1.Kloramfenikol

2.1.1 Sifat Fisikokimia

Rumus struktur :

Nama Kimia : D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-[β-hidroksi-α-(hidroksimetil)-p- nitrofenetil]asetamida

[56-75-7]

Rumus Molekul : C11H12Cl2N2O5

Berat Molekul : 323,13

Pemerian : Hablur halus berbentuk jarum atau lempeng memanjang; putih hingga putih kelabu

atau putih kekuningan; larutan praktis netral terhadap lakmus p; stabil dalam

larutan netral atau larutan agak asam

Kelarutan : Sukar larut dalam air; mudah larut dalam etanol; dalam propilen glikol; dalam aseton

dan dalam etil asetat (Ditjen POM, 1995).

2.1.2 Farmakokinetik

Setelah pemberiaan oral, kloramfenikol diserap dengan cepat. Kadar puncak dalam darah

tercapai dalam 2 jam. Masa paruh eliminasi pada orang dewasa kurang lebih 3 jam, pada bayi

berumur kurang dari 2 minggu sekitar 24 jam. Kira-kira 50% kloramfenikol dalam darah terikat

dengan albumin. Obat ini didistribusikan dengan baik ke berbagai jaringan tubuh, termasuk

jaringan otak, cairan serebrospinal dan mata (Kunardi dan Setiabudy, 1995)

2.1.3 Efek Samping

Efek samping yang sering terjadi ialah reaksi alergi yang ditandai dengan merahnya kulit. Reaksi

saluran cerna yang ditandai dengan mual, muntah dan diare. Reaksi neurologik dapat terlihat

dalam bentuk depresi, bingung, dan sakit kepala (Kunardi dan Setiabudy, 1995)

2.1.4 Bentuk Sediaan

Kloramfenikol tersedia dalam bentuk salep mata tube 3,5 g, ; tetes mata 15 ml, 8 ml dan 5 ml;

tetes telinga 10 ml; kapsul 500 mg/kapsul dan 250 mg/kapsul; sirup (ISO, 2007)

Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), Kloramfenikol dapat ditetapkan kadarnya

secara KCKT dan menurut Farmakope Indonesia edisi III (1979) Kloramfenikol ditentukan

secara nitrimetri setelah direduksi terlebih dahulu dengan Zn/HCl.

a. Salep

2.1.5 Kegunaan

Kloramfenikol digunakan sebagai pengobatan infeksi-infeksi yang parah seperti tifus atau

demam. Kloramfenikol kadang-kadang juga digunakan secara topikal untuk pengobatan infeksi

mata (Katzung, 2004).

2. Teori Kromatografi

1.1. Sejarah

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik

pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas

ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu

Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari

daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi

diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah

kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk

memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan

yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk

beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai

berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov

dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik

sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak

hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk

pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James

mempublikasikan makalahpertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir

tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada

dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat

membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan

kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance =

Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah

berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan

kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian

membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini

dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang

sederajat dengan kromatografi gas.

1.2. Kelebihan KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru

yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerakcairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak

kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan

Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara

lain:

• mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

• mudah melaksanakannya

• kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

• dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

• Resolusi yang baik

• dapat digunakan bermacam-macam detektor

• Kolom dapat digunakan kembali

• mudah melakukan "sample recovery"

2.2.1 Pemakaian Kromatografi

Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu

dalam cuplikan

Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen

campuran

Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah

memadai dalam keadaan murni (Gritter, dkk., 1991).

2.2.2 Analisa Kualitatif dan Kuantitatif

a. Analisis Kualitatif

Ada 3 pendekatan untuk analisa kualitatif yakni:

1. Perbandingan antara retensi solut yang tidak diketahui dengan data retensi baku yang

sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama.

Untuk kromatografi yang menggunakan kolom (seperti KCKT dan KG), waktu retensi (tR)

atau volume retensi (VR) senyawa baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan

dengan cara kromatografi secara berurutan dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan

waktu pengoperasian antar keduanya sekecil mungkin.

2.Dengan cara spiking.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, spiking dilakukan dengan menambah sampel yang

mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi

kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara: pertama, dilakukan proses kromatografi

sampel yang tidak di spiking. Kedua, sampel yang telah di-spiking dengan senyawa baku

dilakukan proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa

yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di-spiking dibandingkan

dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak dilakukan spiking maka dapat diidentifikasi bahwa

sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.

3. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa. Pada pemisahan dengan

menggunakan kolom kromatografi, cara ini akan memberikan informasi data spektra massa solut

dengan waktu retensi tertentu. Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan

spektra yang ada di data base komputer yang diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan

untuk solut yang belum ada baku murninya.

b. Analisis Kuantitatif

Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil dan reprodusibel, baik

pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut beberapa syarat yang harus dipenuhi

dalam analisis kuantitatif:

a. Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-komponen lain

dalam kromatogram

b. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia

c. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan luas puncak

atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak berbanding langsung dengan banyaknya

solut yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier (Johnson dan

Stevenson, 1991).

1. Metode tinggi puncak

Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah dengan tinggi

puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke puncak maksimum seperti puncak

1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar

antara awal dan akhir puncak.

Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak linier dengan

konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan pada puncak yang

mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika kolom mengalami kelebihan muatan.

2. Metode luas puncak

Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu teknik untuk

mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai hasil kali tinggi puncak dan

lebar pada setengah tinggi (W1/2). Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang

simetris atau yang mempunyai bentuk serupa (Johnson dan Stevenson, 1991).

Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi. Tinggi puncak

mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh

variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter

yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan

dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh puncak maksimum seperti puncak 1, 2,

dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara

awal dan akhir puncak.

Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak linier dengan

konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan pada puncak yang

mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika kolom mengalami kelebihan muatan.

2. Metode luas puncak

Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu teknik untuk

mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai hasil kali tinggi puncak dan

lebar pada setengah tinggi (W1/2). Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang

simetris atau yang mempunyai bentuk serupa (Johnson dan Stevenson, 1991).

Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi. Tinggi puncak

mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh

variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter

yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan

efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh

Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik

Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif

Waktu analisis umumnya singkat

Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar

Ideal untuk molekul besar dan ion (Putra, 2007)

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan

dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks,

maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Munson, 1991).

KOMPONEN-KOMPONEN KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Gambar 3. 1 . Diagram Blok

KCKT berikut ini

Gambar 3.1 : Diagram Blok KCKT

2.3.2.1 Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum

digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung wadah harus lebih besar dari 500 ml,

yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit. 2.3.2.2

Pompa

Untuk mengerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu

menghasilkan tekanan 6000 psi pada kecepatan alir 0,1–10 ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu

pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert

terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon.

Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada

detektor.

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa

yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) danpemindahan konstan (constant

displacement). Pemindahan konstan dapat dibagimenjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan

pompa syringe. Pompa reciprocatingmenghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur

(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,

menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.

Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran

yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

3. 2. Injektor (injector)

2.3.2.3 Injektor

Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agas sesedikit

mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a. Hentikan aliran/stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem

tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil

dan resolusi tidak dipengaruhi. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja

atmosfir, system tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di

dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada

kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini

tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum

yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. Septum: Septum yang

digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat

digunakan pada kinerja sampai 60 - 70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua

pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum

injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya

digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 µ dan dilakukan dengan cara automatis

(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara

manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE

difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.

c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 2, tipe injektor ini

umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 μl dan sekarang

digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat

diinjeksikan secara manual). Pada

posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup

difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

Gambar 2. Tipe injektor katup putaran

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum

dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

3. 3. Kolom (Column)

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada

pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material

pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk

kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -

100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar,

tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan

kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan

(Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange

Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC)

3. 4. Detektor (Detector) .

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis

kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki

sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan

memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan

fluktuasi temperature sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT

yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat

digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks

refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya

kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

Detektor Fluorometer

Detektor Spektrofotometer Massa

Detektor lonisasi nyala

Detektor Refraksi lndeks

Detektor Elektrokimia

Detektor Reaksi Kimia

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang

keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan

(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua

tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat

diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor yang paling banyak digunakan dalam

kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm.

Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi

populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang

luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi,

tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya,

antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga

telah digunakan.

3. 5. Elusi Gradien

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis

kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu etensi dari

senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh

Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara

trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode

kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan

sesudah pompa. Tabel 3. 1 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien

3. 7. Fasa gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara

keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh

polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel

(Johnson dan Stevenson, 1991). Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa

gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang

sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang

sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur

pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di

atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting. Menghilangkan gas (gelembung

udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating

pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang

terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detector

sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan

gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara

(contoh : kolom berikatan dengan NH2).

Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali

membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4 persyaratan pertama adalah yang

paling penting. Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena

udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data

tidak dapat digunakan (Putra, 2007).

Elusi Gradien dan Isokratik

Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:

1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase

gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).

2.Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang

perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah

selama elusi).

Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis

kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks

terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan

dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat

ditahan di dalam kolom (Putra, 2007).

2.3.2.6 Pengolahan Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara

keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

Guna kromatogram:

1. Kualitatif

Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan

untuk identifikasi.

1. Kuantitatif

Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk

menghitung konsentrasi.

2. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja

kolom (kapasitas ‘k’, selektifitas ‘’, jumlah pelat teoritis ‘N’, jarak setara dengan pelat

teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’).

3. 6. Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada

rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3.2 berikut ini

Gambar 3.2 : kromatogram dari senyawa 5’ Nukleotida

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa

digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat

dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan

dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

2.4 Jenis Kromatografi

1. Kromatografi Adsorbsi

Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase

diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika gel

sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi

dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut

dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor (tailling). Fase gerak

yang digunakan untuk fase diam silika atau alumina berupa pelarut non polar yang ditambah

dengan pelarut polar seperti air atau alkohol rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan

elusinya sehingga tidak timbul pengekor puncak, misalnya n-heksan ditambah dengan metanol

(Rohman, 2007).

2. Kromatografi Partisi

Tenik ini tergantung pada partisi solute diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur, salah

satu diantaranya bertindak sebagai fase diam dan yang lainnya sebagai fase gerak (Putra, 2007).

3. Kromatografi Penukar Ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu

fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar dipasaran, meskipun demikian yang paling

luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan

dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut

campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase

gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau

Universitas Sumatera Utara

kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan

retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion

fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin (Rohman, 2007).

4. Kromatografi Ekslusi

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut

dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut

yang mempunyai berat molekul yang jauh lebih besar, akan terelusi lebih dahulu, kemudian

molekul-molekul yang ukuran medium dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini

disebabkan solut dengan berat molekul yang besar tidak melewati poros, akan tetapi lewat

diantara partikel fase diam. Dengan demikian dalam pemisahan dengan ekslusi ukuran ini terjadi

interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti kromatografi yang lain (Rohman, 2007),

terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang Tidak

dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detector sehingga data yang

diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga

sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom

berikatan dengan NH2).

2.3.1 Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan

kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut

ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan

penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak,

panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Rohman,

2007). 3.8. Keuntungan KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua

teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila

derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat

dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan

utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan

peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada

KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang

umumnya digunakan. KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi

cair klasik, antara lain:

1.Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari

sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari

5 menit bisa dicapai

2.Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi

selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;

pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara

selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk

mencapai pemisahan yang diinginkan.

3.Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat

mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-

detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).

Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat

juga digunakan dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom

KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bias dilakukan dengan kolom

yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang

digunakan. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bias dianalisis

dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.

KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

1.Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan

destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel

tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat

dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur

khusus.

3.9 Seleksi Tipe KCKT

Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus membuat keputusan tipe

yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan informasi yang diinginkan.

Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi tipe KCKT . Informasi

ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan pemelihan tipe KCKT yang memberikan

para analis untuk memutuskan pemilihan tipe KCKT yang memberikan kemungkinan terbaik

pada pemisahaan yang diinginkan. Namun, sampel yang tidak dikenal (unknown) akan

menyulitkan pemilihannya tipe KCKT. Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada,

besarnya Berat Molekul dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data

spektroskopik

Seperti nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infrared

spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass

Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk

bagi analis memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.

Skema 1 : Seleksi tipe KCKT

Dengan berpedoman pada Hukum Dasar "like dissolves like" maka sangat mudah untuk

memutuskan tipe KCKT yang akan dipilih. Dari Skema 1 : Seleksi tipe KCKT, dengan cepat kita

dapat melihat bahwa Berat Molekul (BM) lebih besar dari 2000, maka kita dapat menggunakan

kromatografi eksklusi. Fasa geraknya adalah air jikasampelnya larut dalam air; bila dapat larut

dalam pelarut organik maka digunakanpelarut- pelarut organik sebagai rasa gerak. Fasa diamnya

adalah Sephadex atau (Bondagel Seri E untuk rasa gerak air dan Styragel atau MicroPak TSK

gel untuk rasa gerak organik. Bila BM lebih rendah dari 2000, pertama yang harus

ditentukanadalah apakah sampel dapat larut dalam air. Bila sampel dapat larut dalam air,maka

kromatografi partisi rasa terbalik atau kromatografi penukar ion dapat digunakan. Bila kelarutan

dipengaruhi oleh penambahan asam atau basa atau bila pH larutan bervariasi lebih dari 2 (dua)

satuan pH dari pH 7, maka kromatografi penukar ion adalah pilihan utama. Bila kelambatan

tidak dipengaruhi oleh asam dan basa dan larutan sampel adalah netral, maka kromatografi

partisi rasa terbalikadalah pilihan terbaik. Tipe Eksklusi menggunakan ukuran poros yang kecil

dan rasa air dapat juga dicoba. Bila sampel tidak larut dalam air, kromatografi partisi atau

kromatografi padat cair dianjurkan untuk digunakan. Untuk pekerjaan rutin

disarankanmenggunakan kromatografi partisi fasa terikat normal karena kolom-kolom ini tidak

begitu rumit dalam perawatannya setelah digunakan. Untuk sampel-sampel isomer kromatografi

padat cair lebih baik digunakan. Bila sampel memiliki perbedaan ukuran partikel yang besar,

kromatografi eksklusi sterik dengan fasa gerak organik dapat juga digunakan.

IV. Penggunaan KCKT dalam Farmasi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda pemisahan canggih dalam

analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar.

Titik beratnya adalah untuk analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap dan tidak

stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa

yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik

makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif

dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang

mampu menentukan rasemis dan isomer aktif. Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979

KCKT belum digunakan sebagai suatu metoda analisis baik kualitatif maupun kuantitatif.

Padahal di Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti Farmakope Amerika

Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI), Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Deutches

Arzneibuch 10). Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT dalam

analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus tujuh puluh

tujuh) obat/bahan obat. Perubahan yang sangat spektakuler dari Farmakope Indonesia Edisi IV

Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa Pemerintah Indonesia melalui Departemen Kesehatan

Republik Indonesia dan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan benar-benar telah

mengikuti perkembangan dankemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang

analisis obat. Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat

mahal, namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat / bahan obat

karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi,waktu analisis cepat. Pada

Tabel 4.1 dapat dilihat Daftar Obat-obat yang Penetapan Kadamya dengan KCKT yang

tercantum dalam Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995.

Tabel 4.1 : Daftar Obat – obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT (FL Edisi IV)

No. Nama Obat /Bahan Obat

1. Tablet Asetazolamida

2. Asetilsistein

3. Larutan Asetilsistein© 2004 Digitized by USU digital library

4. Tablet Asetosal

5. Asam Aminokaproat

6. Asam Aminosalisilat

7. Asam Folat '

8. Tablet Asam Folat

9. Asam Mefenarnat

10. Kapsul Asam Mefenamat

11. Asiklovir

12. Tablet Allopurinol

13. Alprozolam

14. Tablet Alprozolam

15. Amikasin Sulfat

16. Injeksi Amikasin Sulfat

17. Aminofilin

18. Amoksihn .

19. Kapsu Armoksilin

20. Amoksilin untuk Suspensi Oral

21. Ampisilin

22. Tablet Atropin Sulfat

23. Injeksi Atropin Sulfat

24. Beklometason Dipropionat

25. Gel Benzoil Peroksida

26. Betametason

27. Tablet Betametason

28. Betametason Dipropionat

29. Krim Bemetason Dipropionat

30. Salep Betametason Dipropionat

31. Betametason Natrium Fosfat

32. Inj. Betametason Natrium Fosfat

33. Betametason Valerat

34. Krim Betametason Valerat

35. Salep Betametason Valerat

36. Tablet Bisakodil

37. Supositoria Bisakodil

38. Tablet Bromokriptin Mesilat

39. Injeksi Bupivakain Hidroklorida

40. Karbamazepin

41. Tablet Karbamazepin

42. Karbidopa

43. Tablet Karisoprodol

44. Sefazolin Natrium untuk Injeksi

45. Sefaleksin

46. Kapsul Sefaleksin

47. Tablet Sefaleksin

48. Sefaleksin untuk Suspensi Oral

49. Sefradin

50. Kapsul Kloramfenikol

51. Krim Kloramfenikol

52. Tetes Telinga Kloramfenikol

53. Tetes Mata Kloramfenikol

54. Kloramfenikol Palmitat

55. Susp.Oral Kloramfenikol Palmitat

56. Klordiazepoksida