FFI0776 FFI0776 ‐‐Modelagem e Modelagem e ggEngenharia de ProteínasEngenharia de Proteínas

Prof Rafael V C GuidoProf Rafael V C GuidoProf. Rafael V. C. GuidoProf. Rafael V. C. Guidorvcguido@ifsc.usp.brrvcguido@ifsc.usp.br

Aula 09Aula 09Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares

Instituto de Física de São Carlos Instituto de Física de São Carlos ‐‐ USPUSP

ObjetivosObjetivos

• Mutação aleatória E PCR• Error‐prone PCR

• DNA shuffling• Apresentação em Fagos (Phage Display)E l d A li ã• Exemplos de Aplicação

M ã l ó iM ã l ó iMutação aleatória Mutação aleatória ErrorError‐‐proneprone PCRPCRErrorError‐‐proneprone PCRPCR

Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase –– PCR PCR 

Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase –– PCRPCR

1 4 7

2 5 82 5 8

3 6 9

ErrorError‐‐proneprone PCRPCR

• Condições alteradas da PCR paraCondições alteradas da PCR para aumentar a taxa de erros durante a cópia do gene 

• Taq‐polimerase apresenta uma taxa de erro de 1 nucleotídeo não complementar para cada 10.000‐100.000 bases

• Aumentando‐se a concentração d 2 2 dde Mn+2 ou Mg+2 a taxa de erro da Taq‐polimerase aumenta para 2 15 erros para cada 1 0002‐15 erros para cada 1.000 pares bases (↑ 1‐3 ordens de magnitude)(↑ g )

DNA DNA polimerasepolimerase ErrorError‐‐proneprone PCRPCR

ErrorError‐‐proneprone PCRPCR

Mutações aleatórias produzidas por error‐prone PCR são tendenciadas a incluir alterações onde a probabilidade de incorporação é maior para aminoácidos codificados por vários  códons (e.g., leucina, ( garginina e serina)

R bi ã ê iR bi ã ê iRecombinação gênica Recombinação gênica DNADNA shufflingshufflingDNA DNA shufflingshuffling

DNA DNA shufflingshuffling DNA DNA shufflingshuffling

• O método de DNA shufflingff g(Embaralhamento de DNA) é empregado para recombinar sequências homólogas de DNA randomicamente fragmentadasDNA randomicamente fragmentadas, durante a evolução molecular in vitro;

• O procedimento original é constituído por diferentes etapas, incluindo a obtenção de substrato (genes parentais a serem (g precombinados), digestão enzimática dos genes parentais, recombinação e recuperação de novas sequências, atravésrecuperação de novas sequências, através de ciclos de anelamento na presença da enzima DNA polimerase;

• A metodologia apresenta‐se promissora com perspectivas de aplicação nos p p p çprocessos biotecnológicos

DNA DNA shufflingshuffling

A t l i d DNA h ffli é• A tecnologia do DNA shuffling é uma ferramenta atrativa para a construção de bibliotecasconstrução de bibliotecas combinatórias de genes mutantes;

• Geração de grande variedade de novos genes e permite a seleção das proteínas com características desejadas, ç p jsegundo critérios previamente estabelecidos;

• Aplicação → enzimas são as mais suscep veis, minimizando os problemas de incompatibilidade 

t i d t i i ti id dentre os processos industriais e a atividade enzimática em condições drásticas de valores de pH altas temperaturas e força iônicapH, altas temperaturas e força iônica

DNA DNA shufflingshuffling

O processo de DNA Shuffling é dividido em quatro etapas:1. Obtenção do substrato2 Fragmentação do(s) gene(s)2. Fragmentação do(s) gene(s)3. Recombinação gênica4. Amplificação dos genes recombinados 

DNA DNA shufflingshuffling

1. Obtenção do substrato– O substrato da reação consiste de gene(s) apresentando

variada taxa de identidade sequencial, isolados atravésde digestão com enzimas de restrição ou amplificaçãode digestão com enzimas de restrição ou amplificaçãoem Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). Osoligonucleotídeos iniciadores, utilizados na obtenção dogene devem conter sítios para enzimas de restrições agene, devem conter sítios para enzimas de restrições afim de permitir futuras subclonagens em vetores deexpressão.

2. Fragmentação do(s) gene(s). O b t t é f t d l t i t tili d– O substrato é fragmentado aleatoriamente, utilizandoprincipalmente a enzima DNAse I sob condiçõescontroladas. Alternativamente, utilizam‐se enzimas de

d d h drestrição, podendo neste caso, se estimar o tamanho dosfragmentos gerados. Nessa etapa, é recomendável aobtenção de uma mistura de fragmentos contendo entreç g50 a 300 pares de bases.

DNA DNA shufflingshuffling

3. Recombinação gênica– Uma PCR, sem adição de oligonucleotídeos iniciadores, é realizada utilizando 

como molde o produto da etapa (2). Os fragmentos isolados ao se anelarem formam “homoduplexes” (originados de anelamento de sequências doformam  homoduplexes  (originados de anelamento de sequências do mesmo gene) ou “heteroduplexes” (anelamento de sequências de genes distintos) que funcionarão como “iniciadores” da reação. Uma taxa maior de heteroduplexes, em relação aos homoduplexes, é desejada com intuito de atingir maior diversidade na recombinação. Durante a etapa de extensão, os pequenos duplexes se sobrepõem formando pontos de junção entre osos pequenos duplexes se sobrepõem, formando pontos de junção entre os diferentes segmentos de sequências homólogas.

Identidade Sequencial

DNA DNA shufflingshuffling

4. Amplificação dos genes recombinados p ç g– Uma alíquota do produto da primeira PCR (etapa 3) é submetida à nova PCR, porém com adição desubmetida à nova PCR, porém com adição de oligonucleotídeos iniciadores contendo sequências 5’ e 3’ dos genes originais. Os homo ou heteroduplexesg g pestendidos atuam como moldes para amplificação dos genes recombinados com o mesmo tamanho do gene original.

DNA DNA shufflingshuffling

• A população de genes recombinadosp p ç gé inserida em vetores de expressão apropriados para a seleção de proteínas recombinantes comproteínas recombinantes com características desejadas. 

• A combinação da metodologia de DNA shuffling com a técnica de apresentação em Fagos (Phage Display) temtécnica de apresentação em Fagos (Phage Display) tem sido utilizada para explorar a grande diversidade de mutantes expressando proteínas funcionais. 

• A progênie, proveniente do primeiro ciclo de DNA p g p pshuffling, poderá servir de genes parentais (substrato) para os ciclos subsequentes, de modo que o processo poderá ser repetido até se atingir as propriedades desejadasser repetido até se atingir as propriedades desejadas.

DNA DNA shufflingshuffling

GenesGenes parentais

DNA shuffling

Biblioteca de genes mutantes Repetições 

se necessário

Expressão         e       seleção

Progênie melhorada

DNA DNA shufflingshuffling ‐‐ LimitaçõesLimitações

O sucesso ou não da técnica de DNA shuffling pode ser medido pelo número de moléculas heteroduplex encontradas napelo número de moléculas heteroduplex encontradas na biblioteca de recombinantes obtida;

Heteroduplex→ podem apresentar melhorias funcionais em relação aos genes parentais pelo fato de acumularem as mutações benéficas presentes em genes parentais distintos;benéficas presentes em genes parentais distintos;

Family Shuffling é a denominação para o método original quando tili d i i h ól b t tutiliza‐se dois ou mais genes homólogos como substrato;

A baixa diversidade de mutantes encontrada em alguns gexperimentos de DNA shuffling é, muitas vezes, atribuída à alta formação de homoduplexes proveniente da sobreposição dos fragmentos durante a etapa de recombinação utilizando PCR;fragmentos durante a etapa de recombinação utilizando PCR;

Estratégias utilizando DNA fita dupla e enzimas de restrição, em substituição a enzima DNase I, ou DNA fita simples como substrato são alternativas para amenizar este problema.

FamilyFamily ShufflingShuffling ‐‐ Utilizando DNA fita simplesUtilizando DNA fita simples

A modificação no protocolo original consiste no preparo do substrato cuja utilização de DNA fita simples reduz a formação desubstrato, cuja utilização de DNA fita simples reduz a formação de homoduplexes, permitindo o aumento da diversidade de mutantes;

O DNA fit i l ( DNA) l t t i ãOs DNAs fita simples (ssDNA) e complementares entre si são purificados, a partir de partículas de fagos, e usados como substratos para o shuffling. A utilização desse método favorece a formação de heteroduplexes e aumenta a diversidade de recombinantes.

FamilyFamily ShufflingShuffling ‐‐ Utilizando DNA fita dupla e Utilizando DNA fita dupla e enzimas de restriçãoenzimas de restrição

Tendo em visa o aumento na taxa de recombinação utilizou‐se enzimas de restrições para a fragmentação de dois ou mais genes homólogos em substituição

enzimas de restriçãoenzimas de restrição

restrições para a fragmentação de dois ou mais genes homólogos, em substituição a enzima DNase I.

b d à d úEmbora este procedimento apresente vantagens quanto à previsão do número e tamanho dos fragmentos gênicos, a diversidade dos produtos recombinados pode ficar restrita à disponibilidade de sítios de ligação para as enzimas de restrições.ficar restrita à disponibilidade de sítios de ligação para as enzimas de restrições. 

Dependendo da sequência gênica a digestão enzimática pode gerar fragmentos demasiadamente grandes favorecendo à baixa taxa de recombinação;demasiadamente grandes, favorecendo à baixa taxa de recombinação;

A utilização de várias denzimas pode minimizar 

este problema.

DNA DNA shufflingshuffling DNA DNA shufflingshuffling

• Obje vo: ↑ a resistência aos an bió cos cefalosporinas• Genes homólogos

– genes para cefalosporinase

DNA DNA shufflingshuffling DNA DNA shufflingshuffling

A ãA ã FFApresentação Apresentação em Fagos em Fagos ((PhagePhage DisplayDisplay))((PhagePhage DisplayDisplay))

ApresentaçãoApresentação emem FagosFagos ((Phage DisplayPhage Display))

Apresentação em fagos (Phage display), é um método para o estudo prático de evolução química artificial que utiliza a tecnologia de DNA recombinante. Nesta técnica as sequênciascodificantes de peptídeos ou proteínas são incorporadas ao sistema de replicação viral (bacteriófagos). 

Bacteriófagos são vírus que infectam células bacterianas. Os vetores usadoscélulas bacterianas. Os vetores usados   em pesquisa de DNA recombinante sãofagos que infectam o hospedeiro parafagos que infectam o hospedeiro para DNA recombinante padrão, ou seja, a bactéria Escherichia coli.bactéria Escherichia coli.

Visão GeralVisão Geral BacteriófagoBacteriófago filamentosofilamentoso

pIII VI VII pIXssDNApIII pVI pVIII pVII pIX

FagosFagos ‐‐ VetoresVetores

pIIIpVI pVIII pVII pIXpVI pVIII pVII pIX

FagosFagos

FagosFagos FagosFagos

A ã dA ã d FFApresentação de Apresentação de Fagos Fagos ––Exemplos aplicaçãoExemplos aplicaçãoExemplos aplicaçãoExemplos aplicação

““TrypsinTrypsin‐‐likelike serineserine‐‐proteasesproteases””

• Proteases envolvidas na cascata de coagulação sanguínea:– plasmina– kalicreína Resíduos de aa do sítio catalítico– fator XIa– complexo fator VIIa

81% de identidade sequencial p

Inibidores de proteínas “Inibidores de proteínas “trypsintrypsin‐‐likelike““

Inibidor de proteasesDomínio Kunitz (~60 aa; 33% de identidade sequencial)Domínio Kunitz ( 60 aa; 33% de identidade sequencial)Domínio da proteína‐β precursora de fibra amilóide de Alzheimer (APPI)Inibidor D1 de coagulação associado à lipoproteína (LACI‐D1)

‐ Resíduos 11‐19 (alça 1ª de ligação)‐ Resíduos 34‐39 (alça 2ª de ligação / estruturação da alça 1ª)‐ Pontes dissulfeto (estabilização da estrutura)

Inibidores de proteínas “Inibidores de proteínas “trypsintrypsin‐‐likelike““

Minimização do esqueleto estruturalMinimização do esqueleto estrutural

Minimização da estrutura e manutenção da função

Domínio Z  da proteína A bacteriana (59 aa)

Estruturação do epítopo

ít

ç p p

epítopo

K 20 MKd = 20 nM

Minimização do esqueleto estruturalMinimização do esqueleto estrutural

Kd = 3400 nM Kd = 300 nM33 resíduosKd = 40 nMKd  3400 nM Kd  300 nM d