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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MANOEL ANDRÉ DE SOUZA NETO
Ziziphus joazeiro MARTIUS: ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO
HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS, FRACIONAMENTO BIOGUIADO ANTI-
Candida E AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR EM MODELO DE
DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL
NATAL-RN
2016
MANOEL ANDRÉ DE SOUZA NETO
Ziziphus joazeiro MARTIUS: ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO
HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS, FRACIONAMENTO BIOGUIADO ANTI-
Candida E AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR EM MODELO DE
DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner
Co-orientadores: Guilherme Maranhão Chaves
Gerlane Coelho Bernardo Guerra
NATAL-RN
2016
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Souza Neto, Manoel André de.
Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato
hidroetanólico das folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida
e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória
intestinal / Manoel André de Souza Neto. - Natal, 2016.
262f.: il.
Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner.
Coorientadores: Guilherme Maranhão Chaves, Gerlane Coelho Bernardo Guerra.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Ziziphus joazeiro - Dissertação. 2. Fitoquímica -
Dissertação. 3. Flavonoides - Dissertação. 4. Candida -
Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Chaves,
Guilherme Maranhão. III. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. IV.
Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 634.662
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Souza Neto, Manoel André de.
Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato
hidroetanólico das folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida
e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória
intestinal / Manoel André de Souza Neto. - Natal, 2016. 262f.: il.
Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner.
Coorientadores: Guilherme Maranhão Chaves, Gerlane Coelho Bernardo Guerra.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Ziziphus joazeiro - Dissertação. 2. Fitoquímica -
Dissertação. 3. Flavonoides - Dissertação. 4. Candida -
Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Chaves,
Guilherme Maranhão. III. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. IV.
Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 634.662
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, à minha família, especialmente aos meus pais, Margarida e Francisco,
e ao meu irmão, Francisco Júnior, por todo carinho, suporte e incentivo durante essa jornada
inicial na área acadêmica.
À Profa. Silvana Maria Zucolotto Langassner, pela orientação, paciência, confiança e
principalmente por apoiar as minhas ideias, por vezes mirabolantes, que surgiram durante a
realização deste trabalho. Muito obrigado pela oportunidade.
Ao meu co-orientador micologista, Prof. Guilherme Maranhão Chaves, por todo
auxílio, orientação e ensinamentos, fundamentais para a realização da etapa de atividade
antifúngica deste trabalho.
A todos do laboratório de Microbiologia Clínica e Micologia Médica e Molecular
(LMMM), principalmente ao doutorando Plínio Rocha, pelo auxílio na realização dos
experimentos de atividade antifúngica.
A minha co-orientadora, Profa. Gerlane Coelho Bernardo Guerra, pela orientação,
apoio e, por assim dizer, otimismo na realização dos experimentos in vivo de doença
inflamatório intestinal.
A todos do laboratório de Farmacologia do CB pela enorme ajuda prestada na
realização dos experimentos de doença inflamatório intestinal, incluindo os técnicos Flávio,
Carla, César e Dona Neida, além dos alunos de IC Valéria, Iuri e Cássio. Agradeço
especialmente a doutoranda Daline por todo o auxílio e aprendizado proporcionados.
Ao Prof. Freddy Alejandro Ramos e ao Geison Modesti Costa pela orientação,
essencial suporte e ensinamentos fornecidos durante a realização dos experimentos na
Universidade Nacional de Colombia (UNAL), Laboratório de Productos Naturales Marinos y
Frutas de Colombia.
A operadora do equipamento de RMN da UNAL, Katherine Jaramillo, por todo
cuidado e atenção na obtenção dos espectros. A todas as pessoas da UNAL e Bogotá que me
ajudaram e contribuíram, de alguma forma, para a realização deste trabalho.
Aos colegas do laboratório de Farmacognosia da UFRN/PNBio pela ajuda e amizade.
Em especial, ao meu “ex” IC Jordan, pelo auxílio na realização dos experimentos, e a Samara,
por ter me ensinado boa parte do que sei sobre fitoquímica, pelas dicas, trocas de ideias e
ajuda nos experimentos de isolamento.
Aos professores Josean Fechine Tavares e Norberto Peporine Lopes, assim como aos
técnicos Evandro Ferreira e José Carlos Tomaz, pela colaboração nas análises de RMN e
espectrometria de massas, respectivamente.
À UFRN, Faculdade de Farmácia e Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas pela oportunidade de formação.
À CAPES e ao CNPq pelo auxílio financeiro a essa pesquisa.
RESUMO
A espécie Ziziphus joazeiro é uma planta da Caatinga do Nordeste brasileiro, utilizada como antiséptico, dentifrício, anticaspa, anti-inflamatório e antimicrobiano. A maioria dos estudos químicos relatou a presença de triterpenos nas cascas da espécie. Quanto às folhas, os estudos fitoquímicos são escassos, envolvendo apenas a triagem fitoquímica. Até o momento não foram caracterizadas as substâncias responsáveis pela atividade antifúngica das folhas e não foi encontrado nenhum estudo que tenha avaliado o seu efeito anti-inflamatório em modelo de doença inflamatória intestinal. Portanto, o trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar os marcadores químicos do extrato hidroetanólico das folhas (EHF) e desenvolver um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para quantifica-los. Em paralelo a isso, objetiva-se avaliar a atividade anti-Candida do extrato, frações e substâncias isoladas de Z. joazeiro, por meio de um fracionamento bioguiado, além de avaliar o efeito protetor do EHF em modelo de doença inflamatória intestinal (colite) induzida por DNBS. O EHF foi preparado por meio de maceração, o qual foi posteriormente particionado com solventes de polaridade crescente. O extrato e as frações foram analisados por reações químicas clássicas, Cromatografia em Camada Delgada, CLAE e CLAE acoplada a espectrômetro de massas (CLAE-EM), sendo observada a presença de saponinas, ácidos fenólicos, cumarinas, e flavonoides glicosilados derivados de quercetina, canferol e isormanetina ou o seu isômero, tamarixetina. Por meio das análises por CLAE-EM foi possível identificar glicosídeos de quercetina (quercetina-3-O-rutinosídeo, quercetina-3-O-galatosídeo, quercetina-3-O-glicosídeo), canferol (canferol-3-O-rutinosídeo) e isoramnetina ou tamarixetina (isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-galactosídeo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-glicosídeo). Para o isolamento dos flavonoides majoritários, a fração acetato de etila foi submetida à técnica de Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade aliada ao refinamento por zona de pH, seguido de cromatografia em coluna de fase reversa e CLAE semipreparativa. Desse processo, foram isolados 3 flavonóis (ZJF1, ZJF2 e ZJF3), os quais foram identificados, pela análise conjunta de dados cromatográficos e RMN de 1H, como quercetina-3-O-rutinosídeo, canferol-3-O-rutinosídeo e isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo, respectivamente. A partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em caldo, aliada a bioautografia, observou-se que a fração butanólica apresentou maior atividade antifúngica frente à Candida glabrata ATCC2001 (CIM = 0,625 mg/mL), e que o processo de concentração das substâncias hipoteticamente bioativas permitiu obter frações com maior atividade anti-Candida in vitro frente a cepas de referência e clínicas. Foi observado que as principais substâncias responsáveis são as saponinas, e a partir de uma dessas frações isolou-se a saponina bacopasídeo X, presuntivamente identificada por análises mono e bidimensionais de RMN. A atividade anti-inflamatória do EHF foi avaliada em modelo de doença inflamatória intestinal nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, não sendo observado efeito protetor do EHF em relação ao grupo controle positivo. Os resultados obtidos são inéditos para a espécie e o estudo abre perspectivas para a realização de novas investigações envolvendo o uso de flavonoides e saponinas no controle de qualidade e avaliação da sazonalidade, além do estudo do mecanismo de ação das saponinas das folhas sobre as leveduras do gênero Candida. Palavras-chave: Ziziphus joazeiro, flavonoides, saponinas Candida, colite
ABSTRACT
The species Ziziphus joazeiro is a Caatinga plant from Northeast Brazil, used as an antiseptic, dentifrice, anti-dandruff, anti-inflammatory, and antimicrobial. Most chemical studies reported the presence of triterpenes in the bark of the species. Regarding the leaves, the phytochemical studies are scarce, only involving phytochemical screening. The substances responsible for the antifungal activity of leaves have not yet been characterized and no study has evaluated its anti-inflammatory effect in inflammatory bowel disease model. Therefore, this study aims to isolate and characterize the chemical markers of hydroethanolic extract of the leaves (HEL), and develop an analytical method by high-performance liquid chromatography (HPLC) to quantify them. Parallel to this, the study aims to evaluate the anti-Candida activity of the extract, fractions and isolated substances from Z. joazeiro through a bioguided fractionation, and to evaluate the HEL protective effect in a DNBS induced model of inflammatory bowel disease (colitis). The HEL was prepared by maceration, which was further partitioned with increasingly polar solvents. The extract and the fractions were analyzed by classical chemical reactions, Thin Layer Chromatography, HPLC and HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), being observed the presence of saponins, phenolic acids, coumarins and flavonoid glycosides derived from quercetin, kaempferol and isorhamnetin or its isomer, tamarixetin. Through HPLC-MS analysis it was identified quercetin glycosides (quercetin-3-O-rutinoside, quercetin-3-O-galatosídeo, quercetin-3-O-glycoside), kaempferol (kaempferol-3-O-rutinoside) and isorhamnetin or tamarixetin (tamarixetina-3-O-rutinoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-galactoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-glucoside). For the isolation of the major flavonoids, the ethyl acetate fraction was subjected to a pH-zone-refining high speed countercurrent chromatography, followed by reversed phase column chromatography and semi-preparative HPLC. In this process, 3 flavonols were isolated (ZJF1, and ZJF2 ZJF3), which were identified by the joint analysis of chromatographic data and 1H NMR as quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-rutinoside and isorhamnetin or tamarixetin-3-O-rutinoside, respectively. From the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) by broth microdilution, coupled with bioautography, it was observed that the butanol fraction had higher antifungal activity against Candida glabrata ATCC2001 (MIC = 0.625 mg / mL), and the process of concentration of the hypothetically bioactive substances afforded fractions which had more anti-Candida activity in vitro against clinical and reference strains. It was observed that the main substances involved are saponins, and through a saponin rich fraction it was isolated bacopaside X, presumptively identified by one and two-dimensional NMR analyzes. The anti-inflammatory activity of EHF was evaluated in a model of inflammatory bowel disease in doses of 50, 100 and 200 mg / kg and it was not observed protective effect of the HEL compared to the positive control group. The results are novel for the species and the study opens perspectives for new investigations involving the use of flavonoids and saponins in quality control and evaluation of seasonality, besides the study of the mechanism of action of leaves saponins on the Candida genus. Key-words: Ziziphus joazeiro, flavonoids, saponins Candida, colitis
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Indivíduo de Ziziphus joazeiro Martius. ........................................... 31
Figura 2 - Folhas e flores de Ziziphus joazeiro Martius. ................................... 32
Figura 3 - Representação do teste de microdiluição em caldo. ....................... 72
Figura 4 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para
glicosídeos ...................................................................................... 83
Figura 5 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para
agliconas. ........................................................................................ 85
Figura 6 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões
de quercetina e canferol .................................................................. 86
Figura 7 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões
de rutina e isoquercetina. ................................................................ 88
Figura 8 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações
obtidas da partição líquido-líquido. .................................................. 90
Figura 9 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações
obtidas da partição líquido-líquido ................................................... 90
Figura 10 - Espectros de UV (210-450 nm) dos 25 picos observados na
análise por CLAE-UV-DAD do EHF de Z. joazeiro Mart. ................. 94
Figura 11 - Cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus
joazeiro Mart. e frações. .................................................................. 97
Figura 12 - Comparação entre os cromatogramas obtidos para a fração
AcOEt-PLL01 nos equipamentos de CLAE-UV-DAD e CLAE-EM-
TOF, sob o comprimento de onda de 340 nm. ................................ 105
Figura 13 - Análise por CCD das fases dos testes em tubos para os sistemas
contendo acetato de etila-butanol-água........................................... 108
Figura 14 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV1..................... 110
Figura 15 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV4..................... 110
Figura 16 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV5..................... 110
Figura 17 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV6..................... 111
Figura 18 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV11. .................. 111
Figura 19 - Análise por CCD dos flavonoides ZJF1, ZJF2, ZJF3 e das
misturas ZJFM1 e ZJFM2................................................................ 112
Figura 20 – Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF1. .................... 114
Figura 21 - Representação estrutural do flavonol quercetina. ............................ 115
Figura 22 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF1 (400 MHz,
metanol-d4). .................................................................................... 118
Figura 23 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF2. .................... 120
Figura 24 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF2 (400 MHz,
metanol-d4). .................................................................................... 123
Figura 25 - Possibilidades estruturais para o flavonoide ZJF3. .......................... 126
Figura 26 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF3. .................... 128
Figura 27 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF3 (400 MHz,
metanol-d4) ..................................................................................... 129
Figura 28 - Ensaio de microdiluição em caldo para as frações da fração
BuOH-PLL01. .................................................................................. 135
Figura 29 - Bioautografia e análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e da
fração BuOH-PLL01. ....................................................................... 137
Figura 30 - Bioautografia e análise por CCD das subfrações da fração BuOH-
PLL01. ............................................................................................ 138
Figura 31 - Ensaio de microdiluição em caldo para a fração 07-CCFR07. ......... 141
Figura 32 - Ensaio de concentração fungicida mínima realizado para a fração
07-CCFR07. .................................................................................... 142
Figura 33 - Microscopia de amostras dos poços contendo Candida albicans
ATCC90028. ................................................................................... 144
Figura 34 - Valores de CIM observados para a fração 07-CCFR07 frente a
cepas de referência e cepas clínicas. .............................................. 147
Figura 35 - Análise por CCD das frações da CFG03. ........................................ 151
Figura 36 - Análise por CCD das frações da CGF04. ........................................ 152
Figura 37 - Análise por CCD das frações da cromatografia em coluna de fase
reversa 12. ...................................................................................... 153
Figura 38 - Representação estrutural do núcleo damarano (A) e da saponina
bacopasídeo X (B). ......................................................................... 155
Figura 39 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 156
Figura 40 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 157
Figura 41 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 157
Figura 42 - Espectro ampliado de RMN 13C da saponina ZJS1(DMSO-d6;
125 MHz). ....................................................................................... 159
Figura 43 - Representação estrutural da aglicona jujubogenina. ....................... 160
Figura 44 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 161
Figura 45 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 162
Figura 46 - Espectro ampliado de HMQC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 163
Figura 47 - Espectro ampliado de COSY da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500
MHz). .............................................................................................. 164
Figura 48 - Principais correlações de HMBC e COSY observadas para ZJS1... 168
Figura 49 - Monitorização do peso corporal das ratas durante o período
experimental.................................................................................... 171
Figura 50 - Índice de atividade da doença (IAD) relativo aos grupos tratatos e
controle durante o período de pós-indução da doença. ................... 172
Figura 51 - Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os
grupos controle, sobre o escore de dano macroscópico do cólon. .. 173
Figura 52 - Cólons representativos dos tratamentos e grupos controle. ........... 173
Figura 53 - Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os
grupos controle, sobre a relação peso/longitude (mg/cm) do cólon. 174
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Fracionamento do EHF por partição líquido:líquido com
solventes de polaridade crescente. ........................................... 56
Fluxograma 2 - Isolamento dos flavonoides ZJF1, ZJF2 e ZJF3. ....................... 63
Fluxograma 3 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 09-
CCFR05, utilizada no teste de atividade antifúngica. ................ 64
Fluxograma 4 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 07-
CCFR07, utilizada no teste de atividade antifúngica. ................ 65
Fluxograma 5 - Esquema do processo de fracionamento por partição líquido-
líquido das frações BuOH-PLL01 e 02-PLL02. .......................... 67
Fluxograma 6 - Esquema de isolamento da saponina ZJS1, a partir da fração
02-PLL03. ................................................................................. 69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Redimento das frações obtidas após a partição líquido-líquido do
EHF de Ziziphus joazeiro Martius. ................................................... 55
Tabela 2 - Sistemas de solventes testados e proporção (v/v) dos seus
respectivos componentes. ............................................................... 58
Tabela 3 - Condições cromatográficas das separações realizadas por
Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade. .................. 60
Tabela 4 - Gradiente utilizado na separação da fração 12-CCCAV11 por
coluna de C18 (CCFR02). ............................................................... 62
Tabela 5 - Rendimento das principais frações obtidas após o fracionamento
por partição líquido-líquido da fração BuOH-PLL01. ....................... 66
Tabela 6 - Gradiente utilizado na separação da fração por cromatografia em
coluna de fase reversa (CCFR12). .................................................. 68
Tabela 7 - Amostras testadas pelo método de microdiluição em caldo e suas
respectivas concentrações iniciais e faixa de concentração após a
diluição seriada. .............................................................................. 71
Tabela 8 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação
das cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para
glicosídeos. ..................................................................................... 82
Tabela 9 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação
das cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para
agliconas. ........................................................................................ 84
Tabela 10 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por
co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart.utilizando os padrões de
quercetina e canferol. ...................................................................... 86
Tabela 11 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por
co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando os padrões de
rutina e isoquercetina. ..................................................................... 87
Tabela 12 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos
espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise
do EHF de Ziziphus joazeiro Mart.por CLAE-UV-DAD. ................... 93
Tabela 13 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos
espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise
da fração CH2Cl2-PLL01 por CLAE-UV-DAD. .................................. 98
Tabela 14 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos
espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise
da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-UV-DAD. .................................. 100
Tabela 15 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos
espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise
da fração BuOH-PLL01 por CLAE-UV-DAD. ................................... 101
Tabela 16 - Dados cromatográficos, espectroscópicos (UV) e de
espectrometria de massas dos principais flavonoides encontrados
na fração AcOEt-PLL01. ................................................................. 104
Tabela 17 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide
ZJF1. ............................................................................................... 117
Tabela 18 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do
flavonoide ZJF2. .............................................................................. 122
Tabela 19 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do
flavonoide ZJF3 e literatura. ............................................................ 127
Tabela 20 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z.
joazeiro Mart. frente a cepas de referência de leveduras de
importância clínica. ......................................................................... 130
Tabela 21 - CIM das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-
PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de Candida. .............................. 132
Tabela 22 - CIM de frações da fração BuOH-PLL01 frente à levedura Candida
glabrata ATCC 2001........................................................................ 135
Tabela 23 - Estatística descritiva das áreas relativas aos halos de inibição
observados após o teste de bioautografia. ...................................... 138
Tabela 24 - CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de
Candida. .......................................................................................... 140
Tabela 25 - Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07
testada frente a cepas clínicas. ....................................................... 146
Tabela 26 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da
saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a aglicona, em
comparação com a literatura. .......................................................... 165
Tabela 27 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da
saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a glicona, em
comparação com a literatura. .......................................................... 166
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Mart. ........................... 34
Quadro 2 - Metabólitos isolados de diferentes espécies já estudadas no
gênero Ziziphus. .............................................................................. 36
Quadro 3 - Códigos dos processos de separação utilizados ............................. 55
Quadro 4 - Cepas clínicas utilizadas no teste de suscetibilidade....................... 73
Quadro 5 - Distribuição dos grupos de colite aguda para a avaliação da
atividade do EHF de Z. joazeiro Mart. ............................................. 77
Quadro 6 - Critérios utilizados para a monitorização clínica da doença
inflamatória intestinal. ...................................................................... 78
Quadro 7 - Critério para a avaliação da gravidade do dano macroscópico da
colite experimental de acordo com Bell, Gall e Wallace (1995). ...... 79
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcOEt acetato de etila
ASD Ágar Sabourand Dextrose
ATCC American Type Culture Collection
BuOH n-butanol
CC Cromatografia em coluna de vidro
CCCAV Cromatografia em contra-corrente de alta velocidade
CCD Cromatografia em Camada delgada analítica
CCFR Cromatografia em coluna de fase reversa
CFM Concentração Fungicida Mínima
CGF Cromatografia em coluna de gel de filtração
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CLAESP Cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa
CNCA Candida não-Candida albicans
COSY Correlation Spectroscopy
CVC Cateter venoso central
DAD Detector de arranjo de diodos
DMSO dimetilsulfóxido
DNBS ácido 2,4-dinitrobenzóico
EHF Extrato hidroetanólico das folhas
HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation
IAD Índice de Atividade da Doença
IDM Indice de Dano Macroscópico
MeOH metanol
MHC Caldo Mueller-Hinton
MMA Ministério do Meio Ambiente
RMN 13C Ressonância magnética nuclear de carbono 13
RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
UFC Unidades Formadoras de Colônia
UTI Unidade de Terapia Intensiva
UV Ultravioleta
YPD Yeast peptone dextrose
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 22
2 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................... 24
2.1 O gênero Candida e as espécies vegetais como fonte de agentes
antifúngicos ......................................................................................... 24
2.2 As plantas medicinais como alternativa no tratamento de
doenças inflamatórias intestinais ...................................................... 28
2.3 Ziziphus joazeiro Martius: informações gerais ................................... 30
2.4 Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Martius ....................... 32
2.5 Constituintes químicos de Ziziphus joazeiro Martius ....................... 35
2.6 Atividades biológicas descritas para a espécie Ziziphus joazeiro
Martius ................................................................................................. 39
2.6.1 Atividade antifúngica ............................................................................. 39
2.6.2. Atividade antibacteriana ........................................................................ 39
2.6.3 Atividade larvicida ................................................................................. 41
2.6.4 Atividade antioxidante ........................................................................... 41
2.6.5 Avaliação toxicológica ........................................................................... 41
2.6.6 Avaliação do potencial genotóxico ......................................................... 42
2.6.7 Atividade anti-inflamatória do gênero Ziziphus e da espécie Ziziphus
joazeiro Mart. ......................................................................................... 42
2.7 Marcadores químicos e controle de qualidade de plantas
medicinais ............................................................................................ 43
3 OBJETIVOS .......................................................................................... 45
3.1 Objetivo geral ....................................................................................... 45
3.2 Objetivos específicos .......................................................................... 45
4 JUSTIFICATIVA .................................................................................... 46
5 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 48
5.1 Solventes e reagentes ......................................................................... 48
5.2 Equipamentos e sistemas cromatográficos utilizados no estudo
fitoquímico ........................................................................................... 48
5.3 Material vegetal: coleta, secagem e moagem .................................... 50
5.4 Preparação dos extratos ..................................................................... 50
5.5 Estudo fitoquímico .............................................................................. 51
5.5.1 Análise fitoquímica preliminar ................................................................ 51
5.5.1.1 Identificação das classes de metabólitos secundários por reações
químicas clássicas................................................................................. 51
5.5.1.1.1 Compostos fenólicos ............................................................................. 51
5.5.1.1.2 Taninos ................................................................................................. 51
5.5.1.1.3 Flavonoides ........................................................................................... 51
5.5.1.1.4 Alcaloides .............................................................................................. 52
5.5.1.1.5 Saponinas ............................................................................................. 52
5.5.1.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. por Cromatografia em Camada
Delgada (CCD) ...................................................................................... 52
5.5.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-
líquido por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ................. 53
5.5.3 Análise da fração AcOEt-PLL01 por espectrometria de massas ............ 54
5.5.3.1 Partição líquido-líquido .......................................................................... 55
5.5.3.2 Análise por cromatografia em contracorrente de alta velocidade ........... 56
5.5.3.2.1 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por
cromatografia em contra-corrente de alta velocidade ............................ 57
5.5.3.3 Isolamento dos flavonoides por cromatografia em coluna e CLAE
semipreparativa ..................................................................................... 62
5.5.3.4 Obtenção das frações para o teste de atividade antifúngica .................. 64
5.7 Avaliação da atividade antifúngica do EHF e frações ...................... 70
5.7.1 Determinação da CIM do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações ................ 70
5.7.1.1 Reativação das leveduras e triagem fenotípica ..................................... 70
5.7.1.2 Preparo do inóculo ............................................................................... 70
5.7.1.3 Triagem com micro-organismos de referência ....................................... 71
5.7.1.4 Determinação da CIM conforme o método do CLSI (CLSI, 2008).......... 73
5.7.1.5 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ...................... 74
5.7.1.6 Ensaio de bioautografia ......................................................................... 74
5.8 Avaliação do efeito protetor do EHF de Z. joazeiro Mart. em
modelo de doença inflamatória intestinal ......................................... 76
5.8.1 Animais ................................................................................................. 76
5.8.2 Modelo de colite aguda ......................................................................... 76
5.8.3 Avaliação macroscópica do processo inflamatório intestinal .................. 78
5.8.3.1 Monitorização clínica da doença inflamatória intestinal ......................... 78
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 80
6.1 Análise fitoquímica preliminar............................................................ 80
6.1.1 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel
para glicosídeos .................................................................................... 80
6.1.2 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel
para agliconas ....................................................................................... 84
6.1.3 Análise por co-cromatografia ................................................................. 85
6.2 Análise por CCD das frações da partição líquido-líquido do EHF
de Z. joazeiro Mart. ............................................................................... 89
6.3 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-
líquido por CLAE-UV-DAD .................................................................. 91
6.3.1 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-
líquido.................................................................................................... 91
6.4 Análise da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-IES-EM (TOF) ................ 102
6.5 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por
cromatografia em contra-corrente de alta velocidade e
isolamento de flavonoides .................................................................. 108
6.5.1 Análise estrutural do flavonoide ZJF1 .................................................... 113
6.5.2 Análise estrutural do flavonoide ZJF2 .................................................... 119
6.5.3 Análise estrutural do flavonoide ZJF3 .................................................... 124
6.6 Avaliação da atividade anti-Candida do EHF de Ziziphus joazeiro
Mart. e frações ..................................................................................... 130
6.6.2 Atividade das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01,
BuOH-PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de referência ........................ 132
6.6.3 Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOH-
PLL01 .................................................................................................... 133
6.6.4 Ensaio de bioautografia para o EHF, fração BuOH-PLL01 e
respectivas subfrações ativas .......................................................... 136
6.6.5 Avaliação da atividade antifúngica das frações 07-CCFR07 e 10-
CCFR12 frente a cepas de referência segundo o método do CLSI ....... 139
6.6.6 Avaliação da atividade antifúngica da fração 07-CCFR07 frente a
isolados clínicos segundo o método do CLSI ........................................ 145
6.7 Isolamento da saponina ZJS1 ............................................................ 151
6.8 Análise estrutural por RMN da saponina ZJS1 ................................. 154
6.9 Avaliação do efeito protetor do extrato hidroetanólico das folhas
de Z. joazeiro Mart. em modelo de doença inflamatória intestinal ... 170
7 CONCLUSÕES ..................................................................................... 176
REFERÊNCIAS ..................................................................................... 177
APÊNCIDE A – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO ......................... 192
APÊNDICE B - ESTRUTURA QUÍMICA DAS SUBSTÂNCIAS
MENCIONADAS NA DISSERTAÇÃO................................................... 216
ANEXO A .............................................................................................. 262
22
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais acompanha a humanidade desde a pré-história,
as quais, ao longo dos anos, formaram a base de sistemas terapêuticos de várias
civilizações antigas, como os astecas, incas, chineses, egípcios e gregos.
Substâncias obtidas de plantas, como nicotina, muscarina e reserpina, além de
terem contribuído significativamente para o avanço da farmacologia e patofisiologia,
compõem parte do arsenal terapêutico atualmente utilizado na clínica (PASQUALE,
1984; GILANI; RAHMAN, 2005; FABRICANT; FARNSWORTH, 2001).
Apesar da atual predominância, na indústria farmacêutica, de técnicas de
química combinatória como estratégia para a descoberta de fármacos, o número de
fármacos produzidos e aprovados para uso clínico não aumentou proporcionalmente
ao número de compostos sintéticos gerados com base nessas técnicas. Assim,
observa-se ainda que as plantas e outros produtos naturais continuam a participar,
direta ou indiretamente, desse processo (NEWMAN, 2008; NEWMAN; CRAGG,
2012).
Um exemplo da atual utilidade dos vegetais e de outros produtos naturais na
obtenção de fármacos é que, em 2010, de todas as moléculas pequenas e
inovadoras reportadas (que contem grupos farmacofóricos inéditos), cerca da
metade consistia em produtos naturais ou compostos derivados desses (NEWMAN;
CRAGG, 2012). De acordo com trabalhos envolvendo compilação de dados, entre
2000 e 2013 foram aprovados 38 medicamentos cujos fármacos derivam de
substâncias de espécies vegetais (BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014;
SAKLANI; KUTTY, 2008). Além disso, até dezembro de 2013, vinte e um fármacos
antineoplásicos derivados de plantas estavam sendo submetidos a ensaios clínicos
(BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014).
O país que possui a maior variedade dessas fontes de compostos bioativos é
o Brasil, as quais estão distribuídas em 6 biomas continentais e um marinho,
encerrando cerca de 20% da biodiversidade mundial. Igualmente extensa é a flora
brasileira, estimada em cerca de 55.000 espécies vegetais (IBGE, 2004; DIAS,
1995). Diante disso, percebe-se o importante potencial do Brasil como terreno para a
bioprospecção sustentável e a consequente geração de emprego, renda e produtos
para a saúde, como os medicamentos fitoterápicos (VILLAS BÔAS; GADELHA,
2007).
23
Apesar da imensa biodiversidade do Brasil, esta foi pouco explorada, pois
estima-se que a busca por compostos bioatlivos foi realizada em apenas cerca de
8% da flora do país (GUERRA; NODARI, 2001). Portanto, considerando a relevância
das plantas na descobertcoa de fármacos e a grande diversidade vegetal no país, é
de suma importância que as suas espécies vegetais sejam caracterizadas quanto ao
seu perfil fitoquímico e atividade biológica.
Ziziphus joazeiro Mart. destaca-se como uma das plantas da região
semiárida, nativa e endêmica do Brasil e de grande importância para a população do
Nordeste (LIMA, 2013a; LORENZI; MATOS, 2008). A árvore, cuja folhagem mantem-
se verde durante a seca, é usada tanto como forragem quanto como planta
medicinal, sendo a casca e as folhas tradicionalmente empregadas na higiene bucal
e capilar, no alívio de problemas estomacais (LORENZI; MATOS, 2008), no
tratamento de infecções fúngicas (CRUZ et al., 2007) e como anti-inflamatório
(OLIVEIRA, 2005).
De acordo com a literatura, um extrato concentrado em saponinas extraídas
da casca de Z. joazeiro Mart. inibiu o crescimento fúngico de Candida albicans
(RIBEIRO et al., 2013), um importante patógeno oportunista de infecções fúngicas
invasivas (SARDI et al., 2013). Logo, o uso popular da casca e da folha em
infecções fúngicas possivelmente tem relação com a presença de saponinas nesses
farmacógenos.
A partir de análises iniciais realizadas no presente trabalho, observou-se que
as folhas possuem, além de saponinas, uma grande variedade de flavonoides
glicosilados. Os flavonoides tem apresentado atividade anti-inflamatória em
diferentes modelos de inflamação (CHIBLI et al., 2015) e os glicosídeos destacam-
se por sua atividade anti-inflamatória em modelos de doença inflamatória intestinal
(COMALADA et al., 2005; MASCARAQUE et al., 2014).
Portanto, baseando-se no contexto explicitado e considerando a sua
importância etnofamacológica, neste trabalho foi realizado um estudo fitoquímico de
Z. joazeiro Mart. com o objetivo de isolar e caracterizar marcadores químicos, bem
como a avaliação da atividade antifúngica in vitro e protetora em modelo in vivo de
colite experimental do extrato hidroetanólico das folhas e suas respectivas frações
24
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 O gênero Candida e as espécies vegetais como fonte de agentes
antifúngicos
As infecções fúngicas, apesar de serem frequentemente subestimadas e
negligenciadas por pesquisadores e entidades governamentais, têm acometido e
causado a morte de milhares de pessoas ao redor do mundo (BROWN et al., 2012).
Recentemente, foram realizados estudos epidemiológicos no Brasil, México,
Espanha, Bélgica e Rússia, acerca da prevalência de infecções fúngicas graves, e a
soma de todos os casos estimados nesses países totalizou 18 047 381 milhões
(CORZO-LEÓN; ARMSTRONG-JAMES; DENNING, 2015; GIACOMAZZI et al.,
2015; KLIMKO et al., 2015; LAGROU et al.; RODRIGUEZ-TUDELA et al., 2015). É
importante mencionar que 52% de todos esses casos foram originados por espécies
do gênero Candida e, no Brasil, para o ano de 2011, de todos os casos de infecções
fúngicas graves estimados, 74% foram igualmente ocasionados por espécies do
gênero Candida (GIACOMAZZI et al., 2015)
O gênero Candida é constituído por leveduras que habitam diferentes sítios
anatômicos da espécie humana, assim como de outros animais e o meio ambiente
(água, solo, plantas). Candida albicans é a única espécie que sobrevive unicamente
no organismo humano e de outros animais de sangue quente, sendo portanto
comensal, fazendo parte da microbiota humana normal da cavidade oral, trato
gastrintestinal e vagina de indivíduos saudáveis. Em decorrência deste fator, pode-
se explicar a sua alta prevalência em infecções dos mais variados sítios anatômicos
(REISS; SHADOMY; LYON, 2011).
As espécies do gênero são patógenos oportunistas e atingem principalmente
indivíduos debilitados por outras doenças ou imunocomprometidos. São
responsáveis por causar um amplo espectro de efermidades, como candidíase oral,
vulvovaginal, infecções de pele, mucosa, onicomicose, assim como infecções
invasivas, incluindo a candidemia, que está associada a uma elevada taxa de
mortalidade (REISS; SHADOMY; LYON, 2011).
A patogenicidade das espécies do gênero Candida é resultante dos seus
fatores de virulência, os quais estão relacionados à adesão a células epiteliais e
endoteliais do hospedeiro, formação de uma comunidade microbiana envolvida em
25
matriz exopolimérica, denominada de biofilme, produção de enzimas hidrolíticas,
fosfolipases e aspartil-proteases secretadas, além da filamentação, ou seja, a
transição de blastoconídio para hifa verdadeira, fenômeno este comum em Candida
albicans (O’DONNELL; ROBERTSON; RAMAGE, 2015) A espécie Candida glabrata
não é capaz de produzir hifas, porém é a segunda ou terceira mais reportada em
estudos da América do Norte e Norte da Europa, que envolvem o isolamento de
leveduras nos mais variados sítios. Este achado pode ser justificado devido aos
mecanismos de resistência aos antifúngicos que essa espécie apresenta
(LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014).
Candida spp. têm emergido principalmente no ambiente hospitalar na forma
de candidíase invasiva, resultando sobretudo do aumento no número de pacientes
debilitados ou imunocomprometidos, como indivíduos com a Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA), aqueles submetidos a quimioterapia em
decorrência de neoplasias malígnas ou transplantes, indivíduos submetidos a
procedimentos invasivos ou que permanecem longos períodos de tempo em
unidades de terapia intensiva (UTI) (YAPAR, 2014). A candidíase invasiva
comumente está associada a um aumento da mortalidade e custos hospitalares e,
possivelmente, esse fator explica a maior atenção fornecida a essa doença no que
se refere a estudos epidemiológicos, aspecto que pode ser observado
principalmente nos Estados Unidos e países da Europa (MORGAN et al., 2005;
YAPAR, 2014).
Existem mais de 150 espécies de Candida conhecidas, porém cerca de 95%
da infecções invasivas são causadas por apenas 5 espécies: C. albicans, C.
glabrata, C. parapsilosis e C. krusei. A espécie C. albicans é frequentemente
reportada como a espécie mais prevalente nos estudos epidemiológicos acerca de
candidíase invasiva, sendo variável a sua proporção em relação às outras espécies
de acordo com a região (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014).
No entanto, ao longo dos últimos anos, tem-se observado uma tendência
caracterizada por uma redução gradativa na prevalência de C. albicans isoladas de
pacientes com candidíase invasiva. Apesar de C. albicans ainda ser a espécie mais
prevalente nos mais variados estudos, o número de casos de candidíase invasiva
por essa espécie tem diminuído, enquanto que a candidíase invasiva ocasionada por
espécies de Candida não-Candida albicans (CNCA) tem aumentado, a um ponto em
que, quando consideradas em conjunto, superam a prevalência de C. albicans em
26
muitos estudos mundiais. Atualmente não se sabe as causas dessa mudança,
porém supõem-se que os principais fatores que a impulsionaram foram o uso
excessivo do fluconazol como terapia empírica e a implementação de cateteres
venosos centrais (CVCs) em pacientes graves (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014).
Na América do Norte e em muitos países da Europa, o declínio de C. albicans
foi acompanhado por um aumento na prevalência de C. glabrata. Enquanto isso, na
América Latina, a segunda espécie mais prevalente pertence ao complexo C.
parapsilosis, que afetava principalmente neonatos e indivíduos portadores de CVCs
internados em UTIs, porém atualmente tem sido isolada de todas as faixas etárias.
A Espanha, assim como os países da América Latina, também possui como
segunda espécie mais prevalente C. parapsilosis em estudos de infecções fúngicas
invasivas (YAPAR, 2014).
No Brasil, C. glabrata tem emergido como a segunda espécie mais prevalente
em alguns hospitais públicos e principalmente em hospitais privados (COLOMBO et
al., 2013; MORETTI et al., 2013). Segundo Colombo et al. (2013), alguns hospitais
privados apresentam um perfil semelhante ao de países desenvolvidos devido ao
uso do fluconazol como agente profilático.
Outro importante gênero envolvido em infecções fúngicas é Trichosporon,
constituído por espécies causadoras principalmente de infecções superficiais de pele
e fâneros em pacientes imunocompetentes, destacando-se casos de piedra branca
e, em menor frequência, episódios de onicomicose (CHAGAS-NETO et al., 2009;
COLOMBO et al., 2011). O gênero Trichosporon é considerado o segundo ou
terceiro agente mais comumente isolado de infecções fúngicas invasivas por
leveduras não-Candida spp., em pacientes com câncer. Em um estudo realizado
durante 8 anos pala rede ARTEMIS, envolvendo 134 grupos de pesquisas de 40
países, incluindo o Brasil, Trichosporon spp. responderam por 10,7% das 8.821
cepas de leveduras não pertencentes ao gênero Candida (PFALLER E DIEKEMA,
2007)
No Brasil, em cerca de 68% dos casos de infecções sistêmicas, foram isoladas
cepas de T. asahii, seguida de T. asteroides (CHAGAS-NETO et al., 2009). O
prognóstico para os pacientes é relativamente pobre. As infecções invasivas tendem
a ser graves e apresentam elevada taxa de mortalidade, da ordem de 53%, podendo
chegar até 83% em pacientes com câncer (FLEMING et al., 2002; CHAGAS-NETO
et al., 2008).
27
O atual arsenal terapêutico para o tratamento de infecções fúngicas é
limitado, se restringido a poucas classes. Dentre elas, destacam-se os azólicos,
poliênicos, equinocandinas e análogos de nucleosídeos. Os azólicos, incluindo
miconazol, fluconazol, voriconozol e posaconasol, atuam causando danos à
membrana celular fúngica ao inibir uma enzima envolvida na biossíntese do
ergosterol (14-α-demetilase). Os poliênicos, como a nistatina e a anfotericina B,
também atuam no ergosterol, porém ligam-se diretamente a esse componente e
causam a formação de poros na membrana. As equinocandinas, incluindo a
caspofungina e a micafungina, impedem a formação da parede celular fúngica por
meio da inibição de uma enzima envolvida na síntese de glucana (β-1-3-D-glucano-
sintase). Por último, os análogos de nucleosídeos, como flucistosina e pirimidina,
impedem a síntese do DNA ao inibir uma enzima envolvida na sua biossíntese, a
timidilato sintase (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).
O surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos sintéticos disponíveis
comercialmente torna ainda mais limitado o arsenal terapêutico disponível. Embora a
prevalência de resistência em C. albicans seja baixa e permaneça relativamente
constante, em espécies de CNCA ela tem emergido, sendo C. glabrata uma espécie
em destaque por apresentar menor susceptibilidade intrínseca aos azólicos, além ter
sido reportado um aumento no número de cepas resistentes às equinocandinas
(ALEXANDER et al., 2013; LOCKHART, 2014). Portanto, considerando a já
mencionada substituição gradativa de C. albicans por espécies de CNCA, a situação
passa a ser ainda mais preocupante.
A resistência aos antifúngicos envolve basicamente os mecanismos de
bomba de efluxo, perda de afinidade ao receptor e compensação do efeito do
fármaco (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).
O mecanismo de bomba de efluxo consiste na expulsão do agente antifúngico
do meio intracelular para o extracelular. Em Candida, existem bombas de efluxo do
tipo ABC (ATP-binding cassette), responsáveis por expulsar todos os antifúngicos
azólicos do meio intracelular, assim como bombas específicas para o fluconazol, que
utilizam um gradiente de prótons como energia propulsora. No primeiro tipo de
bomba, os genes codificantes são o CDR1 e o CDR2, e no último o gene MDR1 é o
responsável (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).
A diminuição da afinidade do antifúngico ao alvo resulta de mutações pontuais
no gene ou genes que o codificam. Para os azólicos, podem ocorrer mutações no
28
gene ERG11 que codifica a enzima 14-α-demetilase. Por outro lado, para as
equinocandinas, o mecanismo de resistência envolve mutações nos genes FKS1 e/
ou FKS2, os quais codificam o complexo enzimático β-1-3-D-glucano-sintase
(SPAMPINATO; LEONARD, 2013).
O mecanismo compensatório envolve o aumento na quantidade do alvo, por
consequência do aumento na sua expressão gênica ou ausência do alvo devido a
mutações. Para os antifúngicos azólicos, pode ocorrer uma superexpressão do gene
ERG11, levando a um aumento na proteína alvo. No caso dos antifúngicos
poliênicos, ocorre uma diminuição no conteúdo de ergosterol da membrana em
virtude de mutações nos genes ERG3 ou ERG6 que codificam enzimas envolvidas
na biossíntese do ergosterol (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).
Portanto, conforme o contexto anteriormente apresentado, são necessárias
novas alternativas que venham a complementar os agentes antifúngicos disponíveis,
e as plantas medicinais, por apresentarem a capacidade de produzir metabólitos
diversos, constituem uma dessas alternativas.
2.2 As plantas medicinais como alternativa no tratamento de doenças
inflamatórias intestinais
A inflamação consiste numa cascata de eventos, envolvendo uma variedade
de mediadores e tipos celulares, quel é eliciada em resposta a um estímulo nocivo.
Essa resposta é pré-programada e inespecífica quanto ao tipo tecidual e seu
objetivo final é a remoção do agente agressor e reparo do local afetado. No entanto,
o alcance desse objetivo requer uma drástica alteração da homeostase tecidual, que
envolve a dilatação dos vasos e consequente aumento do fluxo sanguíneo, aumento
da permeabilidade capilar, formação de exsudato, infiltração leucocitária e lesão
tecidual (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; OKIN e MEDZHITOV, 2012).
Em consequência disso, pode-se inferir que a resposta inflamatória é
essencial para a sobrevivência da espécie humana, por ser capaz de tratar
condições severas, causadas por diferentes estímulos, porém, ao mesmo tempo é
potencialmente danosa. O custo sobrepõe o benefício quando a resposta
inflamatória não atinge o seu objetivo final e torna-se exacerbada e persistente. Em
consequência disso, a inflamação atua como elemento-chave na patofisiologia de
diversas doenças, como artrite reumatóide, diabetes, hipertensão e distúrbios
29
intestinais (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; OKIN e MEDZHITOV, 2012). De particular
interesse para esta pesquisa são as doenças inflamatórias intestinais, que possuem
etiologia pouco conhecida e cuja patogênese envolve uma complexa interação entre
fatores relacionados ao ambiente, componentes genéticos, microbiota intestinal e
sistema imune.
Neste contexto, as duas principais doenças inflamatórias intestinais são a
colite ulcerativa e a doença de Crohn (ZHANG e LI, 2014). Especificamente, a colite
ulcerativa é uma doença inflamatória recidivante e restrita à mucosa do colon. As
pessoas acometidas por essa doença apresentam dores abdominais, evacuação de
pus, muco e diarreias sanguinolentas. Essas podem ocorrer em torno de quatro
vezes ao dia, nos casos clinicamente classificados como leves, até mais de 10
vezes ao dia, nos casos considerados fulminantes (BAUMGART; SANDBORN,
2007).
O tratamento medicamentoso das doenças inflamatórias intestinais objetiva
amenizar o processo inflamatório e promover a remissão da doença. A terapia
envolve o uso de aminosalicilatos, corticosteróides, agentes imunossupressivos e
antimicrobianos. No entanto, o uso crônico desses medicamentos é frequentemente
limitado devido a eventos adversos a medicamentos, incluindo náusea, vômito,
cefaleia, dislipidemia, osteoporose, hiperglicemia, hipertensão e nefrotoxicidade
(HEMSTREET, 2014).
Diante desse contexto, é de fundamental importância buscar alternativas
eficazes, seguras e que possam ser usadas cronicamente. Uma dessas alternativas
são as plantas medicinais.
Na literatura há muitos trabalhos que têm como objetivo avaliar o potencial de
extratos vegetais como agente anti-inflamatório e protetor em modelos de colite
experimental, os quais geralmente apresentam compostos fenólicos, principalmente
os flavonoides, como os metabólitos secundários majoritários. Por exemplo, foi
reportado que os extratos de Bryophyllum pinnatum e Jasminum sambac, os quais
possuem polifenóis como componentes majoritários, apresentaram atividade anti-
inflamatória em modelos de edema de pata e de orelha, enquanto que o extrato de
Prunus dulcis apresentou atividade em um modelo de colite induzida por ácido
trinitrobenzenosulfônico (CHIBLI et al., 2014; SENGAR et al., 2015; ZORILLA et al.,
2014). Os flavonoides, na forma isolada, também tem apresentado considerável
potencial na modulação da inflamação, apresentando atividade em modelos in vivo
30
de edema de pata e de orelha (CHIBLI et al., 2015) e in vitro frente à produção de
óxido nítrico por macrógagos (CUONG et al., 2015). Com relação à atividade de
flavonoides em modelos de colite, foi reportado que a miricitrina apresentou
atividade anti-inflamatoria sobre a colite experimental induzida em ratos por sulfato
sódico de dextrana (SCHWANKE et al., 2013), enquanto que o flavonoide rutina
apresentou atividade em modelos de colite induzida por sulfato sódico de dextrana e
de indução por transferência de células T (COMALADA et al., 2005; MASCARAQUE
et al., 2014).
Uma constatação relevante que alguns estudos têm enfatizado é a de que os
glicosídeos de quercetina, como rutina e quercitrina, apresentam atividade anti-
inflamatória em modelos de inflamação intestinal, enquanto que a aglicona
apresenta-se inativa. Essa informação é aparentemente contraditória, pois a forma
livre possui o maior efeito anti-inflamatório in vitro. A hipótese mais reforçada é a de
que a aglicona é absorvida no intestino delgado e, em contrapartida, a forma
glicosilada funciona como um pró-fármaco, carreando a aglicona até intestino
grosso, onde é liberada na forma livre por glicosidases bacterinanas (COMALADA et
al., 2005; KIM et al., 2005; KWON et al., 2005, MASCARAQUE et al., 2014). Essa
informação é de extrema relevância para o presente trabalho, pois, de acordo com
os resultados observados neste estudo, as folhas de Ziziphus joazeiro possuem uma
grande variedade de flavonoides glicosilados.
2.3 Ziziphus joazeiro Martius: informações gerais
O gênero Ziziphus pertence à família Rhamnacea, encontrada nas regiões
temperadas, tropicais e subtropicais de todo o mundo e possui aproximadamente
900 espécies distribuídas em 58 gêneros (BARROSO, 2002).
Os representantes desta família, no Brasil, podem ser encontrados em todas
as cinco regiões do país e, consequentemente, em todos os domínios
fitogeográficos (Amazônico, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica, Pampa e Pantanal).
No país, a família compreende 14 gêneros, sendo três endêmicos. Os gêneros
possuem 47 espécies representativas, das quais 16 são endêmicas. Na região
Nordeste, 20 das 47 espécies podem ser encontradas (LIMA, 2013b).
No Nordeste, as espécies da família são utilizadas na ornamentação, na
medicina popular, na fabricação de cosméticos, cremes dentais antissépticos e
31
doces, na alimentação de animais e no trabalho artesanal. As espécies do gênero
Ziziphus estão entre as mais conhecidas pelos habitantes da região, destacando-se,
como comentado anteriormente, Z. joazeiro, cuja as raspas da casca são
comercializadas para o uso na higiene capilar (QUEIROZ, 2006).
Entre as nove espécies do gênero que ocorrem no país, seis são encontradas
na região Nordeste:
Ziziphus cinnamomum Triana & Planch; Ziziphus cotinifolia Reissek; Ziziphus
guaranítica Malme; Ziziphus platyphylla Reissek; Ziziphus undulata Reissek;
Ziziphus joazeiro Mart (LIMA, 2013c).
A espécie Z. joazeiro possui vários nomes populares, sendo os mais comuns
juá e juazeiro. A planta (Figura 1) é típica da Caatinga e ocorre em oito dos nove
estados do Nordeste e também em Minas Gerais, sendo encontrada no ambiente de
forma isolada, longe das matas secas (CARVALHO, 2007).
Figura 1 - Indivíduo de Ziziphus joazeiro Martius.
É uma espécie que, ao contrário de outras plantas da Caatinga, consegue
manter-se perenifolia durante o ano todo. Isto porque a planta possui raízes amplas
e profundas, capazes de captar a pouca umidade presente na terra semi-árida,
Fonte: autor
32
podendo perder por completo a sua folhagem apenas quando a água do solo torna-
se quase inexistente (OLIVEIRA, 1976).
As árvores do juazeiro podem atingir até 16 metros de altura quando adultas e
formam uma copa ampla e densa. O tronco pode ser reto ou tortuoso, sendo bem
ramificado a partir da base e com galhos dotados de espinhos. A casca externa é
rígida e de cor cinza escuro a levemente castanha; a casca interna é amarelada, a
qual libera um exsudato transparente e amargo após uma incisão (CARVALHO,
2007).
As folhas medem de 2 a 6 cm de largura por 5 a 10 cm de comprimento.
São lustrosas, de consistência membranácea a coriácea, com disposição alternada
nos ramos. Possuem formato oval ou elíptico, ápice acuminado e 3 a 5 nervuras que
emergem da base e se reúnem no ápice. As flores são pequenas, de coloração
amarelo-esverdeada. Os frutos são uma drupa amarela de formato esférico,
medindo de 1,5 a 2 cm de diâmetro (CARVALHO, 2007).
Figura 2 - Folhas e flores de Ziziphus joazeiro Martius.
2.4 Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Martius
Ao longo dos anos, as civilizações e tribos humanas construíram um extenso
conhecimento acerca de plantas medicinais, as quais foram selecionadas de forma
Fonte: autor
33
empírica com base nos seus efeitos. Como exemplo do acúmulo dessa sabedoria,
tem-se a medicina tradicional Chinesa e a Ayurveda. É este tipo de conhecimento
que constitui o alvo da pesquisa etnofarmacológica, que visa validá-lo
cientificamente através de estudos fitoquímicos e farmacológicos não-clínicos e
clínicos (FABRICANT; FARNSWORTH, 2001; ELISABETSKY, 2001).
Pode-se dizer que a pesquisa etnodirigida apresenta vantagens em relação à
pesquisa randômica de plantas e às técnicas de química combinatória. Isto porque
as espécies que foram utilizadas pelo homem por um longo período provavelmente
passaram por uma triagem inicial e, consequentemente, possuem maior
probabilidade de conter compostos eficazes tanto farmacologicamente quanto
biofarmaceuticamente (ELISABETSKY, 2001).
Baseando-se nessa ideia, foi realizado, na década de 1980, um levantamento
de todos os fármacos derivados de plantas utilizados na clínica e observou-se que a
maioria foi descoberta com base em dados etnobotânicos (FARNSWORTH et al.
1985). Além disso, outros estudos forneceram evidências da maior eficácia da
abordagem etnofarmacológica em relação à abordagem aleatória na seleção de
plantas promissoras (SLISH et al., 1999; KHAFAGI; DEWEDAR, 2000). Portanto, a
tradição popular mostra-se muito útil para nortear pesquisas que envolvam a
descoberta de fármacos, o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos ou
apenas a validação do uso popular.
Diante deste contexto, é de grande importância que os estudos científicos da
espécie Z. joazeiro Mart. também sejam direcionados pelo conhecimento popular,
sobretudo porque, de acordo com a literatura, esta é uma das plantas do Nordeste
brasileiro mais utilizadas na região da Caatinga (ALBUQUERQUE et al., 2007) e
uma das 100 plantas com maior diversidade de usos medicinais do Brasil
(MEDEIROS; LADIO; ALBUQUERQUE, 2013). Desta forma, foi realizado um
levantamento bibliográfico da etnobotânica da espécie Z. joazeiro Mart. (Quadro 1).
34
Quadro 1 - Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Mart.
Partes Usadas Modo de preparo Uso popular/indicação Referências
Entrecasca do fruto In natura Sabão e dentifrício BRAGA, 1960 apud
OLIVEIRA, 1978 Entrecasca do fruto Infusão ou maceração Tônico capilar
Casca
ND
Xampu, anticaspa e tônico capilar
LIMA, 1985 apud CARVALHO, 2007
Casca e folha Detergente
Folha e casca Extrato aquoso
Alívio de problemas gástricos, clareamento da pele do rosto, tônico capilar, dentifrício, doenças de pele.
BRAGA, 1960; SOUSA et al., 1991; MATOS, 2002 apud LORENZI; MATOS,
2008 Entrecasca(pó) Pó Dentifrício
Casca
Raspas da casca deixadas em água
Cicatrizante ALBUQUERQUE; ANDRADE, 2002
Xarope Tosse
Casca/folhas ND Anti-inflamatório, antitussígeno, higiene bucal
OLIVEIRA, 2005
ND ND Gripe PINTO et al., 2006
Casca Banho Reações alérgicas TEIXEIRA; MELO, 2006
Casca do caule
Adição de raspas da casca na água Cicatrização ALBUQUERQUE, 2006
Xarope
ND ND Tosse ALBUQUERQUE, OLIVEIRA, 2007
Casca (pó) ND Dentifrício, anticaspa AGRA et al., 2007
Folhas Decocção Micoses superficiais
CRUZ et al., 2007
Casca Infusão Candidíase
Madeira In natura Fitocombustível RAMOS, 2007
Fruto In natura Alimento
ROQUE, 2009 Folha In natura Forrageira (dieta de bovinos, caprinos e ovinos).
Casca (raspa) Maceração, banho e xarope
Queimaduras, verminose, higiene bucal, gripe, caspa, cicatrizante em geral.
ND ND Dentifrício SANTOS et al., 2009
ND ND Mau hálito, doenças bucais CAVALCANTE, 2010
35
Folhas, frutos, casca Decocção, infusão, maceração, suco
Gripe, febre, azia, problemas estomacais, indigestão, reumatismo, antiséptico, caspa, dentifrício, tônico capilar
CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010
Casca Uso tópico Caspa
OLIVEIRA; BARROS; MOITA NETO, 2010
Casca Emplastro Queimadura
Folha Infusão Problemas gástricos
Casca Maceração Gripe, caspa, dor dentária SILVA; FREIRE, 2010
Folha Infusão
Tosse, gripe, indigestão, bronquite
MARINHO; SILVA; ANDRADE, 2011
Casca do caule Maceração
Entrecasca da raíz Decocção
Folhas Decocção Problemas da dentição, diarréia
SILVA et al., 2012
ND ND
Antisséptico, antisséptico oral, azia, caspa, constipação, dor de estômago, diarreia, expectorante, febre, ferida, fortificante capilar, gripe, inflamação, insônia, dentifrício, indigestão, problemas estomacais, reumatismo, tosse, tuberculose, helmintíase
MEDEIROS; LADIO; ALBUQUERQUE, 2013
ND: Não descrito.
2.5 Constituintes químicos de Ziziphus joazeiro Martius
O conhecimento dos metabólitos secundários, presentes no gênero
Ziziphus, é de fundamental importância, pois permite prever os metabolitos
secundários que podem ser encontrados na espécie Z. joazeiro Mart. Dentre as
várias espécies pertencentes a este gênero, destacam-se Ziziphus mucronata Willd.,
Ziziphus mauritiana Lam. e Ziziphus jujuba Mill., por serem as mais estudadas
quanto a sua fitoquímica (Quadro 2).
36
Quadro 2 - Metabólitos isolados de diferentes espécies já estudadas no gênero
Ziziphus.
Espécie Parte usada
Extração Isolado(s) Referência
Z. mucronata
Raíz (casca)
Percolação em diclorometano
Mucronina A, D e J (alcalóides ciclopeptídicos).
AUVIN et al., 1996
Z mauritiana
Raiz
Extração em metanol
Àcido ceanotico, ácido ceanotano, ácido zizimauritico, ácido betulínico.
JI et. al., 2012
Z. oxyphylla
Raiz
Extração em metanol
Alcalóides ciclopeptídicos: Oxifilina-B 1, Oxifilina C 2, Oxifilina -D 3, Nummularina-C 4, Nummularina-R 5
KALEEM et al., 2013
Z. jujuba e Z. jujuba var. Spinosa
Folhas Extração em metanol 80%
Três flavonóides: Quercetina-3-O-rutinosídeo; quercetina-3-O-α-L-arabinosil-(1 → 2)-α-L-rhamnosídeo; 3, quercetina-3-O-β-d-xilosil-(1 → 2)-α-L-ramnosídeo; Duas saponinas: Ziziphus saponina I; Ziziphus saponina
II Nove ácidos triterpênicos: ácido ceanótico; ácido alfitólico; ácido maslínico; ácido 2-α-hidroxiursolico; ácido ziziberanálico; ácido epiceanótico; ácido ceanotênico; ácido betulínico; ácido oleanólico.
GUO et al., 2011
Z. jujuba
Fruto sem semente
1 - extração em n-hexano clorofórmio; etanol 80%+ agua + acetato de etila. 2 - extração em n-hexano com posterior maceração com metanol.
Isômeros do ácido palmitoléico e ácidos triterpénicos, tais como: ácido betulínico, ácido ursólico, ácido alfitólico, ácido oleanóico
PLASTINA et. al., 2012
Os trabalhos acerca dos constituintes químicos da espécie Z. joazeiro Mart.
são esporádicos e tem como foco a investigação dos metabólitos secundários da
casca, principalmente substâncias triterpenóides.
Um dos primeiros estudos acerca dos fitoconstituintes da espécie foi
publicado em 1984 por Higuchi et al.. Nesse trabalho, a partir da casca, foram
isoladas e caracterizadas três saponinas triterpênicas inéditas que diferem quanto à
porção glicídica e, portanto, possuem a mesma aglicona, a jujubogenina,
previamente isolada das sementes de Ziziphus jujuba. A primeira saponina
(bacocasídeo X) é uma jujubogenina ligada a uma molécula de glicose (β-D-
glicopiranose) e duas moléculas de arabinose (α-L-arabinofuranose e α-L-
37
arabinopiranose). A segunda e terceira saponinas correspondem a jujubogenina
ligada à mesma porção glicídica, porém a glicona encontra-se monosulfatada (4’’’-O-
sulfato) para a segunda saponina, e disulfatada (3’’, 4’’’-di-O-sulfato) para a terceira
saponina.
Posteriormente, foi realizado um estudo no qual a casca do caule foi extraída
com clorofórmio, seguido de extração com metanol, sendo a fração clorofórmica
submetida à cromatografia líquida em coluna e a fração metanólica submetida a uma
cromatografia de gel de filtração. Ao final do estudo, foram isolados da casca do
caule ácido betulínico, ácido oleanóico e uma saponina que forneceu lactona ebilin
quando submetida à hidrólise ácida (BARBOSA-FILHO; TRIGUEIRO;
BHATTACHARYYA, 1985). A lactona ebilin, segundo os autores, provavelmente é
um artefato derivado da hidrólise de um glicosídeo de jujubogenina, sendo o mesmo
evento detectado anteriormente por Higuchi et al. (1984).
Kato et al. (1997) isolaram e identificaram da casca do caule de Z. joazeiro
Mart. lupeol, ácido betúlinico, cafeína e estearato de glicerila. Dois anos após, em
um estudo feito na Suiça, foram isolados do extrato diclorometano da casca os
ácidos triterpênicos betulínico, ursólico e alfitólico, também presentes em Z. jujuba
(GUO ET al., 2011; PLASTINA et. al., 2012) assim como três novos ácidos
triterpênicos derivados do ácido betulínico: [ácido betulínico 7-β-O-(4-
hidroxibenzoiloxi); ácido betulínico 7-β-O-(4-hidroxi-3'-metoxibenzoiloxi) e ácido
betulínico 27-O-(4-hidroxi-3'-metoxibenzoiloxi) (SCHÜHLY et al., 1999). Em seguida,
os mesmos autores isolaram da casca 4 saponinas triterpênicas, sendo três nunca
antes reportadas na literatura (SCHÜHLY et al., 2000).
A primeira saponina, um jujubosídeo, já havia sido isolada por Higuchi et al.
(1984) e, dentre as isoladas, foi considerada a majoritária. Outra saponina isolada foi
denominada lotosideo A, a qual compartilha a mesma aglicona presente nas
saponinas lotosídeo I e II, isoladas da casca da raíz de Z. lotus (RENAULT et al.,
1997). As últimas saponinas possuem uma aglicona inédita e estruturalmente similar
a lotogenina, a qual foi intitulada joazeirogenina. Assim, essas novas saponinas
foram nomeadas joazeirosídeo A e joazeirosídeo B, diferindo apenas quanto ao
número e natureza dos açúcares ligados ao carbono 3.
Em 2010, Leal et al. realizaram um fracionamento do extrato etanólico da
casca do Z. joazeiro Mart. baseado na atividade antibacteriana,. Após a extração
com etanol, foram realizadas partições com solventes de polaridade crescente
38
(diclorometano, acetato de etila e butanol) gerando, respectivamente, 3 frações.
Dentre essas, apenas a fração diclorometano foi escolhida para análises posteriores
por apresentar a maior atividade antibacteriana. Após ser submetida a sucessivos
fracionamentos, foram isolados e identificados 5 compostos triterpênicos
provenientes da casca: metilbetulinato, ácido betulínico, ácido alfitólico, ácido
epigouanico A e metilceanotato, este último sendo o composto majoritário da fração
mais ativa (LEAL et al., 2010).
Os estudos anteriormente citados tinham como foco o isolamento,
identificação e/ou caracterização dos metabólitos da casca, no entanto, foram
publicados estudos fitoquímicos, neste caso de caráter preliminar, acerca de outras
partes da planta, como folhas e frutos. Foram realizadas análises em extratos
metanólicos obtidos a partir de amostras de caule e folha de plantas jovens e
adultas. Os extratos foram analisados por Cromatografia em Camada Delgada com
o emprego de diversas fases móveis e reveladores específicos. Como resultado, foi
observada a presença de saponinas, mono, sesquiterpenos e esteróides em todas
as partes vegetais. Apenas nas folhas foram detectados flavonoides, enquanto que
apenas no caule de plantas adultas foram detectados derivados do ácido cinâmico e
cumarinas (SILVA, 2008). Outra análise fitoquímica preliminar avaliou a composição
de extratos etanólicos da casca do caule, folhas e frutos. A casca do caule
apresentou saponinas, triterpenos, esteróides; as folhas apresentaram alcalóides,
saponinas, triterpenos, esteróides e taninos (MELO et al., 2012).
Em 2015, foi publicado um trabalho que envolveu a análise fitoquímica
preliminar do extrato hidroetanólico, assim como a avaliação da presença de
compostos fenólicos por CLAE. Na prospecção fitoquímica, foi detectada a presença
de ácidos fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas. Através da análise por CLAE,
foram identificados 11 compostos fenólicos no extrato hidroalcoólico das folhas,
constituindo um relato inédito para as folhas da espécie. Desses 11 compostos, 4
são ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido elágico) e
7 são flavonoides (catequina, epicatequina, quercetina, isoquercitrina, quercitrina,
rutina e canferol). Os polifenóis presentes no extrato foram identificados ao se
comparar o seu tempo de retenção e espectro no UV com os de padrões comerciais.
No entanto, não foi realizada uma co-eluição dos padrões com o extrato nem uma
análise posterior por técnicas espectroscópicas. Logo, a presença desses
39
compostos fenólicos nas folhas é de caráter sugestivo, não confirmatório (BRITO et
al., 2015).
Com base no que foi exposto acerca dos constituintes químicos, pode-se
concluir, no geral, que a casca possui triterpenoides e heterosídeos triterpênicos, as
saponinas. As folhas possuem triterpenos, saponinas, alcaloides, taninos e
compostos fenólicos, principalmente os flavonoides.
2.6 Atividades biológicas descritas para a espécie Ziziphus joazeiro Martius
2.6.1 Atividade antifúngica
Cruz et al. (2007) observaram que o infuso (1mg/mL) da entrecasca de Z.
joazeiro apresentou atividade antifúngica contra Candida albicans, C. guilliermondii,
Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrume Fonsecaea pedrosoi. Foram
observados valores de CIM entre 6,25 µg/mL e 400 µg/mL. Em outro estudo, as
saponinas extraídas da casca apresentaram atividade contra C. albicans (156
µg/mL) e Aspergillus niger (312.5 µg/mL) pelo método de microdiluição em caldo
(RIBEIRO et al., 2013). O extrato etanólico (SILVA et al, 2011) e o extrato
hidroalcoólico da casca (MELO et al., 2012) também apresentaram atividade frente
a C. albicans pelo método de difusão em ágar.
As folhas foram avaliadas num estudo recente acerca da sua atividade
antifúngica. A CIM do extrato hidroetanólico das folhas foi determinada pelo método
de microdiluição em caldo, frente a cepas clínicas de Candida krusei, Candida
tropicalis e Candida albicans, além de cepas multirrestitentes de C. krusei, C.
tropicalis e C. albicans. Nesse estudo, a CIM foi ≥ 1024 µg/mL, indicando, segundo
os autores, ausência de atividade antifúngica para as folhas (BRITO et al., 2015).
2.6.2. Atividade antibacteriana
Em estudos que realizaram uma triagem da atividade antibacteriana, extratos
etanólicos, hidroalcoólicos e hexânicos de diferentes partes do joazeiro (folhas,
casca, frutos) apresentaram variada atividade frente a isolados clínicos e cepas de
referência de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em geral, os extratos
40
etanólicos foram os mais ativos, assim como os da casca. (LIMA, 2008; SILVA et al.,
2011; MELO et al., 2012).
Contrariamente aos estudos mencionados, um extrato da casca da planta,
rico em saponinas, não apresentou efeito inibitório, em concentração igual ou inferior
a 12,5 mg/mL, frente às seguintes cepas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,
Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Bacillus
subtilis ATCC 6633 (RIBEIRO et al., 2013).
Por outro lado, em estudos fitoquímicos biomonitorados, compostos
triterpênicos isolados de extratos metanólicos da casca apresentaram atividade
frente a bactérias Gram-positivas, com CIM entre 8 e 128 µg/mL (SCHÜHLY et al.,
1999, LEAL et al., 2009).
Foi realizado um estudo sobre a atividade antibacteriana de dentifrícios pelo
método de difusão em ágar. O dentifrício da empresa Unilever (Gessy Cristal®),
contendo extrato da casca do joazeiro em sua composição, apresentou atividade
frente a bactérias causadores de cárie (BARRETO et al., 2005).
Em um estudo etnobotânico sobre plantas utilizadas em doenças bucais, a
atividade antibacteriana do extrato etanólico (maceração) e do extrato aquoso
(decocção) da casca do juá foi avalidada frente a bactérias associadas a doenças
bucais. O extrato etanólico foi ativo contra todas as cepas enquanto que o decocto
não apresentou efeito inibitório contra a maioria (CAVALCANTE, 2010). Um extrato
aquoso (infuso) da casca interna de Z. joazeiro Mart. também apresentou atividade
antimicrobiana contra bactérias relacionadas à doenças bucais, com valores de CIM
variando de 1mg/mL a 16 mg/mL (ALVIANO et al., 2007).
Recentemente, o EHF das folhas foi avaliado pelo método de microdiluição
em caldo para a determinação da CIM. O extrato foi testado frente às cepas de
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 e Enterobacter
aerogenes, assim como frente a cepas multirresistentes de S. aureus, E. coli e E.
aerogenes. Além da CIM, foi avaliado o sinergismo do extrato quando associado a
diferentes antimicrobianos, como amoxicilina, penicilina G, gentamicina, amicacina e
vancomicina. Nesse estudo, a CIM foi ≥ 1024 µg/mL, indicando, segundo os autores,
ausência de atividade antibacteriana para as folhas. Porém, foi observada uma
redução da CIM dos antimicrobianos amicacina e gentamicina, quando associados
ao extrato hidroetanólico das folhas (BRITO et al., 2015).
41
2.6.3 Atividade larvicida
Ao analisar as atividades dos extratos aquoso (15%, p/v) hidroalcoólico (50%,
p/v) e etanólico das folhas de Z. joazeiro Mart. contra a larva do Culex
quinquefasciatus, verificou-se que os extratos hidroalcoólico e etanólico
apresentaram resultados significativos contra o estágio larval L3 (26% e 28% de
mortalidade, respectivamente), ao contrário do extrato aquoso que não apresentou
resultados satisfatórios (LIMA, 2008).
2.6.4 Atividade antioxidante
Em um estudo, avaliou-se a atividade antioxidante da fração butanol, obtida
do extrato metanólico da casca, e de uma fração enriquecida em saponinas, obtida a
partir da lavagem da fração butanol com NaOH 1%. A atividade antioxidante foi
avaliada pela capacidade dos extratos em capturar o radical livre DPPH (2,2-difenil-
2-picrilhidrazila). A fração enriquecida em saponinas apresentou CE50 (quantidade
de amostra necessária para diminuir em 50% a absorbância do DPPH) maior que
10.000 µg/mL. A fração butanol, composta de saponinas e compostos fenólicos,
apresentou CE50 de 668 µg/mL (RIBEIRO et al., 2013). Alviano et al. (2007)
avaliaram o potencial do extrato aquoso da entrecasca do Z. joazeiro Mart. para
capturar radicais livres pelo método do DPPH. O extrato apresentou CE50 de 821,4
± 35,3 µg/mL. Em outro estudo, que empregou o mesmo método do DPPH, o extrato
etanólico das folhas e cascas de Z. joazeiro Mart. apresentaram valores de CE50
iguais a 461,88 e 1743,05 µg/mL, respectivamente (SILVA et al, 2011).
2.6.5 Avaliação toxicológica
Alviano et al. (2007) avaliaram a toxicidade aguda, por meio de doses
crescentes em camundongos (via oral), do extrato aquoso da parte interna da casca
de Z. joazeiro Mart.. Os resultados não demonstraram qualquer alteração
comportamental e nenhum efeito letal sobre os camundongos com as doses
testadas (1-5 g/Kg). Desta forma, o referido estudo indicou que o extrato apresentou
baixa toxicidade.
42
Por outro lado, em outro estudo toxicológico não-clínico da casca do juazeiro
feito em camundongos, observou-se que estes apresentaram alterações
metabólicas, bioquímicas, hematológicas e histopatológicas após ensaios de
toxicidade aguda e crônica. No ensaio toxicológico agudo, foi administrada, por via
oral, uma dose de 2000 mg/Kg do extrato etanólico da casca. Após 14 dias, foi
observado que as fêmeas passaram a ingerir mais ração e que apresentaram
leucopenia e neutropenia. Os machos apresentaram redução na ingestão de água,
níveis séricos de uréia diminuídos e os de creatinina aumentados. No estudo
crônico, administrou-se as doses de 7 mg/Kg , 35 mg/Kg e 175 mg/Kg aos
camundongos por 90 dias. Ao final do teste e alguns dias após, pôde-se observar
que ocorreram alterações hematológicas em ambos os sexos (leucopenia,
neutropenia, monocitose), mudanças na ingestão de água e ração, elevação da
creatinina sérica em machos e fêmeas, diminuição da uréia em machos, além de
alterações renais, hepáticas e pulmonares após a análise histopatológica. Dessa
forma, são necessários mais estudos clínicos acerca da toxicidade da espécie Z.
joazeiro Mart., a fim de esclarecer a segurança de preparações desta planta
(ESTEVAM, 2008). É importante destacar que para as folhas não há até o momento
estudos que avaliem a sua toxicidade em modelos animais.
2.6.6 Avaliação do potencial genotóxico
Resende et al. (2008) avaliaram a mutagenicidade de extratos hidroalcoólico
(tratamentos de 500, 1000, 1500 e 2000 mg/Kg) das cascas e folhas da espécie Z.
joazeiro Mart., por meio do teste do micronúcleo em medula óssea in vivo. Controles
negativo (NaCl 0,9%) e positivo (50 mg/Kg de N-Nitroso-N-etilureia) foram utilizados.
O resultado deste ensaio sugeriu ausência de potencial clastogênico e/ou
aneugênico do extrato de Z. joazeiro Mart. testado.
2.6.7 Atividade anti-inflamatória do gênero Ziziphus e da espécie Ziziphus joazeiro
Mart.
Até o momento, foi reportado apenas um estudo acerca da avaliação da
atividade anti-inflamatória de Ziziphus joazeiro Mart., porém o foco desse trabalho foi
a casca. Nesse estudo, o extrato etanólico da casca apresentou atividade anti-
43
inflamatória nos modelos de edema de pata e peritonite induzidos por carragenina
(ESTEVAM, 2012).
Para uma espécie do mesmo gênero, Zizyphus lotus, foi relatado que as
frações ricas em flavonoides, provenientes das folhas, e ricas em saponinas,
provenientes das folhas e casca, apresentaram atividade anti-inflamatória
significativa no modelo de edema de pata e inibição da produção de óxido nítrico em
macrófagos (BORGI; et al., 2008). Em outro estudo, os extratos de diclorometano e
acetato de etila das folhas e casca de Ziziphus spina Cristi foram capazes de inibir a
atividade enzimática das enzimas COX-1 e COX-2 (ELDEEN; STADEN, 2008).
2.7 Marcadores químicos e controle de qualidade de plantas medicinais
O uso de plantas medicinais, ao contrário da opinião popular, pode causar
danos à saúde, principalmente quando exercido de forma irracional. No Brasil, as
plantas comumente são utilizadas sem que existam evidências científicas da sua
eficácia e segurança, o que pode comprometer o tratamento ou causar reações
adversas (LANINI et al., 2009).
Outro problema é a qualidade da droga vegetal e de seus derivados
comercializados, que podem estar contaminados, adulterados, apresentarem falsa
autenticidade ou conter quantidade insuficiente de substâncias ativas para promover
um efeito terapêutico (ZHANG et al., 2012). Portanto, além de testes farmacológicos
e toxicológicos não-clinicos e clinicos, devem ser realizados ensaios de controle de
qualidade para garantir a constância da segurança e eficácia do produto.
Uma das estratégias utilizadas no controle de qualidade de plantas medicinais
e fitoterápicos é o emprego de marcadores químicos, que podem ser substâncias
relacionadas diretamente ou não ao efeito terapêutico. Por exemplo, um marcador
pode ser uma molécula com atividade farmacológica ou uma substância majoritária
da planta. A sua quantificação apresenta várias aplicações, tanto para fins de
fiscalização quanto para a padronização e monitoramento da qualidade de
fitoterápicos durante a sua produção (LI et al., 2008).
A qualidade dos produtos à base de plantas medicinais comercializadas no
Brasil é cada vez mais preocupante. Pesquisas realizadas em diferentes regiões do
país constataram diversas irregularidades, que podem comprometer a eficácia do
produto e pôr em risco a saúde do consumidor. Estas irregularidades envolvem a
44
presença de resíduos de pesticidas, elevado teor de impurezas e de umidade,
ausência ou baixa concentração dos constituintes ativos, adulterações, além de
informações inadequadas na embalagem do produto (ZUIN; YARIWAKE; BICCHI,
2004; BARA et al., 2006; MELO et al., 2007; DIAS et al., 2013).
Em resposta a esse problema, existe a resolução RDC 26/2014, de 13 de
maio de 2014, que dispõe sobre os requisitos mínimos para o registro de
medicamentos fitoterápicos e de produtos tradicionais fitoterápicos, além da
resolução RDC 17/2010, que trata das Boas Práticas de Fabricação de
Medicamentos. Segundo estas resoluções, os medicamentos fitoterápicos são
caracterizados pelo conhecimento da sua eficácia e segurança, assim como pela
constância da sua qualidade.
A determinação do perfil cromatográfico, prospecção fitoquímica e análise
quantitativa do(s) marcador(es) estão entre os testes exigidos pela RDC 26/2014
para o registro de fitoterápicos, os quais devem ser apresentados em laudos de
análises da matéria-prima vegetal e do produto acabado. Estes testes também são
necessários ao cumprimento das boas práticas de fabricação de medicamentos
fitoterápicos, como consta na RDC 17/2010 (BRASIL, 2010).
Segundo a RDC 26/2014, marcador é um composto ou classe de compostos
químicos presentes na matéria-prima vegetal que é utilizado como referência no
controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do medicamento fitoterápico,
possuindo preferencialmente relação com o efeito terapêutico (BRASIL, 2014).
Durante o processo de fabricação, os marcadores químicos podem ser utilizados
como padrões de referência no controle de qualidade da matéria-prima vegetal e do
produto acabado, podendo ser escolhidos com base em estudos que o tenham
caracterizado, nos casos de ausência na Farmacopeia Brasileira, ou em outro
código reconhecido pela Anvisa (BRASIL, 2010). Baseado nisso, a escolha e
determinação de marcadores químicos para a espécie Ziziphus joazeiro Mart.
mostra-se muito importante para auxiliar no controle de qualidade da droga vegetal e
de seus derivados.
45
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Caracterização dos marcadores químicos e a avaliação das atividades anti-
Candida in vitro e protetora em modelo de colite experimental in vivo a partir do
extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Martius.
3.2 Objetivos específicos
• Identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes no
extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. e candidatos a marcadores químicos,
utilizando reações químicas clássicas, cromatografia em camada delgada e
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de
fotodiodos;
• Isolar e caracterizar por técnicas espectroscópicas possíveis marcadores
químicos da espécie Z. joazeiro Mart.;
• Avaliar a atividade antifúngica do extrato, frações, e/ou substâncias isoladas
mais ativas por meio do ensaio de bioautografia e da determinação da
concentração inibitória mínima e fungicida mínima em microdiluição em caldo,
frente a cepas de Candida;
• Isolar e caracterizar os compostos responsáveis pela atividade antifúngica;
• Avaliar o potencial protetor do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. sobre a
colite experimental utilizando parâmetros clínicos murinométricos;
• Determinar o efeito do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. sobre a
concentração de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em tecido
colônico.
46
4 JUSTIFICATIVA
Embora a espécie Z. joazeiro Mart. seja amplamente utilizada pela população
da região Nordeste do país, pode-se observar que há uma escassez de estudos
químicos com a espécie. Com base nos estudos relatados na literatura, sabe-se que
as saponinas e triterpenos têm atividades interessantes e que apresentam um altor
teor nas cascas de Z. joazeiro Mart., amplamente utilizadas para o preparo de
produtos de higiene como shampoo e pasta dental (BARRETO et al., 2005).
Entretanto, visto que as folhas da espécie também são utilizadas medicinalmente,
não foram encontrados estudos na literatura que envolvam o isolamento e
caracterização de substâncias que venham a ser marcadores químicos, o que
justifica a proposta deste estudo.
Ainda, pode-se destacar que a utilização das folhas como matéria-prima é
mais interessante do ponto de vista ecológico, tendo em vista que dependendo da
forma como é retirada a casca de algumas plantas, pode ocasionar a morte do
vegetal. Ademais, as folhas geralmente são consideradas um subproduto das
indústrias.
A presente proposta vai ao encontro da RDC nº 26, de 13 de maio de 2014,
que dispõe sobre os requisitos mínimos para o registro de medicamentos
fitoterápicos e de produtos tradicionais fitoterápicos, em que faz-se necessário
caracterizar um marcador, que pode ser ou não a substância ativa, para que em
todas as fases da produção e desenvolvimento de um medicamento fitoterápico
mantenha-se constante o teor desse metabólito.
Com relação ao potencial antifúngico, alguns estudos foram relatados para a
espécie (BRITO et al., 2014; CRUZ et al., 2007; MELO et al., 2012; RIBEIRO et al.,
2013), mas nenhum desses apresentou uma investigação mais aprofundada da
atividade antifúngica, tampouco a caracterização dos componentes responsáveis por
essa atividade.
No que se refere à atividade anti-inflamatória, até o momento não há na
literatura estudos que tenham avaliado o potencial anti-inflamatório da espécie em
modelos de doença inflamatória intestinal.
Dentro deste contexto, a proposta principal deste trabalho é isolar e
caracterizar marcadores químicos do extrato de Z. joazeiro Martius, além da avaliar
a atividade antifúngica por meio de um fracionamento biomonitorado, em
47
colaboração com o Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves (UFRN), e a atividade
protetora em modelo de colite experimental, em colaboração com a Profa. Dra.
Gerlane Coelho Bernado Guerra (UFRN).
48
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Solventes e reagentes
Os solventes e reagentes utilizados para a realização da análise fitoquímica e
avaliação da atividade antifúngica foram de origem diversa, incluindo Merk®, Vetec®,
Chemis®, Neon®, Synth®, Dinâmica®, Alphatec® e Panreac®. Foram utilizados os
solventes acetato de etila, acetona, acetonitrila, água destilada, água ultrapura,
clorofórmio, diclorometano, dimetilsulfóxido, etanol, éter de petróleo, hexano,
metanol, n-butanol e tolueno; os ácidos e bases incluíram ácido sulfúrico, ácido
acético, ácido fórmico, hidróxido de amônio e amônia. Os solventes utilizados foram
de grau analítico, exceto os usados para as análises por cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), os quais foram de grau espectroscópico.
A água utilizada nos experimentos, incluindo o preparo dos extratos, foi
destilada e o etanol foi de procedência variada.
Os reagentes utilizados para a detecção de classes de metabólitos
secundários foram: Bertrand (ácido sílico-túngstico), Dragendorff
(tetraiodobismutato de potássio) e Mayer (tetraiodomercurato de potássio) para
alcaloides; cloreto férrico para compostos fenólicos; difenilboriloxietilamina e
magnésio em pó para flavonoides, KOH 5% (p/v) para a detecção de cumarinas e
antraquinonas; vanilina sulfúrica para a detecção universal.
5.2 Equipamentos e sistemas cromatográficos utilizados no estudo fitoquímico
Os procedimentos cromatográficos envolveram cromatografia em camada
delgada analítica (CCD), em coluna de vidro (CC), líquida de alta eficiência analítica
(CLAE), líquida de alta eficiência semipreparativa (CLAESP) e em contra-corrente de
alta velocidade (CCCAV).
As cromatografias em camada delgada analítica foram realizadas em
cromatoplacas de alumínio (20x20 cm) cobertas com gel de sílica 60 F254, com
tamanho de partícula de 5-17 µm (Macherey-Nagel). A detecção foi realizada
mediante visualização sob luz visível e lâmpada de luz ultravioleta com
comprimentos de onda de 254 nm e 365 nm, seguida de visualização sob luz visível
após reação química com os agentes cromogênicos vanilina sulfúrica, Reagente
49
Natural A (1% p/v), Reagente de Bornträger (KOH 5%, p/v) e Dragendorff. As
cromatoplacas reveladas com Reagente Natural A e Reagente de Bornträger foram
novamente visualizadas sob luz ultravioleta a 365 nm para a detecção de
fluorescência originada por compostos fenólicos.
As cromatografias em coluna de vidro foram realizadas em sílica de fase
reversa – C18 - com tamanho de partícula de 40-63 µm (Merck Lichroprep®, Merck)
e 100 µm (Chromabond®, Macherey Nagel).
A cromatografia líquida de alta eficiência analítica foi realizada em dois
equipamentos. O primeiro, um aparelho Agilent® 1260 Infinity Quaternary LC
System, equipado com uma coluna Luna Phenomenex® (250 x 4,0 mm, 5 µm),
detector de arranjo de diodos (DAD) bomba quaternária, auto-injetor e
desgaseificador. O segundo aparelho, utilizado para a análise das substâncias
isoladas, era um cromatógrafo Merck-Hitach® equipado com um detector de DAD,
bomba quaternária e autoinjetor.
As análises por CLAE semipraparativa foram realizadas numa coluna
Thermo® Hypersil GOLD Cyano (250x10 mm, 5 μm), utilizando um equipamento
Merck-Hitach® equipado com um detector DAD, bomba quaternária e autoinjetor.
Para o fracionamento por CCCAV, foi utilizado um Cromatógrafo em
Contracorrente de Alta Velocidade da P.C.Inc.®, equipado com uma coluna em
espiral multicamada de 110 mL e equilibrada com contrapeso, loop de 7 mL, bomba
de alta pressão Merck-Hitachi® modelo L-6000 e um coletor de frações automático
Eldex®.
A análise por CLAE acoplado a espectrômetro de massa foi realizada na USP
de Ribeirão Preto, num aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada
a um espectrômetro de massas micro-TOF da Bruker® com interface por
eletronspray (IES) e analisador de massas do tipo Time-of-Flight (CLAE-IES-EM
{TOF}). O aparelho é de alta resolução, necessitando de calibração interna antes da
realização das análises, sendo efetuada com uma solução de NA-TFA a 10 mg/mL.
Uma parte das análises de RMN foram realizadas no Laboratorio de
Ressonancia Magnética Nuclear da Universidad Nacional de Colombia, em um
equipamento Bruker Avance 400, equipado com um espectrômetro, imã
supercondutor de 9,4 tesla, sonda BBI de banda larga 5 mm e unidade de controle
de temperatura BVT3200. As amostras foram dissolvidas em metanol-d4
previamente à realização das análises. As outras análises foram realizadas no
50
Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal da Paraíba,
num equipamento de 500 MHz da marca Varian, modelo NMR systems, operando a
500 MHz para análises de 1H e 125 MHz para análises de 13C.
5.3 Material vegetal: coleta, secagem e moagem
As folhas da espécie Ziziphus joazeiro Mart. foram coletadas no município
de Maxaranguape, estado do Rio Grande do Norte, nas coordenadas
latitude/longitude -5.484221 -35.311565 e altura de 22 metros em relação ao nível
do mar. A coleta foi realizada no período da tarde, nos meses de novembro de 2011
e maio de 2012. Uma amostra do material vegetal foi utilizada para fazer uma
exsicata, a qual foi depositada no herbário da UFRN sob o número 12253. A
autorização da coleta foi obtida no Sistema de Autorização e informação em
Biodiversidade (SISBIO), sob o número 35017. A autorização para acesso ao
patrimônio genético, via Plataforma Carlos Chagas/CNPq, foi concedida pelo
Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN), do Ministério do Meio
Ambiente (MMA), sob o número 010142/2012-6.
Após a coleta, as folhas foram secas em estufa de ar circulante a uma
temperatura de 60 ºC, durante 72 horas. Em seguida, o material vegetal seco foi
moído em um aparelho liquidificador, originando 3,136 kg de folhas trituradas.
5.4 Preparação dos extratos
O extrato hidroetanólico das folhas (EHF) foi preparado utilizando o método
maceração, na qual o material vegetal, na proporção 1:15 p/v (droga
vegetal:solvente), foi mantido em contato com etanol: H2O (70: 30, v/v) durante sete
dias. Após esse período, o extrato foi filtrado à vácuo e seu volume reduzido em
evaporador rotatório Buchi® R-3, a uma temperatura de 40 ºC, até a remoção total
do etanol, restando apenas uma suspensão do extrato em água. Para os
experimentos com Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Valocidade, o extrato
proveniente da maceração de 950 g de folhas, após a remoção do etanol, foi
utilizado diretamente numa partição líquido-líquido com solventes orgânicos de
polaridade crescente. Para os ensaios biológicos e análises por CCD, CLAE-UV-
DAD e CLAE acoplado a espectrômetro de massas, o extrato reduzido à forma
51
aquosa, proveniente da maceração de 150 g de material vegetal, teve seu volume
reduzido em evaporador rotatório, a 40 ºC, até tornar-se completamente seco
(23,5556 g). Uma porção desse extrato, na forma aquosa, foi reservada para a
realização da triagem fitoquímica clássica.
5.5 Estudo fitoquímico
5.5.1 Análise fitoquímica preliminar
5.5.1.1 Identificação das classes de metabólitos secundários por reações químicas
clássicas
5.5.1.1.1 Compostos fenólicos
A presença de compostos fenólicos foi avaliada por meio da reação com
cloreto férrico. Foram transferidos 2 mL do EHF para um tubo de ensaio, ao qual
foram adicionadas 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. O
surgimento de coloração verde-escuro, violeta ou azul indica positividade da reação.
5.5.1.1.2 Taninos
Foram transferidos 2 mL do EHF das folhas de Z. joazeiro Mart. para um
tubo de ensaio, em seguida, foram adicionadas algumas gotas de solução
aquosa de gelatina a 2,5 %. O desenvolvimento de precipitado indica positividade
da reação.
5.5.1.1.3 Flavonoides
Foram transferidos 2 mL do EHF das folhas de Z. joazeiro Mart. para
uma cápsula de porcelana, levando-a ao aquecimento em banho-maria (50 °C)
até a obtenção da amostra seca. Aguardou-se o resfriamento da cápsula e, em
seguida, foi adicionado à amostra 0,2 mL de clorofórmio para a remoção da clorofila.
O resíduo contendo clorofila foi desprezado. O resíduo restante na cápsula foi
dissolvido com 1 mL de etanol 70 % v/v e, posteriormente, transferido para um tubo
52
de ensaio. Verteu-se pelas paredes do tubo de ensaio 1 mL de HCl concentrado,
adicionando-se uma pequena quantidade de magnésio em pó. O
desenvolvimento de coloração amarelo-avermelhada indica a positividade da
reação.
5.5.1.1.4 Alcaloides
Em uma placa de vidro foram adicionados, separadamente, do lado esquerdo,
duas gostas dos seguintes reagentes: Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand. Do
lado direito da placa, ao lado de cada reagente, foram adicionadas 2 gotas do EHF
das folhas de Z. joazeiro Mart.. Em seguida, com auxilio de um capilar, fez-se a
mistura de cada reagente com o seu extrato correspondente. A formação de
precipitado indica a positividade da reação.
5.5.1.1.5 Saponinas
Para um tubo de ensaio grande, foram transferidos 2 mL do EHF e,
posteriormente, foram adicionados 4 mL de água destilada. Logo após, o tubo foi
agitado vigorosamente por 1 minuto. O tubo foi deixado em repouso e observou-se a
presença ou não de espuma abundante e persistente, que indica positividade da
reação.
5.5.1.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. por Cromatografia em Camada Delgada
(CCD)
O EHF foi analisado por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
utilizando cromatoplacas de alumínio com gel de sílica F254 (Macherey-Nagel®). A
fase móvel utilizada foi acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água
(100:14:6:10,v/v/v/v), para a observação de moléculas glicosiladas, e tolueno:acetato
de etila:ácido fórmico (50:50:5, v/v/v) para a obsevação de agliconas. Após a eluição
em cuba cromatográfica, as placas foram secadas e visualizadas sob luz visível e
sob luz UV a 365 nm para uma inspeção inicial. Posteriormente, foram reveladas
com os agentes cromogênicos vanilina sulfúrica, Reagente Natural A
(difenilborietoxietilamina 2 % p/v em metanol), Reagente de Bornträger (KOH 5% p/v
53
em etanol) e Dragendorff, sendo reservada uma placa para cada reagente. As
cromatoplacas reveladas com Reagente Natural A e Reagente de Bornträger foram
novamente visualizadas sob luz ultravioleta a 365 nm para a observação de
fluorescência.
Foram utilizados os padrões de ácido elágico, ácido gálico, ácido tânico,
apigenina, canferol, crisina, diosmina, isoorientina, isoquercetina, isovitexina,
luteonina, morina, narigenina, quercetina, rutina, vicenina-2 e vitexina (Sigma-
Aldrich®, pureza ≥ 95%).
Com o objetivo de obter uma maior evidência acerca da presença dos
flavonoides suspeitos de ocorrerem no EHF das folhas de Z. joazeiro Mart., após a
análise inicial por CCD, foi realizada a análise por co-CCD do extrato com os
padrões de quercetina, canferol, isoquercetina e rutina (Sigma-Aldrich®, pureza ≥
95%) em cromatoplacas com sílica gel F254. Para a observação das agliconas
flavonoídicas, utilizou-se a fase móvel tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (50:50:5
v/v/v/v). A fase móvel acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,
v/v/v/v) foi utilizada para a observação dos flavonoides glicosilados.
5.5.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-líquido por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Para as análises por CLAE-UV-DAD, o extrato hidroetanólico seco das folhas,
assim como as frações da partição líquido-líquido, foram dissolvidos em
metanol:água (1:1 v/v) numa concentração de 5 mg/mL e filtrados em membrana
PVDF de 0,45 µm. Todos os solventes utilizados na análise por CLAE foram
previamente filtrados em membrana de 0,45 µm e desgaseificados.
O perfil cromatográfico foi determinado em um aparelho Agilent® 1260 Infinity
Quaternary LC System, equipado com uma coluna Luna Phenomenex® (250 x 4,0
mm, 5 µm), detector de arranjo de diodos (DAD) bomba quaternária, auto-injetor e
desgaseificador. Para a análise, foi desenvolvido um método que consistiu num
gradiente de fase móvel composta por ácido acético 0,3% (solvente A) e acetonitrila
(solvente B), iniciando-se numa proporção de 90:10 (v/v) e variando até 68:32 (v/v)
em 55 minutos, com um fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 10 µl,
monitorização nos comprimentos de onda de 210, 254, 280 e 345 nm e aquisição
espectral na faixa de 210 a 450 nm.
54
5.5.3 Análise da fração AcOEt-PLL01 por espectrometria de massas
A análise foi realizada no aparelho de CLAE-IES-EM {TOF}, em colaboração
com o professor Norberto Peporine Lopes, da USP de Ribeirão Preto. As condições
utilizadas foram as seguintes:
Prato final: 500 Volts;
Voltagem do capilar: 3500 Volts;
Voltagem da saída do capilar: 120 Volts;
Skimmer 1: 40 Volts;
Skimmer 2: 22 Volts;
Transferência: 59µs;
Tipo de gás utilizado: gás nitrogênio;
Temperatura do gás seco: 220 Cº;
Fluxo do gás seco:10 l/min;
Pressão do gás de nebulização: 5,5 Bar;
Faixa de escaneamento: 0-1000 m/z
O método desenvolvido para a análise do extrato e frações foi utilizado para a
análise por CLAE-IES-EM (TOF). A identificação das substâncias foi realizada por
meio da comparação dos dados obtidos com os presentes na base de dados
MassBank, bem como com base no espectro no ultravioleta e tempo de retenção
obtidos para os picos observados.
5.5.3 Fracionamento do EHF de Z. joazeiro Mart.
O fracionamento foi inicialmente realizado por uma partição líquido-líquido
com solventes imiscíveis e de polaridade crescente, seguida de separação por
técnicas cromatográficas envolvendo diferentes suportes, fases estacionárias e
fases móveis. No quadro a seguir, seguem os códigos dos processos de separação,
numerados conforme a ordem de realização, pois foram executados repetidamente.
55
Quadro 3 - Códigos dos processos de separação utilizados
Processo Código
Partição líquido-líquido PLL
Cromatografia em contra corrente de alta velocidade CCCAV
Cromatografia em coluna de fase reversa CCFR
Cromatografia em coluna de gel de filtração CGF
CLAE semipreparativa CLAESP
5.5.3.1 Partição líquido-líquido
Após ser submetido à redução de volume em evaporador rotatório, o extrato
foi particionado com solventes imiscíveis e de polaridade crescente (éter de petróleo,
diclorometano, acetato de etila e n-butanol). O extrato (4000 mL) foi adicionado num
funil de separação e logo em seguida o solvente, na proporção 5:3 (extrato:solvente,
v/v). Foram realizadas 8 partições, cada uma partindo de 500 mL de extrato para
300 mL de solvente orgânico (3x 300 mL). Ao final, resultaram as frações éter de
petróleo (EP-PLL01), diclorometano (CH2Cl2-PLL01), acetato de etila (AcOEt-
PLL01), n-butanol (BuOH-PLL01) e residual aquosa (RA-PLL01). O rendimento das
frações encontra-se na Tabela 1, e o processo está esquematizado no Fluxograma
1.
Tabela 1 - Redimento das frações obtidas após a partição líquido-líquido do EHF de
Ziziphus joazeiro Martius.
Frações Rendimento (g) Rendimento (%)*
EP-PLL01 0,0979 0,01
CHCl2-PLL01 1,9239 0,20
AcOEt-PLL01 3,3658 0,35
BuOH-PLL01 40,0265 4,21 * Valor relativo a 950 g de folhas
56
Fluxograma 1 - Fracionamento do EHF por partição líquido:líquido com solventes de
polaridade crescente.
5.5.3.2 Análise por cromatografia em contracorrente de alta velocidade
Em virtude da dificuldade em se obter compostos isolados e em quantidade
suficiente para a realização de testes biológicos, desenvolvimento e validação de um
método analítico por CLAE, iniciou-se um estágio no laboratório de Productos
Naturales Marinos e Frutos de Colombia, no Departamento de Química da
Universidad Nacional de Colombia (Bogotá, Colômbia), sob orientação do professor
Extrato reduzido
Resíduo
EP-PLL01
CH2Cl2-PLL01
Resíduo
AcOEt-PLL01
Resíduo
BuOH-PLL01
Resíduo Aquoso
(RA-PLL01)
Extração com
éter de petróleo
Extração com
diclorometano
Extração com
acetato de etila
Extração com
n-butanol
PLL: partição líquido-líquido
Proporção 5:3 (v/v) extrato:solvente
57
Freddy Alejandro Ramos. As seções a seguir referem-se aos experimentos
realizados nesse laboratório, que envolveram o fracionamento e isolamento de
substâncias da fração BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por Cromatografia em Contra-
Corrente de Alta Velocidade (CCCAV), colunas cromatográficas em fase reversa e
CLAE em modo semipreparativo.
5.5.3.2.1 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por
cromatografia em contra-corrente de alta velocidade
Primeiramente, os sistemas de solventes utilizados para o fracionamento por
CCCAV foram selecionados através de testes de partição líquido-líquido em tubos
de ensaio, seguido de análise por CCD. Posteriormente, os sistemas aparentemente
mais promissores foram selecionados mediante teste empírico direto no
equipamento de CCCAV.
Para cada teste em tubo de ensaio, o sistema de duas fases foi preparado
pela adição direta dos seus componentes, seguido da agitação vigorosa do tubo por
30 segundos. Após o equilíbrio das fases, foram adicionados cerca de 5 mg da
fração BuOH-PLL01, e posteriormente o tubo foi novamente agitado por 10
segundos. Após o alcance do equilíbrio, as fases foram coletadas separadamente e
analisadas por CCD, sendo aplicadas num mesmo número de vezes para evitar uma
interpretação errônea do resultado. Abaixo segue uma tabela descrevendo os
diversos sistemas de solventes testados (Tabela 2).
58
Tabela 2 - Sistemas de solventes testados e proporção (v/v) dos seus respectivos
componentes.
Sistema Solventes
AcOEt BuOH H2O
1 1 0,05 1 2 1 0,1 1 3 1 0,2 1 4 1 0,4 1 5 1 0,6 1 6 1 0,8 1 7 1 1 1
Hex AcOEt MeOH BuOH H2O
8 1 1 1
1
9 1 2 1
2
10 0,5 2 0,5
2
11 0,5 3 0,5
3
12 0,5 2
0,1 2
Hex AcOEt MeOH BuOH H2O
13 0,2 3 0,5
3
14 0,5 3 0,5
3
15 0,8 3 0,5
3
16 1 3 0,5
3
17 1,2 3 0,5
3
18 1,4 3 0,5
3
19 0,5 2
0,1 2
Hex AcOEt BuOH H2O
20 0,2 3 0,3 3 21 0,5 3 0,3 3 22 0,8 3 0,3 3 23 1 3 0,3 3 24 1,2 3 0,3 3
CHCl3 EtOH H2O
25 2 1 2 26 2 1,5 2
BuOH Hex H2O
27 2 2 4
CHCl3 MeOH H2O
28 4 4 2 29 4 2 2
Hex AcOEt MeOH H2O
30 0,5 3 0,5 2,5 31 0,5 3 1 2,5 32 0,5 3 1,5 2,5
Hex AcOEt MeOH BuOH H2O
33 0,5 3 1 0,5 2,5
34 0,5 3 1,5 0,5 2,5
AcOEt ACN H2O
35 1,5 0,5 2 36 1,5 1 2 37 1,5 1,5 2
Hex AcOEt BuOH H2O
38 0,1 3 0,6 3 39 0,2 3 0,6 3 40 0,4 3 0,6 3 41 0,6 3 0,6 3 42 0,8 3 0,6 3 *ACN: acetonitrila; AcOEt: acetato de etila; BuOH: butanol; CHCl3: clorofórmio; Hex:
hexano; H2O: água; MeOH: metanol.
59
Para a realização da separação por CCCAV, inicialmente o sistema de
solventes a ser utilizado foi preparado em um funil de separação, em que a fase
aquosa e a fase orgânica foram adicionadas e agitadas vigorosamente. Após
alcançarem o equilíbrio, foram coletadas em frascos separados para a utilização na
separação. Subsequentemente, a amostra foi pesada em balança analítica e
dissolvida em um determinado volume das fases aquosa e orgânica.
Após o preparo do sistema de solventes e da amostra, iniciou-se o
bombeamento da fase estacionária para o interior da coluna sob um fluxo de 9
mL/min, durante 20 minutos. Nas análises em que a fase estacionária era a
orgânica, o sentido de bombeamento na coluna foi centro-periferia; quando a fase
estacionária era a aquosa, o sentido de bombeamento na coluna foi periferia-centro.
Após a coluna estar totalmente preenchida com fase estacionária, iniciou-se a
rotação do sistema até 40% de sua capacidade, o que corresponde a cerca de 530
rpm. Com o sistema em rotação, a fase móvel foi bombeada para o interior da
coluna num fluxo de 1mL/min, e a amostra injetada apenas quando observava-se
que um equilíbrio de fases havia se estabelecido no interior da coluna, caracterizado
pela saída apenas da fase móvel. A retenção da fase estacionária foi estimada neste
momento, em que se subtraia o volume da coluna pelo volume de fase estacionária
estruída.
Os modos de separação utilizados consistiram em fase normal (fase
estacionária aquosa e fase móvel orgânica) e fase reversa (fase estacionária
orgânica e fase móvel aquosa). Além disso, a fase móvel foi eluída em 3
modalidades: isocrática (fase móvel constante), gradiente (mudança gradativa de
um dos componentes da fase móvel) e separação por refinamento por zona de pH
(gradiente de pH) contendo ácido fórmico e amônia, os quais foram adicionados as
respectivas fases antes do seu bombeamento para o interior da coluna.
Foram realizadas 11 separações por CCCAV, empregando diferentes modos
de eluição, com o objetivo de selecionar empiricamente as melhores condições
cromatográficas. A separação baseada em cromatografia de fase reversa associada
a refinamento por zona de pH (do inglês pH-zone refining) foi eleita a melhor
condição a ser utilizada. Os parâmetros da CCCAV utilizados em cada separação,
incluindo o pH da fase móvel, no caso de uma separação com refinamento por zona
de pH, estão descritos na tabela a seguir (Tabela 3).
60 Tabela 3 - Condições cromatográficas das separações realizadas por Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade.
CCCAVNº
Sistema Modo Sentido Retenção
da FE Fluxo
Volume da fração
Amostra Quantidade
1 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v Isocrático Centro-periferia 64 % 1
mL/min 3 mL
BuOH-PLL01
1 g dissolvidos em 5 mL de FA e 1 mL de FO
2 1. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,8:3:0,1:3 v/v/v/v 2. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,25:3:0,1:3 v/v/v/v 3. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,025:3:0,3:3 v/v/v/v 4. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:1,2:3 v/v/v/v
Gradiente Periferia-centro 81,82 % 1
mL/min 3 mL
BuOH-PLL01
1 g dissolvidos em 5 mL de FA e 1 mL de FO
3 1. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 1:3:0,1:3 v/v/v/v 2. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,6:3:0,1:3 v/v/v/v 3. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,3:3:0,1:3 v/v/v/v 4. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,05:3:0,1:3 v/v/v/v 5. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,025:3:0,2:3 v/v/v/v 6. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:0,4:3 v/v/v/v 7. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:0,8:3 v/v/v/v 8. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:1,2:3 v/v/v/v 9. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:1,8:3 v/v/v/v
Gradiente Periferia-centro 77,2 % 1,2
mL/min 3 mL
BuOH-PLL01
1 g dissolvidos em 5 mL de FA e 1 mL de FO
4 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v Isocrático Centro-periferia 65 % 1,5
mL/min 4-9 mL
BuOH-PLL01
3 injeções: 0,6 g, 1 g e 1 g dissolvidos em 5 mL de FA e 1 mL de FO
5 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v Isocrático Centro-periferia 65 % 1,5
mL/min 4-9 mL
BuOH-PLL01
2 injeções: 1 g e 1 g, dissolvidos em 5 mL de FE e 1 mL de FM
6 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
1. 280 mL de FE + 0,2 mL de ácido fórmico e FM ajustada ao pH 8 com amônia
2. FM ajustada ao pH 10 com amônia
Gradiente de pH
Centro-periferia 81 % 1,2
mL/min 2-9 mL
BuOH-PLL01
1 g em 6 mL de FA e 1 mL de FO
7 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
1. 280 mL FE + 17 mL de ácido fórmico e
Gradiente de pH
Centro-periferia 63,6 % 1,2
mL/min 2-9 mL
BuOH-PLL01
1 g em 6 mL de FA e 1 mL de FO
61
FA = fase aquosa; FO = fase orgânica; FE = fase estacionária; FM = fase móvel
FM ajustada ao pH 7 com amônia 2. FM ajustada ao pH 8 com amônia 3. FM ajustada ao pH 10 com amônia
8 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
1. 280 mL FE + 17 mL de ácido fórmico e
FM ajustada ao pH 3 com ácido fórmico 2. FM ajustada ao pH 8 com amônia 3. FM ajustada ao pH 10 com amônia
Gradiente de pH
Centro-periferia 63,6 % 1,2
mL/min 2-9 mL
BuOH-PLL01
1 g em 6 mL de FA e 1 mL de FO
9 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
1. 280 mL de FE + 0,2 mL de ácido fórmico e FM ajustada ao pH 8 com amônia
2. FM ajustada ao pH 10 com amônia
Gradiente de pH
Centro-periferia 72,7 % 1,2
mL/min 2-9 mL
BuOH-PLL01
1 g em 6 mL de FA e 1 mL de FO
10 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
1. 280 mL de FE + 0,2 mL de ácido fórmico e FM ajustada ao pH 8 com amônia
2. FM ajustada ao pH 10 com amônia
Gradiente de pH
Centro-periferia 54 % 1,2
mL/min 2-5 mL
39-48 CCC5
470 mg em 5 mL de FA e 2 mL de FO
11 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
1. 280 mL de FE + 0,2 mL de ácido fórmico e FM ajustada ao pH 8 com amônia
2. FM ajustada ao pH 10 com amônia
Gradiente de pH
Centro-periferia 70,9 % 1,2
mL/min 3-7 mL
AcOEt-PLL01
1,5 g em 6 mL de FO e 1 mL de FA
62
5.5.3.3 Isolamento dos flavonoides por cromatografia em coluna e CLAE
semipreparativa
Com base em seu perfil por CCD, as frações obtidas a partir do
fracionamento por CCCAV11 foram reunidas e secas em evaporador rotatório
numa temperatura entre 30-40 ºC. As frações aparentemente mais purificadas
por CCD e de rendimento satisfatório foram submetidas à cromatografia em
coluna de fase reversa (CCFR) para posterior isolamento por CLAE
semipreparativa. Para fins didáticos, as frações obtidas por esses
procedimentos cromatográficos foram rotuladas com números após a sua
reunião.
A fração 12-CCCAV11 (127,1 mg) foi submetida a uma coluna
cromatográfica de fase reversa (Merck Lichroprep®, 40-63 µm) e eluída a um
fluxo de 1 mL/min com um gradiente de metanol e água, conforme descrito na
tabela abaixo:
Tabela 4 - Gradiente utilizado na separação da fração 12-CCCAV11 por coluna
de C18 (CCFR02).
Nº % H2O % MeOH Volume (mL)
1 80 20 80
2 50 50 50
3 30 70 80
4 0 100 50
A partir da fração 08-CCFR02 (29,1 mg) realizou-se um fracionamento
por CLAE semipreparativa no equipamento Merck-Hitachi®, equipado com
detector de UV-VIS, bomba manual e injetor manual com loop de 150 μl. A
coluna utilizada para a separação foi uma ciano Hypersil Gold Cyano (250x10
mm, 5 μm, ThermoScientific®) e a fase móvel composta por H2O:ACN (85:15,
v/v), eluída em modo isocrático a um fluxo de 1,8 mL/min. A amostra foi
dissolvida em 0,58 mL de H2O:MeOH (1:1, v/v), de modo a produzir uma
solução a 50 mg/mL, sendo injetada 5 vezes num volume correspondente a
100 μl. Ao final desse processo, foram obtidos um isolado (ZJF1) e 3 misturas
de flavonoides (frações 02, 03, e 04-CLAESP01)
63
A fração 02-CLAESP01 foi submetida ao mesmo processo com o
objetivo de obter mais 2 substâncias isoladas (ZJF2 e ZJF3). As condições
cromatográficas empregadas foram as mesmas, sendo utilizados 5,9 mg dessa
fração, que foi dissolvida em 0,3 mL de H2O:MeOH (1:1, v/v) e, em seguida,
injetada 3 vezes num volume correspondente a 100 μl.
Fluxograma 2 - Isolamento dos flavonoides ZJF1, ZJF2 e ZJF3.
Fração AcOEt-
PLL01 (1,5 g)
12-CCCAV11
(127,1 mg)
08-CCFR02
(29,1 mg)
01-CLAESP01
(ZJF1, 3,3 mg)
02-CLAESP01
5,9 mg
03-CLAESP01
(ZJFM1, 4,7 mg)
04-CLAESP01
(ZJFM2, 0,9 mg)
01-CLAESP02
(ZJF2, 1,5 mg)02-CLAESP02
(ZJF3, 1,4 mg)
CCCAV11Sistema solvente:
AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
Fluxo: 1,2 ml/min
CCFR02FE: C18 (40-63 µm)
AC: 40 cm ; AFE: 21,5 cm ; D: 2,5 cm
FM: gradiente de MeOH:H O
Fluxo: 1 ml/min
CLAESP01FE: ciano (250x10 mm, 5 μm)
FM: H2O:ACN (85:15, v/v)
Fluxo: 1,8 ml/min;
Detecção: 280 nm
CLAESP02FE: ciano (250x10 mm, 5 μm)
FM: H2O:ACN (85:15, v/v)
Fluxo: 1,8 ml/min;
Detecção: 280 nm
Isolado
análises de RMN de 1H 1D e 2D
PLL: partição líquido-líquido
CCCAV: cromatografia em contra-corrente de alta velocidade
CCFR: cromatografia em coluna de fase reversa
CLAESP: cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa
Isolados
análises de RMN de 1H 1D e 2D
FE: fase estacionária
FM: fase móvel
AC: altura da coluna (cm)
AFE: altura da fase estacionária (cm)
D: diâmetro da coluna (cm)
64
5.5.3.4 Obtenção das frações para o teste de atividade antifúngica
Com base nos resultados da análise por CCD e bioautografia, objetivou-
se obter frações concentradas nas substâncias antifúngicas por meio de
técnicas cromatográficas. A fração 02-CCCAV07 (127,5 mg) foi dissolvida em
1,7 mL de metanol:água (23:77, v/v) e submetida a uma cromatografia de fase
reversa (CCFR05, Merck Lichroprep ®, 40-63 µm) com um fluxo de 0,8 mL/min
e um gradiente de metanol e água (20% - 100 % de MeOH). Foram obtidas 9
frações, sendo a fração 09-CCFR05 (13 mg) utilizada no ensaio de atividade
antifúngica. O processo de fracionamento está esquematizado no Fluxograma
3.
Fluxograma 3 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 09-
CCFR05, utilizada no teste de atividade antifúngica.
Fração BuOH-
PLL01 (1 g)
02-CCCAV07
(127,5 mg)
09-CCFR05
(13 mg)
CCCAV07Sistema solvente:
AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
Gradiente de pH
Fluxo: 1,2 ml/min
CCFR05FE: C18 (40-63 µm)
AC: 40 cm ; AFE: 21,5 cm ; D: 2,5 cm
FM: gradiente de MeOH:H O
Fluxo: 0,8 ml/min
PLL: partição líquido-líquido
CCCAV: cromatografia em contra-corrente de alta velocidade
CCFR: cromatografia em coluna de fase reversa
FE: fase estacionária
FM: fase móvel
AC: altura da coluna (cm)
AFE: altura da fase estacionária (cm)
D: diâmetro da coluna (cm)
65
As frações 02,03 e 05-CCCAV09 foram reunidas (290,3 mg + 43,4 mg +
42,2 mg) e também utilizadas num fracionamento por cromatografia em coluna
de fase reversa, conforme exemplificado no Fluxograma 4 (CCFR07, Merck
Lichroprep ®, 40-63 µm). As frações foram primeiramente reunidas (375,9 mg)
e dissolvidas em 3 mL de metanol:água (23:77, v/v). Posteriormente, a amostra
foi aplicada na coluna e eluída a um fluxo de 0,8 mL/min com um gradiente de
metanol e água (20% - 100 % de MeOH). Foram obtidas 9 frações, sendo
utilizada a fração 07-CCFR07 (93,5 mg) no teste biológico.
Fluxograma 4 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 07-
CCFR07, utilizada no teste de atividade antifúngica.
Fração BuOH-
PLL01 (1 g)
03-CCCAV09
(43,4 mg)
07-CCFR07
(93,5 mg)
CCCAV09Sistema solvente:
AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v
Gradiente de pH
Fluxo: 1,2 ml/min
CCFR07FE: C18 (40-63 µm)
AC: 40 cm ; AFE: 21,5 cm ; D: 2,5 cm
FM: gradiente de MeOH:H O
Fluxo: 0,8 ml/min
02-CCCAV09
(290,3 mg)
05-CCCAV09
(42,2 mg)+ +
PLL: partição líquido-líquido
CCCAV: cromatografia em contra-corrente de alta velocidade
CCFR: cromatografia em coluna de fase reversa
FE: fase estacionária
FM: fase móvel
AC: altura da coluna (cm)
AFE: altura da fase estacionária (cm)
D: diâmetro da coluna (cm)
66
Após os experimentos com Cromatografia em Contra Corrente de Alta
Velocidade, o restante da fração BuOH-PLL01 (25,0495 g) foi utilizado num
fracionamento por partição líquido-líquido, que objetivou obter amostras
concentradas nas substâncias suspeitas de apresentarem atividade
antifúngica. A fração foi primeiramente suspensa em 300 mL de metanol:água
25:75 (v/v) e adicionada a um funil de separação de 500 mL. Posteriormente,
realizou-se a partição líquido-líquido com solventes imiscíveis em água e de
polaridade crescente, obedecendo a uma proporção de amostra/solvente
equivalente a 5:3 v/v. Foi utilizado o éter etílico, para a extração da clorofila
ainda presente (540 mL, fração Et-PLL02); acetato de etila 6 vezes (1080 mL,
fração 01-PLL02) para a extração dos flavonoides (agliconas, mono e
diglicosídeos), seguido de uma mistura composta por acetato de etila e butanol
(60:40, v/v,) a qual foi adicionada 4 vezes (720 mL, fração 02-PLL02) para a
extração das saponinas e simultaneamente evitar a extração de açúcares,
devido à presença do acetato de etila na mistura. Por último, realizou-se a
partição com o butanol (3 vezes, 540 mL, fração 03-PLL02)
A fração 02-PLL02 foi ressuspensa em 100 mL de metanol:água (20:80,
v/v) e submetida a uma partição líquido-líquido na proporção 5:4
(amostra/solvente). Primeiramente realizou-se a partição com acetato de etila,
o qual foi adicionado 10 vezes (800 mL, fração 01-PLL03) para extrair mais
flavonoides (agliconas, mono e diglicosídeos) e por último com n-butanol,
adicionado 3 vezes (240 mL, fração 02-PLL03), para a extração das saponinas.
Na Tabela 5, a seguir, estão os códigos das principais frações obtidas e seus
respectivos rendimentos. O esquema do processo de fracionamento encontra-
se no Fluxograma 5.
Tabela 5 - Rendimento das principais frações obtidas após o fracionamento por
partição líquido-líquido da fração BuOH-PLL01.
Solvente utilizado na extração Código Rendimento (g)
acetato de etila 01-PLL02 1,944
n-butanol 03-PLL02 2,0756
acetato de etila 01-PLL03 1,0127
n-butanol 02-PLL03 5,676
67
Fluxograma 5 - Esquema do processo de fracionamento por partição líquido-
líquido das frações BuOH-PLL01 e 02-PLL02.
BuOH-PLL01 (25 g) em 300
ml de MeOH:H2O (25:75 v/v)
ResíduoEt-PLL02
01-PLL02
Resíduo
02-PLL02
Resíduo
03-PLL02
Resíduo Aquoso
Extração com
éter etílico
Extração com
acetato de etila
Extração com
n-butanol
Extração com acetato de
etila:butanol (40:60 v/v)
02-PLL02 em 100 ml de
MeOH:H2O (20:80 v/v)
01-PLL03
Resíduo
02-PLL03
Resíduo
Aquoso
Extração com
acetato de etila
Extração com
n-butanol
3x 180 ml
6x 180 ml
4x 180 ml
3x 180 ml
10x 80 ml
3x 80 ml
68
A fração 02-PLL03 (5,6 g) que, de acordo com o seu perfil por CCD,
estava mais concentrada nas substâncias de interesse, foi submetida a uma
cromatografia em coluna de gel de filtração (CGF) utilizando a fase estacionária
Sephadex ® LH-20. Foram realizadas duas separações por esse método
(CGF01 e CGF02), utilizando 2 g de amostra, que foi dissolvida em 8 mL de
MeOH:H2O (6:2, v/v).
Posteriormente, a fração 02-CGF01 (643 mg) e 02-CGF02 (550 mg),
foram submetidas, separadamente, ao processo mencionado, com a exceção
de que as amostras foram dissolvidas em 1,5 mL de MeOH:H2O (1:2, v/v) e
eluídas sob um fluxo de 1 mL/min.
As frações 05-CGF03 e 04-CGF04 foram reunidas (177,1 mg) e
submetidas a uma cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12, , 100 µl,
Chromabond®, Macherey Nagel). A amostra foi dissolvida em 0,7 mL de
MeOH:H2O (5:2, v/v) e eluída com um gradiente de MeOH: H2O sob um fluxo
de 0,7 mL/min. O gradiente utilizado está descrito na tabela a seguir (Tabela 6):
Tabela 6 - Gradiente utilizado na separação da fração por cromatografia em
coluna de fase reversa (CCFR12).
Nº % H2O % MeOH Volume (mL)
1 60 40 40
2 40 60 160
3 20 80 40
4 0 100 40
A partir desse procedimento, foram obtidas 10 frações, sendo a fração
05-CCFR12 (5 mg) analisada em espectrômetro de ressonância magnética
nuclear, por denotar estar semipurificada após avaliação por CCD. Dessa
fração, obtiveram-se os espectros monodimensinais e bidimensionais de
ressonância magnética nuclear de 1H e 13C, em colaboração com o professor
Josean Fechine Tavares, da Universidade Federal da Paraíba. Por meio
dessas análises, foi possível constatar que a fração consistia numa saponina
isolada, sendo nomeada ZJS1.
69
Fluxograma 6 - Esquema de isolamento da saponina ZJS1, a partir da fração
02-PLL03.
02-PLL03 (2 g)
02-CGF01
(643 mg)
04-CCFR04
CGF01FE: Sephadex ® LH-20
AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm
D: 3,3 cm
FM: MeOH
Fluxo: 2 ml/min
PLL: partição líquido-líquido
CGF: cromatografia em coluna de gel de filtração
CCFR: cromatografia em coluna de fase reversa
FE: fase estacionária
FM: fase móvel
AC: altura da coluna (cm)
AFE: altura da fase estacionária (cm)
D: diâmetro da coluna (cm)
02-PLL03 (2 g)
02-CGF02
(550 mg)
05-CCFR03
CGF02FE: Sephadex ® LH-20
AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm
D: 3,3 cm
FM: MeOH
Fluxo: 2 ml/min
CGF04FE: Sephadex ® LH-20
AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm
D: 3,3 cm
FM: MeOH
Fluxo: 2 ml/min
CGF03FE: Sephadex ® LH-20
AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm
D: 3,3 cm
FM: MeOH
Fluxo: 2 ml/min
177,1 mg
05-CCFR12
ZJS1
CCFR12FE: C18
AC: 36,6 cm; AFE: 18 cm
D: 2 cm
FM: gradiente de MeOH:H O
Fluxo: 0,7 ml/minisolado
análises de RMN de 1H e 13C 1D e 2D
70
5.7 Avaliação da atividade antifúngica do EHF e frações
5.7.1 Determinação da CIM do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações
5.7.1.1 Reativação das leveduras e triagem fenotípica
As leveduras pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de
Micologia Médica e Molecular, armazenadas em YPD caldo (“Yeast peptone
dextrose”; extrato de levedura 10 g/L; dextrose 20g/L; peptona 20 g/L)
adicionado de 20% de glicerol a -80 °C (Termo Scientific), foram reativadas
após 3 repiques sucessivos para placas de Petri de 90 mm de diâmetro
contendo meio de cultura, sendo semeadas por esgotamento e incubadas a 37
ºC por 48 horas. O primeiro repique foi realizado em Ágar Sabouraud Dextrose
(ASD, Difco), com posterior repique em meio cromogênico CHROMagar
Candida®(Difco), para a purificação dos isolados. O último repique foi realizado
no meio ASD. Paralelamente a isso, a partir desse último repique, foi realizado
o microcultivo de cada colônia. Cada amostra foi semeada com o auxílio de
alça em anel de níquel-cromo em três estrias paralelas sobre a placa de Petri
de 90 mm de diâmetro contendo ágar fubá com Tween-80 (fubá 40 g/L; ágar
bacteriológico 20 g/L; tween-80 12 mL/L). As estrias realizadas sobre o ágar
foram cobertas com lamínulas estéreis e a placa incubada a 30 °C, durante
48h. As leituras foram realizadas em microscopia de luz com 400x de
magnificação (Olympus, CX21).
5.7.1.2 Preparo do inóculo
Tratando com as leveduras puras, foi preparada uma suspensão em
solução salina estéril 0,85% (v/v), agitando-a em vórtex e ajustada visualmente
com base no tubo 0,5 da escala de McFarland, que equivale à concentração de
1 a 5x108 UFC/mL. Foram realizadas duas diluições da suspensão: 1:50 em
solução salina estéril e uma nova diluição de 1:20 em meio de cultura.
71
5.7.1.3 Triagem com micro-organismos de referência
Amostras do EHF, frações obtidas da partição líquido-líquido e sub-
frações da fração BuOH-PLL01 (Tabela 7) foram testadas pelo ensaio de
microdilução em caldo frente às seguintes cepas de referência:
Candida albicans ATCC90028
Candida tropicalis ATCC13803
Candida dubliniensis CBS7987
Candida parapsilosis ATCC22019
Candida glabrata ATCC2001
Candida krusei ATCC6258
Candida rugosa ATCC10571
Tabela 7 - Amostras testadas pelo método de microdiluição em caldo e suas
respectivas concentrações iniciais e faixa de concentração após a diluição
seriada.
Amostra Concentração inicial Faixa de concentração
EHF 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL
Fração EP-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL
Fração CH2Cl2-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL
Fração AcOEt-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL
Fração BuOH-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL
Fração RA-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL
Fraçao 09-CCFR05 2,5 mg/mL 1,25 - 0,010 mg/mL
Fração 07-CCFR07 2,5 mg/mL 1,25 - 0,010 mg/mL
Fração 01-PLL02 5 mg/mL 2,5 - 0,020 mg/mL
Fração 03-PLL02 5 mg/mL 2,5 - 0,020 mg/mL
Fração 01-PLL03 5 mg/mL 2,5 - 0,020 mg/mL
Fração 02-PLL03 5 mg/mL 2,5 - 0,020 mg/mL
Antes da realização do ensaio, foram preparadas as soluções do EHF e
frações, sendo inicialmente dissolvidos em DMSO e posteriormente o volume
completado com caldo Mueler-Hinton (MHC) estéril, de forma a produzir uma
solução contendo DMSO a 5% v/v. Por apresentar elevada solubilidade em
água, apenas a fração residual aquosa foi dissolvida diretamente em MHC
estéril puro. Após o preparo das soluções, essas foram filtradas em filtro de
72
seringa com membrana de 0,22 µm (KASVI). Posteriormente, iniciou-se o teste
de microdiluição em microplacas estéreis de 96 poços. Primeiramente, foram
adicionados 100 μl da amostra nos poços das colunas 1, 2 e 11. Em seguida,
foram transferidos 100 μl de MHC para os poços das colunas de 2 a 8 e 200 μL
para os poços da coluna 12. Posteriormente, com o auxílio de uma micropipeta
multicanal, foi realizada uma diluição seriada partindo da coluna 2,
homogeneizando-se e retirando-se 100 μL da mistura (meio + amostra) e
adicionando-se ao poço da coluna seguinte. Este procedimento foi repetido até
a coluna 9, desprezando-se os 100 μL restantes. Após a diluição seriada, foram
adicionados, em cada poço, 100 μL da suspensão de leveduras, exceto nas
colunas 1 (controle de esterilidade da amostra) e 12 (controle de esterilidade do
meio de cultura). Os poços das colunas 10 e 11 foram reservados,
respectivamente, para o controle de viabilidade da levedura na ausência e
presença do solvente DMSO (Figura 3). Subsequentemente, as placas foram
incubadas sob 35 ± 2 °C por 48 horas. As leituras foram realizadas após o
período de incubação, observando-se a ausência ou não de crescimento
fúngico nas respectivas diluições através de comparação visual. A CIM foi
considerada como a menor concentração de extrato ou fração capaz de inibir
visualmente o crescimento de cada cepa, tomando como referência o
respectivo controle de viabilidade (OLIVEIRA et al., 2006). Os ensaios foram
realizados uma única vez para a triagem (teste do EHF e frações da PLL01) e
em duplicata para as frações da fração BuOH-PLL01.
Figura 3 - Representação do teste de microdiluição em caldo.
Coluna 1 = controle de esterilidade do extrato. Coluna 2 – 9 = poços-teste. Coluna 10 = controle de viabilidade do inoculo. Coluna 11 = controle do solvente. Poço 12 = controle de esterilidade do meio de
cultura. Fonte: autor.
73
5.7.1.4 Determinação da CIM conforme o método do CLSI (CLSI, 2008).
A CIM das frações 07-CCFR07, 28-36 CCFR04 e 46-51 CCFR04 foi
determinada pelo método preconizado pelo CLSI frente às cepas de referência
de Candida. A execução foi quase idêntica a do método de triagem, com a
exceção de que o meio de cultura utilizado foi o caldo RPMI-1640, e o tempo
de incubação das leveduras, previamente à realização do experimento, foi de
24 horas.
A CIM da fração 07-CCFR07 também foi determinada frente a isolados
clínicos de Candida obtidos a partir do banco de microorganismos do
Laboratório de Micologia Média e Molecular. Os isolados clínicos foram
previamente identificados por metodologia clássica de identificação. As cepas
utilizadas encontram-se descritas no Quadro 4. O ensaio foi realizado em
duplicata.
Quadro 4 - Cepas clínicas utilizadas no teste de suscetibilidade.
Isolados clínicos
Candida albicans LMMM 116 (U)
Candida albicans LMMM 78 (S)
Candida albicans LMMM 233 (S)
Candida glabrata LMMM 48 (CO)
Candida glabrata LMMM 79 (S)
Candida glabrata LMMM 249 (S)
Candida glabrata LMMM 255 (S)
Candida tropicalis LMMM 190 (Ur)
Candida tropicalis LMMM 21 (Ur)
Candida tropicalis LMMM 35 (O)
Candida parapsilosis LMMM 81 (S)
Candida parapsilosis LMMM 104 (U)
Candida parapsilosis LMMM 84 (CO)
Candida dubliniensis LMMM (CO)
Trichosporon asahiiLMMM 451 (S)
S = sangue. Ur = urina. CO = cavidade oral. U = unha.
74
5.7.1.5 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
Após a leitura do resultado do teste que utilizou o meio RPMI-1640, foi
realizada a determinação da CFM. A partir dos poços com ausência de
crescimento visível, 10 µl do seu conteúdo foram retirados e transferidos para
placas contendo ASD, sendo incubadas a 37 ºC por 48 horas. A menor
concentração de amostra que apresentou subcultura negativa foi considerada a
concentração fungicida mínima. Como controles, foram utilizados alíquotas de
10 µl do controle de crescimento da levedura e do controle de esterilidade do
meio de cultura.
5.7.1.6 Ensaio de bioautografia
O ensaio de bioautografia foi realizado frente à cepa de referência de
Candida glabrata (ATCC2001), segundo Rahalinson et al. (1991), com algumas
modificações. As amostras utilizadas foram o EHF e as frações BuOH-PLL01,
01-PLL02, 03-PLL02, 01-PLL03, 02-PLL03, 09-CCFR05 e 07-CCFR07.
Primeiramente, as amostras foram dissolvidas em metanol:agua (75:25,
v/v) de modo a formar uma solução a 20 mg/mL (p/v). Em seguida, com o
auxílio de um capilar, 5 a 10 µl das amostras foram aplicadas em 3 placas de
CCD, sendo a quantidade por aplicação correspondente a 100 µg ou 200 µg.
Foram preparadas duas placas para o ensaio de bioautografia,
constituindo assim uma duplicata, e duas placas para comparação, as quais
foram utilizadas para a revelação com os agentes cromogênicos vanilina
sulfúrica e Reagente Natural A. Para o ensaio de bioautografia, também foram
reservadas duas placas de CCD para a realização de uma duplicata dos
controles de viabilidade do inóculo (placa de CCD desenvolvida sem amostra)
e viabilidade do inóculo na presença do solvente (placa de CCD desenvolvida
com aplicação do solvente utilizado para a dissolução da amostra).
Antes de desenvolver cada CCD, a cuba contendo a fase móvel acetato
de etila:ácidofórmico:metanol:água (100:15:6:15, v/v/v/v) foi deixada saturando
75
com o vapor do solvente por 10 minutos, de forma a diminuir o erro associado a
uma saturação incompleta e a garantir a reprodução da separação nas
duplicatas.
Posteriormente, as placas de CCD contendo as amostras foram
colocadas na cuba cromatográfica, eluídas e secas em capela (Quimis®), com
o auxílio de um secador portátil, para a remoção do solvente.
Subsequentemente, as placas de CCD foram transferidas para uma cabine de
fluxo laminar (BSTEC®) e submetidas à ação de lâmpada germicida (UV 254
nm) por 20 minutos para efeitos de esterilização. Em seguida, as placas de
CCD foram depositadas em placas de Petri de 140 mm por 15 mm.
Após a etapa de desenvolvimento e acondicionamento das placas de
CCD, 3 mL de uma suspensão da cepa de referência de C. glabrata (ATCC
2001) a aproximadamente 1x108 UFC/mL, preparada conforme o item 5.7.1.2 ,
foram transferidos para um tubo contendo 30 mL de ASD fundido e mantido em
banho-maria (Quimis®) a 50°C. O inóculo diluído no ágar foi então aplicado
sobre as placas de CCD com o auxílio de uma pipeta de vidro estéril. Ao final,
as placas de Petri foram incubadas em estufa a 37 °C por 48 horas e, logo
após a incubação, visualizadas para a detecção de halos de inibição.
Após a incubação, foram obtidas imagens da bioautografia, sendo
processadas por softwares para a medição da área dos halos de inibição. As
imagens foram obtidas com uma câmera de 21 megapixels, abertura f/2, modo
flash e ISO 64. Posteriormente, foram processadas pelo software livre GIMP,
versão 2.8.14, utilizando inicialmente a ferramenta “Perspectiva”, para tornar a
imagem plana, e em seguida o filtro de imagem Máscara de Desaguçar (raio:
200; quantidade: 2,0 ou 4,0; limiar: 0) para realçar as bordas do halo de
inibição. Logo após, a imagem processada foi transferida para o software livre
ImageJ 1.48 v (National Institute of Health, USA, Bethesda) para medir a área
dos halos de inibição, utilizando-se inicialmente a ferramenta de seleção oval,
seguida da função MEASURE. Os resultados foram expressos como média,
desvio padrão e coeficiente de variação da área medida em pixel².
76
5.8 Avaliação do efeito protetor do EHF de Z. joazeiro Mart. em modelo de
doença inflamatória intestinal
5.8.1 Animais
Ratas (180-250g), da espécie Rattus norvegicus albinus foram obtidas
do biotério da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram
mantidos em uma sala com temperatura controlada de 25 ± 2°C, ciclo claro-
escuro, com acesso à comida e água ad libitum, sendo submetidos a jejum
somente 12 horas antes do experimento. Todos os procedimentos visaram
minimizar o número de animais empregados nos testes e qualquer desconforto
que possa a provir desses. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no
Uso de Animais da UFRN sob o número de protocolo 067/2015.
5.8.2 Modelo de colite aguda
As ratas (n = 7/ grupo) foram distribuídas aleatoriamente em grupos de
indução da doença inflamatória intestinal (DII) com tratamento por
administração do extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Mart. ou
sulfassalazina, e grupos controles. A DII foi induzida pelo ácido 2,4
dinitrobenzóico (DNBS), com duração de 4 dias.
A indução da colite aguda foi realizada pelo método descrito por Morris
et al., (1989) e Gálvez et al. (2000) com pequenas modificações. Os animais
foram submetidos a um período de jejum de 24 horas e, posteriormente,
anestesiados com 10% de ketamina (70 mg/Kg, Quetamina, Sintec, São Paulo)
e 2% de xilazina (10 mg/Kg, Sintec, São Paulo). O DNBS foi preparado numa
concentração de 120 mg/mL, dissolvidos em uma solução a 50 % de etanol v/v.
A solução hidroetanólica de DNBS foi administrada por via retal, num volume
de 0,25 mL, com o auxílio de um catéter de teflón (diâmetro de 2 mm) acoplado
a uma seringa de 1 mL. O catéter foi introduzido no ânus das ratas até uma
distância de 8 cm. Os animais do grupo controle negativo foram submetidos ao
mesmo procedimento, porém com a administração de solução salina em
substituição ao DNBS. Após a administração do hapteno, os animais foram
77
mantidos em posição vertical, com a cabeça voltada para baixo, por 15 minutos
de modo a evitar o extravasamento do agente indutor.
Os tratamentos receberam, por gavagem, 1 mL de uma suspensão do
extrato em solução salina (0,9 %, v/v), uma vez ao dia em três doses: 50 mg/kg
(dose baixa), 100 mg/Kg (dose média) e 200 mg/kg (dose alta). Outro grupo
recebeu 1 mL de sulfassalazina a 250 mg/Kg por via oral. Os tratamentos
foram realizados às 72, 48, 24 e 2 horas antes da indução de colite, assim
como 4 dias após. Como padrão de comparação, foi utilizado o grupo controle,
ao qual foi induzida a colite, mas sem tratamento farmacológico (controle
positivo) e um grupo saudável (controle negativo), ao qual não foi induzido o
processo inflamatório colônico. Os animais dos grupos controle positivo e
negativo receberam 1 mL de solução salina, por via oral. Todos os animais
foram eutanasiados 4 dias após a indução da colite por overdose de tiopental
associado a lidocaína. (Quadro 5)
Quadro 5 - Distribuição dos grupos de colite aguda para a avaliação da
atividade do EHF de Z. joazeiro Mart.
Grupos Tratamento via oral
Grupo 1 (7 animais) Salina 0,9% v/v
Grupo 2 (7 animais) Salina 0,9 % v/v
Grupo 3 (7 animais) EHF 50 mg/kg
Grupo 4 (7 animais) EHF 100 mg/kg
Grupo 5 (7 animais) EHF 200 mg/kg
Grupo 6 (7 animais) sulfassalazina 250 mg/kg - oral
Grupo 1: controle negativo; Grupo 2: controle positivo
78
5.8.3 Avaliação macroscópica do processo inflamatório intestinal
5.8.3.1 Monitorização clínica da doença inflamatória intestinal
A severidade clínica do modelo murino de inflamação intestinal foi
avaliada com base no exame diário da perda de peso, consistência fecal e
presença macroscópica de sangue nas fezes. O peso e o aspecto das fezes
dos animais foram determinados no primeiro dia do experimento, antes da
administração dos tratamentos, até o último dia, antes da eutanásia dos
animais. A perda de peso foi calculada como a diferença entre o peso corporal
no dia anterior ao da indução e qualquer dia após a indução. Para cada
parâmetro (perda peso, consistência fecal, presença de sangue) foi atribuído
um escore, cujo valor baseou-se nos critérios apresentados no Quadro 6. O
Índice de Atividade da Doença (IAD) foi calculado para cada animal por meio
da média dos três parâmetros já mencionados. Quanto maior o valor do IAD,
mais severa é a condição clínica apresentada pelo animal ou grupo de animais.
Quadro 6 - Critérios utilizados para a monitorização clínica da doença
inflamatória intestinal.
Pontuação Critérios
Perda de Peso Consistencia das fezes Sangramento
0 0 Normal Normal
1 1--10 Pouco branda -
2 11--15 Fezes brandas Sangue oculto
3 15 - 20 Pastosa -
4 >20 Diarreia Sangue
5.9.3.2 Determinação do dano macroscópico
Para a determinação do dano macróscopico, os animais foram
primeiramente eutanasiados através da injeção de uma overdose de tiopental
sódico (90 mg/kg) por via intraperitoneal, associado com lidocaína (10 mg/mL).
Subsequentemente, o seguimento colônico foi extraído na sua totalidade,
lavado com solução fisiológica e, em seguida, colocado sobre uma placa de
Petri com gelo para a remoção das aderências mesentéricas.
79
Posteriormente, foi verificado o seu peso, em balança eletrônica digital, e
medido o seu comprimento total para determinação da relação peso/longitude
(P/L). O cólon foi então aberto longitudinalmente para que fosse avaliada a
extensão da área inflamada e o Índice de Dano Macroscópico (IDM). O IDM de
cada animal foi determinado com base na presença de parâmetros de
inflamação, na quantidade de úlceras e na extensão do dano tissular, medida
com o auxílio de uma régua (BELL; GALL; WALLACE, 1995) (Quadro 7)
Quadro 7 - Critério para a avaliação da gravidade do dano macroscópico da
colite experimental de acordo com Bell, Gall e Wallace (1995).
Pontuação Critério
0 Cólon normal (sem dano)
2 Ulceração sem hiperemia nem engrossamento da parede
3 Ulceração com ponto de inflamação
4 Dois ou mais sítios de ulceração e/ou inflamação
5 Zonas grandes de inflamação e ulceração com uma
extensão maior que 1 cm
6-10 Zonas grandes de dano tissular com uma extensão maior
que 2 cm, adicionando-se 1 (até 10) ponto a cada 1 cm
adicional de extensão.
Em seguida, o colón foi cuidadosamente seccionado em cortes
longitudinais, os quais foram armazenados a -20 °C para uma posterior
avaliação histopatológica e para a determinação de marcadores do processo
inflamatório e estresse oxidativo tecidual.
80
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Análise fitoquímica preliminar
Após a análise fitoquímica clássica, foi detectada a presença de
compostos fenólicos, flavonoides e saponinas no extrato hidroetanólico das
folhas (EHF) de Z. joazeiro Mart. Em seguida, foi realizada uma análise por
CCD do extrato, utilizando três reveladores específicos (Reagente Natural A,
Reagente de Borntrager, Dragendorff) e um universal (vanilina sulfúrica), além
de 2 fases móveis. Para um melhor entendimento, serão discutidos
primeiramente os resultados obtidos com a fase móvel de maior polaridade e
posteriormente os obtidos com a fase móvel utilizada para a visualização de
agliconas.
6.1.1 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel para
glicosídeos
Antes da revelação, a CCD foi visualizada sob luz UV (ultravioleta) a 365
nm para a observação de compostos que emitem fluorescência sem a
necessidade de agentes cromogênicos, como flavonoides, cumarinas e ácidos
fenólicos (Figura 4-1). Foram observadas manchas com extinção de
fluorescência (negro), indicativo de flavonoides, e manchas de fluorescência
azul brilhante, sugestivo de flavonoides, ácidos fenólicos ou cumarinas
(MABRY; MARKHAM; THOMAS; 1970; WAGNER e BLADT, 2001). Em
seguida, a cromatoplaca foi revelada com KOH a 5% p/v para a detecção de
cumarinas e antraquinonas (Figura 4-2 e 3). Ao realizar a visualização sob luz
visível, observou-se manchas amarelas por toda a extensão da placa,
enquanto que, sob luz UV a 365 nm, foi possível observar manchas de
fluorescência azul-verde, indicativo de ácidos fenólicos e cumarinas. É
importante destacar que as manchas entre os valores de Rf 0,08 e 0,33
(Tabela 8) apresentaram uma fluorescência mais intensa em relação à placa
sem revelação, sobretudo a mancha com intensa fluorescência azul-verde de
valor de Rf 0,15, comportamento esse característico de cumarinas, que têm a
sua fluorescência intensificada em meio alcalino (WAGNER e BLADT, 2001).
81
A placa revelada com Reagente Natural A apresentou, sob luz UV a 365
nm, manchas de fluorescência amarela, laranja e verde por toda a sua
extensão, indicativo da presença de flavonoides com diferentes núcleos e
níveis de glicosilação. De acordo com a literatura, as manchas de cor laranja e
amarela são características de flavonoides cujo anel B possui 2 hidroxilas
adjacentes, como quercetina, luteolina, miricetina e seus derivados glicosilados
(Figura 4-4). Por sua vez, as manchas de cor verde são características de
flavonoides que apresentam apenas uma hidroxila no anel B, como canferol,
isoramnetina, apigenina e seus glicosídeos (WAGNER e BLANDT, 2001).
Após a revelação com vanilina sulfúrica (Figura 4-5), o extrato
apresentou manchas amarelas, de disposição semelhante às manchas
observadas na placa revelada com Reagente Natural A, as quais
provavelmente correspondem aos flavonoides observados anteriormente. Além
disso, pôde-se observar manchas azuis de valor de Rf 0,20 e 0,33
respectivamente, indicativo de saponinas devido à sua elevada polaridade e
cor característica. O reagente de Dragendorff, utilizado para detecção de
alcaloides, também foi empregado. Após a revelação com esse reagente
(Figura 4-6), não foi observado o desenvolvimento de manchas de coloração
alaranjada, característico da presença de alcaloides, assim como não foi
observado na reação clássica de precipitação (WAGNER e BLADT, 2001).
82
Tabela 8 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação das
cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para glicosídeos.
Mancha Rf Cor
Luz UV 365 nm KOH 5%/luz
visível KOH 5%/luz UV 365 nm
Reagente Natural A/ UV
365 nm
Vanilina Sulfúrica/ luz visível
1 0,08 Azul brilhante Laranja Azul-verde Laranja -
2 0,15 Azul brilhante Laranja Azul-verde Amarelo Azul
3 0,20 Azul- brilhante Laranja Azul-verde Laranja -
4 0,26 Azul brilhante Laranja Azul-verde Laranja Azul
5 0,33 Negro Laranja Azul-verde Laranja Laranja
6 0,40 Negro Laranja Laranja Amarelo-verde Laranja
7 0,47 Azul brilhante Laranja-amarelo Azul-verde Laranja Amarelo
8 0,51 Azul brilhante Laranja-amarelo Azul-verde Laranja -
9 0,55 Negro Laranja Azul-verde Laranja Amarelo
10 0,63 Negro Laranja-amarelo Laranja Verde Amarelo
11 0,69 Azul brilhante - Azul-verde - -
12 0,74 Azul brilhante Laranja Azul-verde Laranja Amarelo
13 0,79 Negro Laranja-amarelo Azul-verde Laranja Amarelo
14 0,84 - - Azul-verde Verde -
15 0,90 - - Azul-verde - -
83
Figura 4 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para glicosídeos
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:14:6:10,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: 1 – UV 365 nm; 2 – KOH 5 %/luz
visível; 3 – KOH 5%/ UV 365 nm; 4 – Reagente Natural A/UV 365 nm; 5 - vanilina sulfúrica/aquecimento; 6 - Dragendorff. Fonte: autor
84
6.1.2 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel para
agliconas
A observação inicial da placa em luz UV a 365 nm permitiu verificar a
presença de 6 manchas vermelhas com valores de Rf entre 0,5 e 0,84, as quais
possivelmente correspondem a pigmentos vegetais, como clorofila (Figura 5-1).
Posteriormente, a placa foi revelada com KOH 5% (p/v), preservando a cor das
manchas vermelhas, exceto a de Rf 0,75, que passou a apresentar uma
coloração azul. Logo, é possível que esteja coeluindo uma cumarina juntamente
com o pigmento vegetal (Figura 5-2; Tabela 9).
Após a revelação com Reagente Natural A, surgiram manchas de
fluorescência verde e laranja (Figura 5-3). Como comentado anteriormente, a
mancha laranja é característica de flavonoides cujo anel B possui duas hidroxilas
adjacentes, enquanto que a coloração verde é característica de flavonoides com
apenas uma hidroxila no anel B (WAGNER e BLADT, 2001). Portanto, há pelo
menos dois tipos de agliconas flavonoídicas no EHF de Z. joazeiro Mart., cujo os
derivados glicosilados possivelmente originam as manchas observadas após o
uso da fase móvel apropriada para glicosídeos.
O uso do revelador universal vanilina sulfúrica permitiu observar, sob luz
visível, manchas de cor violeta com valores de Rf de 0,75 e 0,85, as quais co-
eluem com as manchas vermelhas (Figura 5-4). A cor violeta é característica de
substâncias da classe dos terpenoides (WAGNER e BLADT, 2001).
Tabela 9 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação das
cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para agliconas.
Mancha Rf
Cor
Luz UV 365 nm
KOH 5%/luz UV 365 nm
Reagente Natural A/ UV 365 nm
Vanilina Sulfúrica/ luz
visível
1 0,5 Vermelho Vermelho - -
2 0,55 Vermelho Vermelho - Verde
3 0,58 - - Laranja -
4 0,61 Vermelho Vermelho Vermelho Verde
5 0,66 - - Verde -
6 0,75 Vermelho Azul Vermelho Violeta
7 0,84 Vermelho Vermelho Vermelho Violeta
85
Figura 5 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para
agliconas.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:14:6:10,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: 1 – UV 365 nm; 2 – KOH 5%/ UV 365 nm; 3 – Reagente Natural A/UV
365 nm; 4 - vanilina sulfúrica/aquecimento. Fonte: autor
6.1.3 Análise por co-cromatografia
Adicionalmente, foi realizada uma análise por co-CCD com os padrões
comerciais das agliconas flavonoídicas quercetina e canferol, além dos
flavonoides glicosilados rutina e isoquercetina, de modo a verificar a sua presença
no extrato. Os padrões foram eluídos em paralelo com o EHF, bem como
juntamente com esse (co-eluição). Após a eluição com a fase móvel para
agliconas e revelação com Reagente Natural A/UV 365 nm, foi possível observar
que as manchas dos padrões, tanto em paralelo quanto após a co-eluição,
apresentaram Rf e coloração semelhante às manchas verde e laranja observadas
no EHF. A mancha verde (Rf = 0,72) apresentou comportamento cromatográfico
similar ao da amostra autêntica de canferol (Figura 6-1; 6-2; 6-3; Tabela 10),
enquanto que a mancha amarelo-laranja (Rf = 0,65) apresentou comportamento
86
cromatográfico similar à amostra autêntica de quercetina (Figura 6-4; 6-5; 6-6;
Tabela 10).
Tabela 10 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por co-
CCD do EHF de Z. joazeiro Mart.utilizando os padrões de quercetina e canferol.
Mancha Rf Cor
EHF
Padrão quercetina
Padrão canferol
EHF + padrão
1 0,65 Laranja-Amarelo Amarelo - Amarelo
2 0,68 Vermelho - - Vermelho
3 0,72 Verde - Verde Verde
4 0,76 Vermelho - - Vermelho
5 0,82 Vermelho - - Vermelho
Figura 6 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões de
quercetina e canferol
Eluente: tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (50:50:5,v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: 1 – EHF; 2 – padrão de canferol; 3 – co-
eluição do EHF com o padrão de canferol; 4 – EHF; 5 – padrão quercetina; 6 – co-eluição do EHF com o padrão quercetina. Fonte: autor.
A análise utilizando a fase móvel adequada para glicosídeos permitiu
observar, após revelação com Reagente Natural A/UV 365 nm, que as manchas
87
dos padrões de rutina (Rf = 0,55, Figura 7-2, Tabela 11) e isoquercetina (Rf =
0,80, Figura 7-5, Tabela 11) apresentaram coloração similar, porém um valor de
Rf relativamente discrepante ao das manchas de fluorescência laranja presentes
no EHF (Rf = 0,50 e 0,75; Figuras 7-1 e 7-4). Embora na eluição em paralelo, as
referidas manchas não tenham apresentado valor de Rf próximo ou igual ao das
amostras autênticas, possivelmente devido ao efeito da complexidade da matriz,
após a co-eluição foi possível observar um aumento da fluorescência dessas
(Figuras 7-3 e 7-6), o que permite sugerir a presença desses flavonoides no EHF
de Z. joazeiro Mart.
Tabela 11 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por co-
CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando os padrões de rutina e isoquercetina.
Mancha Rf Cor
EHF Padrão rutina
Padrão isoquercetina
EHF + padrão
1 0,50 Laranja - - Laranja
2 0,55 - Laranja - -
3 0,56 Verde - - Verde
4 0,60 Amarelo - - Amarelo
5 0,66 Amarelo - - Amarelo
6 0,75 Laranja - - Laranja
7 0,80 - - Laranja -
8 0,83 Verde - - Verde
9 0,90 Laranja - - Laranja
88
Figura 7 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões de
rutina e isoquercetina.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: 1 – EHF; 2 – padrão de
rutina; 3 – co-eluição do EHF com o padrão rutina; 4 – EHF; 5 – padrão de isoquercetina; 6 – co-eluição do EHF com o padrão isoquercetina. Fonte: autor
Com base nos resultados dessa análise fitoquímica preliminar, foi possível
constatar a presença de saponinas, flavonoides e possivelmente ácidos fenólicos,
cumarinas e terpenoides no EHF de Ziziphus joazeiro Mart.. Ainda, foi possível
observar a presença de agliconas flavonoidicas e seus respectivos glicosídeos,
bem como sugerir a presença dos flavonóis quercetina, canferol, rutina e
isoquercetina por meio de uma análise por co-CCD.
Estudos anteriores já haviam reportado a presença de saponinas,
flavonoides e terpenoides nas folhas de Ziziphus joazeiro Mart.. No entanto,
também foi reportada a presença de taninos e alcaloides por meio de reações
clássicas (SILVA el al., 2008; MELO et al., 2012). Essa discrepância pode
decorrer de variações no perfil metabólico em função do local e época da coleta
ou devido a resultados falso-positivos que podem ocorrer nas técnicas clássicas
de identificação. Em um estudo recentemente publicado, foram identificados, por
CLAE-DAD, ácidos fenólicos e flavonoides no extrato hidroetanólico das folhas,
incluindo os flavonoides quercetina, canferol, rutina e isoquercetina, o que
corrobora para a presença desses constituintes nas folhas da espécie (BRITO et
al., 2015).
89
6.2 Análise por CCD das frações da partição líquido-líquido do EHF de Z.
joazeiro Mart.
O EHF foi particionado com solventes de polaridade crescente, obtendo-se
as frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01 e RA-PLL01.
Essas frações foram analisadas por CCD a fim conhecer o seu perfil
cromatográfico.
Foram utilizadas duas fases móveis de forma a permitir a visualização de
moléculas polares e menos polares. Pôde-se observar que nas placas reveladas
com Reagente Natural A, específico para flavonoides, o EHF e a fração BuOH-
PLL01 apresentaram um perfil semelhante, enquanto que a fração AcOEt-PLL01
apresentou uma maior diversidade de flavonoides com diferentes polaridades,
que nitidamente se distribuíram em 3 regiões (Figura 8). Observa-se na placa da
Figura 9, revelada com vanilina sulfúrica, a presença de manchas azuis no EHF e
na fração BuOH-PLL01. Devido à sua cor e maior polaridade, sugere-se que
sejam saponinas, como observado anteriormente na análise por CCD do EHF.
Não foi possível observar manchas nas frações EP-PLL01e CH2Cl2-PLL01. A
fração RA-PLL01 se apresentou como um arraste disperso, característico de
açúcares.
90
Figura 8 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações obtidas da
partição líquido-líquido.
Eluente A: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,v/v/v/v). Eluente B: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:2,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254;
Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: EHF; EP-PLL01; CH2Cl2-PLL01; AcOEt-PLL01; BuOH-PLL01; RA-PLL01. Fonte: autor.
Figura 9 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações obtidas da
partição líquido-líquido
Eluente A: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,v/v/v/v). Eluente B: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:2,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254;
Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: EHF; EP-PLL01; CH2Cl2-PLL01; AcOEt-PLL01; BuOH-PLL01; RA-PLL01. Fonte: autor.
EH
F
EH
F
91
6.3 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-líquido
por CLAE-UV-DAD
O extrato hidroetanólico das folhas (EHF) de Z. joazeiro Mart. e suas
respectivas frações da partição líquido-líquido foram analisados por CLAE-UV-
DAD para caracterizar as classes de metabólitos secundários presentes,
utilizando como detector um arranjo de fotodiodos, que realizou a varredura do
espectro na região entre 210-450 nm. Devido à presença de ácido acético na fase
móvel, não foi possível realizar a identificação de saponinas, pois o grupo
carboxila do ácido acético absorve em torno de 200-210 nm, o que dificulta a
observação de moléculas com poucos grupos cromóforos (SNYDER; KIRKLAND;
GLAJCH, 1997). Portanto, a análise foi útil para a identificação de classes e
subclasses de compostos fenólicos.
6.3.1 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-líquido
A análise do EHF por CLAE-UV-DAD demonstrou a presença de 25 picos
com resolução satisfatória (Figura 10), sendo possível adquirir seus espectros no
UV com pureza maior que 80%. Foram observados espectros com bandas de
absorção indicativas de ácidos fenólicos, cumarinas, flavonóis com substituição
em C-3 e flavonas (Tabela 12).
Os picos 1, 3 e 4 (Tabela 12), com menor tempo de retenção, podem
corresponder a ácidos fenólicos derivados do ácido benzóico, pois apresentam
um único máximo de absorção em torno de 200-290 nm (WAKSMUNDZKA-
HAJNOS; SHERMA, 2010)
Os picos 5, 8 e 19 (Tabela 12) podem derivar de cumarinas. O pico 5
apresenta bandas de absorção sugestivas de uma cumarina com oxigenação em
C-7 (HARBORNE , 1989). Enquanto isso, o pico 6 apresenta espectro sugestivo
de uma 4-fenilcumarina devido a presença de 3 bandas de absorção em torno de
230, 280-295 e 340-370 nm (DANG et al., 2015). Por último, o pico 19 pode
corresponder a uma furanocumarina linear por possuir 4 bandas de absorção em
torno de 205 e 316 nm (HARBORNE , 1989).
92
A partir do tempo de retenção (tR) de 16 min, surgem picos com espectro
no UV característico de flavonoides, mais especificamente flavonas ou flavonóis
com substituição em C-3, por apresentarem dois máximos de absorção
correspondentes a banda I (sistema cinamoila do anel B) e banda II, (sistema
benzoila do anel A) entre 300-380 nm e 240-280 nm, respectivamente (MABRY;
MARKHAM; THOMAS, 1970).
Pode-se observar picos (9, 10, 14, 15 e 16; Tabela 12) com espectro no UV
sugestivo de flavonóis com o núcleo quercetina, possivelmente apresentando
glicosilação em C-3 devido ao seu tempo de retenção. Sustentam essa hipótese a
presença de duas bandas principais em torno de 255 e 354 nm, estando a banda I
fora da região de sobreposição entre flavonas e flavonois substituídos em C3
(328-350 nm), um deslocamento hipsocrômico da banda I em torno de 15 nm em
relação a aglicona quercetina, que corrobora para a substituição em C-3 por um
açúcar, e uma banda II duplicada, indicativo de hidroxilação nas posições 3' e 4'
do anel B (CAMPOS; MARKHAM, 2007; MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).
Ainda, na região de tempo de retenção entre 16 e 30 minutos, verifica-se
que os picos 11, 13 e 17 (Tabela 12) possuem a dupla banda II em torno de 255
nm e a banda I em torno de 345-350 nm, comportamento esse sugestivo de uma
flavona com oxigenação em 3' e 4' e ausência de substituição em 3, ou seja,
sugestivo de luteolina. Considerando o tempo de retenção dos picos,
possivelmente a flavona está glicosilada.
A partir do tR de 26 min, surgem picos com espectro característico de
flavona ou flavonol (20, 22, 23, 24, 25; Tabela 12) apresentando uma banda I em
torno de 325-335, o que representa um intenso deslocamento hipsocrômico em
relação aos flavonoides anteriores. Esse comportamento é sugestivo de
flavonoide com metilação ou glicosilação em 3, 4' e 5' ou ausência de oxigenação
nessas posições (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).
93
Tabela 12 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros
no UV observados para os picos obtidos após a análise do EHF de Ziziphus
joazeiro Mart.por CLAE-UV-DAD.
Pico tR (min) λmax(nm)
1 2,53 253
2 2,93 212, 244sh, 255sh
3 4,21 270
4 4,53 270
5 7,84 234, 313
6 8,55 215, 240sh, 324
7 8,91 241, 327
8 9,60 230, 292, 337sh
9 16,54 256, 262sh, 298sh, 354
10 18,26 256, 263, 296, 354sh
11 18,90 255, 263sh, 295sh, 346
12 19,58 266, 296, 340
13 20,94 255, 263sh, 298sh, 346
14 21,83 255, 262sh, 298sh, 354
15 22,60 254, 262sh, 354
16 24,10 255, 262sh, 354
17 25,21 254, 262sh, 349
18 26,97 230, 266sh, 294, 326sh
19 29,85 245, 262sh, 332
20 31,76 253, 265sh, 296sh, 329
21 32,64 265, 317
22 36,34 243, 266, 295sh, 328
23 38,04 242, 265, 297sh, 335
24 38,67 267, 295sh, 328
25 39,43 246sh, 267, 325 sh = shoulder ou ombro
94
Figura 10 - Espectros de UV (210-450 nm) dos 25 picos observados na análise
por CLAE-UV-DAD do EHF de Z. joazeiro Mart.
1
2
3
4
6
7
8
5
95
12
13
11
10
9
16
17
14
15
18
96
Fonte: autor
21
22
20
19 23
24
25
97
Figura 11 - Cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus joazeiro Mart. e frações.
A
A
A
A
B
B
B
B
EHF
CH2Cl2-PLL01
AcOEt-PLL01
BuOH-PLL01
A = cromatograma obtido a 254 nm (280 nm para a fração BuOH-PLL01). B = espectro no UV em função do tempo de retenção. Fonte: autor
98
A fração CH2Cl2-PLL01, após análise por CLAE-UV-DAD, apresentou
picos com perfil espectral predominante em ácidos fenólicos, possivelmente
derivados do ácido benzoico e ácido cinâmico, além de cumarinas. Os picos 2, 4,
7, 8, 9, 10, 16, e 21 podem ser derivados do ácido benzóico por apresentarem
máximo de absorção entre 200-290 nm (Tabela 13). Por sua vez, os picos 5, 11,
12, 13, 14, 15, 1 e 20 podem corresponder a ácidos fenólicos derivados do ácido
cinâmico ou cumarinas, em decorrência de possuírem máximos de absorção
entre 218 e 330 nm (Tabela 13). Portanto, o perfil químico da fração CH2Cl2-
PLL01 difere bastante do EHF.
Tabela 13 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros
no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração CH2Cl2-PLL01
por CLAE-UV-DAD.
Pico tR(min) λmax(nm)
1 5,49 265, 274
2 7,89 284
3 8,54 252
4 10,12 280
5 11,20 228, 276, 306
6 11,89 218, 265sh, 292
7 12,15 217, 281
8 12,66 229, 278
9 14,35 223, 284
10 15,25 244
11 15,63 220, 258, 302sh
12 16,50 230, 280, 310
13 17,41 218, 229sh, 308
14 18,68 242, 326
15 19,01 219sh, 239, 294sh, 323
16 20,35 241
17 24,20 246sh, 259, 298, 358
18 25,23 234, 345
19 41,56 228
20 44,52 238, 330
21 45,45 276
22 47,13 238, 329 sh = shoulder ou ombr
99
A fração AcOEt-PLL01 apresentou um perfil abundante em flavonoides,
assim como observado na análise por CCD. Dos 30 picos analisados, 20
apresentaram espectro no UV característico de flavonoides (Tabela 14). Além dos
flavonoides observados no extrato entre tR de 16 - 30 min, surgiram mais picos na
região entre tR 30 - 55 min, possivelmente devido à capacidade do acetato de etila
de extrair agliconas flavonoídicas da fase aquosa, além de flavonoides mono e
diglicosilados. Logo, surgiram mais picos com tempo de retenção elevado,
comportamento esse associado a moléculas de menor polaridade, considerando a
cromatografia de fase reversa.
Em consonância com o observado no EHF, os picos 8(a),9, 12, 13, 15 e 16
(Tabela 14) apresentaram espectro característico de quercetina-3-O-glicosídeo,
com máximos de absorção em torno de 255 e 355 nm, além da presença de
banda IIb ao redor de 266 nm. Os picos 10, 15(b) e 19, por sua vez,
possivelmente correspondem a derivados glicosilados de canferol, em
decorrência do deslocamento hipsocrômico da banda I em relação aos
glicosídeos de quercetina e ausência de uma banda II duplicada, indicativo de um
anel B hidroxilado apenas na posição 3' (CAMPOS; MARKHAM, 2007).
Os picos 18, 22, 23, 24, 25, 27, 29 e 30 (Tabela 14) podem derivar de
flavonoides com ausência de substituintes oxigenados nas posições 3, 4' e 5,
devido ao intenso descolamento hipsocrômico observado para as bandas I ou II
ou ambas. Além disso, destaca-se o pico 26, que possui espectro no UV
indicativo de uma flavona com ausência de oxigenação no anel B, como a crisina
(MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).
Foi observado para os picos 17(a) e 25 (Tabela 14) um espectro
característico de flavonoide, no entanto com anomalia. Esses apresentam banda
IIa e IIb, indicativo de oxigenação em 3' e 4', porém a banda I possui um intenso
deslocamento hipsocrômico, sendo incoerente com o restante do espectro, uma
vez que esse deslocamento hipsocrômico é característico de um núcleo do tipo
apigenina. Assim, propõe-se que essas substâncias devem apresentar algum
substituinte com efeito imprevisível sobre o espectro no UV, sendo portanto de
interesse para o isolamento.
100
Sugere-se também a presença de derivados do ácido benzoico e ácido
cinâmico (picos 1, 2, 3, 4, 5, e 28; Tabela 14) devido à presença de bandas de
absorção entre 216 e 334 nm.
Tabela 14 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros
no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração AcOEt-PLL01
por CLAE-UV-DAD.
Pico tR (min) λmax(nm)
1 2,89 258, 268sh
2 3,61 259, 266sh
3 7,34 218, 260, 295
4 10,63 256
5 11,90 218, 261, 295, 334sh
6 12,15 216, 273
7 14,36 227, 279
8(a) 16,34 257, 266sh, 358
8(b) 16,34 223sh, 271sh, 312
9 18,33 256, 266, 294, 354
10 18,98 256, 261sh, 292sh, 347
11 19,67 264, 291, 344
12 21,03 256, 264sh, 292sh, 346
13 21,92 255, 266sh, 295sh, 354
14 22,69 256, 266sh, 292sh, 354
15 24,19 255, 267sh, 278sh, 353
16 25,31 254, 266sh, 297sh, 353
17 (a) 27,11 229, 266, 295sh, 321
17 (b) 27,11 264, 350
18 29,91 245, 267sh, 332
19 31,83 252sh, 268, 298sh, 329
20 32,74 236sh, 256, 267sh, 294sh, 316
21 34,40 264, 298, 340
22 36,40 219sh, 244sh, 266, 296sh, 328
23 38,08 245, 268sh, 295sh 332
24 38,72 245sh, 268, 296sh, 328
25 39,45 245, 268sh, 330
26 40,50 257, 267sh, 292sh, 314
27 41,55 252, 267sh, 296sh, 333
28 43,55 227, 293, 317sh
29 46,12 230, 268, 280sh, 328
30 47,55 269, 292sh, 328 sh = shoulder ou ombro
101
A fração BuOH-PLL01 apresentou um perfil quase idêntico ao do EHF,
porém com menos picos entre os tempos de retenção de 0-10 min. Novamente,
observa-se o pico 6 (Tabela 15) com um espectro sugestivo de uma 4-
fenilcumarina. (DANG et al., 2015). Assim como observado para o extrato, a
partir do tR = 16 min surgem picos com espectro no UV característico de
flavonoides do tipo quercetina-3-O-glicosídeo (picos 9, 13, 13, 15; Tabela 15),
mesclados com flavonoides que apresentam uma banda I indicativa de uma
flavona do tipo luteolina (picos 11 e 16). Além disso, também nota-se a
presença de picos (19, 20) com espectro sugestivo de flavonoides que
apresentam metilação ou glicosilação em 3, 4' e 5' ou ausência de oxigenação
nessas posições.
Tabela 15 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos
espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração
BuOH-PLL01 por CLAE-UV-DAD.
Pico tR (min) λmax(nm)
1 2,52 265
2 2,88 257, 268sh
3 3,6 257
4 7,74 243, 311
5 7,92 232, 287
6 9,58 229, 290, 343sh
7 16,55 256, 264sh, 292sh, 355
8 18,27 256, 266sh, 286sh, 354
9 18,9 256sh, 265, 352
10 19,59 266, 293, 336
11 20,97 256, 264sh, 292sh, 346
12 21,82 255, 266sh, 292sh, 354
13 22,61 254, 267sh, 355
14 23,41 232, 290, 330
15 24,11 256, 266sh, 354
16 25,18 254, 266sh, 294, 343
17 27,03 227, 266, 293, 324
18 28,37 233, 290
19 29,84 245, 268sh, 332
20 31,78 252, 266sh, 332
21 32,68 232, 257, 264, 317, 362 sh
22 36,33 243, 328
23 43,5 295, 318sh sh = shoulder ou ombro
102
6.4 Análise da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-IES-EM (TOF)
Os cromatogramas obtidos em 340 nm nos equipamentos de CLAE-DAD
e CLAE-IES-EM (TOF) apresentaram um perfil semelhante. Por conseguinte,
os espectros de UV dos picos obtidos na análise por CLAE-UV-DAD foram
utilizados para nortear a busca de picos revelantes no cromatograma de pico
base, obtido na análise por CLAE-IES-EM (TOF), além de complementar os
dados de espectrometria de massas (Figura 12). Conforme mencionado
anteriormente, na análise por CLAE-UV-DAD a fração AcOEt-PLL01
apresentou um perfil químico complexo em flavonoides, sendo observados
picos com espectros no UV característicos de O-glicosídeos de quercetina e
canferol. Os picos equivalentes, observados no cromatograma em 340 nm
obtido com o equipamento de CLAE-IES-EM (TOF) em modo positivo, tiveram
os seus espectros de massas analisados em busca de fragmentos com relação
massa/carga (m/z) característicos dessas agliconas e de outras
estruturalmente semelhantes. Os picos foram identificados por meio da
comparação com os dados presentes na base de dados MassBank.
De acordo com as massas exatas das agliconas, obtidas na base de
dados MassBank (Tabela 16), os picos 8, 9 e 10 apresentaram fragmentos com
m/z condizentes com a aglicona quercetina, enquanto que o pico 11
apresentou um fragmento com m/z em concordância com a aglicona canferol.
Por outro lado, os picos 13, 15 e 16 apresentaram fragmentos característicos
das agliconas metoxiladas isoramnetina ou tamarixetina, isômeros de posição.
Por meio da análise das diferenças de m/z dos espectros, constatou-se
que todos apresentavam picos com uma diferença de 162 e/ou 142 unidades,
correspondendo a perdas de unidades de hexose e deoxihexose,
respectivamente. Em relação ao pico 8 do cromatograma, esse apresentou um
espectro de massas com fragmentos em 465,1046 ([M+H]+ - 146); 303,0510
([M+H]+ - 162), indicativos da perda de uma deoxihexose seguido de uma
hexose, o que permitiu identifica-lo como quercetina-3-O-rutinosídeo. Esse
composto foi posteriormente isolado e identificado por ressonância magnética
nuclear (RMN) de hidrogênio, confirmando a identidade do flavonoide. Os picos
9 e 10 apresentaram fragmentos e moléculas protonadas com massa quase
idêntica, sendo identificados inicialmente como os isômeros quercetina-3-O-
103
galactosídeo ou quercetina-3-O-glicosídeo. Porém, com base num estudo
acerca de flavonoides de espécies do gênero Ziziphus (PALOWSKA et al.,
2009) quercetina-3-O-galactosídeo apresenta um tR menor em relação ao seu
isômero quercetina-3-O-glicosídeo. Assim, sugere-se que os picos 9 e 10
sejam, respectivamente, quercetina-3-O-galactosídeo e quercetina-3-O-
glicosídeo. O pico 11 do cromatograma, que havia apresentado um espectro no
UV característico de um derivado glicosilado de canferol (IWASHINA;
MATSUMOTO, 2013), exibiu um espectro de massas com fragmentos em
449,1080 ([M+H]+ - 146); 287,0555 ([M+H]+ - 162), indicativos da perda de uma
deoxihexose seguido de uma hexose. Assim, foi identificado como canferol-3-
O-rutinosídeo. Outra possibilidade, de acordo com os dados do MassBank,
seria o canferol-3-O-neohesperidosídeo, porém, de acordo com os dados de
RMN 1H que serão apresentados posteriormente, o deslocamento químico e a
constante de acoplamento do dubleto referente ao hidrogênio de carbono
anomérico da ramnose corroboram para uma ligação glicosídica entre esse
com o carbono 6' da glicose (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003). O pico 13
também apresentou fragmentos sugestivos da perda de uma unidade de
deoxihexose e hexose, sendo identificado como isoramnetina-3-O-rutinosídeo,
podendo também corresponder a seu isômero tamarixetina-3-O-rutinosídeo. Os
picos 15 e 16, por sua vez, são derivados monoglicosilados da isoramnetina ou
tamarixetina, e ambos foram identificados como isoramnetina-3-O-glicosideo ou
tamarixetina-3-O-glicosideo, com base nos dados do MassBank. Porém, por
possuírem tempos de retenção distintos e de acordo com a ordem de eluição
reportada na literatura (SCHIEBER et al., 2002), pode-se sugerir que o pico
15 seja isoramnetina/tamarixetina-3-O-galactosideo, e o pico 16
isoramnetina/tamarixetina-3-O-glicosídeo.
104
Tabela 16 - Dados cromatográficos, espectroscópicos (UV) e de espectrometria de massas dos principais flavonoides encontrados
na fração AcOEt-PLL01.
Identificação Pico tR(min) λmax(nm)* [M+H]+ (m/z) Fragmentos [M+H]+ (m/z) MassBank
Registro no MassBank
Quercetina-3-O-rutinosídeo 8 18,0 257, 266sh, 358 611,1620 465,1046 ([M+H]+ - 146); 303,0510 ([M+H]+ - 162); 147,0446 ([M+H]+ - 156)
611,1593 FIO00588
Quercetina 3-O-galactosídeo 9 20,0 256, 266, 294, 354 465,1039 303,0506 ([M+H]+ - 162) 465,1033 FIO00150
Quercetina 3-O-glicosídeo 10 20,6 256, 261sh, 292sh, 347 465,1042 303,0508 ([M+H]+ - 162); 177,0559 ([M+H]+ - 126 )
465,1073 TY000218
Canferol-3-O-rutinosídeo 11 21,4 264, 291, 344 595,1663 449,1080 ([M+H]+ - 146); 287,0555 ([M+H]+ - 162);
595,1658 FIO00728
Isoramnetina-3-O-rutinosídeo ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo
13 23,8 255, 266sh, 295sh, 354 625,1764 479,1179 ([M+H]+ - 146); 317,0666 ([M+H]+ - 162); 245,1393 ([M+H]+ - 72)
625,1838 PR020050
Isoramnetina-3-O-galactosídeo ou tamarixetina-3-O-galactosídeo
15 26,3 255, 267sh, 278sh, 353 479,1182 317,0657 ([M+H]+ - 162) - -
Isoramnetina-3-O-glicosideo ou tamarixetina3-O-glicosideo
16 27,5 254, 266sh, 297sh, 353 479,1184 317,0658 ([M+H]+ - 162) 479,1349 PR020049
*Dados obtidos na análise por CLAE-UV-DA
105
Figura 12 - Comparação entre os cromatogramas obtidos para a fração AcOEt-
PLL01 nos equipamentos de CLAE-UV-DAD e CLAE-EM-TOF, sob o
comprimento de onda de 340 nm.
A = cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD. B = cromatograma obtido por CLAE-EM-TOF, com os picos de interesse numerados conforme o cromatograma anterior. Fonte: autor
A
8
9
10
11
13
15
16 B
106
Na análise por CLAE-UV-DAD do EHF, fração AcOEt-PLL01 e a fração
BuOH-PLL01, observou-se que os picos com tempo de retenção entre 16 e 25
minutos constituem os flavonoides com maior intensidade de absorção no
espectro de UV, ou seja, os flavonoides majoritários. Portanto, esses são
possíveis candidatos a marcadores químicos (Li et al., 2008) das folhas da
espécie Ziziphus joazeiro Mart.. Conforme será discutido adiante, objetivou-se
isola-los e, por técnicas espectroscópicas, caracteriza-los.
Em resumo, o EHF de Ziziphus joazeiro Mart., de acordo com as análises
por reações clássicas, CCD, CLAE-UV-DAD e CLAE-IES-EM (TOF), possui
ácidos fenólicos, cumarinas, saponinas e flavonoides, principalmente derivados
de quercetina e canferol, tanto na forma livre quanto na forma glicosilada.
Conforme mencionado anteriormente, foi reportado um estudo em que
identificou-se flavonoides e ácidos fenólicos por CLAE-UV-DAD no extrato das
folhas da espécie Ziziphus joazeiro Mart., incluindo rutina, isoquercetina,
quercetina, canferol, ácido cafeíco, ácido clorogênico e ácido elágico (BRITO et
al., 2015). No presente estudo, além de se identificar rutina e isoquercetina por
CLAE-IES-EM (TOF), foram identificados canferol-3-O-rutinosideo (nicotiflorina) e
glicosídeos de isoramnetina ou tamarixetina.
Com relação a outras espécies do gênero Ziziphus, foi reportada a
presença de flavonoides em diferentes partes, incluindo folhas, sementes e frutos.
Os flavonoides pertenciam a diferentes classes, principalmente flavonóis livres e
O-glicosideos de quercetina, mas também flavonas livres, metoxiladas e C-
glicosiladas, além de chalconas (CHENG et al., 2000; GUO et al., 2011;; LI et al.,
2013; MACIUK et al., 2003; NAWWAR et al., 1984; PELOTTO e MARTINEZ,
1993; PAWLOWSKA et al., 2009; ZHANG et al., 2014). Nos estudos que
utilizaram as folhas como material vegetal, os flavonóis predominam, sendo
relatada a presença principalmente de derivados glicosilados de quercetina e, em
menor proporção, de canferol (GUO et al., 2011; MACIUK et al., 2003; NAWWAR
et al., 1984; PELOTTO e MARTINEZ, 1993; ZHANG et al., 2014). Cabe destacar
que, especificamente com EHF de Z. joazeiro Mart., a presença de canferol-3-O-
rutinosideo (nicotiflorina) e dos derivados glicosilados de isoramnetina ou
tamarixetina é descrita pela primeira vez para a espécie neste trabalho.
107
Logo, os flavonóis, principalmente derivados de quercetina, possuem
hegemonia em diferentes partes das espécies de Ziziphus, incluindo as folhas,
sendo o mesmo observado por CCD e CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus
joazeiro Mart..
As saponinas igualmente constituem uma classe de metabólitos
predominante nas espécies do gênero Ziziphus, em que Ziziphus jujuba Mill e sua
variedade, denominada spinosa, se destacam entre os trabalhos publicados sobre
o tema. As primeiras saponinas do gênero, jujubosídeo A e B, dois heterosídeos
triterpênicos com núcleo damarano denominado jujubogenina, foram isoladas das
sementes de Ziziphus jujuba (OTSUKA et al., 1978). Posteriormente, foram
isoladas das sementes dessa espécie novas saponinas derivadas da
jujubogenina, denominadas jujubosídeos D e E, as quais contem uma cadeia
glicídica, ligada ao carbono 3, com 5 e 6 unidades osídicas, respectivamente (YU;
WANG; HU, 2014).
As cumarinas não constituem uma classe amplamente distribuída em
Ziziphus, sendo reportada apenas em Ziziphus rugosa (raízes) a presença de
uma cumarina, a escopoletina (KAENNAKAM et al., 2013). Consequentemente,
as substâncias observadas por CLAE-UV-DAD, com espectro no UV
característico de cumarinas, podem ser úteis como marcadores
quimiotaxonômicos da espécie.
108
6.5 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por
cromatografia em contra-corrente de alta velocidade e isolamento de
flavonoides
Previamente ao uso do equipamento de CCCAV, foram realizados testes
em tubos de ensaio a fim de selecionar sistemas de solventes para serem
utilizados na separação. Primeiramente, de acordo com a literatura, foram
testados sistemas de solventes pertencentes à família acetato de etila-butanol-
água, passando para sistemas contendo hexano-acetato de etila-metanol-água,
hexano-acetato de etila-butanol-água, a sistemas contendo clorofórmio e
acetonitrila. Basicamente, foram realizadas modificações nos denominados
modificadores orgânicos e aquosos desses sistemas, sendo o hexano e butanol
modificadores orgânicos, e o metanol um modificador aquoso. Logo, a função do
hexano seria a de tornar a fase orgânica mais apolar, a do butanol seria a de
torna-la mais polar, enquanto que a do metanol, tornar a fase aquosa mais apolar
(COSTA; LEITÃO, 2010). Foram testados e analisados por CCD 42 sistemas de
solventes, sendo os mais promissores os sistemas contendo acetato de etila-
butanol-água.
Figura 13 - Análise por CCD das fases dos testes em tubos para os sistemas
contendo acetato de etila-butanol-água.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:ácido metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F25. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. S = fase superior; I = fase inferior.
Fonte: autor
109
A partir da figura 13, pode-se observar que o aumento gradativo na
quantidade de butanol promoveu, na fase orgânica (superior), um aumento na
intensidade e quantidade de manchas com Rf < 0,5, ou seja, ocorreu uma maior
distribuição da amostra para a fase orgânica, ao passo em que o contrário
ocorreu para a fase aquosa (inferior). Dentre os sistemas testados, foi escolhido o
sistema 4, contendo AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1, para a realização das separações
1, 4 e 5 por CCCAV em fase reversa (Figuras 14, 15 e 16), pois, aparentemente,
apresentou-se como um sistema com intermediária retenção da amostra. Assim,
foi proposto que o sistema 4 poderia permitir a distribuição gradativa dos
compostos mais polares para a fase aquosa, pois além dos flavonoides
majoritários era de interesse o isolamento de saponinas, que podem estar
relacionadas à atividade antifúngica observada para a fração BuOH-PLL01.
Posteriormente, com base numa consulta na literatura, foi realizado um
fracionamento por CCCAV envolvendo uma mudança de pH no sistema (Figura
15). Na fase orgânica, utilizada como estacionária, foi adicionado ácido fórmico,
enquanto que na fase aquosa, utilizada como fase móvel, foi adicionado amônia.
A função do ácido foi a de promover a retenção dos compostos com base em seu
pKa, e a da base a de promover a eluição desses a medida em que a sua
concentração aumentava na fase móvel (XU; LUO;KONG, 2013). De acordo com
o resultado por CCD, observou-se que o uso da técnica de refinamento por zona
de pH tornou a separação 6 (Figura 17) mais diferenciada e eficiente em relação
às separações 1, 4 e 5 (Figuras 14, 15 e 16), apesar de todas possuírem a fase
aquosa como fase móvel.
Embora tenha ocorrido uma melhora na separação dos compostos, o
rendimento dos flavonoides de interesse foi insatisfatório para a fração BuOH-
PLL01, em torno de 50 mg a cada procedimento. Assim, foi realizada uma nova
separação por CCCAV a partir de 1,5 g da fração AcOEt-PLL01, também
concentrada em flavonoides. Essa nova separação foi denominada CCCAV11
(Figura 18).
110
Figura 14 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV1.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – Reagente Natural A/UV 365 nm.
Numeração: refere-se às frações reunidas Fonte: autor
Figura 15 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV4.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – UV 254 nm; C – Reagente Natural A/UV
365 nm. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor
Figura 16 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV5.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – UV 254 nm; C – Reagente Natural A/UV
365 nm. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor
111
Figura 17 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV6.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – UV 254 nm; C – Reagente Natural A/UV
365 nm. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor
Figura 18 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV11.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – UV 254 nm; C – Reagente Natural A/UV
365 nm. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor
112
A fração 12-CCCAV11, por apresentar um rendimento satisfatório e conter
os flavonoides majoritários observados por CLAE, foi escolhida para dar
continuidade ao processo de isolamento. Assim, essa fração foi submetida a uma
coluna de fase reversa, resultando em 10 frações após a reunião. A fração 08-
CCFR2 foi submetida a uma separação por CLAE semipreparativa, resultando em
4 frações, as quais foram analisadas por CLAE analítica. A fração 02-CLAESP
apresentou dois picos no cromatograma, sendo submetida a um novo processo
de CLAE semipreparativa, utilizando as mesmas condições cromatográficas da
separação anterior. A análise dos espectros de RMN de 1H obtidos, juntamente
com os dados de CLAE e CCD analítica, permitiu concluir a presença de 3
flavonoides semi purificados, nomeados de ZJF1 (3,3 mg), ZJF2 (1,5 mg) e ZJF3
(1,4 mg), além de 2 misturas de flavonoides, nomeadas de ZJFM1 (4,7 mg) e
ZJFM2 (0,9 mg). A mistura ZJFM1 consiste em dois flavonoides, um não
identificado e o outro predominantemente ZJF3, segundo dados de RMN de 1H e
CCD. Enquanto isso, a mistura ZJFM2 consiste em uma combinação dos mesmos
flavonoides, porém com predominância do não identificado, de acordo com a
análise por CCD (Figura 19).
Figura 19 - Análise por CCD dos flavonoides ZJF1, ZJF2, ZJF3 e das misturas
ZJFM1 e ZJFM2.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético:água (100:10:10:26,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: EHF; flavonoides ZJF1
ZJF2 e ZJF3; misturas ZJFM1 e ZJFM2.
113
6.5.1 Análise estrutural do flavonoide ZJF1
O isolado ZJF1, após análise por CCD e revelação com o Reagente
Natural A/UV 365 nm, apresentou uma mancha laranja de valor de Rf 0,55 (figura
19), sugestivo de um flavonoide glicosilado contendo duas hidroxilas adjacentes
no anel B (WAGNER e BLADT, 2001).
Após a análise por CLAE, a substância apresentou um espectro de UV
característico de flavonoide (Figura 20), com 2 máximos de absorção (UV max:
257, 354; figura 23) referentes às bandas I (anel A) e II (anel B), a presença de
bandas IIa e IIb, característica de oxigenação em 3’ e 4’ e um tempo de retenção
de 22,79 min. Assim, sugere-se que a substância seja a princípio um flavonol
3’,4’-dioxigenado com glicosilação em C-3 (MABRY; MARKHAM, THOMAS;
1970). Somando os dados da análise por CCD e UV, essa substância
possivelmente corresponde a um flavonol 3’,4’ dihidroxilado com a posição 3
glicosilada. Além disso, de acordo com a literatura, ZJF1 apresenta um espectro
no UV característico do flavonol quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina) (MABRY;
MARKHAM; THOMAS; 1970; MOURA; VILEGA, SANTOS, 2011).
114
Figura 20 – Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF1.
Ab
so
rbân
cia
(A
U)
Comprimento de onda (nm)
(nm)
Coluna: C8 Waters, 4,6 x 150 mm, 5 µm. Eluente: gradiente de acetonitrila:água (8:92-34:66, v/v). Fluxo: 0,8
mL/min. Tempo: 55 min. Detecção: UV 340 nm. Fonte: autor
115
Para concluir a caracterização, a substância ZJF1 foi analisada por RMN
de 1H (400 MHz, metanol-d4; Figura 22; Tabela 17). Por meio da análise dos
sinais na região dos prótons aromáticos (6-8 ppm) é possível observar, em um
campo mais alto (δH 6-6,5) a presença de dois singletos com deslocamentos
químicos de 6,24 e 6,44 ppm respectivamente, indicativos de hidrogênios nas
posições 6 e 8 do anel A e característico de um padrão de substituição 5,7
dihidroxilado (MABRY, MARKHAM, THOMAS, 1970). Além disso, há a ausência
de um singleto na faixa de δH 6,30 - 6,60, característico de H-3 do anel C, o que
permite inferir que essa posição está substituída. Na região mais desblindada,
devido ao efeito mesomérico retirador de elétrons da carbonila em C4, observa-se
os sinais característicos de hidrogênios do anel B. Inicialmente, observa-se um
dubleto em δH 6,89, indicativo de H5', apresentando acoplamento em orto (J =
8,39 Hz) com o H-6'. Em campo mais baixo, observa-se um duplo dubleto em δH
7,62 e um dubleto em δH 7,89. O duplo dubleto (δH 7,62; J = 1,2; 8,39 Hz) é
indicativo de H-6' devido à presença de acoplamento orto e meta com os
hidrogênios H-5' (orto) e H-2' (meta). O dubleto pode ser atribuído ao H-2' por
apresentar acoplamento meta (J = 1,2 Hz) com o H-6'. Portanto, os sinais
observados na região dos prótons aromáticos corroboram com a possibilidade de
um núcleo flavônico do tipo 5,7,3,4',3' pentasubstituído. Por meio de comparação
com dados da literatura (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003) sugere-se que a
substância ZJF1 seja um flavonol do tipo quercetina (Figura 21).
Figura 21 - Representação estrutural do flavonol quercetina.
OH
OOH
OH O
OH
OH
1'
2'3'
4'
5'
6'
34
1056
8
7
9
2
116
Na análise do espectro em campo mais alto, pode-se observar,
respectivamente, um dubleto e um singleto numa região característica de
hidrogênios de carbono anomérico (MABRY, MARKHAM, THOMAS, 1970). Com
base na literatura, o dubleto apresenta deslocamento químico e constante de
acoplamento característicos de hidrogênio de carbono anomérico de glicose (δH
5,10; J = 7,7 Hz). Enquanto isso, o singleto em δH 4,51 pode ser atribuído ao
hidrogênio de carbono anomérico de ramnose. A presença de um dubleto em
região mais protegida (δH 1,11; J = 6,1 Hz), característico de sinal de metila de
ramnose, corrobora para a presença desse tipo de hexose. Na região entre δH
3,37 - 3,9 também é possível observar sinais sobrepostos referentes a
hidrogênios de açucares. Portanto, com base nos dados espectrais de RMN,
dados espectrais de UV, comparação com dados da literatura e análise por CCD
envolvendo comparação com o padrão comercial de rutina, pode-se concluir que
a substância ZJF1 corresponde a quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina). Além disso,
foi observado na analise por espectrometria de massas um pico com fragmentos
característicos desse flavonoide, corroborando para esse achado.
O flavonol rutina é amplamente distribuído entre as espécies de Ziziphus,
incluindo Ziziphus mauritiana (frutos), Ziziphus spina-christi (folhas e frutos),
Ziziphus jujuba Mill. e Ziziphus jujuba variedade spinosa (folhas e frutos), Ziziphus
lotus (folhas) e Ziziphus mistol (folhas). Embora rutina aparentemente não possua
valor como marcador quimiotaxonômico, esse ainda pode ser utilizado como
marcador analítico para a quantificação de flavonoides totais e no
desenvolvimento e monitorização da eficiência de técnicas extração de
flavonoides, conforme exemplificado no trabalho de Zhang et al. (2014).
117
Tabela 17 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide
ZJF1.
Atribuição δH (ppm); multiplicidade; J (Hz)
ZJF1
rutina (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003)
Aglicona
H-6 6,24 (s) 6,21 (d; 2,0)
H-8 6,44 (s) 6,40 (d; 2,0)
H-5' 6,89 (d; 8,4) 6,87 (d; 8,5)
H-6' 7,62 (dd; 1,2; 8,4) 7,62 (dd; 2,1; 8,5)
H-2' 7,89 (d; 1,2) 7,66 (d; 2,1)
3-glicosil H-1'' 5,09 (d; 7,8) 5,10 (d; 7,7)
6'-ramnosil H-1'' 4,55 (s) 4,51 (d; 1,5)
H-6'' (-CH3) 1,21 (d; 6,2) 1,11 (d; 6,1) s = singleto, d = dubleto, dd = duplo dubleto.
118
H-2’
H-6’H-5’
H-8
H-6
H-1’’
H-1’’’
H-6’’’
O
O
O
O
OOH
OH O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
1'
2'3'
4'
5'
6'
34
1056
8
7
9
1''
2''
3''4''
5''
6''1'''
2'''3'''
4'''
5'''
6'''
2
Figura 22 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF1 (400 MHz, metanol-d4).
Fonte: autor
119
6.5.2 Análise estrutural do flavonoide ZJF2
A análise por CCD desse flavonoide evidenciou uma mancha de valor de
Rf 0,62, indicativo da presença de açúcar conjugado à molécula, conforme a
polaridade da fase móvel utilizada. Após a revelação com o Reagente Natural A e
visualização sob luz UV a 365 nm, a mancha apresentou coloração verde (Figura
19), que sugere tratar-se de um flavonoide com núcleo 4’ hidroxilado (WAGNER e
BLADT, 2001).
Na análise por CLAE, foi observado um tempo de retenção de 28,1 min e
um espectro no UV com máximos de absorção característicos (UV max: 266, 345)
de uma flavona ou flavonol substituido em C-3 (Figura 23). A presença de uma
única banda II e de um ombro entre 280 e 310 nm é indicativo de um núcleo com
hidroxilação em C-4’ e C-7, porém não em C-3’, possibilidade essa corroborada
pelo aspecto da mancha na CCD e devido ao deslocamento hipsocrômico da
banda I em relação à substância ZJF1. Uma vez que flavonas com hidroxilação
em C-4’, como apigenina, apresentam um máximo de absorção da banda II menor
que 340 nm, sugere-se que ZJF2 possua oxigenação em C-3 (MABRY;
MARKHAM, THOMAS; 1970). Associando os dados de UV com o comportamento
cromatográfico da amostra, essa substância possivelmente corresponde a um
flavonol com ausência de hidroxilação em C-3’ e com glicosilação em C-3. A
comparação dos dados espectrais no UV desse flavonoide com a literatura
(IWASHINA; MATSUMOTO, 2013) sugere tratar-se do canferol-3-O-rutinosídeo.
120
Figura 23 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF
Comprimento de onda (nm)
Coluna: C8 Waters, 4,6 x 150 mm, 5 µm. Eluente: gradiente de acetonitrila:água (8:92-34:66, v/v). Fluxo: 0,8
mL/min. Tempo: 55 min. Detecção: UV 340 nm.. Fonte: autor. A
bs
orb
ân
cia
(A
U)
121
O espectro de RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) apresentou sinais
característicos de núcleo flavonoídico na região dos hidrogênios aromáticos
(Tabela 18 e Figura 24). Pode-se observar sinais correspondentes aos
hidrogênios 6 (δH 6,23; d, J = 1,6 Hz) e 8 (δH 6,43; s) do anel A e sugestivos de
um padrão de substituição 5,7 dihidroxilado. A ausência de sinal referente ao H-3
permite sugerir substituição em C-3. Em campo mais baixo, na região dos
hidrogênios do anel B (δH 6,5 – 8), é evidente a presença de um par de dubletos
em δH 6,11 e δH 8,11, ambos com acoplamento em orto (J = 8,7 Hz),
característico de um anel aromático para-disubstituído. No caso de flavonoides,
esse comportamento é típico de um anel B oxigenado em C-4’, em que o dubleto
na região mais blindada corresponde aos hidrogênios H-3 e H-5’, devido ao efeito
mesomérico protetor da hidroxila livre em C4’, enquanto que o dubleto em campo
mais baixo corresponde aos hidrogênios H-2’ e H-6’, estando mais desprotegidos
devido ao efeito mesomérico da carbonila em C4 (MABRY; MARKHAM,
THOMAS; 1970).
Em campo mais alto, é evidente a presença de dois sinais de hidrogênio de
carbono anomérico, o primeiro sendo um dubleto (δH 5,05; J = 7,8 Hz), que pode
ser atribuído ao hidrogênio H-1’’ de uma molécula de glicose e o segundo um
singleto em δH 4,54, que se pode atribuir ao hidrogênio H-1’’’ de uma molécula de
ramnose Também foi observado um intenso dubleto em região mais protegida (δH
1,20; J = 6,2 Hz), que corresponde ao radical metila da ramnose.
Baseado nos dados espectrais de UV e RMN de 1H do presente estudo e
da literatura, além do resultado observado na análise da fração AcOEt-PLL01 por
espectrometria de massas, sugere-se que ZJF2 seja canferol-3-O-rutinosídeo,
denominado nicotiflorina, o qual foi previamente identificado nos frutos de Z.
jujuba e Z. spina-christi (PAWLOWSKA et al., 2009) porém nunca foi antes
reportado na literatura para a espécie Z. joazeiro Mart..
O flavonoide nicotiflorina foi identificado em Z. jujuba Mill. var. spinosa. De
acordo com pesquisa na base de dados Scifinder, há 12 registros da presença
desse flavonoide em espécies do gênero. Logo, observa-se que a sua distribuição
entre as espécies é mais limitada em relação ao flavonol rutina, sendo portanto
um possível candidato a marcador quimiotaxonômico.
122
Tabela 18 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide ZJF2.
Atribuição δH (ppm); multiplicidade; J (Hz)
ZJF2
Nicotiflorina (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003)1
Aglicona
H-6 6,23 (d; 1,6) 6,21 (d; 1,8)
H-8 6,43 (s) 6,40 (d; 1,8)
H-5' 6,91 (d; 8,7) 6,89 (d; 9,0)
H-3' 6,91 (d; 8,7) 6,89 (d; 9,0)
H-6' 8,11 (d; 8,7) 8,05 (d; 9,0)
H-2' 8,11 (d; 8,7) 8,05 (d; 9,0)
3-glicosil H-1'' 5,05 (d; 7,8) 5,12 (d; 7,3)
6''-ramnosil
H-1'' 4,54 (s) 4,51 (d; 1,5)
H-6'' (-CH3) 1,20 (d; 6,2) 1,11 (d; 6,2) 1 400 MHz, CD3OD
123
H-2’/H-6’ H-3’/5’
H-8
H-6
H-1’’
H-1’’’
H-6’’’
O
O
O
O
OOH
OH O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
1'
2'3'
4'
5'
6'
34
1056
8
7
9
1''
2''
3''4''
5''
6''1'''
2'''3'''
4'''
5'''
6'''
2
Figura 24 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF2 (400 MHz, metanol-d4).
Fonte: autor
124
6.5.3 Análise estrutural do flavonoide ZJF3
Após a análise por CCD e detecção com o Reagente Natural A/UV 365 nm,
a substância ZJF3 apresentou uma mancha verde e de mesmo valor de Rf 0,62
(Figura 19) que o flavonoide ZJF2. Logo, ZJF3 possivelmente apresenta um
núcleo com hidroxilação em C-3’ ou C-4’ (WAGNER e BLADT, 2001).
A análise por CLAE revelou um pico com tempo de retenção de 29,99 min
e máximos de absorção no espectro de UV (UV max : 255 e 354) característicos
de um flavonol substituído em C-3 (Figura 26). A presença de uma banda II
duplicada indica uma maior oxigenação no anel B, sendo seu espectro compatível
com o do flavonoide rutina (MABRY; MARKHAM; THOMAS; 1970; MOURA;
VILEGA, SANTOS, 2011). Porém, com base no resultado da CCD, esse
flavonoide apresenta um anel B monohidroxilado e não dihidroxilado como o do
flavonol rutina. Uma hipótese seria a de que haveria outro substituinte oxigenado,
que não uma hidroxila, ligado nas posições C-3’ ou C-4’. Segundo Wagner e Bladt
(2001), um possível núcleo flavonoídico que apresenta fluorescência verde após
detecção com Reagente Natural A/UV 365 nm, além de um anel B dissubstituído
e monohidroxilado, seria quercetina-3’-metil éter ou isoramnetina. Seu
diglicosídeo, isoramentina-3-O-rutinosídeo, apresenta fluorescência verde e valor
de Rf próximo ao do flavonoide rutina.
O espectro de RMN de 1H de ZJF3 (400 MHz, metanol-d4) apresentou
semelhança com o espectro do flavonoide ZJF1 (Figura 27 e Tabela 19). É
possível observar dois dubletos com acoplamento meta, relativos aos hidrogênios
6 (δH 6,23; J = 1,8 Hz) e 8 (δH 6,44; J = 1,4 Hz) do anel A e a ausência de sinal
referente ao hidrogênio 3 do anel C. Em campo mais baixo, observa-se os sinais
relativos aos hidrogênios do anel B, com um dubleto com acoplamento orto em δH
6,93 (J = 8,4 Hz), característico de H-5’, um duplo dubleto (acoplamento orto e
meta) característico de H-6’ em δH 7,62 (J = 1,7; 8,4 Hz) e em δH 8,05 um dubleto
com acoplamento meta (J = 1,8 Hz) o qual pode ser atribuído ao H-2’.
Em campo mais alto, observa-se a presença de dois sinais de hidrogênio
de carbono anomérico. O primeiro é um dubleto (δH 5,25; J = 7,8 Hz), indicativo
de H-1’’ de uma molécula de glicose e o segundo um dubleto em δH 4,55 (J = 1,0
Hz), indicativo de H-1’’’ de uma molécula de ramnose. A presença de um intenso
125
dubleto em região mais protegida (δH 1,19; J = 6,2 Hz) e com integração para 3
hidrogênios corrobora para a presença desse açúcar.
Com base nos dados espectrais de UV e de RMN de 1H, é possível sugerir
que ZJF3 possua um núcleo do tipo quercetina, com substituição em C-3 por uma
rutinose. Porém, no espectro de RMN de 1H, ainda há a presença de um singleto
intenso em δH 3,99 com integração para 3 hidrogênios, sugestivo de um radical
metoxila, o qual pode estar substituindo um hidrogênio nas posições 5, 7, 3’ ou 4’.
Uma vez que o flavonoide, após análise por CCD, apresentou fluorescência
verde, característico de um anel B monohidroxilado, um espectro de UV sugestivo
de um padrão de oxigenação em C-3’ e C-4’ e devido à ausência de sinais
referentes aos hidrogênios 3’ e 4’, é reforçada a hipótese de que há outro
substituinte oxigenado em algumas dessas posições. Neste caso, baseado nos
dados de RMN de 1H, esse substituinte seria uma metoxila, a qual estaria ligada
aos carbonos 3’ ou 4’ do anel B, de modo a preservar uma hidroxila livre em uma
dessas posições e a consequentemente permitir o surgimento de fluorescência
verde após detecção com Reagente Natural A/UV 365 nm. Portanto, com base
nos dados do presente estudo e em comparação com os da literatura, sugere-se
que ZJF3 corresponda ao flavonoide isoramnetina-3-O-rutinosídeo ou a seu
isômero de posição, tamarixetina-3-O-rutinosídeo, ambos inéditos para a espécie
(Figura 25). A confirmação da posição da metoxila poderia ser realizada com base
em um espectro bidimensional de HMBC, porém, devido a pouca quantidade de
amostra, foi possível apenas a realização de um espectro monodimensional de
1H.
Em pesquisa realizada na base de dados SciFinder® há apenas um estudo
que relata a presença de isoramnetina-3-O-rutinosídeo no gênero Ziziphus, ainda
que por meio de técnicas com menor poder preditivo, como cromatografia em
papel e espectroscopia no UV (PELOTTO e MARTINEZ, 1993). Em contrapartida,
para o isômero tamarixetina-3-O-rutinosídeo, não há qualquer relato para o
gênero. Portanto, ambas as possibilidades estruturais são candidatas a
marcadores quimiotaxônomicos da espécie Ziziphus joazeiro Mart..
126
Figura 25 - Possibilidades estruturais para o flavonoide ZJF3.
isoramnetina-3-O-rutinosídeo tamarixetina-3-O-rutinosídeo
127
Tabela 19 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide ZJF3 e literatura
1BENAHMED et al., 2014; 300 MHz, DMSO-d6
2HARPUT; SARACOĞLU; OGIHARA, 2004; 500 MHz, CD3OD
3XU et al., 2011; 400 MHz, DMSO-d6
Atribuição Atribuição
δH (ppm); multiplicidade; J (Hz)
ZJF3 isoramnetina-3-O-
rutinosídeo1 isoramnetina -3-O-
rutinosídeo2 tamarixetina-3-O-
rutinosídeo3
Aglicona H-6 6,23 (d; 1,8) 6,20 (d; 1,7) 6,11 (d) 6,22 (d; 1,5)
H-8 6,44 (d; 1,4) 6,43 (d; 1,7) 6,28 6,43 (d; 1,5)
H-5' 6,93 (d; 8,7) 6,5 (d; 8,5) 6,89 (d; 8,5) 7,03 (d; 8,5)
H-6' 7,62 (dd; 1,7; 8,4) 7,53 (dd; 1,7; 8,5) 7,63 (dd; 1,8; 8,5) 7,71 (dd; 1,8; 8,5)
H-2' 8,05 (d; 1,8) 7,86 (d; 1,7) 7,94 (d; 1,8) 7,50 (d; 1,8)
3' ou 4 ' -OCH3 3,99 (s) 3,83 (s) 3,94 (s) 3,85 (s)
3-glicosil H-1'' 5,25 (d; 7,8) 5,45 (d; 7,2) 5,14 (d; 7,3) 5,37 (d; 7,0)
6''-ramnosil H-1''' 4,54 (d; 1,0) 4,41 (s) 4,52 (d; 1,8) 4,40 (s)
H-6''' (-CH3) 1,19 (d; 6,2) 0,98 (d; 6,0) 1,12 (d; 6,1) 0,98 (d; 6,0)
128
Figura 26 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF3.
Comprimento de onda (nm)
Ab
so
rbân
cia
(A
U)
Coluna: C8 Waters, 4,6 x 150 mm, 5 µm. Eluente: gradiente de acetonitrila:água (8:92-34:66, v/v). Fluxo: 0,8 mL/min. Tempo: 55 min. Detecção: UV 340 nm. Fonte: autor
129
H-2’
H-6’H-5’
H-8
H-6
H-1’’
H-1’’’
H-6’’’3’ ou 4’ O-CH3
Figura 27 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF3 (400 MHz, metanol-d4)
Fonte: autor
130
6.6 Avaliação da atividade anti-Candida do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. e
frações
6.6.1 Atividade do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. frente a cepas de referência
Inicialmente, foi realizada uma triagem da atividade anti-Candida do EHF de
Ziziphus joazeiro Mart. por meio da determinação da concentração inibitória mínima
(CIM). O ensaio foi executado frente a 7 cepas de referência do gênero Candida e
uma de Trichosporon asahii. Após o ensaio, observou-se que o EHF, na
concentração de 5 mg/mL, foi capaz de inibir o crescimento de quatro leveduras: C.
albicans, C. dubliniensis, C. glabrata e C. rugosa (Tabela 20).
Tabela 20 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z. joazeiro
Mart. frente a cepas de referência de leveduras de importância clínica.
Cepas de referência CIM
(mg/mL)
Candida albicans ATCC90028 5
Candida tropicalis ATCC13803 +*
Candida dubliniensis CBS7987 5
Candida parapsilosis ATCC22019 +
Candida glabrata ATCC2001 5
Candida krusei ATCC6258 +
Candida rugosa ATCC10571 5
Trichosporon asahii CBS 2630 + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)
Em estudos anteriores, o infuso e uma fração butanólica concentrada em
saponinas, obtidos da casca do caule de Ziziphus joazeiro Mart., apresentaram
atividade frente a uma gama de espécies fúngicas, incluindo C. albicans, C.
guilliermondii, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum, Fonsecaea pedrosoi
e Aspergillus niger (CRUZ et al., 2007; RIBEIRO et al., 2013). Foi reportada uma
CIM de 25 µg/mL para o infuso da casca frente a C. albicans ATCC18804 (CRUZ et
al., 2007) e uma CIM de 156 µg/mL para a fração butanólica frente a C. albicans
ATCC10231.
Entretanto, o extrato aquoso das folhas, assim como o seu extrato
hidroetanólico, não apresentaram atividade em ensaios de difusão em ágar e
microdiluição frente a C. albicans, C. guilliermondii, C. krusei, C. tropicalis, C.
131
neoformans, T. rubrum e F. pedrosoi (BRITO et al., 2014; CRUZ et al., 2007; MELO
et al., 2012).
De acordo com a literatura etnobotânica, as cascas de Ziziphus joazeiro Mart.
são amplamente utilizadas pela população do Nordeste na limpeza dos dentes e
cabelos, fato que está associado à presença de saponinas, as quais possuem
caráter tensoativo. Para as folhas, também há dados acerca do seu uso
etnobotânico para as mesmas finalidades, assim como relatos da presença de
saponinas (CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010; LORENZI; MATOS, 2008;
OLIVEIRA et al., 2005).
As saponinas são substâncias anfifílicas, amplamente conhecidas por sua
ação desestabilizante sobre membranas biológicas, além de apresentarem atividade
antifúngica in vitro frente a diferentes cepas, incluindo espécies do gênero Candida
(AUGUSTIN et al., 2011; SPARG, S. G.; LIGHT, M. E.; STADEN, 2004). A exemplo
disso, saponinas esteroidais apresentaram atividade frente a C. albicans, C.
glabrata, C. krusei, Cryptococcus neoformans e Apergillus fumigatus, com CIM de 2
µg/mL frente a C. albicans e 0,4 µg/mL frente a C. neoformans (YANG et al., 2006)
Portanto, é provável que a atividade antifúngica observada para os extratos da
casca, nos estudos de CRUZ et al. (2007) e RIBEIRO et al. (2013) seja decorrente
da presença de saponinas. Por sua vez, para as folhas, que também apresentam
saponinas, não foi observada atividade segundo os critérios estabelecidos nos
estudos citados. Logo, uma hipótese que poderia explicar esse resultado é de que
as folhas apresentam saponinas, porém em um baixo teor quando comparado às
cascas.
Segundo Ríos e Recio (2005), durante a busca por extratos com atividade
antimicrobiana, deve-se evitar experimentos nos quais sejam utilizadas
concentrações maiores que 1 mg/mL. O estudo de BRITO et al. (2015), adotou o
mesmo critério para desconsiderar a atividade antifúngica do extrato hidroetanólico
das folhas de Z. joazeiro Mart. No presente estudo, essa concentração foi
extrapolada 5 vezes em relação ao recomendado por publicações anteriores. No
entanto, se o objetivo da investigação for o isolamento ou obtenção de frações
enriquecidas, deve-se atentar para a possibilidade de que as substâncias com
potencial antimicrobiano podem estar em baixa concentração no extrato, numa
quantidade insuficiente para ser detectada pelos ensaios, ou que há efeito
antagônico entre elas. Outra hipótese a ser considerada é a de que as substâncias
132
atuam sinergicamente e estão em quantidade insuficiente para eliciar um efeito
antimicrobiano. Porém, caso seja verdadeira, é possível que a atividade
antimicrobiana continue a não ser detectada após a realização de um fracionamento.
6.6.2 Atividade das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01
e RA-PLL01 frente a cepas de referência
Em vista disso, prosseguiu-se o fracionamento do extrato por meio de uma
partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente, obtendo-se as
frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01 e RA-PLL01. A
partir da determinação da CIM (Tabela 21), observou-se que as cepas inibidas por
um maior número de frações foram Candida albicans, C. glabrata e C. rugosa. Com
relação à atividade das frações, a fração CH2Cl2-PLL01 foi a que inibiu o maior
número de leveduras, sendo ativa contra cepas de referência de 5 espécies. Porém,
a fração BuOH-PLL01 destacou-se por apresentar a menor CIM, frente à cepa de C.
glabrata ATCC2001, numa concentração de 0,625 mg/mL (Tabela 16). Para verificar
a reprodutibilidade desse resultado, o teste da fração butanólica frente a C. glabrata
ATCC2001 foi novamente realizado, em duplicata, sendo observado o mesmo valor
de CIM.
Tabela 21 - CIM das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01
e RA-PLL01 frente a cepas de Candida.
Cepas de referência CIM (mg/mL)
EP-
PLL01 CH2Cl2-PLL01
AcOEt-PLL01
BuOH-PLL01
RA-PLL01
Candida albicans ATCC90028 +* 5 5 5 +
Candida tropicalis ATCC13803 + + + + +
Candida dubliniensis CBS7987 + + + + +
Candida parapsilosis ATCC22019 + + + + +
Candida glabrata ATCC2001 5 5 5 0,625 +
Candida krusei ATCC6258 + 5 + + +
Candida rugosa ATCC10571 + 5 5 5 +
Trichosporon asahii CBS 2630 + 5 + + + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)
A partir desses resultados, é possível propor que a quantidade de substâncias
antifúngicas no EHF esteja numa concentração insuficiente para causar um efeito
133
semelhante ao observado para os extratos da casca. É plausível considerar que,
para a cepa de C. glabrata, o processo de partição líquido-líquido permitiu obter uma
fração (BuOH-PLL01) mais concentrada nas substâncias antifúngicas. Porém, dado
que não foi realizado a quantificação desses componentes, nem a comparação da
atividade entre cascas e folhas, não há evidências para, neste momento, comprovar
essa hipótese. Ainda assim, supondo que a hipótese da baixa concentração é
verdadeira, a fração BuOH-PLL01 foi selecionada para dar continuidade ao
fracionamento, a fim de isolar as substâncias com atividade anti-Candida.
É importante mencionar que se a cepa de C. glabrata não fosse inibida pela
fração BuOH-PLL01 e caso fosse levado em consideração os critérios de Ríos e
Recio (2005), o fracionamento não teria prosseguido. Portanto, é de fundamental
importância que, para uma triagem de atividade antimicrobiana, sejam incluídas uma
grande variedade de cepas. Além disso, conforme será evidenciado nos próximos
parágrafos, é importante aliar a esses resultados dados de análise fitoquímica das
amostras, de modo que permita a criação de hipóteses que possam direcionar o
estudo.
6.6.3 Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOH-PLL01
Conforme mencionado anteriormente, é de amplo conhecimento que as
saponinas apresentam atividade antimicrobiana por possuírem a habilidade de
desestabilizar a membrana plasmática de células (SPARG, S. G.; LIGHT, M. E.;
STADEN, 2004). Além disso, são frequentemente concentradas na fração butanólica
após um procedimento de partição líquido-líquido, a exemplo do estudo de Ribeiro et
al. (2013). Uma vez que foi detectada a presença de saponinas na fração BuOH-
PLL01, após o teste de formação de espuma em tubo de ensaio, e com base nas
propriedades das saponinas expostas anteriormente, hipotetizou-se que essas
seriam as substâncias responsáveis pela atividade da fração frente à levedura C.
glabrata. Além disso, foi hipotetizado que essas corresponderiam às manchas azuis
de elevada polaridade observadas na placa de CCD após revelação com vanilina
sulfúrica. É importante destacar que essas mesmas manchas apresentaram
fluorescência azul quando visualizadas, previamente à revelação, sob luz UV a 365
nm, comportamento característico de cumarinas. Assim, é possível que as manchas
azuis estejam coeluindo com esses compostos fenólicos, os quais também podem
134
apresentar atividade antifúngica (KUMAR; SAHA; SAHA, 2012; MARCONDES et al.,
2015).
Com base nessas hipóteses, objetivou-se obter frações concentradas nessas
manchas por meio de técnicas cromatográficas, para posteriormente serem testadas
biologicamente. Durante o estágio na Universidade Nacional de Colombia, foram
obtidas, a partir da fração BuOH-PLL01, frações concentradas nessas manchas, por
meio da técnica de cromatografia em contra-corrente de alta velocidade aliada ao
refinamento por zona de pH (CCCAV-pH). Essas frações foram posteriormente
purificadas em cromatografia de fase reversa do tipo C18.
O restante da fração BuOH-PLL01 (25 g), não utilizado em sua totalidade no
estágio no exterior, também foi submetido a um fracionamento a fim de isolar as
substâncias bioativas em quantidade suficiente para os ensaios biológicos. A partir
de dois processos de partição líquido-líquido foram obtidas as seguintes frações:
Fração 01-PLL02
Fração 03-PLL02
Fração 01-PLL03
Fração 02-PLL03
As frações oriundas das separações 7 e 9 por CCCAV, além das frações da
partição líquido da fração BuOH-PLL01, mencionadas anteriormente, foram testadas
frente à cepa ATCC2001 de C. glabrata pelo método de microdiluição em caldo
aliado ao método de bioautografia por revestimento de ágar, ou em inglês, agar-
overlay bioautography.
Após a realização do teste de microdiluição em caldo, observou-se que as
frações mais ativas foram aquelas que passaram por um processo de concentração
das substâncias que se apresentam como manchas azuis na CCD, após revelação
com vanilina sulfúrica. Assim, as amostras mais ativas foram as frações 09-CCFR05
e 07-CCFR07, oriundas inicialmente de frações da CCCAV-pH, além da fração
Fração 02-PLL03, a qual foi purificada por meio de partições líquido-líquido da
fração BuOH-PLL01. O teste foi realizado em duplicata e os resultados, expressos
como média e desvio padrão das réplicas, encontram-se na Tabela 22.
135
Tabela 22 - CIM de frações da fração BuOH-PLL01 frente à levedura Candida
glabrata ATCC 2001.
Amostras CIM (mg/mL)*
Fração 01-PLL02 +**
Fração 01-PLL03 +
Fração 03-PLL02 0,313 ± 0
Fração 02-PLL03 0,156 ± 0
Fração 07-CCFR07 0,117 ± 0,055
Fração 09-CCFR05 0,078 ± 0 * Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2) ** Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada
Figura 28 - Ensaio de microdiluição em caldo para as frações da fração BuOH-
PLL01.
A = Fração 01-PLL02. B = Fração 01-PLL03. C = Fração 03-PLL02. D = Fração 02-PLL03. F = Fração 07-CCFR07. G = Fração 09-CCFR05. Coluna 1 = Controle de esterilidade da amostra.
Coluna 2 – 9 = diluição seriada. Coluna 10, 11 e 12 = controle de viabilidade do inóculo, controle de viabilidade na presença de DMSO, controle de esterilidade do meio. Fonte: autor.
136
6.6.4 Ensaio de bioautografia para o EHF, fração BuOH-PLL01 e respectivas
subfrações ativas
Com o objetivo de corroborar os resultados observados no ensaio de
microdiluição em caldo e verificar a hipótese de que as manchas azuis tem relação
com a atividade anti-Candida, realizou-se o teste de bioautografia por revestimento
de ágar em duplicata, testando o EHF, fração BuOH-PLL01 e suas respectivas
subfrações.
A técnica de bioautografia é de grande utilidade no processo de
fracionamento biomonitorado, pois apresenta as vantagens da cromatografia em
camada delgada convencional, como baixo custo, capacidade de analisar várias
amostras simultaneamente, além de pouca quantidade de amostra necessária, ao
mesmo tempo em que se observa a atividade biológica em função da separação
promovida pela cromatografia (DEWANJEE et al., 2015).
Após a realização da bioautografia, observou-se a formação de halos de
inibição em torno da região correspondente às manchas azuis presentes, após
revelação com vanilina sulfúrica, no EHF, fração BuOH-PLL01 e frações
provenientes dessa. Observa-se que o EHF, na duplicata 1, apresentou um halo de
inibição discreto na região onde essas manchas surgem. Pode-se observar,
visualmente (Figura 29 e 30) e com base nos resultados quantitativos (Tabela 23),
que as sub-frações 09-CCFR07 e 07-CCFR07, mais concentradas nas substâncias
hipoteticamente bioativas, apresentaram um maior halo de inibição em relação às
frações menos purificadas provenientes da partição da fração BuOH-PLL01. Além
disso, a fração BuOH-PLL01 apresentou um maior halo de inibição em relação ao
EHF de Z. joazeiro Mart. Assim, conclui-se que à medida que a amostra torna-se
mais concentrada nessas substâncias, ocorre um aumento do halo de inibição,
resultado em concordância com o observado no ensaio de microdiluição em caldo.
Outro resultado relevante é a seletividade observada para a fração BuOH-
PLL01 frente a C. glabrata, uma importante espécie de Candida não-Candida
albicans, a qual é a segunda mais reportada nos estudos de infecções invasivas em
países da América do Norte e Europa (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014), além de
apresentar menor suscetibilidade intrínseca ao azólicos e isolados clínicos
resistentes a caspofungina, micafungina e anfotericina B já reportados
(ALEXANDER et al., 2013; CHO et al., 2014). Uma característica que difere C.
137
glabrata das demais espécies é a sua incapacidade de formar hifas (SUDBERY,
2011). Consequentemente, a ausência de algum componente, expresso apenas nas
espécies portadoras de genes associados ao estágio de hifa, pode ser a causa da
sua maior susceptibilidade a fração BuOH-PLL01 em relação às demais cepas
testadas.
Figura 29 - Bioautografia e análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e da fração
BuOH-PLL01.
Eluente: acetato de etila:ácidofórmico:metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Amostras: E - EHF, 200 µg; BuOH – fração BuOH-PLL01, 200 µg. A: réplica 1 da
bioautografia. B: réplica 2 da bioautografia. C: vanilina sulfúrica/aquecimento. D: UV 365 nm. E: Reagente Natural A/UV 365 nm. Fonte: autor.
138
Figura 30 - Bioautografia e análise por CCD das subfrações da fração BuOH-PLL01.
Eluente: acetato de etila:ácidofórmico:metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Amostras: 1 – fração 03-PLL02, 100 µg; 2 – fração 02-PLL03, 100 µg; 3 – fração 09-
CCFR05, 100 µg; 4 – fração 07-CCFR07, 100 µg; 5 – fração 01-PLL02, 100 µg; 6 – 01-PLL03, 100 µg. A: réplica 1 da bioautografia. B: réplica 2 da bioautografia. C: vanilina sulfúrica/ aquecimento. D:
UV 365 nm. E: Reagente Natural A/UV 365 nm. Fonte: autor.
Tabela 23 - Estatística descritiva das áreas relativas aos halos de inibição
observados após o teste de bioautografia.
Amostras Média (pixel2) DPa CVb
EHF* 2024,00 2862,37 141,42
Fração BuOH-PLL01 26624,50 289,21 1,09
Fração 03-PLL02 ** 2704,00 3824,03 141,42
Fração 02-PLL03 10978,00 248,90 2,27
Fração 09-CCFR05 32890,00 9927,78 30,18
Fração 07-CCFR07 32345,00 4569,32 14,13 a: desvio padrão da duplicata b: coeficiente de variação da duplicata * 200 µg de amostra para extrato e fração butanólica ** 100 µg de amostra para as frações da fração butanólica
1 – fração 03-PLL02, 100 µg;
2 – fração 02-PLL03, 100 µg;
3 – fração 09-CCFR05, 100 µg;
4 – fração 07-CCFR07, 100 µg;
5 – fração 01-PLL02, 100 µg;
6 – fração 01-PLL03, 100 µg.
139
6.6.5 Avaliação da atividade antifúngica das frações 07-CCFR07 e 10-CCFR12
frente a cepas de referência segundo o método do CLSI
Após obter evidências de que as referidas manchas azuis, observadas na
CCD, causam a inibição do crescimento de C. glabrata ATCC2001, foi realizado um
fracionamento da fração 02-PLL03, por diferentes processos cromatográficos, a fim
de isolar essas substâncias bioativas. Desse processo, não foi possível obter
substâncias isoladas em quantidade suficiente para a realização de testes
biológicos, porém foi possível obter uma fração, que se apresentou como uma única
mancha azul após análise por CCD e revelação com vanilina sulfúrica, com pureza e
quantidade suficiente para análises estruturais por ressonância magnética nuclear
(RMN). Conforme será descrito na seção posterior, foram realizadas análises por
RMN monodimensional e bidimensional, que possibilitaram a identificação de uma
saponina com núcleo damarano, equivalente ao da jujubogenina. Detalhes da
elucidação estrutural são apresentados no item 6.7. Assim, esse resultado corrobora
com a hipótese de que as manchas azuis são saponinas.
Além disso, a partir desse fracionamento, foram obtidas frações concentradas
em manchas que apresentam cor amarela na CCD, após revelação com vanilina
sulfúrica, e fluorescência azul sob visualização com luz UV a 365 nm, característico
de cumarinas.
A partir da fração 07-CCFR07, enriquecida em saponinas e de rendimento
satisfatório, e da fração 10-CCFR12, concentrada nas hipotéticas cumarinas, foi
realizado um novo teste de microdiluição em caldo RPMI-1640, utilizando um leque
maior de microorganismos. As amostras foram testadas frente às 8 cepas de
referência de Candida spp e T. asahii., com o objetivo de averiguar se a atividade da
fração 07-CCFR07 se estenderia para as outras cepas, ao mesmo tempo em que se
avaliaria a possibilidade de as hipotéticas cumarinas também contribuírem para o
efeito antifúngico.
A fração 10-CCFR12, dentro do intervalo de concentração e do critério para a
determinação da CIM utilizados, não foi capaz de inibir qualquer uma das 8 cepas de
referência. Por outro lado, a fração 07-CCFR07, além de inibir o crescimento de C.
glabrata, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans, C. dubliniensis, C.
parapsilosis, C. rugosa e T. asahii com baixas CIMs. A média da CIM para C.
albicans e C. glabrata foi equivalente (94 µg/mL), assim como entre C. dubliniensis e
140
C. parapsilosis (CIM = 188 µg/mL), e entre C. rugosa e T. asahii (CIM = 125 µg/mL)
(Tabela 24; Figura 31)
Após a observação da CIM, a concentração fungicida mínima (CFM) foi
determinada por meio do repique em ASD do conteúdo dos poços que não
apresentaram crescimento visível. As cepas de Candida rugosa ATCC10571 e
Trichosporon asahii CBS2630 apresentaram CFM correspondente a CIM, o que
significa dizer que a concentração de 125 µg/mL apresentou efeito fungicida frente a
essas duas cepas. Em contrapartida, para C. albicans ATCC90028, C. dubliniensis
CBS7987, C. parapsilosis ATCC22019 e C. glabrata ATCC2001, a CIM apenas foi
capaz de apresentar efeito fungistático, porém em concentrações superiores
apresentou efeito fungicida.
Tabela 24 - CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de Candida.
Cepas de referência CIM (mg/mL)* CFM (mg/mL)*
Candida albicans ATCC90028 0,094±0,044 0,3125±0,265
Candida tropicalis ATCC13803 +** +
Candida dubliniensis CBS7987 0,188±0,088 0,5±0
Candida parapsilosis ATCC22019 0,188±0,088 +
Candida glabrata ATCC2001 0,094±0,044 0,125±0
Candida krusei ATCC6258 + +
Candida rugosa ATCC0571 0,125±0 0,125±0
Trichosporon asahii CBS2630 0,125±0 0,125±0 * Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2) **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada
141
Figura 31 - Ensaio de microdiluição em caldo para a fração 07-CCFR07.
A =. Candida albicans. B = C. tropicalis. C = C. dubliniensis. D = C. parapsilosis . E = C. glabrata. F = C. krusei. G = C. rugosa. H = Trichosporon asahii. Coluna 1 = Controle de esterilidade da amostra.
Coluna 2 – 9 = diluição da amostra. Coluna 10, 11 e 12 = controle de viabilidade do inóculo, controle de viabilidade na presença de DMSO, controle de esterilidade do meio. Fonte: autor.
Duplicata 1
Duplicata 2
142
Figura 32 - Ensaio de concentração fungicida mínima realizado para a fração 07-
CCFR07.
1 = duplicata 1. 2 = duplicata 2. A = Candida albicans. C = C. dubliniensis. D = C. parapsilosis . E = C. glabrata. G = C. rugosa. H = Trichosporon asahii. Numeração de 2 a 6 indica os possos que não
apresentaram creacimento visível. Número 10 = controle de viabilidade do inoculo. CN = controle negativo. Fonte: autor.
143
Na literatura, há estudos que demonstram a capacidade de extratos vegetais
e substâncias isoladas, como saponinas, em inibir a transição morfológica de
Candida albicans de blastoconídio para hifa verdadeira, um importante fator de
virulência desta espécie (CHEVALIER.; MEDIONI; PRÊCHEUR, 2012;
LAURENÇON et al., 2013; SILVA-ROCHA et al., 2015). Baseado nisso, foi realizada
uma análise por microscopia óptica do conteúdo dos poços da microplaca (réplica 1)
após a incubação. Retirou-se uma amostra do poço A6 (CIM da réplica 1) e do poço
A10 (controle de viabilidade do inóculo da réplica 1), os quais continham a levedura
Candida albicans ATCC90028. Como resultado, foi observada a presença de
blastoconídios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas bem desenvolvidas no poço A10
(figura 33A); por outro lado, para o poço A6, no qual havia ocorrido efeito
fungistático, foi observada a presença de alguns blatoconídios e a ausência de hifas
(figura 33B). A partir desses indícios, é possível sugerir que essas saponinas
tenham a capacidade de inibir a filamentação de Candida albicans, um importante
fator de virulência envolvido na invasão tecidual durante o processo infeccioso
(SUDBERY, 2011). Assim, são necessários mais estudos para avaliar se essa
inibição se estende para outras cepas de Candida e como ela ocorre.
144
Figura 33 - Microscopia de amostras dos poços contendo Candida albicans
ATCC90028.
Visualização em objetiva de 100x. A = poço A10, controle de viabilidade. B = poço A6, 62,5 µg/mL da fração 07-CCFR.07. Fonte: autor.
145
Todos os resultados apresentados até o momento corroboram para as
hipóteses de que as saponinas são as principais substâncias responsáveis pela
atividade anti-Candida e de que, previamente ao fracionamento, estavam em baixa
concentração no EHF. Além disso, é importante mencionar o potencial antifúngico,
ao menos in vitro, que essas substâncias apresentam, pois uma fração foi capaz de
inibir diferentes cepas de Candida, além de Trichosporon asahii CBS2630, numa
concentração média abaixo de 190 µg/mL. Por conseguinte, as saponinas isoladas
podem apresentar CIMs ainda menores e potencial para inibir um maior número de
cepas.
6.6.6 Avaliação da atividade antifúngica da fração 07-CCFR07 frente a isolados
clínicos segundo o método do CLSI
A fim de complementar os resultados anteriores, a fração 07-CCFR07,
concentrada em saponinas, foi testada frente a 15 isolados clínicos do banco de
cepas do Laboratório de Micologia Médica e Molecular (LMMM) obtidos a partir do
Hospital Universitário Onofre Lopes. Foram utilizadas 9 cepas de infecção sistêmica
e 6 cepas de infecção superficial, coletadas de diferentes fontes, incluindo sangue,
urina, cavidade oral e unha.
Após a determinação da CIM, foi observado que todas as cepas foram
inibidas, exceto Candida parapsilosis LMMM 104 e C. parapsilosis LMMM 84 (CO)
(Tabela 25). A susceptibilidade por cepa de uma mesma espécie e entre espécies foi
variável, porém foi observada uma tendência de menor susceptibilidade para C.
parapsilosis.
146
Tabela 25 - Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07 testada
frente a cepas clínicas.
Isolados clínicos CIM (mg/mL)*
Candida albicans LMMM 116 (U) 0,375±0,177
Candida albicans LMMM 78 (S) 0,25±0
Candida albicans LMMM 233 (S) 0,25±0
Candida glabrata LMMM 48 (CO) 0,188±0,088
Candida glabrata LMMM 79 (S) 0,25±0
Candida glabrata LMMM 249 (S) 0,188±0,088
Candida glabrata LMMM 255 (S) 0,25±0
Candida tropicalis LMMM 190 (Ur) 0,188±0,088
Candida tropicalis LMMM 21 (Ur) 0,625±0,530
Candida tropicalis LMMM 35 (O) 0,188±0,088
Candida parapsilosis LMMM 81 (S) 0,750±0,354
Candida parapsilosis LMMM 104 (U) +**
Candida parapsilosis LMMM 84 (CO) +
Candida dubliniensis LMMM 19 (CO) 0,188±0,088
Trichosporon asahii LMMM 451 (S) 0,188±0,088 * média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2); **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada S = sangue. Ur = urina. CO = cavidade oral. U = unha;
O gráfico a seguir (Figura 34) sintetiza todos os resultados de CIM obtidos
para a fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência e isolados clínicos. Pode-se
observar que 15 (68 %) das 22 cepas foram inibidas numa CIM média menor ou
igual a 250 µg/mL. As únicas espécies que apresentaram exemplares com menor
susceptibilidade (CIM > 0,5 mg/mL e < 1 mg/mL) ou ausência de inibição (CIM > 1
mg/mL) foram C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei.
147
Figura 34 - Valores de CIM observados para a fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência e cepas clínicas.
CA = Candida albicans. CG = C. glabrata. CT = C. tropicalis. CP = C. parapsilosis. CD = C. dubliniensis. CK = C. krusei. TA = Trichosporon asahii.
Fonte: autor.
0,094
0,375
0,25 0,25
0,094
0,188
0,25
0,188
0,25
>1
0,188
0,625
0,188 0,188
0,75
>1 >1
0,188 0,188
>1
1
0,125
0,188
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
CIM
(m
g/m
l)
Cepa de referência
Cepa clínica
148
Posto que neste trabalho não foi realizada uma análise fenotípica
detalhada das cepas, nem se conhece o mecanismo de ação dessa fração, não
é possível afirmar a razão de C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei
apresentarem menor susceptibilidade. Acrescenta que, em estudos
epidemiológicos, a susceptibilidade de espécies do gênero Candida varia de
acordo com a região geográfica, sítio de coleta e tamanho da amostra de cepas
coletadas. Por exemplo, no estudo de Neves-Junio et al. (2015), realizado num
hospital terciário de Minas Gerais, Candida tropicalis foi a espécie com maior
prevalência de resistência ao fluconazol (45 %); por outro lado, num estudo
realizado na Itália entre 2006 e 2008, envolvendo 38 UTIs de 27 hospitais,
Candida parapsilosis foi a que apresentou a maior prevalência (25,8%) de
resistência ao fluconazol (TORTORANO et al., 2012). Apesar disso, é possível
sugerir hipóteses levando em consideração um dos principais efeitos biológicos
das saponinas: a perturbação de membranas.
A discussão quanto o mecanismo de ação das saponinas sobre
membranas biológicas ocorre desde 1962, em que cientistas, em seu artigo
publicado no periódico Nature, investigaram o efeito dessas substâncias sobre
membranas de vírus, células de fígado de galinha e eritrócitos de humanos e
de cobaias (DOURMASHKIN; DOUGHERTY; HARRIS, 1962). Desde então,
foram realizados vários estudos para obter evidências de como as saponinas
interagem a nível molecular com os componentes da membrana. Apesar disso,
até o momento, não há uma explicação única e definitiva de como as
saponinas atuam em membranas em virtude da variação observada nos
resultados, que dependem da natureza química da saponina estudada, como
tipo de aglicona e glicosilação (AUGUSTIN et al., 2011HU; KONOKI;
TACHIBANA, 1996; KORCHOWIEC et al., 2015; SUDJI et al., 2015;
WOJCIECHOWSK et al., 2016). No entanto, a maioria dos trabalhos apontam
para um elemento em comum, sobre o qual as saponinas atuam para que
ocorra a perturbação da membrana: o colesterol.
Em estudos que utilizaram monocamadas de fosfolipídeos e colesterol,
foi medida a influência das saponinas sobre os parâmetros físicos-químicos
dessas membranas artificiais, sendo observado que algumas as saponinas
interagem fortemente com o colesterol presente nessas membranas
(KORCHOWIEC et al., 2015.; WOJCIECHOWSKI et al., 2016).
149
Em outro estudo, foram utilizadas células de carcinoma de bexiga
contendo colesterol marcado radioativamente, para avaliar a influência de
diferentes saponinas triterpênicas sobre o teor de colesterol, além de avaliar a
toxicidade sobre a membrana plasmática. Foi constatado que as saponinas
com maior toxicidade a membrana também foram as que mais diminuíram o
teor de colesterol nela, bem como foram capazes de impedir a incorporação do
colesterol (BÖTTGER; MELZIG, 2013).
Adicionalmente a esses trabalhos, Agustin et al. (2011), a partir de uma
revisão na literatura, propuseram 3 modelos de como as saponinas causam a
perturbação da membrana a nível molecular. Nesses modelos, os esteroides,
como o colesterol, são necessários para que saponinas causem a
desestabilização da membrana. Portanto, as saponinas tratadas neste
trabalham possivelmente inibem o crescimento de Candida e Trichosporon
asahii por esse mecanismo membranolítico.
Posto que o ergosterol é o principal esteroide que compõe a membrana
de células fúngicas, a menor susceptibilidade observada para C. tropicalis, C.
parapsilosis e C. krusei poderia ser explicada com base numa alteração do teor
de ergosterol da membrana, caso o mecanismo das saponinas estudadas
fosse a complexação com o ergosterol e outros esteroides.
Candida krusei ATCC6258 é a única cepa deste estudo da qual se
conhece previamente sua susceptilibidade aos antifúngicos azólicos, que
inibem a síntese do ergosterol. Segundo OROZCO et al. (1998), essa cepa de
referência apresenta resistência aos azólicos, possivelmente devido a uma
menor afinidade da enzima 14-α-demetilase a esses antifúngicos. Não se sabe
o que esse mecanismo de resistência poderia influenciar na menor
susceptibilidade às saponinas, considerando a hipótese de se complexarem
com os esteroides da membrana para danifica-la. Porém, isso abre
perspectivas para estudos mais detalhados acerca dos mecanismos envolvidos
na menor susceptibilidade dessa espécie. Ademais, outra perspectiva para
futuros trabalhos é avaliar se a atividade dessa fração enriquecida em
saponinas é dependente da presença de ergosterol e outros esteroides na
membrana da célula fúngica. Isso poderia ser realizado por meio da
determinação do teor de ergosterol nas leveduras e se a presença do
ergosterol ou outro esteróide no meio extracelular aumentaria a CIM da fração
150
enriquecida em saponinas. Caso essa hipótese não se concretize, poderiam
ser realizados estudos mais detalhados por técnicas ômicas, como
metabolômica, proteômica e transcriptômica.
Em suma, foi demonstrado que as substâncias antifúngicas do EHF de
Ziziphus joazeiro Mart. são as saponinas, as quais possivelmente estavam em
menor concentração no extrato antes do fracionamento. A fração 07-CCFR07
apresentou atividade frente a uma variedade de cepas de Candida,
abrangendo cepas das principais espécies observadas em estudos de
prevalência de infecções invasivas (YAPAR, 2014). A técnica de bioautografia
mostrou-se uma importante ferramenta para o fracionamento bioguiado ao aliar
informações de atividade biológica com informações fitoquímicas. Novamente,
é importante ressaltar a cautela que se deve tomar na realização desse tipo de
estudo, evitando basear-se em poucos resultados e critérios para descartar
uma amostra. Não foi encontrado na literatura, até o momento, trabalhos com
abordagem e finalidades semelhantes para a espécie, assim como para o
gênero. Assim, este estudo tem caráter inédito e abre novas oportunidades de
investigação científica.
151
6.7 Isolamento da saponina ZJS1
A fração 02-PLL03, conforme discutido na seção anterior, apresentou
atividade frente à Candida glabrata ATCC2001 pelo método de microduição em
caldo e bioautografia, em que se evidenciou a atividade anti-Candida das
manchas azuis observadas após a revelação com vanilina sulfúrica. Por
conseguinte, a fim de isolar essas substâncias, essa fração foi submetida a
dois processos de cromatografia em coluna de gel de filtração (CGF), obtendo-
se 4 e 5 frações respectivamente. As frações 2 de ambos os processos foram
submetidas a uma nova separação por CGF, obtendo-se, após a reunião, 6
frações para a CFG03 (Figura 35) e 5 frações para a CGF04 (Figura 36).
Figura 35 - Análise por CCD das frações da CFG03.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:15 v/v/v/v. Adsorvente: gel de
sílica 60 F254. Detecção: A – UV 365 nm; B – Reagente Natural A/UV 365 nm; C - vanilina sulfúrica/aquecimento. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor.
152
Figura 36 - Análise por CCD das frações da CGF04.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:15 v/v/v/v. Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A – UV 365 nm; B – Reagente Natural A/UV 365 nm; C - vanilina
sulfúrica/aquecimento. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor
As frações 05-CGF03 e 04-CGF4 foram reunidas e submetidas a uma
separação por cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12), obtendo-se
11 frações após a reunião (Figura 37).
153
Figura 37 - Análise por CCD das frações da cromatografia em coluna de fase
reversa 12.
Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:15 v/v/v/v. Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A – UV 365 nm; B – Reagente Natural A/UV 365 nm; C - vanilina
sulfúrica/aquecimento. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor
A fração 5 (5 mg), com aspecto semipurificado após a análise por CCD,
foi enviada para a obtenção de espectros de ressonância magnética nuclear. A
inspeção inicial dos espectros de 1H (Figura 38) e 13C (Figura 39) permitiu
sugerir que essa fração contém majoritariamente uma saponina, devido à
presença de muitos sinais em região mais protegida, indicativo de hidrogênios
de metilas, além da presença de sinais característicos de açúcar em campo
mais desprotegido. A análise estrutural dessa fração por RMN encontra-se na
seção a seguir.
154
6.8 Análise estrutural por RMN da saponina ZJS1
A fração em questão, obtida de uma cromatografia em coluna de vidro
empacotada com fase reversa C18, apresentou, segundo os dados de RMN,
pureza suficiente para se considerar que continha majoriariamente uma
substância isolada. Assim, a fração a partir deste momento será chamada de
ZJS1.
Inicialmente, foram analisados os espectros monodimensionais de 1H e
13C, aliado a análise por HMQC, para identificar sinais característicos das
saponinas isoladas das cascas de Ziziphus joazeiro Mart. por Higuchi et al.
(1984) e Schühly et al. (2000). No espectro de RMN 1H, foi possível observar 7
singletos de alta intensidade em δH 0,73, 0,77, 0,94, 1,00, 1,02, 1,58 e 1,64,
sugestivos de hidrogênios de metila (Figura 39), os quais, por HMQC, foram
atribuídos a seus respectivos carbonos (δH 0,73↔16,4; δH 0,77↔16,5; δH
0,94↔δC 27,6; δH 1,00↔δC 18,8; δH 1,02↔δC 29,7; δH 1,6↔δC 18,5; δH1,64↔δC
25,7), vários sinais sobrepostos entre δH 3,2 e 3,9, indicativo de hidrogênios de
açúcar (Figura 40), além de dubletos entre δH 4,2 e 5,5, sugestivos de
hidrogênios de carbonos anoméricos (Figura 41). Após a análise do espectro
de 13C (Figura 42), contatou-se a presença de 23 sinais sugestivos de carbonos
saturados, 17 sinais de metinas ou metilenos oxigenados e 3 sinais
característicos de carbonos anoméricos (δC 103,15↔ δH4,40 [d, J = 8,0 Hz];
104,79↔ δH [4,25, d, J = 6,8 Hz]; 108,73↔ δH 5,13 [d, J = 2,3 Hz]) o que
permite sugerir a presença de 3 açúcares ligados a aglicona. Ainda,
destacaram-se 2 sinais em campo mais desprotegido, em δC 126,27 e 133,92,
sugestivos de carbono olefínico.
Apesar de os espectros terem sido obtidos em DMSO, observou-se uma
semelhança e corência desses deslocamentos químicos com os da saponina
bacopasídeo X, obtidos em metanol e piridina (LI et al., 1999; SCHÜHLY et al,
2000). Essa substância é um derivado da jujubogenina, uma saponina de
núcleo damarano (Figura 38), isolada das cascas de Ziziphus joazeiro Mart.
pelos cientistas supracitados. Portanto, a partir dos dados obtidos na análise
preliminar, foi realizada uma estratégia de atribuição sequencial dos sinais da
aglicona e glicosídeos, através das correlações homo e heteronucleares de
HMBC (Figura 44 e 45), HMQC (Figura 46) e COSY (Figura 47) assim como
155
comparado com a literatura citada. Primeiramente, foi realizada uma análise
dos sinais da aglicona seguido dos sinais da porção glicídica.
Figura 38 - Representação estrutural do núcleo damarano (A) e da saponina
bacopasídeo X (B).
10
5
1
4
2
3
9
8
6
7
11
12
14
13
CH330
CH3
18
CH328
CH329
15
17
16
CH3
19
H
H
H
20
22CH3
21
23
24
25
CH3
26
CH327
H
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
34
56
7
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)
25
1915
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
A
B
156
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
34
56
7
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)
25
1915
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
Figura 39 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz).
H-29
H-19 H-28
H-18 H-21
H-27
H-5 H-15
H-19
H-17
H-26
157
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
34
56
7
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)
25
1915
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
Figura 40 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz).
H-2’’’
H-4’ H-2’
H-3’
H-2’’
H-3
158
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
34
56
7
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)
25
1915
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
Figura 41 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz).
H-24 H-23
H-1’’’
H-1’
H-1’’’
159
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
34
56
7
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)
25
1915
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
Figura 42 - Espectro ampliado de RMN 13C da saponina ZJS1(DMSO-d6; 125 MHz).
160
Para a atribuição dos sinais da aglicona, foram observadas as
correlações de HMBC das metilas identificadas na análise preliminar dos
espectros monodimensionais de H1 e C13. Inicialmente buscaram-se
correlações de sinais diagnósticos da aglicona jujubogenina (Figura 41),
principalmente entre os carbonos e hidrogênios das posições 28/29 e 26/27
Foram observadas correlações de HMBC características de carbonos vicinais,
(δH 1,64 ↔ δC 18,5 e δH 1,58 ↔ δC 25,7; δH 0,73↔δC 27,6 e δH 0,94 ↔ δC 16,4),
indicativas das metilas 26/27 e 28/29.
A confirmação das posições 26/27 foi possível após observar a presença
de correlações entre os hidrogênios dessas metilas com sinais de carbono
característico de ligação dupla (δC 126,27 e δC 133,92), sendo também possível
atribuir os sinais destes últimos e de outros a partir das correlações de HMQC
e COSY. O sinal em δC 133,92 apresentou-se quaternário no HMQC enquanto
que o sinal em δC 126,27 apresentou ligação com apenas um hidrogênio (δH
5,08, dt, J = 8,0 Hz) e foram atribuídos as posições 25 e 24, respectivamente.
O sinal em δH 5,08, por sua vez, indicou no espectro de COSY uma correlação
com o sinal em δH 4,48, o qual foi atribuído ao carbono em δC 67,9, com
deslocamento característico de metina oxigenada. Logo, esse foi atribuído a
posição 23 da molécula de jujubogenina.
Os sinais sugestivos das metilas 28/29 foram confirmados após se
observar a presença de correlação no espectro de HMBC entre os hidrogênios
dessas com um sinal em δC 88,3, característico do carbono 3 ligado a uma
unidade osídica.
Figura 43 - Representação estrutural da aglicona jujubogenina.
21
34
56
7
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)
25
1915
21
O
O
OH
OH
161
Figura 44 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz).
162
H-15/C-30
H-26/C-27
H-27/C-26
H-27/C-24
H-27/C-25H-26/C-25
H-26/C-24
H-15/C-16 H-17/C-16
H-28/C-3 H-29/C-3
H-28/C-5
H-29/C-28
H-28/C-29
H-28/C-4
H-19/C-1H-18/C-7
Figura 45 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz).
163
Figura 46 - Espectro ampliado de HMQC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz).
164
Figura 47 - Espectro ampliado de COSY da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500
MHz).
165
ZJS1 Bacopasídeo X*
Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz) HMBC Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz)
1 38,6 1,55 (m); 0,84 (m) H-19 1 39,8 1,67 (m); 0,92 (m) 2 26,3 1,52 (m), 1,65 (m) - 2 27,3 1,85 (m); 1,70 (m) 3 88,3 2,96 (dd, J = 11,6; 4,0) H-28, H-29, H-1' 3 90,3 3,11 (dd, J = 12,3; 4,3) 4 39,4 - H-28, H-29 4 40,6 - 5 55,8 0,66 (d, J = 11,6 Hz) H-28, H-29 5 57,4 0,74 (d, J = 9,1) 6 18,0 1,47 (m); 1,35 (m) - 6 19,1 1,59 (m); 1,52 (m) 7 35,7 1,45 (m); 1,32 (m) H-18 7 36,9 1,56 (m); 1,49 (m) 8 37,2 - - 8 38,5 - 9 52,4 0,78 (m) H-19 9 54,1 0,88 (m)
10 37,1 - H-19 10 38,3 - 11 21,5 1,48 (m) - 11 22,5 1,64 (m), 1,50 (m) 12 28,1 1,69 (m); 1,73 (m) - 12 29,2 1,86 (m); 1,67 (m) 13 37,1 - H-18 13 38 2,48 (ddd, J = 12,5; 6,7; 6,4) 14 53,1 - H-18 14 54,6 - 15 36,2 1,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 0,98 (s) H-30b 15 36,7 2,06; 1,18 (2d, J = 8,7) 16 109,9 - H-21, H-17 16 111,4 - 17 53,3 0,82 (d, J = 6,4 Hz, 1H) - 17 54,4 1,00 (d, J =6,7) 18 18,8 1,00 (s) - 18 19,2 1,14 (s) 19 16,5 0,77 (s) - 19 16,8 0,88 (s) 20 67,9 - H-22 20 69,4 - 21 29,7 1,02 (s) - 21 29,6 1,14 (s) 22 44,6 1,23 (m); 1,36 (m) H-21 22 45,5 1,47 (m); 1,38 (m) 23 67,9 4,48 (m) H-21 23 69,7 4,68 (ddd, J = 11,3; 8,1; 1,3) 24 126,3 5,08 (dt, J = 8,0 Hz) H26, H-27 24 126,3 5,15 (m) 25 134,0 - H-26, H-28 25 136,7 - 26 25,7 1,64 (s) H-27, H-24 26 25,8 1,72 (s) 27 18,5 1,58 (s) H-26, H-24 27 18,4 1,70 (s) 28 27,6 0,94 (s) H-29 28 28,3 1,05 (s) 29 16,4 0,73 (s) H-28 29 16,8 0,85 (s) 30 65,4 3,64; 3,82 H-15 30 66,9 4,03; 3,94 (2d, J = 12,6)
Tabela 26 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a
aglicona, em comparação com a literatura.
* SCHÜHLY et al. (2000); 400 MHz, CD3OD
166
Tabela 27 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a
glicona, em comparação com a literatura.
ZJS1
Bacopasídeo X*
Posição δ C (ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J (Hz) HMBC COSY Posição δ C
(ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J
(Hz)
3-arabnopiranosil
3-arabnopiranosil
1' 104,8 4,25 (d, J= 6,8 Hz) H-3, H-2' H-3, H-2', H-4' 1' 106 4,39 (d,J=6.4)
2' 75,3 3,57 (m)
H-1' 2' 77,2 3,75 (dd)
3' 81,7 3,63 (m) H-2', H-
1''' H-1''' 3' 83,7 4,05 (dd, J=5,1, 2,6)
4' 67,5 3,82 (m) - H-1' 4' 69,2 4,03 (ddd)
5' 65,4 3,66 (m); 3,36 (m) H-1' - 5' 65,9 3,85 (dd), 3.54 (dd)
2'-arabnofuranosil
2'-arabnofuranosil
1'' 108,8 5,13 (d, J = 2,3 Hz) H-2' H-2'' 1'' 110,3 5,30 (d, J= 2,6)
2'' 82,7 3,87 (td, J = 2,4 Hz) - H-1''' 2'' 83,7 4,09 (dd, J = 5,0; 2,6)
3'' - - - - 3'' 77,9 3.93 (dd)
4'' - - - - 4'' 84,6 3.97 (ddd)
5'' - - - - 5'' 62,1 3,71, 3,60 (2dd, J= 12,3, 2,9)
3'-glicopiranosil
3'-glicopiranosil
1''' 103,2 4,40 (d, J = 8,0 Hz) H-2''' H-3', H-2''' 1''' 104,9 4,51 (d, J = 7,6)
2''' 74,1 3,12 (m) - H-1''' 2''' 75,2 3,28 (dd)
3''' - - - - 3''' 77,7 3,92 (dd, J = 7,6; 4,9)
4''' - - - - 4''' 71,1 3,33 (dd)
5''' - - - - 5''' 77,8 3,35 (ddd)
6''' - - - - 6''' 62,3 3,83; 3,67 (2dd, J = 8,2; 5,2)
* SCHÜHLY et al (2000); 400 MHz, CD3OD
167
Com relação à porção glicídica da molécula, no espectro de 13C foi
observado que o sinal em δC 88,3 apresentou um deslocamento químico que
corrobora para a presença de uma ligação osídica. No espectro de HMQC,
observou-se uma correlação desse sinal com o dubleto em δH 2,96. Enquanto
isso, os sinais em δH 0,94 e δH 0,73, atribuídos às metilas nas posições 28 e
29, respectivamente, apresentaram correlação no espectro de HMBC com o
sinal em δC 88,3, permitindo confirmar a atribuição desse a C-3. Ainda, no
espectro de HMBC, foi possível observar uma correlação entre o sinal do C-3 e
um dubleto em δH 4,25. Este, por sua vez, apresentou correlação no HMQC
com um sinal de carbono em δC 104,79, sugestivo de carbono anomérico.
Portanto, confirmou-se a inserção da unidade osídica no carbono 3.
O sinal em δC 104,79, atribuído ao C-1’, apresentou correlação por
HMBC com um hidrogênio em δH 3,57, que por HMQC foi atribuído ao carbono
em δC 75,29. Igualmente, o sinal de hidrogênio do C-1’ apresentou correlação
no espectro de COSY com o hidrogênio em δH 3,57. Assim, os sinais em δC
75,29 e δH 3,57 foram atribuídos ao H-2’. Continuando a sequência das
correlações, o sinal em δH 3,57 apresentou correlação no HMBC com o sinal
em δC 108,8, indicativo de outro carbono anomérico e evidenciando que a
primeira unidade osídica está ligada a uma segunda por intermédio de uma
ligação com o C-2’. O sinal em δC 108,8 exibiu correlação no HMQC com um
dubleto em 5,13 (J = 2,3 Hz). Adicionalmente, o sinal em 4,40 (d, J = 8,0 Hz),
atribuído ao δC 103,1 e característico de outro carbono anomérico, apresentou
correlação no espectro de HMBC com um sinal de carbono em δC 81,7. Esse
sinal foi atribuído ao C-3’ por correlacionar no HMBC com o hidrogênio
atribuído ao H-2’, o que confirma a ligação da terceira unidade osídica a
primeira por intermédio de uma ligação com o C-3’. As análises dos
espectros ainda estão em andamento para a confirmação da porção glicídica,
sendo ainda necessárias outras análises, como espectrometria de massas,
para confirmar a identidade da molécula. Com base na análise realizada até o
momento, a substância ZJS1 foi presuntivamente identificada como
bacopasídeo X ou 3-O-[α-L-arabinofuranosil-(1 → 2)-{β-D-glicopiranosil-
(1 → 3)-}-α-L-arabinopiranosil] jujubogenina.
168
Figura 48 - Principais correlações de HMBC e COSY observadas para ZJS1
Flecha azul = correlação de HMBC. Flecha vermelha = correlação de COSY.
Uma característica em comum entre as saponinas de Ziziphus spp
isoladas até o momento é que todas compartilham da mesma aglicona, a
jujubogenina, ou apresentam uma aglicona com poucas diferenças estruturais
em relação a essa. A partir da casca das raízes de Ziziphus lotus, foram
isoladas 4 saponinas de núcleo damarano, incluindo jujubosídeo B, e 3
saponinas com uma aglicona inédita, estruturalmente similar a jujubogenina,
denominada lotogenina (RENAULT et al., 1997) Ainda com relação a Ziziphus
lotus, foram isoladas das suas folhas, jujubosídeo B e 4 novas saponinas cuja
sapogenina deriva da jujubogenina (MACIUK et al., 2004). Zizynummin, uma
saponina isolada das folhas de Ziziphus numularia, também apresenta a
jujubogenina como aglicona. Para a espécie do presente estudo, Ziziphus
joazeiro Mart., foram isoladas da casca saponinas de núcleo damarano
derivadas da jujubogenina (bacopasídeo X), bem como da lotogenina
(lotosídeo A), além de 2 saponinas (joazeirosídeos A e B) com uma aglicona
inédita e estruturalmente semelhante a lotogenina e jujubogenina, denominada
joazeirogenina (SCHÜHLY et al., 2000). Portanto, uma hipótese considerada foi
a de que as saponinas observadas no teste de formação de espuma e na
análise por CCD possuíam um núcleo do tipo damarano e eram derivadas das
sapogeninas jujugogenina ou lotogenina. Segundo os resultados apresentados,
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
3
45
67
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)25
19
15
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
169
uma dessas saponinas foi isolada e presuntivamente identificada como
bacopasídeo X, confirmando-se a hipótese proposta.
A saponina bacopasídeo X foi isolada da casca de Ziziphus joazeiro
Mart. primeiramente por Higuchi et al. (1984), seguido de Schühly et al (2000),
em que estes últimos observaram que essa saponina era majoritária na casca.
Apesar de não ter sido realizada a sua quantificação nas folhas, possivelmente
essa saponina também é majoritária nessa parte da planta, pois na análise por
CCD com o revelador vanilina sulfúrica, realizada para o EHF, observou-se
uma intensa mancha azul de Rf equivalente ao observado para a saponina
ZJS1.
Em pesquisa na base de dados SciFinder, não foram encontrados
estudos que mostrem a presença de bacopasídeo X em outras espécies do
gênero, somente em Colubrina retusa (LI et al., 1999) e Bacopa monnieri
(SIVARAMAKRISHNA et al., 2005)
Assim, essa saponina tem distribuição restrita em relação ao gênero e
outras famílias, tendo, consequentemente, utilidade como marcador
quimiotaxonômico para a identificação da espécie e no controle de qualidade
de produtos oriundos das cascas e folhas. Conforme foi abordado na seção
acerca dos resultados da atividade anti-Candida, essa saponina estava
presente numa fração que apresentou atividade frente a uma variedade de
espécies de Candida, além de ter sido reportada sua atividade inibitória contra
Candida albicans, Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus, assim
como frente a diferentes linhagens de células humanas tumorais, nos estudos
da espécie Colubrina retusa (LI et al., 1999) e Bacopa monniera (PENG et al.,
2010). Portanto, além de marcador quimiotaxonômico, essa saponina é
também um candidato a marcador bioativo da espécie, e estudos posteriores
devem ser realizados para avaliar o seu potencial biológico.
170
6.9 Avaliação do efeito protetor do extrato hidroetanólico das folhas de Z.
joazeiro Mart. em modelo de doença inflamatória intestinal
A doença inflamatória intestinal é caracterizada por uma resposta imune
intestinal exacerbada e desregulada, envolvendo células da imunidade inata
(neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células natural killer) e adaptativa
(células T e B). A ativação dessas células é acompanhada pela liberação de
citocinas e quimiocinas, expressão de moléculas de adesão e o consequente
recrutamento de mais células mononucleares e polimorfonucleares para a
mucosa intestinal, estabelecendo-se assim um perpétuo ciclo de ativação,
infiltração leucocitária e dano celular por radicais livres e proteases
(ABRAHAM; CHO, 2009; BAUMGART et al., 2007).
O modelo experimental, em ratos, de doença inflamatória intestinal
induzido pelo hapteno ácido 2,4,6 trinitrobenzóico (TNBS) apresenta vários
aspectos presentes na doença inflamatória intestinal em humanos. Sua
resposta é caracterizada por uma inflamação transmural da mucosa colônica
do animal, associada a formação de úlceras. O seu análogo estrutural, o
DNBS, causa uma resposta inflamatória similar ao TNBS, sendo portanto
utilizado neste estudo como agente indutor do modelo experimental para a
avaliação do efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. (WALLACE et al., 1995).
O protocolo experimental consistiu em 6 grupos, sendo 3 relativos às
doses com concentração crescente do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., além
de grupos com administração oral de salina sem a indução da doença (controle
negativo) e com a indução da doença (controle positivo), bem como um grupo
com a administração oral do fármaco sulfassalazina. A administração de
salina, do extrato e do fármaco foi realizada 72, 48, 24 e 2 horas antes da
indução da doença, assim como em todos os dias subsequentes, até a
eutanásia.
Durante todo o período experimental, os animais foram monitorados
quanto à alteração do peso corporal, consistência fecal e presença de sangue
nas fezes, em que a pontuação atribuída para cada um desses parâmetros foi
utilizada no cálculo do Índice de Atividade da Doença (IAD). O IAD é uma
ferramenta útil na monitorização clínica do processo inflamatório intestinal, pois
é indicativo da gravidade da injúria no dia após à indução da doença e também
171
sugestivo da recuperação dos animais, momento no qual deve-se realizar a
eutanásia.
Pode-se observar na figura 49 que ocorreu uma perda de peso gradativa
ao longo dos dias para todos os grupos, exceto o controle negativo, atingido o
seu ápice no sétimo dia de experimento. Isso resulta da diarreia e consequente
diminuta ingestão de ração observada nos grupos tratados e controle positivo,
após a indução por DNBS. Por sua vez, na Figura 50, observa-se que o escore
IAD foi menor para o grupo que recebeu sulfassalazina, em relação aos
tratamentos com EHF e controle positivo, durante os três dias subsequentes à
indução. De fato, apesar da redução diária de peso, observou-se que menos
animais do grupo sulfassalazina apresentavam diarreia e sangue
macroscopicamente visível nas fezes, o que contribuiu para a redução do IAD
Figura 49 - Monitorização do peso corporal das ratas durante o período
experimental.
1 2 3 4 5 6 7
1 5 0
2 0 0
2 5 0
D ia s d e E x p e r im e n ta ç ã o
Mé
dia
do
pe
so
± d
es
vio
pa
drã
o
(g)
C o n tro le P o s it iv o
Z J 5 0 m g /k g
C o n tro le N e g a tivo
Z J 1 0 0 m g /k g
Z J 2 0 0 m g /k g
S u lfa s s a la z in a 2 5 0 m g /k g
In d u ç ã o c o lite
Valores expressos como média ± desvio padrão (n = 7).
172
Figura 50 - Índice de atividade da doença (IAD) relativo aos grupos tratatos e
controle durante o período de pós-indução da doença.
1 2 3
0
1
2
3
4
D ia s a p ó s a in d u ç ã o d a c o lite
Es
co
re
IA
D
C o n tro le N e g a tivo
C o n tro le P o s it iv o
Z J 5 0 m g /k g
Z J 1 0 0 m g /k g
Z J 2 0 0 m g /k g
S u lfa s s a la z in a 2 5 0 m g /k g
Resultados expressos como média ± desvio padrão (n = 7).
Além da monitorização dos parâmetros clínicos, após a eutanásia dos
animais, foi avaliado o índice de dano macroscópico, o qual se baseia em
critérios estabelecidos por Bell, Gall e Wallace (1995) assim como foi avaliada
a relação peso/longitude dos cólons removidos, parâmetro esse utilizado para
verificar a presença de encurtamento e engrossamento das suas paredes.
A análise do gráfico acerca do escore macroscópico (Figura 51) permite
constatar que os grupos tratados com o EHF de Z. joazeiro Mart., nas doses de
50, 100 e 200 mg/kg, não apresentaram diferença estatisticamente significante
(p>0,05) em relação ao grupo controle positivo. Assim o EHF,
independentemente da dose utilizada no estudo, não foi capaz de diminuir o
dano tecidual causado pelo hapteno DNBS, apresentando em média um escore
próximo a 8, caracterizado pela presença de grandes zonas de injúria tissular
(Figura 52). Em contrapartida, como esperado, o fármaco padrão
sulfassalazina foi capaz de diminuir o dano provocado pelo DNBS.
173
Figura 51 - Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os
grupos controle, sobre o escore de dano macroscópico do cólon.
Co
ntr
ole
Neg
at i
vo
Co
ntr
ole
Po
sit
ivo
ZJ 5
0 m
g/k
g
ZJ 1
00 m
g/k
g
ZJ 2
00m
g/k
g
Su
lfassala
zin
a 2
50m
g/k
g
0
2
4
6
8
1 0
Es
co
re
ma
cro
sc
óp
ico A
A
A
A
A B C
Dados expressos como média ± desvio padrão (n = 7). ANOVA/Teste de Mann-Whitney. Diferença estatisticamente significativa quando p <0,05. A = p <0,05 contra o controle negativo.
B = p<0,05 contra o controle positivo. C = p<0,05 contra os tratamentos com o EHF.
Figura 52 - Cólons representativos dos tratamentos e grupos controle.
174
No gráfico da figura 53, observa-se que a administração de
sulfassalazina foi capaz de prevenir o encurtamento e edemaciamento do cólon
a ponto de tornar o grupo estatisticamente equivalente ao controle negativo.
Além disso, para o tratamento com o EHF nas doses de 50 e 200 mg/kg, não
houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) em relação ao controle
positivo. No entanto, observa-se uma diferença estatisticamente significativa
entre o grupo que recebeu a dose de 100 mg/kg e o grupo controle positivo.
A princípio, propõe-se a seguinte hipótese para o resultado anômalo
observado com o extrato: as variáveis aleatórias e desconhecidas do
experimento, não passíveis de serem controladas, aliado ao efeito imprevisível
decorrente da complexidade química do extrato, contribuíram para que a dose
de 100 mg/kg ocasionalmente melhorasse o parâmetro peso/longitude do
cólon, considerando um nível de significância de 5%.
Figura 53 - Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os
grupos controle, sobre a relação peso/longitude (mg/cm) do cólon.
Co
ntr
ole
Neg
at i
vo
Co
ntr
ole
Po
sit
ivo
ZJ 5
0 m
g/k
g
ZJ 1
00 m
g/k
g
ZJ 2
00m
g/k
g
Su
lfassala
zin
a 2
50m
g/k
g
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
mg
/ c
m
AA B
AA
B C
Dados expressos como média ± desvio padrão (n = 7). One-way ANOVA seguido de teste de Tukey de comparações múltiplas. Diferença estatisticamente significativa quando p <0,05. A = p <0,05 contra o controle negativo. B = p<0,05 contra o controle positivo. C = p<0,05 contra os
tratamentos com o EHF.
175
Com o intuito de explicar a ineficácia observada para o extrato como
agente anti-inflamatório na doença inflamatória intestinal, foram sugeridas
hipóteses que se baseiam nas seguintes informações:
O EHF, conforme verificado nas análises por reações clássicas de
identificação, CCD e CLAE, apresenta flavonoides glicosilados, saponinas e
cumarinas. De acordo com a literatura, sabe-se que as saponinas e cumarinas
apresentam atividade citotóxica frente a células humanas neoplásicas e, em
alguns casos, frente à células humanas normais (CANNING et al., 2013, WU et
al., 2015). Os flavonoides glicosilados, em contrapartida, possuem atividade
protetora em modelos animais de colite experimental (COMALADA et al., 2005;
KIM et al., 2005; KWON et al., 2005, MASCARAQUE et al., 2014). Com base
nisso, duas hipóteses foram propostas:
Os flavonoides glicosilados, responsáveis pela atividade anti-
inflamatória, estão em concentração insuficiente para eliciar um efeito
protetor.
O EHF possui saponinas e cumarinas citotóxicas que intensificam o
dano causado pelo DNBS e sobrepõem o efeito benéfico dos
flavonoides glicosilados.
É importante destacar que se a segunda hipótese sugerida for
verdadeira, as substâncias com atividade antifúngica, suspeitas de
corresponderem a saponinas e cumarinas, possivelmente não poderão ser
utilizadas para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, restando a via
tópica como alternativa.
176
7 CONCLUSÕES
Foi observado que as folhas da espécie Ziziphus joazeiro Mart. possuem
ácidos fenólicos, cumarinas, saponinas e flavonoides, sendo os flavonóis a
classe majoritária. Por meio de análises por co-CCD CLAE, CLAE-IES-
EM(TOF) e RMN, foi possível identificar no EHF glicosídeos dos flavonoides
quercetina, canferol e isormanetina ou tamarixetina, muitos inéditos para a
espécie, e alguns de distribuição restrita para o gênero ou ainda inéditos para o
gênero. Portanto, os flavonoides, principalmente os glicosilados, constituem um
alvo para a seleção de marcadores químicos.
No ensaio de colite experimental, não foi observado efeito protetor para
o extrato hidroetanólico das folhas. Uma hipótese sugerida foi a de que os
flavonoides não estão em concentração suficiente no extrato para promover
efeito anti-inflamatório.
A partir da avaliação da atividade anti-Candida aliada a bioautografia, foi
demonstrado que as saponinas são as principais substâncias responsáveis por
essa atividade, sendo ainda possível isolar e presuntivamente identificar uma
das saponinas, bacopasídeo X, presente nas frações testadas.
Assim, este estudo traz resultados inéditos para a espécie e para o
gênero, abrindo perspectivas para a realização de novas investigações
envolvendo o uso de flavonoides e saponinas como marcadores químicos no
controle de qualidade e avaliação do perfil sazonal, o estudo aprofundado do
mecanismo de ação das saponinas das folhas sobre as leveduras do gênero
Candida, bem como o uso dessas saponinas para outros fins, como avaliação
de outras atividades biológicas, estudos de semissíntese e desenvolvimento de
formulações.
177
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192
APÊNCIDE A – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO
Journal of Ethnopharmacology
- Manuscrito em preparação -
Fracionamento bioguiado e atividade anti-Candida de uma fração
enriquecida em saponinas, obtida do extrato das folhas de Ziziphus
joazeiro Martius
Manoel André de Souza Neto; Jordan Silva de Medeiros; Jovelina Samara
Ferreira Alves; Walicyranison Plinio da Silva da Silva Rocha; Guilherme
Maranhão Chaves; Freddy Alejandro Ramos; Josean Fechine Tavares,
Silvana Maria Zucolotto
Resumo
Relevância etnofarmacológica: as cascas e as folhas de Ziziphus joazeiro Mart.
tem sido tradicionalmente empregadas na higiene bucal e capilar, no alívio de
problemas estomacais, no tratamento de infecções fúngicas e como anti-
inflamatório.
Objetivo do estudo: realizar um fracionamento bioguiado a partir da atividade
anti-Candida das folhas.
Materiais e métodos: as folhas foram submetidas à maceração com
etanol:água (70:30, v/v) por 7 dias e, a partir do extrato hidroetanólico, realizou-
se uma partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. A
fração butanol foi submetida a um fracionamento por cromatografia em contra-
corrente de alta velocidade com refinamento (CCCAV) por zona de pH, seguido
de cromatografia em coluna de fase reversa. Paralelamente ao fracionamento,
a atividade antifúngica do extrato e frações frente a cepas de Candida foi
avaliada pelo método de microdiluição em caldo aliado a bioautografia.
Resultados: Na avaliação da atividade antifúngica, o EHF apresentou
concentração inibitória mínima (CIM) de 5 mg/mL frente a Candida albicans,
Candida dubliniensis, Candida glabrata e Candida rugosa, enquanto que a
fração butanol destacou-se frente a C. glabrata, com uma CIM de 0,625
mg/mL. Após o ensaio de bioautografia para a fração butanol e suas
respectivas sub-frações, observou-se que as manchas azuis, originadas após o
193
uso do revelador vanilina sulfúrica, possuíam atividade frente a C. glabrata. A
fração 07-CCFR07, obtida após concentração das substâncias antifúngicas por
CCCAV e cromatografia em coluna de fase reversa, foi capaz de inibir
diferentes cepas de referência de Candida e isolados clínicos, no teste de
microdiluição em caldo. Com o objetivo de descobrir a identidade das
substâncais antifúngicas, foi realizado um novo fracionamento a partir da fração
butanol. Ao final, foi possível obter uma saponina isolada, presuntivamente
identificada como bacopasídeo X, anteriormente isolada das cascas de
Ziziphus joazeiro
Conclusões: os resultados fornecem evidências que justificam o uso
etnofarmacológico das folhas como antifúngico. Este estudo tem caráter inédito
para a espécie e abre novas oportunidades de investigação científica quanto a
atividade antifúngica das saponinas presentes nas folhas de Ziziphus joazeiro.
1. Introdução
A incidência e prevalência de infecções fungicas invasivas têm
aumentado ao longo dos anos, principalmente em decorrência do aumento no
número de pessoas imunocomprometidas, incluindo transplantados e pessoas
com SIDA (Pappas et al., 2010; Tang et al., 2015). As espécies do gênero
Candida constituem relevante grupo de patógenos oportunistas, os quais são
uma das principais causas de infecção de corrente sanguínea nos Estados
Unidos e Europa (Lockhart, 2014). A espécie Candida albicans é uma das mais
prevalentes, seguido de Candida glabrata na América do Norte e Europa e o
complexo Candida parapsilosis na America Latina (Yapar, 2014).
Apesar dos avanços, o arsenal terapêutico para o tratamento de
infecções fúngicas ainda apresenta limitações. Por exemplo, o uso da
anfotericina B, considerado um padrão ouro na terapia antifúngica, é limitado
devido à possibilidade de reações adversas, como nefrotoxicidade (Laniado-
Laborín and Cabrales-Vargas, 2009). Além disso, há um aumento na
prevalência de espécies com resistência aos azólicos (Orasch et al., 2014).
Portanto, é necessária a busca por novos agentes antifúngicos eficazes e
seguros, e as espécies vegetais são uma fonte para a descoberta de novos
antimicrobianos promissores (Perumal Samy and Gopalakrishnakone, 2010).
194
A espécie Ziziphus joazeiro, popularmente conhecida por juá ou juazeiro,
é uma importante planta medicinal do bioma Caatinga e do Nordeste (Carvalho,
2007). As folhas e a casca, devido a sua propriedade espumógena, são
utilizadas na higiene bucal, capilar e da pele (Lorenzi and Matos, 2008). Além
disso, também são utilizadas no tratamento de infecções fúngicas (Cruz et al.,
2007). As folhas apresentam uma vantagem em relação à casca no que se
refere ao seu uso como matéria-prima na obtenção de fitocomponentes, pois a
árvore mantem-se perenifólia durante todo o ano, até mesmo em períodos de
seca, e a sua remoção acarreta menor dano à planta. Apesar disso, para as
folhas são escassos os estudos tanto para a investigação fitoquímica quanto
para a determinação da sua atividade antimicrobiana. Assim, este trabalho tem
como objetivo preencher a lacuna existente quanto a fitoquímica e atividade
antifúngica da espécie, ao mesmo tempo em que se realiza um estudo
etnofarmacologicamente dirigido, visando também fornecer evidências que
justifiquem o uso das folhas no tratamento de infecções fúngicas superficiais.
2. Materiais e métodos
2.1. Material vegetal
As folhas da espécie Ziziphus joazeiro foram coletadas no município de
Maxaranguape, estado do Rio Grande do Norte, nas coordenadas
latitude/longitude -5.484221 -35.311565 e altura de 22 metros em relação ao
nível do mar. A coleta foi realizada no período da tarde, nos meses de
novembro de 2011 e maio de 2012. Uma exsicata do material vegetal foi
depositada no herbário da UFRN sob o número 12253.
2.2 Extração
O extrato hidroetanólico das folhas foi preparado utilizando o método de
maceração, em que o material vegetal, na proporção 1:15 p/v (droga
vegetal:solvente), foi mantido em contato com etanol: H2O (70: 30, v/v) durante
sete dias. Após esse período, o extrato foi filtrado à vácuo e seu volume
reduzido em rotaevaporador a uma temperatura de 40 ºC.
195
2.3 Avaliação da atividade anti-Candida
A atividade do extrato e frações foi determinada pelo ensaio de microdiuição
em caldo, aliado a bioautografia, de modo a permitir a identificação das
substâncias responsáveis pela atividade antifúngica.
2.3.1. Leveduras e meio de cultura
Para a avaliação da atividade antifúngica, foram utilizadas cepas de
referência do gênero Candida, pertencendo às espécies Candida albicans
ATCC90028, Candida tropicalis ATCC13803, Candida dubliniensis CBS7987,
Candida parapsilosis ATCC22019, Candida glabrata ATCC2001, Candida
krusei ATCC6258, Candida rugosa ATCC10571. As leveduras armazenadas a -
20 °C foram reativadas após 3 repiques sucessivos, primeiramente em Agar
Sabouraud Dextrose – SDA (Himedia®) e posteriormente em CHROMagar
Candida®(Difco), sob incubação por 48 horas a 37 ºC. O último repique foi
realizado em meio ASD, com incubação a 37 °C por 48h para o método de
triagem e 24 horas para o método do CLSI utilizando caldo RPMI-1640.
Previamente a realização dos ensaios, foram preparadas suspensões das
leveduras em solução salina estéril 0,85%, as quais foram ajustadas
visualmente com base no tubo 0,5 da escala de McFarland.
2.3.2 Determinação da concentração inibitória mínima
Inicialmente, o extrato hidroetanólico e as frações da partição líquido-
líquido foram dissolvidos em DMSO e o volume completado com caldo Mueler-
Hinton (MHC) estéril ou caldo RPMI-1640, de forma a produzir uma solução
contendo DMSO a 5% v/v. Por apresentar elevada solubilidade em água,
apenas a fração residual aquosa foi dissolvida em MHC estéril puro. Após o
preparo das soluções, essas foram filtradas em filtro de seringa com membrana
de 0,22 µm.
Para o ensaio de microdiluição, primeiramente foram adicionados 100 μL
da amostra nos poços das colunas 1, 2 e 11. Em seguida, foram transferidos
196
100 μL de MHC para os poços das colunas de 2 a 8 e 200 μL para os poços da
coluna 12. Posteriormente, com o auxílio de uma micropipeta multicanal, foi
realizada uma diluição seriada partindo da coluna 2, homogeneizando-se e
retirando-se 100 μL da mistura (meio + amostra) e adicionando-se ao poço da
coluna seguinte. Este procedimento foi repetido até a coluna 9, desprezando-se
os 100 μL restantes. Após a diluição seriada, foram adicionados 100 μL da
solução contendo o inoculo das células de leveduras em cada poço, exceto nas
colunas 1 e 12 (controle de esterilidade da amostra e do meio de cultura,
respectivamente). Os poços das colunas 10 e 11 foram reservados para o
controle de viabilidade do inóculo na ausência e presença do solvente de
DMSO, respectivamente. Subsequentemente, as placas foram incubadas sob
35 ± 2 °C por 48 horas .
As leituras foram realizadas após o período de incubação (48 horas),
observando-se o crescimento nas respectivas diluições através de comparação
visual. A CIM foi considerada como a menor concentração de extrato ou fração
capaz de inibir visualmente o crescimento de cada cepa, tomando como
referência o respectivo controle de viabilidade (Oliveira et al., 2006).
2.3.3 Ensaio de bioautografia
O ensaio de bioautografia foi realizado segundo Rahalison et al.
(Rahalison et al., 1991) com algumas modificações. As placas de CCD
utilizadas foram cromatoplacas de alumínio revestidas com gel de sílica F254
(Macherey-Nagel®)
Primeiramente, as amostras foram dissolvidas em metanol:agua (75:25,
v/v) de modo a formar uma solução a 20 mg/mL (p/v). Em seguida, com o
auxílio de um capilar, 5 a 10 µl das amostras foram aplicadas em 3 placas de
CCD, sendo a quantidade por aplicação correspondente a 100 µg ou 200 µg.
Foram preparadas duas placas para o ensaio de bioautografia,
constituindo assim uma duplicata, e duas placas para comparação, as quais
foram utilizadas para a revelação com os agentes cromogênicos vanilina
sulfúrica e Reagente Natural A. Para o ensaio de bioautografia, também foram
reservadas duas placas de CCD para a realização de uma duplicata dos
controles de viabilidade do inóculo (placa de CCD desenvolvida sem amostra)
197
e viabilidade do inóculo na presença do solvente (placa de CCD desenvolvida
com aplicação do solvente utilizado para a dissolução da amostra).
A CCD foi desenvolvida em uma cuba saturada (10 minutos de
saturação) com a fase móvel acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água
(100:15:6:15, v/v/v/v). Os cromatogramas foram secos em capela, com o
auxílio de um secador portátil, para a remoção do solvente.
Subsequentemente, as placas de CCD foram transferidas para uma cabine de
fluxo laminar e submetidas à ação de lâmpada germicida (UV 254 nm) por 20
minutos para efeitos de esterilização. Posteriormente, foram depositadas em
placas de Petri de 150 mm por 15 mm.
Após a etapa de desenvolvimento e acondicionamento das placas de
CCD, 3 mL de uma suspensão de uma cepa de referência de C. glabrata
(ATCC 2001) a aproximadamente 1x108 UFC/mL, foram transferidos para 30
mL de ASD, fundido e mantido em banho-maria a 50°C. O inóculo diluído no
ágar foi então aplicado sobre as placas de CCD com o auxílio de uma pipeta de
vidro estéril. Ao final, as placas de Petri foram incubadas em estufa a 37 °C por
48 horas e, logo após a incubação, visualizadas para a detecção de halos de
inibição.
2.4 Purificação da fração mais ativa
O extrato hidroetanólico das folhas foi submetido a diferentes tipos de
fracionamento, orientados com base nos resultados observados nos testes de
concentração inibitória mínima e bioautografia.
2.4.1. Partição líquido-líquido do extrato
O extrato foi particionado com solventes imiscíveis de polaridade
crescente (éter de petróleo, diclorometano, acetato de etila e n-butanol) na
proporção 5:3 (extrato:solvente, v/v), obtendo-se as frações éter de petróleo
(EP-PLL01), diclorometano (CH2Cl2-PLL01), acetato de etila (AcOEt-PLL01), n-
butanol (BuOH-PLL01) e residual aquosa (RA-PLL01).
198
2.4.2. Cromatografia em contra corrente de alta velocidade
A partir da fração BuOH-PLL01, foram realizadas separações por
cromatografia em contra-corrente de alta velocidade.
2.4.2.1. Equipamento
Para o fracionamento por CCCAV, foi utilizado um Cromatógrafo em
Contracorrente de Alta Velocidade da P.C.Inc.®, equipado com uma coluna em
espiral multicamada de 110 mL e equilibrada com contrapeso, loop de 7 mL,
bomba de alta pressão Merk-Hitachi® modelo L-6000 e um coletor de frações
automático Eldex®.
2.4.2.2 Seleção dos sistemas de solvente
Os sistemas de solventes utilizados nas separações por CCCAV foram
escolhidos com base em testes de tubo de ensaio e teste empírico diretamente
no equipamento de CCCAV.
Os testes em tubo de ensaio consistiram em se adicionar cerca de 5 mg
da fração BuOH-PLL01 num tubo de ensaio contendo o sistema de solventes
previamente equilibrado. O tubo foi agitado vigorosamente para particionar a
amostra entre as duas fases e posteriormente mantido em repouso para o
alcance do equilíbrio. Amostras das duas fases equilibradas foram coletadas e
analisadas por CCD utilizando a fase móvel acetato de etila:ácido
fórmico:metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v) e visualização sob luz UV a 254 nm,
seguido de detecção com Reagente Natural A/UV 365 nm
(difenilborietoxietilamina 3% em MeOH).
199
2.4.2.3. Preparo da amostra e do sistema de solvente
A amostra foi preparada dissolvendo-se 1 g em 6 mL de fase aquosa e 1
mL de fase orgânica. O sistema de solventes utilizado era composto por
acetato de etila:butanol:água (10:4:10/ v/v/v), com adição prévia de 0,2 mL
ácido fórmico na fase orgânica e a adição de amônia na fase aquosa, cuja
quantidade utilizada foi suficiente para tornar o pH em torno de 8.
2.4.2.4. Procedimento da separação por CCCAV
A coluna, enquanto estava estática, foi primeiramente preenchida com
fase estacionária (fase orgânica acidificada) sob um fluxo de 9 mL/min durante
20 minutos. Posteriormente, iniciou-se a rotação do equipamento a 530 rpm e,
enquanto isso, a fase móvel (fase aquosa) foi bombeada para o interior da
coluna no sentido centro-periferia sob um fluxo de 1,2 mL/min. Após o alcance
do equilíbrio hidrodinâmico, caracterizado pela saída de uma única fase, a
amostra foi injetada e as frações coletadas num volume entre 2 e 9 mL.
2.4.3 Obtenção da fração enriquecida em saponinas
As frações 02, 03 e 05-CCCAV foram reunidas (290,3 mg + 43,4 mg +
42,2 mg) e utilizadas num fracionamento por cromatografia em coluna de fase
reversa. As frações reunidas (375,9 mg) foram dissolvidas em 3 mL de
metanol:água (23:77, v/v). Posteriormente, a amostra foi aplicada na coluna
empacotada com fase reversa (Merck Lichroprep ®, 40-63 µm; 21,5 x 2,5 cm de
fase estacionária) e eluida a um fluxo de 0,8 mL/min com um gradiente de
metanol e água. Foram obtidas 9 frações, sendo utilizada a fração 07-CCFR07
no teste biológico.
2.4.4 Isolamento da saponina ZJS1
Após os experimentos com cromatografia em Contra Corrente de Alta
Velocidade, o que restou da fração butanol (25,0495 g) foi utilizado num
fracionamento por partição líquido-líquido. A fração foi suspensa em 300 mL de
200
metanol:água 25:75 (v/v) e submetida a partição líquido-líquido com solventes
de polaridade crescente em funil de separação, numa proporção de 5:3 v/v
amostra/solvente. Foram utilizados, em sequencia, os seguintes solventes: éter
etílico,.acetato de etila, uma mistura composta por acetato de etila e butanol
(60:40, v/v,) e por último o butanol. A partir desse primeiro procedimento, foram
obtidas as frações 01-PLL02, 02-PLL02 e 03-PLL02.
A fração 03-PLL02 (fração acetato de etila:butanol {40:60, v/v}) foi
ressuspensa em 100 mL de metanol:água (20:80, v/v) e submetida a uma
partição líquido-líquido na proporção 5:4 (amostra/solvente), primeiramente
com acetato de etila, seguido do butanol. As frações obtidas com esse
procedimento foram 01-PLL03 e 02-PLL03.
A fração 02-PLL03 (5,6 g) que, de acordo com o seu perfil por CCD,
estava mais concentrada nas substâncias de interesse, foi submetida a uma
cromatografia em coluna de gel de filtração (CGF) utilizando a fase estacionária
Sephadex ® LH-20. Foram realizadas duas separações por esse método
(CGF01 e CGF02), utilizando 2 g de amostra, que foi dissolvida em 8 mL de
MeOH:H2O (6:2, v/v).
Posteriormente, a fração 02-CGF01 (643 mg) e 02-CGF02 (550 mg),
foram submetidas, separadamente, ao mesmo processo, com a exceção de
que as amostras foram dissolvidas em 1,5 mL de MeOH:H2O (1:2, v/v) e
eluídas sob um fluxo de 1 mL/min.
As frações 05-CGF03 e 04-CGF04 foram reunidas (177,1 mg) e
submetidas a uma cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12, 36x2
cm, 100 µl, Chromabond®, Macherey Nagel). A amostra foi dissolvida em 0,7
mL de MeOH:H2O (5:2, v/v) e eluída com um gradiente de MeOH: H2O sob um
fluxo de 0,7 mL/min.
A partir desse procedimento, foram obtidas 10 frações, sendo a fração 5
(5 mg) analisada em equipamento de ressonância magnética nuclear.
201
3. Resultados e discussão
3.1 Atividade do extrato hidroetanólico das folhas (EHF) de Ziziphus joazeiro
frente a cepas de referência
Inicialmente, foi realizada uma triagem da atividade anti-Candida do
EHF de Ziziphus joazeiro Mart. por meio da determinação da concentração
inibitória mínima (CIM). O ensaio foi executado frente a 7 cepas de referência
do gênero Candida e uma de Trichosporon asahii. Após o ensaio, observou-se
que o EHF, na concentração de 5 mg/mL, foi capaz de inibir o crescimento de
quatro leveduras: C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata e C. rugosa (Tabela
1)
Tabela 1 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z.
joazeiro Mart.frente a cepas de referência de leveduras de importância clínica.
Cepas de referência CIM
(mg/mL)
Extrato
Candida albicans ATCC90028 5
Candida tropicalis ATCC13803 +*
Candida dubliniensis CBS7987 5
Candida parapsilosis ATCC22019 +
Candida glabrata ATCC2001 5
Candida krusei ATCC6258 +
Candida rugosa ATCC10571 5
Trichosporon asahii CBS 2630 + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)
Em estudos anteriores, o infuso e uma fração butanol concentrada em
saponinas, obtidos da casca do caule de Ziziphus joazeiro, apresentaram
atividade frente a uma gama de espécies fúngicas, incluindo C. albicans, C.
guilliermondii, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum, Fonsecaea
pedrosoi e Aspergillus niger. Foi reportada uma CIM de 25 µg/mL para o infuso
da casca frente a C. albicans ATCC18804 (Cruz et al., 2007; Ribeiro et al.,
2013) e uma CIM de 156 µg/mL para a fração butanol frente a C. albicans
ATCC10231.
202
Entretanto, o extrato aquoso das folhas, assim como o seu extrato
hidroetanólico, não apresentaram atividade em ensaios de difusão em ágar e
microdiluição frente a C. albicans, C. guilliermondii, C. krusei ,C. tropicalis, C,
neoformans, T. rubrum e F. pedrosoi (Brito et al., 2015; Cruz et al., 2007; Melo
et al., 2012).
De acordo com a literatura etnobotânica, as cascas são amplamente
utilizadas pela população do Nordeste na limpeza dos dentes e cabelos, devido
à presença de saponinas neste farmacógeno. Para as folhas, também há
dados acerca do seu uso etnobotânico para as mesmas finalidades, assim
como relatos da presença de saponinas (Cartaxo et al., 2010; Leonardo and
Oliveira, 2005; Lorenzi and Matos, 2008) As saponinas são substâncias
anfifílicas, amplamente conhecidas por sua ação desestabilizante sobre
membranas biológicas, além de apresentarem atividade antifúngica in vitro
frente a diferentes cepas, incluindo espécies do gênero Candida (Augustin et
al., 2011; Sparg et al., 2004). Baseado nisso, é evidente que a atividade
antifúngica observada para os extratos da casca, nos estudos de CRUZ et al
(2007) e Ribeiro et al (2013), é decorrente da presença de saponinas. Assim,
uma hipótese que poderia explicar a inatividade das folhas seria a de que
essas apresentam saponinas, porém numa concentração inferior ao teor
presente na casca, a ponto de ser insuficiente para ter atividade biológica
dentro dos limites estabelecidos no estudo. Por consequência, a realização de
um fracionamento poderia tornar essa atividade melhor detectável.
4.3.2 Atividade das frações da partição líquido-líquido do (EHF) de Ziziphus
joazeiro frente a cepas de referência
Considerando essa hipótese, prosseguiu-se o fracionamento do extrato
por meio de uma partição líquido-líquido com solventes de polaridade
crescente, resultando nas frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01,
BuOH-PLL01 e residual RA-PLL01. A partir da determinação da CIM (Tabela
2), observou-se que as cepas inibidas por um maior número de frações foram
Candida albicans, C. glabrata e C. rugosa. Com relação à atividade das
frações, a fração diclorometano foi a que inibiu o maior número de leveduras,
sendo ativa contra 5 espécies. Porém, a fração butanol destacou-se por
203
apresentar a menor CIM, frente à cepa de C. glabrata ATCC2001, numa
concentração de 0,625 mg/mL (Tabela 2). Para verificar a reprodutibilidade
desse resultado, o teste da fração butanol frente a C. glabrata ATCC2001 foi
realizado novamente, desta vez em duplicata, sendo observado o mesmo valor
de CIM.
3.3 Atividade das frações da partição líquido-líquido do (EHF) de Ziziphus
joazeiro frente a cepas de referência
Tabela 2. CIM de frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-
PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de Candida.
Cepas de referência CIM (mg/mL)
EP-
PLL01 CHCl2-PLL01
AcOEt-PLL01
BuOH-PLL01
RA-PLL01
Candida albicans ATCC90028 +* 5 5 5 +
Candida tropicalis ATCC13803 + + + + +
Candida dubliniensis CBS7987 + + + + +
Candida parapsilosis ATCC22019 + + + + +
Candida glabrata ATCC2001 5 5 5 0,625 +
Candida krusei ATCC6258 + 5 + + +
Candida rugosa ATCC10571 + 5 5 5 +
Trichosporon asahii CBS 2630 + 5 + + + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)
A exemplo do estudo de Ribeiro et al (2013), as saponinas são
frequentemente concentradas na fração butanol após um procedimento de
partição líquido-líquido. Uma vez que foi detectada a presença de saponinas na
fração butanol, após o teste de formação de espuma em tubo de ensaio e com
base nas propriedades das saponinas expostas anteriormente, hipotetizou-se
que essas seriam as substâncias responsáveis pela atividade da fração butanol
frente à levedura C. glabrata.
3.4 Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOH-PLL01
Com base nisso, objetivou-se obter frações concentradas nessas
manchas por meio de técnicas cromatográficas, para posteriormente serem
204
testadas biologicamente. Assim, a fração BuOH-PLL01 foi submetida a uma
separação por CCCAV de refinamento por zona de pH, e a fração 2
cromatografada em coluna de fase reversa. A partir dessa coluna, a fração 7
(07-CCFR07) foi testada pelo ensaio de microdiluição em caldo frente à C.
glabrata, apresentando uma CIM de 0,117 ± 0,055 mg/mL (média ± desvio
padrão).
Com o objetivo de corroborar esses resultados, realizou-se o teste de
bioautografia por revestimento de ágar em duplicata, novamente frente a cepa
ATCC 2001 de C. glabrata. Após a realização da bioautografia, observou-se a
formação de halos de inibição em torno da região correspondente às manchas
azuis presentes no extrato bruto, fração butanol e a fração 07-CCFR07,
observadas na placa controle que foi revelada com vanilina sulfúrica.
Considerando a sua polaridade, essas manchas podem corresponder a
saponinas. A partir da casca de Ziziphus joazeiro, foram isoladas saponinas
derivadas de jujubogenina, bem como de lotogenina, presente em Ziziphus
lotus, sendo todas as saponinas com núcleo damarano (Higuchi et al., 1984;
Schühly et al., 2000). Portanto, é possível que as saponinas detectadas sejam
derivadas das sapogeninas jujugogenina ou lotogenina. Outro resultado
relevante é a seletividade observada para a fração BuOH-PLL01 frente a C.
glabrata, uma importante espécie de Candida não-Candida albicans que
apresenta susceptibilidade intrínseca ao azólicos, além de isolados resistentes
a caspofungina já descritos (Alexander et al., 2013).
3.5. Teste da fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência segundo o
método do CLSI
A partir da fração 07-CCFR07, enriquecida em saponinas e de
rendimento satisfatório, foi realizado um novo teste de microdiluição, em caldo
RPMI-1640, utilizando um leque maior de microorganismos. As amostras foram
testadas frente às 8 cepas de referência, com o objetivo de averiguar se a
atividade da fração 07-CCFR07 se estenderia para outras leveduras. Após a
realização do teste, a fração 07-CCFR07, além de inibir o crescimento de C.
glabrata, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans, C. dubliniensis, C.
parapsilosis, C. rugosa e T. asahii. A média da CIM para C. albicans e C.
205
glabrata foi equivalente (94 µg/mL), assim como entre C. dubliniensis e C.
parapsilosis (CIM = 188 µg/mL), e entre C. rugosa e T. asahii (CIM = 125
µg/mL). A concentração fungicida mínima também foi determinada, sendo
observado que Candida rugosa ATCC10571 e Trichosporon asahii CBS2630
apresentaram CFM correspondente a CIM, o que significa dizer que a
concentração de 125 µg/mL apresentou efeito fungicida frente a essas duas
cepas. Por outro lado, para C. albicans ATCC90028, C. dubliniensis CBS7987,
C. parapsilosis ATCC22019 e C. glabrata ATCC2001, a CIM apenas foi capaz
de apresentar efeito fungistático, porém em concentrações maiores foi
observado efeito fungicida (Tabela 3)
Tabela 3. CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de
Candida.
Cepas de referência CIM (mg/mL)* CFM (mg/mL)*
Candida albicans ATCC90028 0,094±0,044 0,3125±0,265
Candid atropicalis ATCC13803 +** +
Candida dubliniensis CBS7987 0,188±0,088 0,5±0
Candida parapsilosis ATCC22019 0,188±0,088 +
Canida glabrata ATCC2001 0,094±0,044 0,125±0
Candida krusei ATCC6258 + +
Candida rugosa ATCC0571 0,125±0 0,125±0
Trichosporon asahii CBS2630 0,125±0 0,125±0 * Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2) **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada
A fim de complementar os resultados anteriores, essa mesma fração foi
testada frente a 15 isolados clínicos do banco de cepas do Laboratório de
Micologia Médica e Molecular (LMMM) obtidos a partir do Hospital Universitário
Onofre Lopes. Foram utilizadas 9 cepas de infecção sistêmica e 6 cepas de
infecção superficial coletadas de diferentes fontes, incluindo sangue, urina,
cavidade oral e unha.
Após a determinação da CIM, foi observado que todas as cepas foram
inibidas, exceto Candida parapsilosis LMMM 104 e C. parapsilosis LMMM 84
(CO). A susceptibilidade por cepa de uma mesma espécie e entre espécies foi
variável, porém foi observada uma tendência de menor susceptibilidade para C.
parapsilosis (Tabela 4).
206
Tabela 4. Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07 testada
frente a cepas clínicas.
Isolados clínicos CIM (mg/mL)*
Candida albicans LMMM 116 (U) 0,375±0,177
Candida albicans LMMM 78 (S) 0,25±0
Candida albicans LMMM 233 (S) 0,25±0
Candida glabrata LMMM 48 (CO) 0,188±0,088
Candidaglabrata LMMM 79 (S) 0,25±0
Candida glabrata LMMM 249 (S) 0,188±0,088
Candida glabrata LMMM 255 (S) 0,25±0
Candida tropicalis LMMM 190 (Ur) 0,188±0,088
Candidatropicalis LMMM 21 (Ur) 0,625±0,530
Candida tropicalis LMMM 35 (O) 0,188±0,088
Candida parapsilosis LMMM 81 (S) 0,750±0,354
Candida parapsilosis LMMM 104 (U) +**
Candida parapsilosis LMMM 84 (CO) +
Candida dubliniensis LMMM (CO) 0,188±0,088
Trichosporon asahii LMMM 451 (S) 0,188±0,088 * média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2); **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada S = sangue. Ur = urina. CO = cavidade oral. U = unha;
Uma vez que neste trabalho não foi realizada uma análise fenotípica
detalhada das cepas, nem se conhece o mecanismo de ação dessa fração, não
é possível afirmar a razão de C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei
apresentarem menor susceptibilidade. Acrescenta que, em estudos
epidemiológicos, a susceptibilidade de espécies do gênero Candida varia de
acordo com a região geográfica, sítio de coleta e tamanho da amostra de cepas
coletadas. Apesar disso, é possível sugerir hipóteses levando em consideração
um dos principais efeitos biológicos das saponinas: a perturbação de
membranas.
Apesar de até o momento não haver uma explicação única e definitiva
de como as saponinas atuam em membranas, em virtude da variação
observada nos resultados, que dependem da natureza química da saponina
estudada, como tipo de aglicona e glicosilação, a maioria dos trabalhos
apontam para um elemento em comum, sobre o qual as saponinas atuam para
que ocorra a perturbação da membrana: o colesterol (Augustin et al., 2011; Hu
207
et al., 1996; Korchowiec et al., 2015; Sudji et al., 2015; Wojciechowski et al.,
2016).
Posto que o ergosterol é o principal esteroide que compõe a membrana
de células fúngicas, a menor susceptibilidade observada para C. tropicalis, C.
parapsilosis e C. krusei poderia ser explicada com base numa alteração do teor
de ergosterol da membrana, caso o mecanismo antifúngico das saponinas
estudadas fosse a complexação com o ergosterol e outros esteroides.
Candida krusei ATCC6258 é a única cepa deste estudo da qual se
conhece previamente sua susceptilibidade aos antifúngicos azólicos, que
inibem a síntese do ergosterol. Segundo OROZCO et al. (Orozco et al., 1998) ,
essa cepa de referência apresenta resistência aos azólicos, possivelmente
devido a uma menor afinidade da enzima 14-α-demetilase a esses antifúngicos.
Não se sabe o que esse mecanismo de resistência poderia influenciar na
menor susceptibilidade às saponinas, considerando a hipótese de se
complexarem com os esteroides da membrana para danifica-la. Porém, isso
abre perspectivas para estudos mais detalhados acerca dos mecanismos
envolvidos na menor susceptibilidade dessa espécie. Ademais, outra
perspectiva para futuros trabalhos é avaliar se a atividade dessa fração
enriquecida em saponinas é dependente da presença de ergosterol e outros
esteroides na membrana da célula fúngica
3.6 Identificação presuntiva da saponina ZJS1
Inicialmente, foram analisados os espectros monodimensionais de 1H e
13C, aliado a análise por HMQC, para identificar sinais característicos das
saponinas isoladas das cascas de Ziziphus joazeiro Mart. por Higuchi et al.
(1984) e Schühly et al. (2000). No espectro de RMN 1H, foi possível observar 7
singletos de alta intensidade em δH 0,73, 0,77, 0,94, 1,00, 1,02, 1,58 e 1,64,
sugestivos de hidrogênios de metila (Figura 39), os quais, por HMQC, foram
atribuídos a seus respectivos carbonos (δH 0,73↔16,4; δH 0,77↔16,5; δH
0,94↔δC 27,6; δH 1,00↔δC 18,8; δH 1,02↔δC 29,7; δH 1,6↔δC 18,5; δH1,64↔δC
25,7), vários sinais sobrepostos entre δH 3,2 e 3,9, indicativo de hidrogênios de
açúcar (Figura 40), além de dubletos entre δH 4,2 e 5,5, sugestivos de
hidrogênios de carbonos anoméricos. Após a análise do espectro de 13C
208
(Figura 42), contatou-se a presença de 23 sinais sugestivos de carbonos
saturados, 17 sinais de metinas ou metilenos oxigenados e 3 sinais
característicos de carbonos anoméricos (δC 103,15↔ δH4,40 [d, J = 8,0 Hz];
104,79↔ δH [4,25, d, J = 6,8 Hz]; 108,73↔ δH 5,13 [d, J = 2,3 Hz]) o que
permite sugerir a presença de 3 açúcares ligados a aglicona. Ainda,
destacaram-se 2 sinais em campo mais desprotegido, em δC 126,27 e 133,92,
sugestivos de carbono olefínico.
Apesar de os espectros terem sido obtidos em DMSO, observou-se uma
semelhança e corência desses deslocamentos químicos com os da saponina
bacosídeo X, obtidos em metanol e piridina.. Portanto, a partir dos dados
obtidos na análise preliminar, foi realizada uma estratégia de atribuição
sequencial dos sinais da aglicona através das correlações homo e
heteronucleares de HMQC, HMBC, COSY e NOESY, assim como em
comparação com a literatura citada. Por conseguinte, foi possível atribuir todos
os sinais de hidrogênios e carbonos observados para a aglicona e uma parte
dos sinais referentes à porção glicídica (Tabela 5 e 6).
Figura 2. Principais correlações de HMBC e COSY observadas.
Flecha azul = correlação de HMBC. Flecha vermelha = correlação de COSY.
O
O
OH
O
O O
OH OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OHO
OH2
1
3
45
67
89
10
29(28)
28(29)
30
13
12
1118
14
1716
20
22
23
24
26(27)
27(26)25
19
15
1'2'
3'
4'5'
2''
5''
3''
4''1''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
21
209
ZJS1 Bacopasídeo X*
Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz) HMBC Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz)
1 38,6 1,55 (m); 0,84 (m) H-19 1 39,8 1,67 (m); 0,92 (m) 2 26,3 1,52 (m), 1,65 (m) - 2 27,3 1,85 (m); 1,70 (m) 3 88,3 2,96 (dd, J = 11,6; 4,0) H-28, H-29, H-1' 3 90,3 3,11 (dd, J = 12,3; 4,3) 4 39,4 - H-28, H-29 4 40,6 - 5 55,8 0,66 (d, J = 11,6 Hz) H-28, H-29 5 57,4 0,74 (d, J = 9,1) 6 18,0 1,47 (m); 1,35 (m) - 6 19,1 1,59 (m); 1,52 (m) 7 35,7 1,45 (m); 1,32 (m) H-18 7 36,9 1,56 (m); 1,49 (m) 8 37,2 - - 8 38,5 - 9 52,4 0,78 (m) H-19 9 54,1 0,88 (m)
10 37,1 - H-19 10 38,3 - 11 21,5 1,48 (m) - 11 22,5 1,64 (m), 1,50 (m) 12 28,1 1,69 (m); 1,73 (m) - 12 29,2 1,86 (m); 1,67 (m) 13 37,1 - H-18 13 38 2,48 (ddd, J = 12,5; 6,7; 6,4) 14 53,1 - H-18 14 54,6 - 15 36,2 1,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 0,98 (s) H-30b 15 36,7 2,06; 1,18 (2d, J = 8,7) 16 109,9 - H-21, H-17 16 111,4 - 17 53,3 0,82 (d, J = 6,4 Hz, 1H) - 17 54,4 1,00 (d, J =6,7) 18 18,8 1,00 (s) - 18 19,2 1,14 (s) 19 16,5 0,77 (s) - 19 16,8 0,88 (s) 20 67,9 - H-22 20 69,4 - 21 29,7 1,02 (s) - 21 29,6 1,14 (s) 22 44,6 1,23 (m); 1,36 (m) H-21 22 45,5 1,47 (m); 1,38 (m) 23 67,9 4,48 (m) H-21 23 69,7 4,68 (ddd, J = 11,3; 8,1; 1,3) 24 126,3 5,08 (dt, J = 8,0 Hz) H26, H-27 24 126,3 5,15 (m) 25 134,0 - H-26, H-28 25 136,7 - 26 25,7 1,64 (s) H-27, H-24 26 25,8 1,72 (s) 27 18,5 1,58 (s) H-26, H-24 27 18,4 1,70 (s) 28 27,6 0,94 (s) H-29 28 28,3 1,05 (s) 29 16,4 0,73 (s) H-28 29 16,8 0,85 (s) 30 65,4 3,64; 3,82 H-15 30 66,9 4,03; 3,94 (2d, J = 12,6)
Tabela 5. Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a
aglicona, em comparação com a literatura.
* SCHÜHLY et al (2000); 400 MHz, CD3OD
210
Tabela 6 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a
glicona, em comparação com a literatura.
ZJS1
Bacopasídeo X*
Posição δ C (ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J (Hz) HMBC COSY Posição δ C
(ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J
(Hz)
3-arabnopiranosil
3-arabnopiranosil
1' 104,8 4,25 (d, J= 6,8 Hz) H-3, H-2' H-3, H-2', H-4' 1' 106 4,39 (d,J=6.4)
2' 75,3 3,57 (m)
H-1' 2' 77,2 3,75 (dd)
3' 81,7 3,63 (m) H-2', H-
1''' H-1''' 3' 83,7 4,05 (dd, J=5,1, 2,6)
4' 67,5 3,82 (m) - H-1' 4' 69,2 4,03 (ddd)
5' 65,4 3,66 (m); 3,36 (m) H-1' - 5' 65,9 3,85 (dd), 3.54 (dd)
2'-arabnofuranosil
2'-arabnofuranosil
1'' 108,8 5,13 (d, J = 2,3 Hz) H-2' H-2'' 1'' 110,3 5,30 (d, J= 2,6)
2'' 82,7 3,87 (td, J = 2,4 Hz) - H-1''' 2'' 83,7 4,09 (dd, J = 5,0; 2,6)
3'' - - - - 3'' 77,9 3.93 (dd)
4'' - - - - 4'' 84,6 3.97 (ddd)
5'' - - - - 5'' 62,1 3,71, 3,60 (2dd, J= 12,3, 2,9)
3'-glicopiranosil
3'-glicopiranosil
1''' 103,2 4,40 (d, J = 8,0 Hz) H-2''' H-3', H-2''' 1''' 104,9 4,51 (d, J = 7,6)
2''' 74,1 3,12 (m) - H-1''' 2''' 75,2 3,28 (dd)
3''' - - - - 3''' 77,7 3,92 (dd, J = 7,6; 4,9)
4''' - - - - 4''' 71,1 3,33 (dd)
5''' - - - - 5''' 77,8 3,35 (ddd)
6''' - - - - 6''' 62,3 3,83; 3,67 (2dd, J = 8,2; 5,2) * SCHÜHLY et al (2000); 400 MHz, CD3OD
211
As análises dos espectros ainda estão em andamento para a confirmação
da porção glicídica, sendo ainda necessárias outras análises, como espectrometria
de massas, para confirmar a identidade da molécula. Com base na análise
realizada até o momento, a substância ZJS1 foi presuntivamente identificada como
bacopasídeo X ou 3-O-[α-L-arabinofuranosil-(1 → 2)-{β-D-glicopiranosil-(1 → 3)-}-α-
L-arabinopiranosil] jujubogenina.
Para essa saponina, foi repordata sua atividade inibitória contra Candida
albicans, Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus, assim como frente a
diferentes linhagens de células humanas tumorais, nos estudos da espécie
Colubrina retusa (LI et al., 1999) e Bacopa monnieri (PENG et al., 2010).
A saponina bacopasídeo X foi isolada da casca de Ziziphus joazeiro
primeiramente por HIGUCHI et al (1984), seguido de SCHÜHLY et al (2000), em que
estes últimos observaram que essa saponina era majoritária na casca. Apesar de
não ter sio realizada a sua quantificação nas folhas, possivelmente essa saponina
também é majoritária nessa parte, pois na análise por CCD com o revelador vanilina
sulfúrica, realizada para o extrato hidroetanólico, observou-se uma intensa mancha
azul de Rf equivalente ao observado para essa saponina.
4. Conclusão
Em suma, foi demonstrado que as principais substâncias antifúngicas do
extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Mart. são as saponinas, as
quais possivelmente estavam em menor concentração no extrato antes do
fracionamento, fornecendo evidências para justificar o uso etnobotânico das folhas
da espécie no tratamento de micoses superficiais. A fração 05-CCFR12 apresentou
atividade frente a uma variedade de cepas de Candida, abrangendo a totalidade de
cepas observadas em estudos de prevalência de infecções invasivas (YAPAR,
2014). A técnica de bioautografia mostrou-se uma importante ferramenta para o
fracionamento bioguiado ao aliar informações de atividade biológica com
informações fitoquímicas. É importante ressaltar a cautela que se deve tomar na
realização desse tipo de estudo, evitando basear-se em poucos resultados e
critérios para descartar uma amostra. O relato da presença de bacopasídeo X nas
folhas de Ziziphus joazeiro é inédido, não sendo encontrado na literatura, até o
momento, trabalhos com abordagem e finalidades semelhantes para a espécie,
212
assim como para o gênero. Assim, este estudo tem caráter inédito e abre novas
oportunidades de investigação científica quanto à atividade antifúngica das
saponinas presentes nas folhas de Ziziphus joazeiro.
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216
APÊNDICE B - ESTRUTURA QUÍMICA DAS SUBSTÂNCIAS MENCIONADAS NA
DISSERTAÇÃO
Lista das substâncias por ordem de citação
N º Nome citado CAS Classe
1 nicotina 54-11-5 alcaloide
2 reserpina 50-55-5 alcaloide indólico
3 muscarina 300-54-9 alcaloide
4 miconazol 22916-47-8 antifúngico azólico
5 fluconazol 86386-73-4 antifúngico azólico
6 voriconazol 137234-62-9 antifúngico azólico
7 posaconazol 171228-49-2 antifúngico azólico
8 ergosterol 57-87-4 esterol
9 nistatina 1400-61-9 antifúngico macrolídeo
10 anfotericina B 1397-89-3 antifúngico macrolídeo
11 caspofungina 179463-17-3 antifúngico
equinocandina
12 micafungina 235114-32-6 antifúngico
equinocandina
13 flucistosina 2022-85-7 diazina
14 pirimidina 289-95-2 diazina
15 óxido nítrico 10102-43-9 óxido de nitrogênio
16 miricitrina 17912-87-7 flavonoide (flavonol)
17 rutina 153-18-4 flavonoide (flavonol)
18 quercitrina 522-12-3 flavonoide (flavonol)
19 quercetina 117-39-5 flavonoide (flavonol)
20 diclorometano 75-09-2 organoclorado
21 metanol 67-56-1 alcoól
22 hexano 110-54-3 alcano
23 clorofórmio 67-66-3 organoclorado
217
24 etanol 64-17-5 alcóol
25 acetato de etila 141-78-6 éster carboxílico
26 mucronina A 38840-25-4 alcaloide cliclopeptídico
27 mucronina D 38496-00-3 alcaloide cliclopeptídico
28 mucronina J 177714-94-2 alcaloide cliclopeptídico
29 ácido ceanótico 21302-79-4 ácido triterpênico
30 ácido ceanotênico 5948-16-3 ácido triterpênico
31 ácido zizimaurítico A 1403460-06-9 ácido triterpênico
32 ácido zizimaurítico B 1403460-07-0 ácido triterpênico
33 ácido zizimaurítico C 1403460-08-1 ácido triterpênico
34 ácido betulínico 472-15-1 ácido triterpênico
35 oxifilina B 1453167-58-2 alcaloide ciclopeptídico
36 oxifilina C 1453167-59-3 alcaloide ciclopeptídico
37 oxifilina D 1244672-17-0 alcaloide ciclopeptídico
38 nummularina C 53947-97-0 alcaloide ciclopeptídico
39 nummularina R 113836-69-4 alcaloide ciclopeptídico
40 quercetina-3-O-α-L-arabinosil-(1 → 2)-α-
L-rhamnosídeo 104683-55-8 flavonoide (flavonol)
41 quercetina-3-O-β-d-xilosil-(1 → 2)-α-L-
ramnosídeo 1327275-49-9 flavonoide (flavonol)
42 ziziphus saponina 1 77943-56-7 saponina (damarano)
43 ziziphus saponina 2 77943-83-0 saponina (damarano)
44 ácido alfitólico 19533-92-7 ácido triterpênico
45 ácido maslínico 4373-41-5 ácido triterpênico
46 ácido 2-α-hidroxiursólico 4547-24-4 ácido triterpênico
47 ácido ziziberanálico 67594-73-4 ácido triterpênico
48 ácido epiceanótico 912676-19-8 ácido triterpênico
49 ácido oleanólico 508-02-1 ácido triterpênico
50 jujubogenina 54815-36-0 triterpeno
51 bacopasídeo X 94443-88-6 saponina (damarano)
218
52 β-D-glicopiranose 492-61-5 carboidrato
53 α-L-arabinofuranose 38029-69-5 carboidrato
54 α-L-arabinopiranose 7296-55-1 carboidrato
55 bacopasídeo X 4’’’-O-sulfato 94414-14-9 saponina (damarano)
56 bacopasídeo X 3’’, 4’’’-di-O-sulfato 94414-15-0 saponina (damarano)
57 lactona ebelin 3649-76-1 triterpeno
58 cafeína 58-08-2 metilxantina
59 ácido ursólico 77-52-1 ácido triterpênico
60 ácido betulínico 7-β-O-(4-
hidroxibenzoiloxi) 256932-93-1 ácido triterpênico
61 ácido betulínico 7-β-O-(4-hidroxi-3'-
metoxibenzoiloxi) 256932-94-2 ácido triterpênico
62 ácido betulínico 27-O-(4-hidroxi-3'-
metoxibenzoiloxi) 256932-95-3 ácido triterpênico
63 jujubosídeo A 55466-04-1 saponina (damarano)
64 lotosídeo A 292044-97-4 saponina (damarano)
65 lotosídeo I 189136-86-5 saponina (damarano)
66 lotosídeo II 189163-11-9 saponina (damarano)
67 joazeirogenina 292044-99-6 triterpeno
68 joazeirosídeo A 292044-89-4 saponina (damarano)
69 joazeirosídeo B 292044-93-0 saponina (damarano)
70 ácido gálico 149-91-7 ácido fenólico
71 ácido clorogênico 327-97-9 ácido fenólico
72 ácido cafêico 331-39-5 ácido fenólico
73 ácido elágico 476-66-4 ácido fenólico
74 catequina 154-23-4 flavonoide (flavano-3-ol)
75 epicatequina 490-46-0 flavonoide (flavano-3-ol)
76 isoquercitrina 482-35-9 flavonoide (flavonol)
77 canferol 520-18-3 flavonoide (flavonol)
78 amoxicilina 26787-78-0 β-lactâmico
79 penicilina G 61-33-6 β-lactâmico
219
80 gentamicina 1403-66-3 aminoglicosídeo
81 amicacina 37517-28-5 aminoglicosídeo
82 vancomicina 1404-90-6 glicopeptídeo
83 2,2-difenil-2-picrilhidrazila 1898-66-4 nitrofenol (picrato)
84 N-Nitroso-N-etilureia 684-93-5 nitrosoureia
85 acetona 67-64-1 cetona
86 acetonitrila 75-05-8 alcanonitrila
87 dimetilsulfóxido 67-68-5 organosulfóxido
88 n-butanol 71-36-3 álcool
89 tolueno 108-88-3 hidrocarboneto
aromático
90 ácido sulfúrico 7664-93-9 ácido inorgânico
91 ácido acético 64-19-7 ácido carboxílico
92 ácido fórmico 64-18-6 ácido carboxílico
93 hidróxido de amônio 1336-21-6 base inorgânica
94 cloreto férrico 7705-08-0 cloreto
95 difenilborietoxietilamina 524-95-8 organoborano
96 vanilina 121-33-5 benzaldeído
97 ácido tânico 1401-55-4 tanino (galotanino)
98 apigenina 520-36-5 flavonoide (flavona)
99 crisina 480-40-0 flavonoide (flavona)
100 diosmina 520-27-4 flavonoide (flavona)
101 isoorientina 4261-42-1 flavonoide (flavona)
102 isovitexina 38953-85-4 flavonoide (flavona)
103 luteolina 491-70-3 flavonoide (flavona)
104 morina 654055-01-3 flavonoide (flavonol)
105 narigenina 480-41-1 flavonoide (flavanona)
106 vicenina-2 23666-13-9 flavonoide (flavonol)
107 vitexina 3681-93-4 flavonoide (flavonol)
108 ácido 2,4 dinitrobenzóico 610-30-0 nitrobenzoato
220
109 sulfassalazina 599-79-1 sulfonamida
110 tiopental 76-75-5 barbiturato
111 licodaína 137-58-6 acetanilida
112 isoramnetina 480-19-3 flavonoide (flavonol)
113 quercetina 3-O-galactosídeo 482-36-0 flavonoide (flavonol)
114 canferol-3-O-rutinosídeo 17650-84-9 flavonoide (flavonol)
115 isoramnetina-3-O-rutinosídeo 604-80-8 flavonoide (flavonol)
116 isoramnetina-3-O-galactosídeo 6743-92-6 flavonoide (flavonol)
117 isoramnetina-3-O-glicosideo 5041-82-7 flavonoide (flavonol)
118 jujubosídeo B 55466-05-2 saponina (damarano)
119 jujubosídeo D 194851-84-8 saponina (damarano)
120 jujubosídeo E 855184-67-7 saponina (damarano)
121 escopoletina 92-61-5 cumarina
122 colesterol 57-88-5 esterol
221
Nº Nome citado CAS Classe
1 nicotina 54-11-5 alcaloide
N
N
Nº Nome citado CAS Classe
2 reserpina 50-55-5 alcaloide indólico
O
O
O
O
O
O
O
O
ON
NH H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
3 muscarina 300-54-9 alcaloide
O
N+
OH
222
Nº Nome citado CAS Classe
4 miconazol 22916-47-8 antifúngico azólico
Cl
Cl
O
Cl
Cl
N
N
Nº Nome citado CAS Classe
5 fluconazol 86386-73-4 antifúngico azólico
F
F
N
N
N
NN
NOH
Nº Nome citado CAS Classe
6 voriconazol 137234-62-9 antifúngico azólico
H
N
NF
OH
NN
N
F F
223
Nº Nome citado CAS Classe
7 posaconazol 171228-49-2 Antifúngico azólico
FF
OO
O
OH
N NN
N
N
NN
N
Nº Nome citado CAS Classe
8 ergosterol 57-87-4 esterol
OH
HH
H
Nº Nome citado CAS Classe
9 nistatina 1400-61-9 antifúngico macrolídeo
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH OH
OH
OH
OH
O
O
OH
O
NH2
224
Nº Nome citado CAS Classe
10 anfotericina B 1397-89-3 antifúngico macrolídeo
O
OHOH
O
O
OH
O
OH
OHOH
OH
OH
O
OHOH OHO
NH2
H
Nº Nome citado CAS Classe
11 caspofungina 179463-17-3 antifúngico equinocandina
O
OH
OO
O O
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
O
N
N
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH2
NH2
Nº Nome citado CAS Classe
12 micafungina 235114-32-6 antifúngico equinocandina
S
OH
OO O
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OHO
O
OH
O
OO
O
OHO
N
N
NH
NH
NH
NH
NH
N
NH2
225
Nº Nome citado CAS Classe
13 flucistosina 2022-85-7 diazina
OH
N
N
NH2
F
Nº Nome citado CAS Classe
14 pirimidina 289-95-2 diazina
N N
Nº Nome citado CAS Classe
15 óxido nítrico 10102-43-9 óxido de nitrogênio
O NH
226
Nº Nome citado CAS Classe
16 miricitrina 17912-87-7 flavonoide (flavonol)
O
O
OH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
17 rutina 153-18-4 flavonoide (flavonol)
O
O
O
O
OOH
OH O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
18 quercitrina 522-12-3 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OHOH
OH
OH
OH
O
OH
227
Nº Nome citado CAS Classe
19 quercetina 117-39-5 flavonoide (flavonol)
O
OH
OH O
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
20 diclorometano 75-09-2 organoclorado
Cl
Cl
Nº Nome citado CAS Classe
21 metanol 67-56-1 alcoól
OH
228
Nº Nome citado CAS Classe
22 hexano 110-54-3 alcano
Nº Nome citado CAS Classe
23 clorofórmio 67-66-3 organoclorado
Cl
Cl
Cl
Nº Nome citado CAS Classe
24 etanol 64-17-5 alcóol
OH
229
Nº Nome citado CAS Classe
25 acetato de etila 141-78-6 éster carboxílico
O
O
Nº Nome citado CAS Classe
26 mucronina A 38840-25-4 alcaloide cliclopeptídico
O
NH
ONH
OH
NH
O
N
H
Nº Nome citado CAS Classe
27 mucronina D 38496-00-3 alcaloide cliclopeptídico
NH
N
OO
N
O
O
NH
NH O
O
230
Nº Nome citado CAS Classe
28 mucronina J 177714-94-2 alcaloide cliclopeptídico
O N
ONH
NH OH
O
H
H
N
Nº Nome citado CAS Classe
29 ácido ceanótico 21302-79-4 ácido triterpênico
OH O
H
H
OH
O
OH
HH
Nº Nome citado CAS Classe
30 ácido ceanotênico 5948-16-3 ácido triterpênico
OHO
OH O
H
HH
H
231
Nº Nome citado CAS Classe
31 ácido zizimaurítico A 1403460-06-9 ácido triterpênico
OH O
O
O
O
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
32 ácido zizimaurítico B 1403460-07-0 ácido triterpênico
OH O
O
O
O
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
33 ácido zizimaurítico C 1403460-08-1 ácido triterpênico
OH O
H
O
O
OH
H
H
232
Nº Nome citado CAS Classe
34 ácido betulínico 472-15-1 ácido triterpênico
OH O
OH
HH
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
35 oxifilina B 1453167-58-2 alcaloide cliclopeptídico
O N
ONH
NH OH
O
H
H
NH
O
Nº Nome citado CAS Classe
36 oxifilina C 1453167-59-3 alcaloide cliclopeptídico
NHNH
OO
O
NH
N
O
H
O
H
233
Nº Nome citado CAS Classe
37 oxifilina D 1244672-17-0 alcaloide cliclopeptídico
O N
O
ONH
N
O
HO
HH
N
Nº Nome citado CAS Classe
38 numularina C 53947-97-0 alcaloide cliclopeptídico
N
O
N
O
O
NH
NH O
OH
H
Nº Nome citado CAS Classe
39 numularina R 113836-69-4 alcaloide cliclopeptídico
NH
N
O
N
O
O
NH
NH O
OH
H
234
Nº Nome citado CAS Classe
40 quercetina-3-O-α-L-arabinosil-(1 → 2)-α-L-
rhamnosídeo 104683-55-8 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OOH
H
OH
OOH
Nº Nome citado CAS Classe
41 quercetina-3-O-β-d-xilosil-(1→ 2)-α-L-ramnosídeo 1327275-49-9 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OOH
H
OH
OOH
Nº Nome citado CAS Classe
42 ziziphus saponina 1 77943-56-7 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
235
Nº Nome citado CAS Classe
43 ziziphus saponina 2 77943-83-0 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
44 ácido alfitólico 19533-92-7 ácido triterpênico
OH O
OH
OH
HH
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
45 ácido maslínico 4373-41-5 ácido triterpênico
OH
O
HOH
OH
H
H
236
Nº Nome citado CAS Classe
46 ácido 2-α-hidroxiursólico 4547-24-4 ácido triterpênico
OH
O
HOH
OH
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
47 ácido ziziberanálico 67594-73-4 ácido triterpênico
OH
O
HOH
OH
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
48 ácido epiceanótico 912676-19-8 ácido triterpênico
OH
O
HOH
OH
H
H
237
Nº Nome citado CAS Classe
49 ácido oleanólico 508-02-1 ácido triterpênico
OH
O
H
OH
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
50 jujubogenina 54815-36-0 triterpeno
O
O
OH
H
OH
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
51 bacopasídeo X 94443-88-6 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O O
OH OH
OHH
O
O
OH
OH
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
238
Nº Nome citado CAS Classe
52 β-D-glicopiranose 492-61-5 carboidrato
OH
OH
OH
O
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
53 α-L-arabinofuranose 38029-69-5 carboidrato
OH
OH
OOH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
54 α-L-arabinopiranose 7296-55-1 carboidrato
OH
OH
OH
O
OH
239
Nº Nome citado CAS Classe
55 bacopasídeo X 4’’’-O-sulfato 94414-14-9 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OOH
OH
H
O
O
OH
OH
OH
OS
O O
OH
H
OOH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
56 bacopasídeo X 3’’, 4’’’-di-O-sulfato 94414-15-0 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OOH
O
SO
O
OH
H
O
O
OH
OH
OH
OS
O O
OH
H
OOH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
57 lactona ebelin 3649-76-1 triterpeno
OH
H
HO
O
240
Nº Nome citado CAS Classe
58 cafeína 58-08-2 metilxantina
O
N
N
ON
N
Nº Nome citado CAS Classe
59 ácido ursólico 77-52-1 ácido triterpênico
OH
O
OH
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
60 ácido betulínico 7-β-O(4-hidroxibenzoiloxi) 256932-93-1 ácido triterpênico
OH O
H
O
O
OH
OH
HH
H
241
Nº Nome citado CAS Classe
61 ácido betulínico 7-β-O-(4-hidroxi-3'-
metoxibenzoiloxi) 256932-94-2 ácido triterpênico
OH O
H
O
O
O
OH
OH
HH
H
Nº Nome citado CAS Classe
62 ácido betulínico 27-O-(4-hidroxi-3'-
metoxibenzoiloxi) 256932-95-3 ácido triterpênico
O
O
O
OH
OH O
H
OH
HH
H
Nº Nome citado CAS Classe
63 jujubosídeo A 55466-04-1 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
242
Nº Nome citado CAS Classe
64 lotosídeo A 292044-97-4 saponina (damarano)
OH
OHO
OH
H
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
H
O
OH
O
OH
OH
H O
OH
OH
H
OH
OOH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
65 lotosídeo I 189136-86-5 saponina (damarano)
OH
OHO
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OH
OH
H
O
OH
OH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
66 lotosídeo II 189163-11-9 saponina (damarano)
OH
OHO
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OH
OH
H
O
OH
OH
H
H
H
H
243
Nº Nome citado CAS Classe
67 joazeirogenina 292044-99-6 triterpeno
OH
OHO
OH
H
OH
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
68 joazeirosídeo A 292044-89-4 saponina (damarano)
OH
OHO
OH
H
O
O
OH
OH
OH
OH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
69 joazeirosídeo B 292044-93-0 saponina (damarano)
OH
OHO
OH
H
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
H
O
OH
O
OH
OH
H O
OH
OH
H
OH
OOH
H
H
H
H
244
Nº Nome citado CAS Classe
70 ácido gálico 149-91-7 ácido fenólico
OH
O
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
71 ácido clorogênico 327-97-9 ácido fenólico
O
OH
OH
O
OHO
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
72 ácido cafêico 331-39-5 ácido fenólico
OH
O
OH
OH
245
Nº Nome citado CAS Classe
73 ácido elágico 476-66-4 ácido fenólico
OH
OOH
O
OH
O
O
OH
Nº Nome citado CAS Classe
74 catequina 154-23-4 flavonoide (flavano-3-ol)
OH
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
75 epicatequina 490-46-0 flavonoide (flavano-3-ol)
OH
O
OH
OH
OH
OH
246
Nº Nome citado CAS Classe
76 isoquercitrina 482-35-9 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
77 canferol 520-18-3 flavonoide (flavonol)
O
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
78 amoxicilina 26787-78-0 β-lactâmico
S
O
O
OH
OOH
N
NH
NH2H
247
Nº Nome citado CAS Classe
79 penicilina G 61-33-6 β-lactâmico
S
O
O
OH
O N
NHH
Nº Nome citado CAS Classe
80 gentamicina 1403-66-3 aminoglicosídeo
O
NH2
NHOH
O
NH2
NH2
O
O
OH
NH
OH
H
Nº Nome citado CAS Classe
81 amicacina 37517-28-5 aminoglicosídeo
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OHO
OHOH
NH
NH2
NH2
NH2
NH2
248
Nº Nome citado CAS Classe
82 vancomicina 1404-90-6 glicopeptídeo
OO
Cl
OHCl
OH
O
O
O
NH2
OH
OH
OH
OOH
NH
NH
OO
O
NH2
O
NH
O
NH
NH
ONH
O
O
OHNH
OHOH OH
Nº Nome citado CAS Classe
83 2,2-difenil-2-picrilhidrazila 1898-66-4 nitrofenol (picrato)
O-
O-
O
O
O-
O
N
NH
N+
N+
N+
Nº Nome citado CAS Classe
84 N-Nitroso-N-etilureia 684-93-5 nitrosoureia
N
N O
NH2
O
249
Nº Nome citado CAS Classe
85 acetona 67-64-1 cetona
O
Nº Nome citado CAS Classe
86 acetonitrila 75-05-8 alcanonitrila
N
Nº Nome citado CAS Classe
87 dimetilsulfóxido 67-68-5 organosulfóxido
S
O
250
Nº Nome citado CAS Classe
88 n-butanol 71-36-3 álcool
OH
Nº Nome citado CAS Classe
89 tolueno 108-88-3 hidrocarboneto aromático
Nº Nome citado CAS Classe
90 ácido sulfúrico 7664-93-9 ácido inorgânico
S
O
O
OH OH
251
Nº Nome citado CAS Classe
91 ácido acético 64-19-7 ácido carboxílico
O
OH
Nº Nome citado CAS Classe
92 ácido fórmico 64-18-6 ácido carboxílico
O
OH
Nº Nome citado CAS Classe
93 hidróxido de amônio 1336-21-6 base inorgânica
OH-
NH4
+
252
Nº Nome citado CAS Classe
94 cloreto férrico 7705-08-0 cloreto
Cl
FeClCl
Nº Nome citado CAS Classe
95 difenilborietoxietilamina 524-95-8 organoborano
NH2
O
B
Nº Nome citado CAS Classe
96 vanilina 121-33-5 benzaldeído
O
O
OH
253
Nº Nome citado CAS Classe
97 ácido tânico 1401-55-4 tanino (galotanino)
O
O
OO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OHOH
OH
OOH
OHO
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
OHOH OH
OH
OH
OH OH
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
98 apigenina 520-36-5 flavonoide (flavona)
O
O
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
99 crisina 480-40-0 flavonoide (flavona)
OH
OH O
O
254
Nº Nome citado CAS Classe
100 diosmina 520-27-4 flavonoide (flavona)
O
O
OH
O
OH
O
O
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
101 isoorientina 4261-42-1 flavonoide (flavona)
OH
OH
O
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
102 isovitexina 38953-85-4 flavonoide (flavona)
OH
OH
O
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
255
Nº Nome citado CAS Classe
103 luteolina 491-70-3 flavonoide (flavona)
O
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
104 morina 654055-01-3 flavonoide (flavonol)
O
O
OHOH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
105 narigenina 480-41-1 flavonoide (flavanona)
O
O
OH
OH
OH
256
Nº Nome citado CAS Classe
106 vicenina-2 23666-13-9 flavonoide (flavona)
OH
O
OH
OH
OH
OHOH O
O
OHO
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
106 vitexina 3681-93-4 flavonoide (flavona)
OH
OH O
O
OHO
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
108 ácido 2,4 dinitrobenzóico 610-30-0 nitrobenzoato
OH
ON+
O-
O
N+O
-
O
257
Nº Nome citado CAS Classe
109 sulfassalazina 599-79-1 sulfonamida
SNH
NOO
NN
OHO
OH
Nº Nome citado CAS Classe
110 tiopental 76-75-5 barbiturato
O NH
NH
O
S
Nº Nome citado CAS Classe
111 lidocaína 137-58-6 acetanilida
NHN
O
258
Nº Nome citado CAS Classe
112 isoramnetina 480-19-3 flavonoide (flavonol)
O
O
OH
O
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
113 quercetina 3-O-galactosídeo 482-36-0 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
114 canferol-3-O-rutinosídeo 17650-84-9 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
259
Nº Nome citado CAS Classe
115 isoramnetina-3-O-rutinosídeo 604-80-8 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Nº Nome citado CAS Classe
115 isoramnetina-3-O-galactosídeo 6743-92-6 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
Nº Nome citado CAS Classe
117 isoramnetina-3-O-glicosídeo 5041-82-7 flavonoide (flavonol)
O
O
OOH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
260
Nº Nome citado CAS Classe
118 jujubosídeo B 55466-05-2 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
OH
O
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
119 jujubosídeo D 194851-84-8 saponina (damarano)
O
O
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
Nº Nome citado CAS Classe
120 jujubosídeo E 855184-67-7 saponina (damarano)
O
H
O
O
OH
OH
OH
OH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
O
O
OH
OH
OOH
H
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
H
OOH
H
H
H
H
OH2
261
Nº Nome citado CAS Classe
121 escopoletina 92-61-5 cumarina
O
OH O O
Nº Nome citado CAS Classe
122 colesterol 57-88-5 esterol
OH
H
H
H
H
262
ANEXO A