Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique

19 septembre 2007Luc Paillard, CNRS UMR 6061

Luc.paillard@univ-rennes1.fr

Que sont les régulations post-transcriptionnelles?

AAAAAA

AAAAAA

Que sont les régulations post-transcriptionnelles?

AAAAAA

AAAAAA

Régulation de la traduction

Régulation de lastabilité des ARNm

(Régulation de lastabilité des protéines)

Un niveau de contrôle de la concentrationcellulaire en chaque protéine

« How is gene expression controlled in eukaryotes?As in prokaryotes, control is exerted primarily

at the level of transcription »

Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988

Importance du contrôle post-transcriptionnelchez les eucaryotes

Des pathologies humaines sont associéesà des défauts de contrôle post-transcriptionnel

Des altérations de facteurs de régulationpost-transcriptionnelle provoquentdes perturbations phénotypiques

Des altérations de régulations post-transcriptionnelles

provoquent des perturbations phénotypiquesMise en place de l’axe antéro-postérieur chez la drosophile

Des pathologies humaines sont associées

à des défauts de contrôle post-transcriptionnel

Thalassémies ( ou ) et instabilité des ARNm ou globine

Oncogenèse et stabilisation d’ARNm de cytokines/proto-oncogènes

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des

régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des

régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm

« Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomesTraduction des ARNm

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des

régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm

« Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomesTraduction des ARNm

Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau d’accumulation des protéinesTraduction, stabilité des protéines

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des

régulations post-transcriptionnelles?

Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNmTranscription, stabilité des ARNm

« Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomesTraduction des ARNm

Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau d’accumulation des protéinesTraduction, stabilité des protéines

Relations Transcriptome/traductome/Protéome

1. Levures en phase de croissance

Gygi et al MCB 1999 19, 1720

Marquage métabolique (Met-35S) des cellulesSéparation des protéines par 2DE

Quantification des spots, identification

Niveaux d’expression de 106 protéines

1. Levures en phase de croissance

Gygi et al MCB 1999 19, 1720

Données de SAGE

Niveaux d’expression des ARNm correspondants

1. Levures en phase de croissance

Gygi et al MCB 1999 19, 1720

Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines

1. Levures en phase de croissance

Gygi et al MCB 1999 19, 1720

Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines

Corrélation très mauvaise!

2. Réponse à un changement de milieu de culture

Griffin et al MCP 2002 1, 323

Culture de levures en galactose

Transfert en galactose ou éthanol

Ratio Gal/Eth mesuré pour 245 produits de gènes :protéine (ICAT : MS en conditions quantitatives),ARNm (microarray)

log du ratio des protéines=f(log du ratio des ARNm)(log=0 pour un produit de gène dont l’abondance ne change pas)

2. Réponse à un changement de milieu de culture

R2=0.21!Griffin et al MCP 2002 1, 323

Conclusion

1. Les régulations post-transcriptionnelles sont un niveauMAJEUR de régulation de l’expression génétique

2. (En conséquence, les analyses transcriptomiquespeuvent être insuffisantes)

Bref survol des modalités de régulations post-transcriptionnelles

ORF AAA….AAA5' 3'

AUG STOP

5'UTR 3'UTR

Structure de l'ARNm eucaryote :

Coiffe Queue poly(A)

Régions non codantes

Rappels sur la traduction eucaryote

Initiation

Recrutement de la petite sous-unité ribosomique (40S) à l ’extrémité 5 ’Scanning jusqu ’à la rencontre de l ’AUG initiateurJonction de la grosse sous-unité (60S) = ribosome (80S)

Elongation

Lecture codon par codon

Terminaison

Relargage du peptideLe ribosome? Influence du contexte du codon stop

La 5’UTR contrôle la traduction1, Les uORF (upstream ORF)

5’UTR de l’ARNm Gcn4 de levure :

Gaba et al EMBO J 2001 20, 6453

4 uORF avant l’ATG initiateur

Réinitiation possible « dans certaines conditions » en 3’ d’une uORFCes conditions contrôlent la traduction de GCN4

La 5’UTR contrôle la traduction1, Les uORF (upstream ORF)

Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF, même chez les métazoaires

Fonction???

La 5’UTR contrôle la traduction2, Fixation d’une protéine dans la 5’UTR

La fixation d’une protéine à proximitéde la coiffe (<40nt) inhibe la traduction

Exemple : Contrôle de la traduction de la ferritine parla séquence IRE et la protéine IRP

La 5’UTR contrôle la traduction3, Les IRES (Internal Ribosome Entry Site)

Initiation indépendante de la coiffe (et de eIF4E)

Traduction de certains ARNmquand les autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire…)

La 3’UTR contrôle la stabilité1, Le récepteur de la transferrine

L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron Response Element)si la concentration cellulaire de fer libre est faible

L’ARNm récepteur de la transferrine contient 5 IRE dans sa 5’UTR (et un site de clivage endonucléolytique)

Complexe IRE-IRP : inhibition de dégradationContrôle de la concentration intracellulaire en fer libre

La 3’UTR contrôle la stabilité2, Les ARE (A/U Rich Element)

Mise en évidence : 1986. ARNm de cytokines, proto-oncogènes…

Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteursous contrôle d’un promoteur inductible

Sans ARE Avec ARE

Xu et al. MCB 2001 21, 6960

La 3’UTR contrôle la stabilité2, Les ARE (A/U Rich Element)

3 classes d’ARE

Classe Exemple Description

I c-fos, c-myc (AUUUA) répartis

II GM-CSF, TNF (AUUUA) chevauchants

III c-jun Pas de (AUUUA)

La 3’UTR contrôle la stabilité2, Les ARE (A/U Rich Element)

Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP) hnRNPD/AUF1, HuR, TTP…

Effet positif ou négatif de la fixation de la protéine

La 3’UTR contrôle la stabilité3, La queue poly(A)

Un ARNm polyadénylé est généralementplus stable qu’un ARN désadénylé

La 3’UTR contrôle aussi la traduction1, Les ARE (A/U Rich Element)

Transfection d’un plasmide codant un ARN EGFP(avec ou sans ARE dans la 3’UTR)

Mesure de l’ARN (Northern) et dela protéine (western) EGFP

Grosset et al. JBC 2004 279, 13254

Vecte

ur v

ide

EGFP

EGFP

-ARE

La 3’UTR contrôle aussi la traduction2, La queue poly(A)

Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997

Incubation dans extrait de levure

Mesure de luminescence

+/-cap +/-poly(A)

Même expérience en présenced ’anticorps anti PABP

Pas de stimulation de la traductionpar la queue poly(A)

Luciferase

La 3’UTR contrôle aussi la traduction2, La queue poly(A)

Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900

Transfection dans les levures

Mesure de luminescence

+/-cap +/-poly(A)Luciferase

"wt"

pab1

La queue poly(A) stimule la traduction de façon dépendante de la PAB1

Mais tout cela est lié!1, ARE et état d’adénylation

Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteurcontenant un ARE sous contrôle d’un promoteur inductible

Diminution de taille avant dégradation

Peng et al. MCB 1996 16, 1490

Mais tout cela est lié!2, ARE, état d’adénylation, traduction, stabilité…

AREAUG STOP

AAAA...AAAAA

Ri

+-

+5'

(et c’est encore pire…)

ARE-BP

La 3’ UTR contrôle la traduction ET la stabilité

Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

miRNA RNAisiRNA

Et alors?

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Mécanismes biochimiques

Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…

Biosynthèse des miRNA

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519Reconnaissance d’un ARN

double brin par Argonaute!

Fonction des miRNA

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt :

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : inhibition de latraduction de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez l’animal

Fonction des miRNA

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : dégradationde l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez la plante

Fonction des miRNA

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez la plante…

… Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitementcomplémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque

sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal

Mise en évidence du RNAi

Injection d'ARN sens, antisens ou double brin dans

la gonade

Phénotype de la descendance?

Fire et al. (1998) Nature 391, 806

Prix NOBEL 2006

Reprenons…

miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génomede la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé)

Environ 200 chez l’humain

S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe satraduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque

sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…)

En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNmUne 3’UTR peut être liée par plusieurs miRNA

siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateurdans une cellule animale

S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

Le RNAi, un mode de régulation post-transcriptionnel au service de

l’expérimentateurApplication en thérapeutique?

Downward BMJ  2004 328, 1245