normal: losprocesos de adhesión celular y la expresión dequeratinas. Los procesos de adhesión interce-lular dependientes del calcio mediados por lafamilia de cadherinas desempeñan un papelclave en la adquisición y mantenimiento de laestructura tisular de los tejidos en la morfogé-nesis embrionaria13. En la epidermis normal,se expresan 2 miembros de esta familia, cad-herina P (CD-P) restringida a las células de lacapa basal proliferativa, y cadherina E (CD-E)expresada mayoritariamente en las capas su-prabasales del estrato espinoso14. La adhesiónde las células epidérmicas básales con la ma-triz extracelular subyacente, lámina basal, estáen gran parte mediada por unos receptores ce-lulares pertenecientes a la familia ce las inte-grinas, constituidos por heterodímeros ap :5

Entre ellos, la integrina a6p4 puede desempe-ñar un papel determinante en el anclaje de lascélulas básales, ya que se expresa exclusiva-mente en la membrana basolateral de estas cé-lulas, asociada a estructuras estables como sonlos hemidesmosomas16. Por otra parte, lasqueratinas, proteínas que forman los filamen-tos intermedios del citosqueleto de las célulasepiteliales, constituyen los principales marcado-res de diferenciación epidérmica1718. Así, lascélulas de la capa basal expresan fundamen-talmente la pareja de queratinas K5, K14, mien-tras que las de las capas suprabasales reprimenla expresión de estas queratinas y expresan que-

ratinas específicas de diferenciación, Kl, K10.En este trabajo presentamos un resumen de

los datos obtenidos acerca de la expresiónde estos componentes celulares en una serie delíneas celulares representativas de diferentes es-tadios de la carcinogénesis química, así comoen tumores inducidos in vivo mediante trata-miento de la piel de ratón con DMBA/TPA. Laposible utilidad del estudio de estos marcado-res en tumores humanos será discutida.

Materiales y métodos

Cultivo de las líneas celulares e inducciónde tumores

Las líneas celulares utilizadas en este estu-dio han sido descritas anteriormente de formadetallada1"3-21-. Las líneas celulares de morfolo-gía epitelial se hicieron crecer en medio de cul-tivo HAM F-12, suplementario con aminoácidosy suero de ternera fetal (FCS) al 10% y las demorfología fibroblastoide en medio de Dulbec-co modificado, DMEM, con FCS al 5%. Las cé-lulas se hicieron crecer a 37 °C en atmósferahúmeda con un 5% de C02.

La inducción de tumores en ratones de lacepa BaibC se realizó mediante el protocolo de2 estadios DMBA/TPA, método descrito previa-mente5. La iniciación se llevó a cabo por apli-cación de una dosis única de DMBA (100u.g/200 u.1). La promoción se realizó al cabo deuna semana por tratamiento con TPA (10u.g/200 ul en acetona) 2 veces por semana du-rante un total de 30 semanas. Los papilomasaparecieron entre las 8 y 20semanas de trata-miento con TPA. Aproximadamente un 5% delos papilomas evolucionaron hacia carcinomas,detectándose su aparición entre 10 y 20 sema-nas tras la finalización de la promoción. Tras elsacrificio de los animales, los tumores se extra-jeron y una fracción de los mismos se recogióenformol salino (3,7%) y el resto se congeló in-mediatamente en OCT en isopentano enfriadoen nitrógeno líquido. Secciones de 5-6 u.m seutilizaron posteriormente para histología y tin-ción inmunohistoquímica, respectivamente.

Anticuerpos

Para la detección de cadherinas se utilizaronlos anticuerpos monoclonales (Ame) ECCD-2,específico de CD-E de ratón y PCD-1, específi-co de CD-P de ratón, amablemente cedidos porel Dr. M. Takeichi (Universidad de Kyoto, Ja-pón). La detección de 0.604 se realizó median-

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MODELOS EXPERIMENTALES DE CÁNCER: ÚTIL DAD EN EL ESTUM DE MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN CELULAR EN LA PROGRESIÓN TUMORAL

F/g. J. Morfología de las líneas celulares de queratinoatos de ratón. Se muestran imágenes de contraste de fasede células de distintas líneas de queratinocitos de ratón: (a) MCA3D; (b) PDV; (c) HaCa4, y (d) CarC, creadasa confluencia (a) o subconfluencia (b a d). Barra, 50 ¡¡m.

te los AcMo, 115-13A y 346-11C, específicosde las subunidades o/ó y 34 de ratón, respecti-vamente; ambos anticuerpos fueron cedidos porel Dr. S. Kennel (Oak Ridge National Laboratory.Oak Ridge, EE.UU). Para la detección de lasqueratinas K8 y K13 se utilizaron e¡ AmeTROMA-1 (ant¡-K8), cedido por el Dr. R. Kem-ler (Instituto Max-Planck, Freiburg, Alemania) yel anticuerpo policlonal RK13 (anti-RK13), ce-dido por el Dr, D. Roop (Instituto Nacional delCáncer, Bethesda, EE.UU.).

Técnicas inmunológicas

Las diferentes técnicas inmunológicas utiliza-das en este estudio (inmunofluorescencia, in-munotransferencia y fluorescencia de flujo aso-ciada a membrana celular [FACS], de célulasen cultivo, así como inmunohistoquímica e in-munofluorescencia de secciones tumorales) serealizaron como describen Navarro et al19 yGómez M et al20, con el uso de los anticuerpos

apropiados. Como anticuerpos secundarios seutilizaron Ig de cabra antirrata o anticonejo con-jugados a compuestos fluorescentes. Para la de-tección ¡nmunohistoqiJÍmica se utilizó Ig de ca-bra antirrata conjugado a biotina y el complejoestreptavidina-fosfatasa alcalina.

Resultados

Características morfológicas y propiedadestumorogénicas de las líneasde queratinocitos de ratón

Parte de las líneas celulares utilizadas en esteestudio fueron derivadas por explantes de tu-mores inducidos in vivo de diferentes estadios:papilomas (PB)21, carcinomas epidermoides(HaCa4)22 y carcinomas fusiformes (CarC)9. Laslíneas MCA3D y PDV se obtuvieron por trata-miento in vitro de cultivos primarlos de epider-mis con DMBA, y posterior selección en presen-cia de calcio en el caso de MCA3D23'24. La

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INVESTIGACIÓN SOBRE CÁNCER EN ESPAÑA: DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR A LA CLÍNICA

TABLA ITUMOROGENICIDAD DE LAS LÍNEAS

CELULARES

Línea

N.° detumores

N.° de sitiosde inyección

Tumorolo-Latencia * génesis

relativa

MCA3D 0 / 6PB 0 / 4PDV 5 /5PDVC57 4 / 4HaCa4 6 / 6CarC 12 /12

3 semanas +2 semanas + +

7-9 días + + +7-9 días + + +

Las líneas celulares se inyectaron s.c. en ratones ¡n-munodeprímidos en ambos flancos (1 x 106

cel/seg/inyección). Los animales se sacrificaroncuando at menos uno de los tumores alcanzó un ta-maño de 1,5-2,0 cm de diámetro; "la latencia se es-timó como el tiempo necesario para desarrollar un tu-mor de 1 cm de diámetro.

TABLA IIEXPRESIÓN DE CADHERINAS, «6/34 Y K8

EN LAS LÍNEAS CELULARES

Línea CD-E* CD-P' 0*604' K8*

MCA3DPBPDVPDVC57HaCa4CarC

ND ND

"Los niveles relativos de expresión de CDE, CDP yK8 se estimaron a partir de los datos obtenidos me-diante análisis de inmunofluorescencia, inmunotrans-ferencia y Northern blot; * "los niveles relativos de ex-presión de a6/34 se estimaron a partir de los datosobtenidos por inmunofluorescencia y fluorescenciade flujo asociada a la membrana (FACS); ND: no de-terminado.

línea PDVC57 se derivó a partir de un explantede un tumor inducido por PDV en ratones sin-génicos25. Durante su tratamiento en cultivoestas líneas celulares presentan una morfologíay patrón de crecimiento bien diferenciados. Así,las líneas MCA3D, PB, PDV y PDVC57 exhibenun fenotipo epitelial, con crecimiento en islaso colonias definidas donde las células formanfuertes contactos celulares (figs. la y b, paraMCA3D y PDV), mientras que las células de lalínea HaCa4 muestran un fenotipo más epite-lioide, siendo incapaces de crecer en islas con

contactos definidos (fig. le). Por su parte, la lí-nea celular CarC exhibe un fenotipo claramen-te fibroblastoide, de acuerdo con su origen apartir de un carcinoma fusiforme (fig. Id).

Las propiedades tumorogénicas de las líneascelulares se analizaron mediante inyección sub-cutánea en ratones inmunodeprimidos (nu/nu).Como se puede observar en la tabla I, las líneasMCA3D y PB no son tumorogénicas, siendo in-capaces de inducir tumores hasta 3 meses trasla inyección. Sin embargo, las líneas derivadasde carcinomas HaCa4 y CarC son altamente tu-morogénicas, induciendo tumores en todos lossitios de inyección y con tiempos de latencia ex-tremadamente cortos, de 7 a 9 días. Por otraparte, las líneas PDV y PDVC57 mostraron unatumorogenicidad intermedia, induciendo tumo-res en ratones nu/nu en todos los sitios de in-yección pero con tiempos de latencia de apro-ximadamente 3 y 2 semanas, respectivamente.La baja tumorogenicidad de PDV se puso, asímismo de manifiesto, mediante inyección en ra-tones singénicos (cepa c57B/L) donde sólo in-dujo tumores en un 10% de los sitios de inyec-ción, mientras que PDVC57 indujo tumores entodos los sitios de inyección26.

Por otra parte, el estudio de alteraciones enel gen H-ras en las diferentes líneas celularespuso de manifiesto la ausencia de alteracionesen las líneas MCA3D y PB, mientras que las lí-neas PDV y PDVC57 presentan una mutaciónpuntual en el codón 61 con un incremento enla dosis de alelo mutado: alelo normal en el casode PDVC5725. La línea HaCa4 derivada de uncarcinoma inducido por el virus HMSV y TPApresenta altos niveles de expresión del oncogénH-ras viral22, mientras que la línea CarC pre-senta una pérdida total del alelo H-ras nor-mal9. Por consiguiente, este conjunto de líneascelulares se pueden considerar como represen-tativas de diferentes estadios de la carcinogé-nesis de piel de ratón, proporcionando un mo-delo in vitro adecuado para el análisis de laexpresión de componentes celulares y alteracio-nes genéticas asociadas a la progresión tumoral.

Expresión de cadheñnas, a6¡34 y K8en líneas celulares en cultivo

Los estudios sobre expresión de cadherinas,0.604 y K8 en las diferentes líneas celulares seresumen en la tabla II. El análisis de la expre-sión de cadherinas mostró la existencia de unafuerte correlación inversa entre la expresión deCD-E y la tumorogenicidad de las líneas celula-res, observándose la ausencia total de esta pro-

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MODELOS EXPERIMENTALES DE CÁNCER: UTILIDAD EN EL ESTUDIO DE MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN CELULAR EN LA PROGRESIÓN TUMORAL

teína en las líneas altamente tumorogénicasHaCa4 y CarC. Sin embargo, ía expresión deCD-P no indicó la existencia de ninguna corre-lación aparente con la tumorogenlcidad (com-parar las concentraciones de PDV y HaCa4 enla tabla II}, aunque la expresión de CD-P no sedetectó en la línea CarC de morfología fibroblas-toide. En contraste con la expresión de CD-E,la expresión de la integrina a634 mostró unmarcado incremento en relación con la adqui-sición del fenotipo tumoral, aunque no se ob-servó una correlación directa con el grado detumorogenicidad, ya que tanto PDV comoHaCa4 mostraron niveles similares de expresiónde esta molécula. Por otra parte, la expresiónde la queratina K8, típica de células de epiteliosimple y estadios embrionarios", sólo se pudodetectar en las células tumorogénicas, siendoindetectable en células no tumorogénicas comoMCA3D y PB.

Estos resultados indicaron que la expresiónde receptores de adhesión celular y de marca-dores de diferenciación como la queratina K8se encuentran alterados diferencialmente du-rante la adquisición del fenotipo tumoral de losqueratinocitos de ratón.

Expresión de cadherínas, ct6(34 y queratinasen tumores inducidos ¡n vivo

Con el fin de estudiar si las alteraciones ob-servadas en la expresión de los componentesde adhesión y de queratinas en las líneas celu-lares podían extrapolarse a la situación in vivo,se estudió la expresión de las diferentes molé-culas en una colección de tumores inducidosen la piel de ratón con DMBA y TPA.

En la figura 2 se observa la tinción por inmu-nohistoquímica obtenida en papilomas y carci-nomas de diferente grado de diferenciación

para CD-E y CD-P. Como se puede comprobar,la expresión de ambas moléculas de adhesiónse conserva en las lesiones benignas de papi-lomas, con un patrón similar al de la epidermisnormal: la CD-P aparece restringida a las célu-las de la capa basal proliferativa (fig, 2c), mien-tras que la CD-E se expresa fundamentalmen-te en las capas suprabasales (fig. 2b). Seobservó un patrón similar de expresión de am-bas cadherinas en carcinomas epidermoidesbien diferenciados, que exhiben altas concen-traciones de CD-E en amplias regiones tumo-rales con una localización preferente en tornoa las regiones de diferenciación y queratiniza-ción (tabla III). Sin embargo, la expresión deCD-E se redujo progresivamente en los carci-nomas de menor grado de diferenciación. Así,en carcinomas moderadamente diferenciados,la expresión de CD-E se restringió a una o doscapas celulares adyacentes a las zonas de que-ratinización (fig. 2e), mientras que en carcino-mas pobremente diferenciados sólo se obser-vó la expresión de CD-E en torno a las escasasáreas de diferenciación queratínica observadaen estos tumores, que estaba totalmente ausenteen amplias regiones tumorales más anaplásicas(fig. 2h). La expresión de CD-P se incrementóen carcinomas moderadamente diferenciadosdonde se detectó de forma más deslocalizadaen amplias zonas tumorales (fig. 21). Sin embar-go, en los carcinomas pobremente diferencia-dos la expresión de CD-P fue más heterogénea,detectándose carcinomas que exhibían una ex-presión restringida de esta molécula (fig. 2i),mientras que en otros casos, histológicamentesimilares, la expresión de CD-P se extendió agrandes regiones tumorales (tabla III). Por otraparte, en los tumores indiferenciados, de tipofusiforme, no se detectó expresión alguna deCD-E ni de CD-P (fig. 2k,l).

TABLA illEXPRESIÓN DE CADHERINAS, «6j34 Y QUERATINAS EN TUMORES INDUCIDOS IN VIVO

CD-E CD-P K8 K13

EpidermisPapilomasCarcinoma epidermoide (BD)Carcinoma epidermoide (MD)Carcinoma epidermoide (PD)Carcinoma fusiforme

+ 1 — + / + -r+ 1-

La expresión de las diferentes moléculas en los tumores se ana-izó por inmunohistoquímica e inmunofluorescenciade secciones tumoralas. Los niveles relativos de expresión se estimaron, en cada caso, en función de la intensidady extensión de la tincón. BD: bien diferenciado; MD: moderadamente diferenciado; PD: pobremente diferenciado.

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INVESTIGACIÓN SOBRE CÁNCER EN ESPAÑA: DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR A LA CÍNICA

Fig 2 H'stolog'a y tinción inmunohistoquimica de cadhenna Ey cadhenna P en tun ores de pie1 de wf.jf? obtenidc soor carcmogenesis química Cortes histo'ogicos, 5 6 /¡m de espesor, de diferentes especímenes se tiñeron conhematoxilina-eosma (paneles a, d, g y ]), y secciones congeladas con el AcMo ECCD-2 (anti-CD-E) ib, e, h y k)y con el AcMo PCD-1 (anti-CD-P) (c, f, i y I). Las imágenes corresponden a-, un papiloma (a-c); un carcinomaepidermolde moderadamente diferenciado (d-f); un carcinoma epidermoide pobremente diferenciado (g-ij, y uncarcinoma fusiforme indiferenciado (j-i). Las zonas de queratinizacion en el panel g se indican con flechas y laexpresión de CD-Ey CD-P en los paneles h e i con puntas de flecha. Barra, 150 ¿crn. El aumento en los panelesa-d corresponde al mostrado en los paneles gy j, el aumento de los paneles ey f corresponde al indicado enlos paneles h-i y k-l.

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M0DE.05 EXPERIMENTALES DE CÁNCER: U'ILijAD EN EL ESTUDIO DE MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN CELULAR EN LA PROGRESICN TUMORAL

En el patrón de expresión de a6(34 en las di-ferentes lesiones tumorales se observó un incre-mento notable de esta molécula respecto a laepidermis normal. En las lesiones benignas depapilomas esta íntegrina se expresa intensa-mente en las células básales delimitando la re-gión de interacción con la membrana basal ad-yacente. Además, se observó una claradespolarización de esta Íntegrina en los papilo-mas, detectándose, así mismo, su expresión enla membrana apical de las células básales y suextensión hacia las capas suprabasales, aunquecon menor intensidad (fig. 3a). En los carcino-mas epidermoídes la expresión de esta Íntegri-na se extendió a amplías regiones tumorales conuna intensidad homogénea en todas las capascelulares, perdiéndose la nitidez de la tinciónen la membrana basal en algunas áreas de car-cinomas bien diferenciados (fig. 3b). La inten-sidad y extensión de la tinción se incrementóen carcinomas moderadamente diferenciados(fig. 3c). Sin embargo, en los carcinomas fusi-formes, no se detectó expresión de a6|34 o que-daba restringida a células aisladas con aparen-te localización citoplásmica (tabla III).

La expresión de K8 en los tumores inducidosin vivóse analizó mediante ¡nmunofluorescen-cia de secciones tumorales, en paralelo con laexpresión de la queratina K13. K13 es una que-ratina típica de epitelios estratificados internos,habiéndose observado previamente su expre-sión aberrante en papilomas y carcinomas epi-dermoídes de ratón2728. Este estudio revelóque los papilomas eran, en general, negativospara la expresión de K8, mientras que los car-cinomas mostraban niveles variables de expre-sión de esta queratina. Sin embargo, los papi-lomas mostraron una expresión detectable dequeratina K13, aumentando su expresión en loscarcinomas bien diferenciados (tabla III). Estosdatos sugerían que la expresión aberrante deK8 podría ser un evento más tardío en la pro-gresión tumoral que la de K13. Con el objetode profundizar estas observaciones, se realizóun estudio de la expresión de ambas querati-nas mediante doble inmunofluorescencia en tu-mores inducidos en ratones slngénicos por laslíneas PDV y PDVC57. PDV induce tumores epi-dermoides bien diferenciados, mientras que lostumores inducidos por PDVC57 presentan unbajo grado de diferenciación y son muy anaplá-sicos. Como se puede observar en la figura 4,ambas queratinas se expresan en regiones tu-morales distintas. Así, la expresión de K8 apa-reció asociada a las áreas anaplásicas, mien-tras que K13 se restringe a las regiones bien

a

Fig. 3. Tinción inmunohistoquímica de a6¡34 en tu-mores de piel de ratón obtenidos por carcinogénesisquímica. Secciones congeladas, 5-6/¡m de espesor,de diferentes especímenes se tiñeron con el Ame346-11A (anti-(S4t. Las imágenes corresponden a-, unpapiloma (a), un carcinoma epidermoide bien dife-renciado (b) y a un carcinoma moderadamente dife-renciado (c). Aumento, x20, en todos los pañetes.

diferenciadas (fig. 4, comparar paneles a-b yc-d). De acuerdo con el grado de diferenciaciónde los tumores inducidos por las líneas PDV y

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NVESTIGACION SOBRE CÁNCER EN ESPAÑA: CE LA ElOLOGlA MOLECLLAR A LA CLÍNICA

Fig. 4. Localización por inmunofluorescencia de K13, K8 y a684 en tumores inducidos en ratones singénicospor las líneas PDVy PDVC57. Secciones congeladas, 5-6 pm de espesor, de tumores inducidos por la línea PDV(a, by e)y por la línea PDVC57 (c, dyOse sometieron a inmunoflucrescencia doOle para la detección conjuntade K13 (paneles a y c) y K8 (paneles byd)e inmunofluorescencia simple para la detección de c£04 (paneleseyf). Como anticuerpos primarios se utilizaron elpoiiclonal RKl3 de conejo para detectar K13, eiAcMo TROMA-1de rata para K8 y el Acm 346-11A de rata para a6@4. Como anticuerpos secundarios se utilizaron ¡g de cabraanticonejo y antirrata acoplados a fluoresceína o rodamina. Aumento, x 16 (paneles a-d) y, x 40 (paneles eyf).

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MODELOS EXPERIMENTALES DE CÁNCER: UTILIDAD EN EL ESTUDIO DE MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN CELULAR EN LA PROGRESIÓN TUMORAL

PDVC57, K13 se expresó abundantemente enlos tumores inducidos por PDV (fig. 4a)y dis-minuyó drásticamente en los inducidos porPDVC57 (fig. 4c), mientras que K8 exhibió unpatrón inverso de expresión en ambos tipos detumores (figs. 4b y d). Por otra parte, la expre-sión de la integrina a6(34 en este tipo de tumo-res mostró una locallzación más restringida ala membrana basal en los inducidos por PDV(fig. 4e) y su amplia deslocalización en los In-ducidos por PDVC57 (fig. 4f).

En conjunto, estos resultados confirman losdatos obtenidos sobre la expresión de los recep-tores de adhesión celular y de queratinas abe-rrantes en las líneas celulares, reforzando la uti-lidad de las mismas como modelo in vitro dela progresión tumoral.

Discusión

El modelo experimental de la carcinogénesisde piel de ratón ha aportado hasta la fecha unavaliosa información acerca de las alteracionesgenéticas asociadas a estadios discretos de laprogresión tumoral811. En un esfuerzo por pro-fundizar en el conocimiento de los eventos ce-lulares potencialmente implicados en la carci-nogénesis, nuestros estudios se dirigen aanalizar en detalle la expresión de receptorescelulares (cadherinas e ¡ntegrinas) y componen-tes del citosqueleto (queratinas) en este modelo.

Los resultados obtenidos sobre la expresiónde estas moléculas en una colección de líneascelulares derivadas de diferentes estadios, asícomo en tumores inducidos en la piel de ratón,han puesto de manifiesto, en primer lugar, lavalidez de este modelo experimental para unaaproximación in vitro a la progresión tumoral.Por otra parte, los diferentes componentes ana-lizados muestran un patrón de expresión dife-rencial, asociado aparentemente a estadios con-cretos de la progresión tumoral.

El estudio de la expresión de las moléculasde adhesión intercelular de la familia de las cad-herinas ha permitido establecer un papel impor-tante para la CD-E en la progresión tumoral. Laregulación a la baja (down regulation) en la ex-presión de esta molécula en relación con el fe-notipo y el grado de diferenciación tumoral su-giere fuertemente la implicación de estamolécula, junto con otros componentes celula-res, en el mantenimiento del patrón de diferen-ciación de la epidermis. De hecho, estudios denuestro grupo han mostrado que la reexpresiónde CD-E, mediante transfecclón génica, en lalínea celular HaCa4 altamente tumorogénica es

capaz de inducir una reversión parcial del fe-notipo tumoral. Esta reversión se manifiesta tan-to por el incremento en los tiempos de latenciacomo en el mayor grado de diferenciación delos tumores inducidos por los transfectantesde CD-E19. Estas observaciones están, por otraparte, de acuerdo con el carácter antiinvasivopropuesto para CD-E por otros grupos2930. Porotra parte, los resultados obtenidos acerca dela expresión de CD-P en este sistema si bien noindican una relación aparente con la adquisi-ción del fenotipo maligno podrían sugerir unaparticipación de esta molécula de adhesión, jun-to a CD-E, en el mantenimiento del fenotipo epi-telial de los queratinocitos. Así, la expresión deCD-P se mantiene a niveles altos en las célulasHaCa4 que conservan una morfología epitelioi-de, a pesar de la ausencia de CD-E, mientrasque su expresión se Inhibe en las células demorfología fibroblastoide (fig. 1 y tabla II).

Los estudios sobre la ¡ntegrlna ct6p4 han mos-trado la existencia de una regulación al alza(up regulation) en la expresión de esta molécu-la con la adquisición del fenotipo maligno. Esinteresante señalar que la expresión de esta mo-lécula sufre un procesó de despolarización, ob-servable en lesiones benignas de papilomas, porel que esta integrina deja de estar restringidaa la membrana de las células básales en con-tacto con la lámina basal y se localiza ademásen la membrana apical y en células de las ca-pas suprabasales. La despolarización de estamolécula se hace más evidente en los carcino-mas donde se expresa con gran intensidad enamplias regiones tumorales, aparentementeen contactos célula-célula, al mismo tiempo quetiende a perderse de forma progresiva en lasregiones de contacto con la lámina basal (fig. 3).Estos resultados sugieren que la función de estaintegrina, y su asociación a hemldesmosomasse altera en los primeros estadios de la progre-sión tumoral (papilomas) pudlendo contribuir enalguna medida a un debilitamiento del anclajede las células básales a la matriz subyacente.

Los resultados obtenidos acerca de la expre-sión de K8, por otra parte, apoyan fuertemen-te que la expresión aberrante de esta queratl-na es un evento tardío de la progresión tumoral,en contraste con la expresión de K13, conside-rado un evento temprano de progresión2728.Por otra parte, el estudio de otras queratinasen las diferentes líneas de queratinocitos trans-formadas ha mostrado que la up regulation deK8 (y su pareja K18) va acompañada de unadisminución progresiva de las queratlnas típi-cas de queratinocitos normales en cultivo

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INVESTIGACIÓN SOBRE CÁNCER EN ESPAÑA: DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR A LA CLÍNICA

(K5/K14 y K6/K17)26. Estos datos, junto a da-tos previos de otros grupos acerca de la pérdi-da de expresión de las queratinas de diferen-ciación Kl y K1028 en carcinomas malignos,muestran claramente la existencia de alteracio-nes significativas en el programa de diferencia-ción de la epidermis durante el desarrollo y pro-gresión tumoral.

En conjunto, nuestros datos apoyan un mo-delo de progresión tumoral en el que las altera-ciones de cadherinas, a634 y queratinas ocu-rren en estadios discretos, pudiendo serutilizados como marcadores de progresión. Lasprincipales características de este modelo sepueden resumir en:

1. La despolarización de la expresión en laintegrina a6(34 y la expresión aberrante de K13son eventos tempranos, pudiendo utilizarsecomo marcadores tempranos del proceso neo-plásico.

2. El incremento en la expresión de a6|34 yK13, junto a la pérdida de K1/K10, ocurre enla transición de papilomas a carcinomas epider-moides bien diferenciados, proporcionandomarcadores del fenotipo maligno.

3. El fenómeno de down regulation de CD-Ey de up regulation de K8 tienen lugar durantela progresión de carcinomas epidermoides ha-cia fenotipos más indiferenciados e invasivos,pudiendo utilizarse como marcadores de pro-gresión intermedia y tardía, respectivamente.

4. La ausencia prácticamente total de CD-E,CD-P, a6(34 y queratinas aparece asociada aldesarrollo de carcinomas fusiformes indiferen-ciados.

Un aspecto importante que plantean nuestrosestudios es la posible relación entre las altera-ciones del programa de diferenciación obser-vadas y las lesiones genéticas detectadas en di-ferentes estadios en este sistema. Nuestrosestudios sobre expresión de queratinas sugie-ren fuertemente que la activación por mutacióndel protooncogén H-ras (evento frecuente en lainiciación por DMBA) no es suficiente para la ex-presión aberrante de K8 in vivo. Así, mientrasque un número elevado de papilomas induci-dos por DMBA presentan mutaciones puntua-les en el codón 61 de H-ras8, la expresión deK8 no se detecta en este tipo de lesiones (ta-bla III). La inactivación por mutación en el genque codifica para p53 se ha localizado signifi-cativamente en la transición de papiloma a car-cinomas malignos11, lo que podría estar rela-cionado hipotéticamente con las alteracionescelulares observadas en dicha transición. Ac-

tualmente, estamos estudiando (en colabora-ción con el Dr. A. Balmain, Beatson Institute forCáncer Research, Glasgow) esta posible relaciónmediante un análisis de la expresión de los mar-cadores de progresión en tumores inducidos enratones mutantes (homo y heterozigotos) parap53. Por otra parte, la ausencia de expresiónde cadherinas, a6(34 y queratinas en los tumo-res fusiformes sugiere que alguno de los poten-ciales genes supresores implicados en este es-tadio podría estar implicado en la regulación dela expresión de genes de diferenciación epite-lial o epidérmica. En este sentido, la pérdida deheterozigosidad detectada en este estadio enel cromosoma 7, en el locus del gen H-ras, su-giere fuertemente la existencia de genes supre-sores en dicho focus9'10. Estudios recientes delgrupo de A. Balmain han puesto de manifiestomediante experimentos de fusión celular que elfenotipo fusiforme es reversible31. Sin embar-go, la posible implicación directa del alelo nor-mal H-ras como gen supresor en los estados fi-nales de progresión parece estar descartada porestudios de transfección génica (A. Balmain, co-municación personal). En la actualidad, estamosestudiando la regulación del promotor de CD-P32 en líneas celulares de diferentes estadioscon el fin de caracterizar los factores implica-dos en su expresión y su posible inactivaciónen los últimos estadios de progresión de la car-cinogénesis de piel de ratón.

Con independencia de profundizar en los me-canismos básicos subyacentes a la carcinogé-nesis de piel de ratón, los resultados obtenidoshasta la fecha en este modelo plantean la posi-bilidad de extender el estudio de los marcado-res analizados a tumores humanos de tipo epi-telial. En este sentido, estamos estudiando laexpresión de CD-E en carcinomas de mama ybasocelulares de epidermis. Los resultados ob-tenidos en el estudio de 61 casos de tumoresde mama han mostrado la existencia de unafuerte correlación entre la expresión de CD-E yel grado de diferenciación y tipo histológico. Así,en carcinomas ductales infiltrativos se ha obser-vado una reducción significativa en la expresiónde CD-E en los tumores de grado 2 (15 de 25casos) y grado 3 (11 de 19) respecto a la ex-presión observada en tumores de grado 1 (unode 10). Por otra parte, los carcinomas de tipolobulillar muestran una ausencia total de expre-sión de CD-E33. Además, en carcinomas baso-celulares, la expresión de CD-E aparece conser-vada en carcinomas no infiltrativos mientras quese reduce en áreas locales de carcinomas infil-trativos. Estos resultados refuerzan la posible

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MODELOS EXPERIMENTALES DE CÁNCER: UTILIDAD EN EL ESTLDIO DE MARCADORAS DE DIFERENCIACIÓN CELULAR EN LA PROGRESIÓN TJMORAL

utilidad de CD-E como marcador de progresióntumoral en tumores humanos, aunque es ne-cesario un estudio más exhaustivo en mayor nú-mero de muestras y tipos tumorales.

Agradecimiento

Este trabajo ha sido realizado con financia-ción de la DGICYT (PB88-0004), CAM(CO75/91) y CICYT (SAF92-0146). P.N. y C.C.,becarios del PFPI y M.G. de la CAM.

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DISCUSIÓN

F. GARRIDO: Quisiera hacer un comentario a lapresentación en general; ¿no considera impor-tante, conociendo la heterogeneidad intratu-moral de los tumores individuales, que es ne-cesario presentar los datos a partir de clonesindividuales dentro de cada tumor, bien seaninducidos in vitro o in vivo, ya que de lo con-trario pueden obtenerse resultados erróneos,en el sentido de que existen muchos clonesdentro de un mismo tumor que pueden tenerfenotipos muy distintos? Por lo que he visto,usted considera los tumores como si fueranhomogéneos.

A. CANO: Estoy de acuerdo con el problema dela heterogeneidad que usted apunta. Hemosanalizado bastantes tumores y creo que el én-fasis que pretendemos hacer con esto es aso-ciar la expresión de estas moléculas con el es-tado de diferenciación. Evidentemente, no entodos los tumores se puede considerar de for-ma homogénea que son muy bien diferencia-dos o moderadamente diferenciados, pero síque en conjunto el tumor muestra una tenden-cia, y lo que es cierto es que dentro de esasdiferentes regiones de diferenciación, si seconsidera un tumor muy heterogéneo, se ob-servan unos elevados niveles de expresión decadherina-E en las zonas muy bien diferencia-das mientras que esta expresión va disminu-yendo conforme disminuye la diferenciación,ya sea intra o intertumoral.

A. MAZO: Quería preguntarle si han llevado acabo estudios sobre los efectos de agentes in-ductores de diferenciación en la expresión delas moléculas que ha presentado, o en la mor-fología de las líneas celulares a las que antesha hecho referencia.

A. CANO: Considerando una línea celular comoes la HaCa4 que tiene una morfología epite-lioide, in vitro se inhibe la expresión de cad-

herina E, pero in vivo es capaz de reexpresarsecuando estas células se inyectan en tumores.Intentamos in vitro el uso de diferentes agen-tes como retinoides, vitamina D3, etc., conesta línea celular para tratar de comprobar sipodríamos revertir parcialmente el efecto, yno obtuvimos ningún resultado.

E. CAMPO: Por las evidencias que nos han mos-trado en relación a las moléculas de adhesión,parece que en estos modelos están íntima-mente relacionadas con diferenciación celu-lar, la pregunta es: ¿es esto un epifenómenode la transformación neoplásica asociada apérdida de diferenciación, o la pérdida de es-tas moléculas de adhesión puede desempe-ñar un papel en los mecanismos de progre-sión, invasión y metástasis?

A. CANO: En relación con la primera parte de supregunta, es decir, si es una consecuencia dela transformación neoplásica, creo que pue-de ser considerada actualmente como una delas alteraciones genéticas que sabemos quese tienen que acumular para generar un fe-notipo maligno. Lo que síes cierto es que exis-ten evidencias, procedentes de otros gruposde investigadores, que demuestran claramen-te que la cadherina E puede ser una molécu-la antiinvasiva. Es decir, la pérdida de esta mo-lécula, al menos por estudios in vitro, favorececlaramente la capacidad de invasión de las cé-lulas tumorales en matrices artificiales. Ennuestro caso concreto, todos los datos que hemencionado acerca de reversión parcial de tu-morogenicidad se refieren a lo que que hemosobservado en un incremento notable en la la-tericia de los tumores, y además, un mayorgrado de diferenciación. Realmente, este as-pecto todavía no está claro.

F. GARRIDO: Quisiera comentar que en el últimoCongreso sobre melanoma celebrado recien-

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MODELOS EXPERIMENTALES DE CÁNCER: UTILIDAD EN EL ESTUDIO DE MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN CELULAR EN LA PROGRESIÓN TUMORAL

temente en Venecia, dos grupos independien-tes de investigadores comunicaron que lasmetástasis oculares de melanomas primarioscomportan en un porcentaje muy elevado decasos la aparición de unas moléculas de ad-hesión concretas de esta compleja familia ala que se refería la Dra. Cano.

O. MASSÓ: Una pregunta muy concreta a laDra. Cano, que se refiere a si tienen ustedesexperiencia, o existen datos publicados sobrela expresión de cadherinas en melanoma y laevolución durante las distintas fases del me-lanoma.

A. CANO: En melanoma, no conozco datos pu-blicados aunque se está haciendo en este mo-mento un gran esfuerzo por parte de bastan-tes grupos para estudiar la expresión decadherina E en diferentes tipos de tumores.

J. VILCHES: En su trabajo, en la parte que co-rresponde a la valoración de la progresión através de la expresión inmunohistoquímica dela citoqueratina: ¿han estudiado el paso co-rrespondiente a papiloma-neoplasia intra-epitelial-carcinoma invasor?

A. CANO: El paso de papiloma a carcinoma seha estudiado empleando fundamentalmentemarcadores K8-K13, y también K5. La con-clusión fundamental es que en esta etapa seproduce un incremento de la expresión de K8y una disminución de K13 al pasar de papilo-ma a carcinoma. Es decir, la idea actual esque mientras que la expresión de K13 podríaconsiderarse un marcador muy temprano dela progresión neoplásica, K8 sería un marca-dor más tardío.

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