Mitogen-activated Protein Kinase-independent Pathways Mediate

the Effects of Nerve Growth Factor and cAMP on Neuronal Survival*

Douglas J. Creedon, Eugene M. Johnson, Jr., and John C. Lawrence, Jr.From the Departments of ‡Molecular Biology and Pharmacology and §Neurology, Washington University School of

Medicine, St. Louis, Missouri 63110

Carlos Gabriel Contreras Serrano. Bsc. Mj.Maestría en ciencias básicas biomédicas.

Universidad el Bosque.

Neurotrofinas.

Factores Ntr.

Regulan el numero final de neuronas y conexiones del SN.

Proteínas endógenas.

Promueven la supervivencia.

Favorecen la diferenciación deCiertas poblaciones neuronales.

Regulan el proceso de formación y establecimientoDe conexiones sinápticas.

Contribuyen a la regeneración neuronal.

Relacionadas estructuralmente.

Neurotrofinas.

• Factor de Crecimiento Nervioso NGF.• Factor Neurotròfico Derivado del Cerebro BDNF• Neurotrofina 3.• Neurotrofina 4/5.

• Factor Neurotròfico Ciliar. CNTF.• Factor Neurotròfico Derivado de la Glìa GDNF.

Vías de acción.

NGF.

Dos Péptidos idénticos unidos por enlaces no covalentes.

El monómero cuenta con una forma alargada con tres pares de estructuras beta antiparalelas conectadas por loops.

Nudo de cisteìnas.

Estabilización de la estructura molecular de algunos factores de crecimiento.

50% de similitud entre las NT.

Las regiones activas se encuentra ubicadas en los mismos sitios.

NT cuentan con un motivo denominado nudo de cisteínas que estabilizan la estructura terciaria de los polipéptidos.

Consiste en la formación de un anillo donde participan cuatro residuos de cisteína y tres puentes disulfuro.

NGF y TRK.

Se han descrito alrededor de 66-88% de similitud entre los tres receptores.

TRK A.

Confiere especificidad para NGF en TRK A

Thr319, His 320, Asn323 importantes en la unión a NGF

El receptor TrkA cuenta con dos isoformas:

1. Con un segmento de 6 aminoácidos que se expresa en neuronas.

2. Sin los seis residuos que se expresan extracelularmente y sobreregula en células PC12 al ser tratadas con NGF.

NGF, TRK y p75NTR.

Células PC 12.

• Son líneas celulares derivadas del feocromocitoma de la rata.

• Al ser tratadas con NGF exhiben características de neuronas simpáticas incluyendo extensiones neuríticas, excitabilidad eléctrica y expresión de proteínas neuronales.

• La mayoría de estudios y conclusiones a las que se han llegado con respecto a vías de señalización para diferenciación y supervivencia neuronal se han llevado a cabo en estas células.

VIA DE SEÑALIZACIÓN.

Estudio.

Investigar el rol de MAP Kinasa en la acción de CPTcA y NGF sobre supervivencia de neuronas simpáticas primarias derivadas del ganglio superior cervical.

Procedimientos.

1 ¿NGF promueve la activación de la vía MAP Kinasa?EN SCG.

Después de retirado NGF, ¿se puede rehabilitar la función kinasa en la célula?., ¿CPTcA y PMA pueden tener los mismos efectos que NGF?.

2

3

Las mediciones de fosforilación de MBP revela que hay actividad de las dos isoformas de MAPK.

¿CPTcA activa selectivamente los isomorfismos ERK-1 y ERK 2 de MAP kinasa?

Procedimiento 1.

Cultivo celular.

Reemplazo del medio de cultivo después de 6 días

Centrifugado a 4ºC y durante 10 minutos.

Siguiente.

Resultado.

Incremento de las concentraciones de NGF sobre la actividad kinasa de MBP en neuronas disociadas.

Proteína Básica de Mielina.

Resultado.

Efecto del retiro de NGF sobre la actividad kinasa de MBP a razón del tiempo De retirada.

Inicial.

Procedimiento 2.

Cultivo celular.

Reemplazo del medio de cultivo después de 6 días

Centrifugado a 4ºC y durante 10 minutos.

Siguiente.

Reemplazo del medio de cultivo después de

12 a 16 horas.

Resultados.

Actividad kinasa en neuronas que habían sido privadas de NGF y fueron inmersasEn tres diferentes medios: NGF, PMA y CPTcA luego de haber estado en medio con

Anticuerpos antiNGF.

Resultados.

Conclusión.

• CPTcA es una molécula análoga a NGF en cuanto a promover supervivencia neuronal se trata.

• CPTcA no tiene efectos significativos sobre la vía MAPK.

• H MAPK no es una vía promotora de supervivencia en neuronas

• Aun así solo un pequeño incremento en MAP kinasa puede ser necesario para promover supervivencia neuronal..

Resultados.

Actividad kinasa en neuronas que habían sido privadas de NGF y fueron inmersasEn tres diferentes medios: NGF, PMA y CPTcA luego de haber estado en medio con

Anticuerpos antiNGF.

Activa la vía MAP en diferentes células, se observa que con PMA hay un aumento en la actividad MBP kinasa pero no un efecto promotor de supervivencia en neuronas.

Inicial.

Procedimiento 3.

• Para descartar la posibilidad de CPTcA activara selectivamente alguna de las isoformas de MAPK las actividades de ERK 1 y ERK II fueron evaluadas mediante SDS-PAGE.

Resultado.

En cada una de las bandas hay actividad Kinasa a la altura de ERK1 y ERK 2.

Esto motiva ensayos de inmunoprecipitaciónPara evaluar confirmar estos resultadosY discriminar el rol especifico de CPTcA enLa activación de ERK 1 y ERK 2.

Resultado ERK 1.

Complemento y conclusión.

• Estudios muestran que células PC12 CPTCA promueve un significativo incremento en MAPK y potencia los efectos de NGF y PMA.

• En neuronas SCG CPTcA por si solo no activa ninguna isoforma de MAPK y causa una leve potenciación del efecto de NGF en la isoforma ERK 1.

Cultivo celular.

• 2nm de MGF.

• 10% de suero fetal bovino.

• 2nm l glutamina.

• 100 microgramos por ml de streptomicina.

• 20 mM fluorodeoxiuridina

• 10 mM afidicolin.

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Reemplazo después de 12 a 16 horas del medio de cultivo 2.

• En este proceso se asignaron las células a diferentes medios:

1. Medio NGF.

2. Medio CPTcA.

3. Medio PMA.

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