MIKROOBIFÜSIOLOOGIA. 1. Füsioloogiliste protsesside globaalne regulatsioon rakkudes. 2. Geeniekspressiooni kontroll transkriptsiooni tasemel. 3. Posttranskripsiooniline regulatsioon. 4. „ Quorum-sensing“ ja selle mõju füsioloogilistele protsessidele rakus. 5. Kahekomponendilised regulatsiooni süsreemid ja signaalide vastuvõtt. 6. Bakteriraku struktuur ja funktsioonid. 7. Bakterite jagunemine. 8. Geneetilise informatsiooni ülekanne bakterites. 9. Energia tootmine. 10. Metaboliitide transport. 11. Lämmastiku metabolism. 12. Valkude ransport (Tüüp I-IV sekretsiooni süsteemid). 13. Substraatide metabolism (v. a. glükoos). 14. Bakterite stressi vastused. 15. Bakterite kasv statsionarses faasis. 16. SOS vastus ja DNA reparatsioon. 17. Kemotaksis. 18. Puriinide ja pürimidiinide süntees. 19. Patogeen-peremees interaktsioon

1. FÜSIOLOOGILISTE PROTSESSIDE GLOBAALNE REGULATSIOON RAKKUDES. Paljud muutused keskkonnas kutsuvad bakterirakus esile stressi. Hoolimata keskkonna muutustest peavad DNA replikatsioon, rakkude kasv ja jagunemine olema balanseeritud. Translatsiooniaparaadis osalevad vähemalt 150 erinevat geeniprodukti (rRNA-d ja ribosoomi valgud, tRNA-d, aminoatsüül-tRNA süntetaasid, translatsiooni initsiatsiooni, elongatsiooni ja terminatsiooni faktorid). Järk-järgulised muutused metaboolsete süsteemide aktiivsuses leiavad aset sõltuvalt sellest, milline on raku varustatus biosünteesiradade lõpp-produktidega. Rikkas kasvukeskkonnas, kus vastavad komponendid on juba valmis kujul olemas, on biosünteetiliste ensüümide ekspressioonitase rakus võrreldes vaese kasvukeskkonnaga vähemalt 10 korda alla surutud. Regulatsioon toimub nii struktuurgeenide transkriptsiooni tasemel (repressioon, attenuatsioon) kui ka biosünteetiliste ensüümide tagasisidestusliku inhibeerimise kaudu. Juhul, kui suvaline komponent keskkonnast ammendub, katkeb koheselt tagasisidestuslik inhibitsioon. Kui sellest ei piisa, tõuseb vastava biosünteesiraja struktuurgeenide transkriptsioonitase. Kui ka sellest ei piisa, vallandub rakus nn. “stringent response”, mille tulemusena toimuvad geenide ekspressioonitasemes globaalsed muutused. Erinevaid bioloogilisi protsesse koordineeritakse globaalse regulatsiooni kaudu. Globaalsele regulatsioonile alluvad kõik operonid. Operonid, mida kontrollib üks regulaatorvalk, moodustavad reguloni. Samasse reguloni kuuluvate operonide induktsioon võib üsna ulatuslikult varieeruda. Näiteks temperatuurishoki reguloni (Htp) puhul täheldatakse osade HSP-del (heat shock proteins) temperatuuri tõusu korral 5- kuni 7-kordset induktsiooni, mõnede HSP-de tase rakus tõuseb aga üle 70 korra. Stressivastuse käigus produtseeritakse rakus signaalmolekule e. alarmoone. Tuntumad signaalmolekulid on näiteks cAMP ja guanosiintetrafosfaat ppGpp. Erinevaid regulone kontrollivad regulaatorid võivad transkriptsiooni kas stimuleerida (näiteks PhoB), inhibeerida (näiteks LexA) või mõnede geenide puhul stimuleerida ja teiste puhul inhibeerida (näiteks Lrp – leucine response protein). Osa regulone on kontrollitud alternatiivsete sigma faktorite poolt (näiteks ζ 32 regulon). Regulatsioon võib toimuda mitmel erineval viisil: 1. regulaatori kovalentne modifitseerimine – enamasti fosforüleerimine/defosforüleerimine (PhoB, NtrI), 2. negatiivse regulaatori degradeerimine (näit. LexA), 3. sigma faktori rakulise hulga tõstmine (ζ32), 4. valgu konformatsiooni muutmine ligandi sidumisel. Bakteris E. coli on kirjeldatud ligikaudu 1000 erinevat operoni ning paarsada erinevat reguloni. Erinevatesse regulonidesse kuuluvad operonid või geenid võivad kuuluda modulonidesse. Samasse moduloni kuuluvaid geene/operone võib kontrollida lisaks nende erinevatele regulaatoritele ka ühine globaalne regulaator (näiteks cAMP retseptorvalk CRP e. CAP). Globaalse regulatsiooni kirjeldamiseks on võetud kasutusele veel mõiste stimulon. Stimuloni kuuluvad geenid, operonid, regulonid ja modulonid, mille tööd mõjutab üks ja sama keskkonnastiimul. Samasse stimuloni kuuluvate regulatoorsete üksuste tööd kontrollivad erinevad regulaatorid. Näiteks temperatuuri tõusu korral aktiveerub Htp (RpoH) regulon ja P-nälja puhul PhoB regulon, kuid lisaks nendesse regulonidesse kuuluvatele geenidele aktiveeruvad veel paljud teised. Näiteks P-nälja puhul on indutseeritud 145 erinevat valku, millest ainult 38 on kodeeritud PhoB reguloni kuuluvate geenide poolt. Nälja korral lähevad rakud statsionaarsesse faasi

ja neis indutseeritakse ka RpoH regulon, Lrp regulon, LexA-kontrollitud SOS regulon ja OxyR regulon. Lisaks paljude valkude induktsioonile põhjustab P-nälg 137 erineva valgu repressiooni.

2. KONTROLL TRANSKRIPTSIOONI TASEMEL Bakteri elukeskkonna tingimused on sageli väga muutlikud. Tulenevalt sellest, peavad bakterid sageli tegema ümberkorraldusi rakus toimuvates füsioloogilistes protsessides. Järgnevalt vaatleme, kuidas bakterites toimuvate mitmesuguste füsioloogiste protsesside regulatsioon on seotud geeni ekspressiooni regulatsiooniga. Geenide transkriptsiooni regulatsioonis osalevad regulaatorvalgud, mis võivad protsessi pärssida (negatiivne kontroll) või soodustada (positiivne kontroll). Geenid, mida transkribeeritakse korraga, kuuluvad ühte operoni (operoni kuuluvad ka nende geenide transkriptsiooni reguleerivad DNA järjestused) ja operonilt sünteesitud RNA molekuli nimetatakse polütsistroonseks RNA-ks. Regulatsioon transkriptsiooni tasemel sõltub DNA-ga seonduvatest regulaator-valkudest. Paljudele transkriptsioonifaktoritele on iseloomulikud teatavad struktuursed motiivid nagu “tsink-sõrmed,” “leutsiini lukud” “heeliks-ling-heeliks“ ja “heeliks-pööre-heeliks”. Lisaks regulaatorvalkudele, osalevad transkriptsiooni regulatsioonis ka nn. efektormolekulid. Efektormolekulideks on väikesed molekulid nagu näiteks aminohapped või erinevad suhkrumolekulid. Indutseeritava operoni puhul nimetatakse efektormolekuli induktoriks, represseeritavate operonide puhul aga korepressoriks. Bakterid on võimelised kasvama väga erinevatel süsiniku allikatel. Kasvukeskkonnast püütakse esmalt ära kasutada need C-allikaid, mis on energeetiliselt kasulikumad ja võimaldavad rakkude kiiremat kasvu. Sellest tulenevalt püüab rakk oma füsioloogilised protsessid ümberkorraldada, et mitte raisata energiat teiste substraatide kasutamisel osalevate valkude produtseerimiseks. Sellist regulatoorset mehhanismi nimetatakse kataboliitseks repressiooniks. Lisaks sellele käivitatakse C-allika omastamiseks vajalike ensüümide produksioon vastava ühendi olemasolu korral keskkonnas. Seega käitub vastav ühend või mõni tema lagundamisel tekkiv vaheühend kui induktor. Selleks, et suhkrud oleksid bakteritele kättesaadavad, transporditakse need fosfoenoolpüruvaadi (PEP) ja fosfotransferaasi süsteemi (PTS) vahendusel tsütoplasmasse. Selle süsteemi moodustavad kaks fosfotransferaasi – Ensüüm I (EI) ja HPr ning sellele lisaks suhkru-spetsiifilised permeaasid - Ensüüm II (EII). EII koosneb kolmest kuni neljast erinevast funktsionaalsest üksusest. Fosforüülrühma ülekandmisel PEP-ilt suhkrule osalevad EI, Hpr, EIIA ja EIIB. Kataboliitne repressioon toimib rakkudes bakterite kasvamisel glükoosil, mille tulemusel raku sisene cAMP tase langeb (kasvamisel laktoosil või suktsinaadil aga tõuseb). cAMP sünteesi ATP-st viib läbi adenülaattsüklaas (cya geeni produkt). Laktoos-operon aktiveeritakse rakus ainult siis, kui aktivaatorvalk CAP (CRP) on seondunud cAMP-ga. cAMP on fosfodiesteraasi poolt kiiresti AMP-ks degradeeritav. Kui bakterite kasvukeskkonnas on glükoos, on cAMP süntees inhibeeritud. Glükoosi-spetsiifiline permeaas EIIGlc koosneb kolmest domeenist IIA, IIB ja IIC. Regulatsiooni seisukohalt on keskse tähtsusega EIIAGlc. Kui C-allikaks ei ole glükoos, on EIIAGlc fosforüleeritud, mis omakorda aktiveerib adenülaat-tsüklaasi ja rakkudes käivitatakse cAMP süntees. Lõpptulemusena on transkriptsioon laktoosi operoni promootorilt aktiveeritud. Glükoosi olemasolul bakterite kasvukeskkonnas on EIIAGlc aga fosforüleerimata, adenülaat-tsüklaasi ei aktiveerita ning inhibeeritud on ka laktoosi permeaas. Kuna laktoosi permeaas on inaktiivne, ei saa laktoos rakku ning rakus ei saa tekkida laktoosi operoni induktormolekuli allolaktoosi, mis pärsiks repressori seondumise operoni operaatoralale. Sellist kontrollmehhanismi nimetatakse induktori välistamiseks (inducer exclusion). EIIAGlc defosforüleerimist põhjustab glükoos-6-fosfaadi olemasolu rakkudes. CRP-valk reguleerib umbes 100 geeni ekspressiooni bakterites. cAMP-CRP kompleks interakteerub RNA-polümeraasiga ja soodustab selle seondumist promootoriga. CRP-valgu poolt reguleeritavad promootorid jagunevad kahte klassi: promootor I ja promootor II. Lisaks cAMP-CRP olulisele rollile füsioloogiliste protsesside regulatsioonis, omab tsentraalset rolli ka Cra (catabolite repressor/activator protein) valk. Selle regulatsiooni füsioloogiline tähtsus seisneb selles, et nimetatud valgu vahendusel reguleeritakse nn. perifeerseid lagundamisi, mis võimaldavad rakkudel kasutada C-allikana ka näiteks suksinaati või malaati. Cra-valgu mõju tema poolt kontrollitavatele geenidele sõltub F-6-P või F-1,6-biP olemasolust rakus. Kui C-allikaks on glükoos, akumuleerub rakus F-6-P. See seondub Cra-valguga, mille tulemusena derepresseeritakse Cra-represseritud valkude (fosfofruktokinaasi; püruvaatkinaasi; jt) süntees; inaktiveeritakse aga Cra-aktiveeritud valkude (PEP süntetaasi; PEP karboksükinaasi; jt) süntees. Kokkuvõttes aktiveeritakse glükoosi lagundamiseks vajalike valkude süntees ja blokeeritakse glükoneogeneesiks vajalike valkude süntees. Selleks, et E. coli oleks võimeline kasutama C-allikana arabinoosi on vajalik kolme valgu AraA, AraB ja AraD süntees. Nende kolme valgu toimel muudetakse arabinoos ksüloos-5-fosfaadiks, mis suunatakse edasi pentoosfosfaat-tsüklisse. Nende kolme geeni ekspressioon on koordineeritult reguleeritud AraC valgu poolt. AraC valk võib rakus olla kahes erinevas konformatsioonis: kompleksis arabinoosiga käitub ta kui aktivaator, ilma arabinoosita kui repressor. Praeguseks on bakterites kirjeldatud rohkem kui 100 erinevat transkripsiooni-

regulaatorit (AraC-perekond), mis sisaldavad AraC-ga homoloogilist heeliks-pööre-heeliks DNA-ga seondumise piirkonda. ATTENUATSIOON Bakterites võib transkriptsioon ja translatsioon toimuda samaaegselt: lõpuni sünteesimata mRNA-ga võivad seonduda ribosoomid ja algab kohe ka valgu süntees. Selline kahe protsessi samaaegne toimumine võimaldab reguleerida transkriptsiooni termineerumist transkriptsiooni ja translatsiooni elongatsiooni kiiruste kaudu. Regulatsioon toimub spetsiifilistelt liiderjärjestustelt, millel on potentsiaal moodustada RNA sekundaarstruktuure ning protsessis ei osale regulaatorvalgud. Regulatsiooni transkriptsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud näiteks aminohapete biosünteesi operonidel, pürimidiini biosünteesi operonil, aminoatsüül tRNA süntetaasi operonil ja trüptofaani degradatsiooni operonil. Pürimidiini biosünteesi operonid. E. colis ja S. entericas on pyrBI üks operonidest, mis osaleb UMP sünteesil ja mille ekspressioon sõltub UMP kontsentratsioonist rakus. Pürimidiini biosünteesi kodeeriv pyrBI operon (aspartaat-transkarbamülaas) kodeerib samuti liiderpeptiidi. 20 nt enne liiderpeptiidis olevat terminatsioonisaiti paiknevad järjestikku 8 uridiinnukleotiidi (T-nukleotiidi DNA-s). Kui rakus on UTP kontsentratsioon madal, aeglustub traskriptsiooni elongatsioon U-järjestuse sünteesil. Protsessi aeglustumisel jõuab transleeriv ribosoom RNA polümeraasile järele ning nende koostoimel lõhutakse transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. Kõrge UTP kontsentratsiooni korral RNA polümeraas U-järjestuse kohal ei peatu, mistõttu translatsiooni ja transkriptsiooni koosmõjul ilmnevat RNA sekundaarstruktuuri lõhkumist ei toimu ning sellega blokeeritakse RNA polümeraasi liikumine struktuurgeenidesse. PyrC (dihüdroorotaas) süntees on moduleeritud spetsiifilise translatsiooni kontrolli mehhanismi kaudu. Transkriptsiooni alguspunkti valik promootorpiirkonnas sõltub pürimidiini hulgast rakus. Antud juhul RNA polümeraas tunnetab nukleotiidi hulka rakus ja vastavalt sellele sõltub transkriptsiooni alguspunkti valik (süntees algab C2 või G4 juurest). Kui rakus on pürimidiini piisavalt, algab transkripsioon C2 juurest. Sellise mRNA 5´otsas tekib sekundaarstruktuur, mis takistab ribosoomi seondumist. Pürimidiini puudusel, algab transkriptsioon G4 juurest ning sünteesitav mRNA ei moodusta 5´otsas ribosoomi seondumist blokeerivat sekundaarstruktuuri. Aminohapete biosünteesi operonid Enamasti on klassikaliseks attenuatsiooni näiteks toodud trp operoni transkriptsiooni regulatsioon. Operoni mRNA liiderjärjestuses on 4 regiooni, mille baasil võivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Regioonide 3 ja 4 paardumisel moodustub rho-sõltumatu transkriptsiooni terminaator. Omavahel võivad paarduda ka regioonid 1 ja 2 või 2 ja 3. Just regioonide 2 ja 3 paardumine takistab teminaatorstruktuuri moodustumist. Milliste regioonide baasil juuksenõelastruktuurid moodustuvad, sõltub sellest, kui palju on rakkudes trüptofaani. Trp-operoni poolt kodeeritavas liiderpeptiidis asuvad nn. Trp kontrollkoodonid. Bakterites kodeerib üks operon erinevate aminohappe biosünteesi. Sellisel juhul sisaldavad vastavate operonide liiderpeptiidi kodeerivad järjestused kõigi nende aminohapete koodoneid. B. subtilises ei ole transkriptsiooni regulatsioon atenuatsiooni vahendusel seotud mitte ribosoomide liikumise seiskumisega, vaid attenuatsiooni süsteemis osaleb RNA-seoseline valk, mis reguleerib mRNA 5` otsas spetsiifiliste sekundaarsete struktuuride teket. Trüptofani kõrge kontsentratsiooni korral seondub trüptofan TRAP valguga. Selliselt aktiveeritud valk seondub 11 lähestikku paikneva (G/U)AG kordusega, mis paiknevad trp-operoni liiderjärjestuses. TRAP seondumine pidurdab RNA polümeraasi liikumist ja selle tulemusena jõuab moodustuda transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. S. typhimuriumis on eri tüüpi flagelliini sünteesiks vajalike geenide fliC ja fliB ekspressioon reguleeritud rekombinatsiooni protsessi vahendusel. Kumba tüüpi flagelliini sünteesitakse, sõltub regulaatorpiirkonna H orientatsioonist fliB geeni ees. Nimetatud piirkonna inversioon toimub tänu valgu Hin vahendusel toimuvale järjestus-spetsiifilisele rekombinatsioonile H regiooni otstes paiknevate 26 ap järjestuste vahel.

3. POSTTRANSKRIPTSIOONILINE REGUALTSIOON Rakkude üleminekuga eksponentsiaalsest statsionaarsesse kasvufaasi toimuvad olulised ümberkorraldused rakus toimuvates füsioloogilistes protsessides. Üks sünteesirada, mis selles etapis indutseeritakse on glükogeeni süntees, mida paljud bakterid säilitavad kui energia reservi. Glükogeeni sünteesil osalevad ensüümid ADP glükoos-pürofosforülaas ja glükogeen süntaas (1,4-α-D-glükaan: 1,4-α-D-glükaan 6-α-D- glükanotransferaas). Glükogeeni süntees on reguleeritud nii cAMP kui ka RelA valgu poolt. Suures osas on glükogeeni süntees kontrollitud ka nn. Csr-süsteemi poolt. Nimetatud süsteemi moodustavad CsrA valk ja 350 ap pikkuned regulatoorne RNA (csrB-RNA). CsrA valk seondub mRNA 5´regiooniga (SD järjestusega) ja mõjutab transkriptide eluiga. csrB-RNA molekul seob rakus olevat CsrA valku. Sellest tulenevalt arvatakse, et CsrA csrB-RNA suhe rakus on see, mis kontrollib CsrA aktiivsust. CsrA ise on glükogeeni sünteesil osalevate geenide negatiivne regulaator. Huvitav on see, et CsrA võib käituda nii positiivse kui ka negatiivse regulaatorina: aktiveerib mõningaid glükolüüsil osalevaid geene - fosfofruktokinaasi geeni (pfkA), kuid represseerib mõningaid geene, mis on seotud glükoneogeneesiga – fruktoos-1,6- bis-fosfaatfosfataas (fbp).

Csr-süsteemiga sarnaseid regulatsiooni süsteeme on kirjeldatud ka paljudel looma- ja taimepatogeenidel, mis näitab, et geeni ekspressiooni regulatsioon mRNA stabiilsuse kaudu on bakterite hulgas laialt levinud. Alles sünteesitavalt mRNA-lt algab koheselt translatsioon, mistõttu ta on ribosoomidega kaetud. Translatsioon kaitseb mRNA-d degradatsiooni eest, sest sel juhul on mRNA tänu ribosoomidele vähem nukleaasidele eksponeeritud. Kui aga ribosoomide seostumine on CsrA või tema analoogide poolt blokeeritud, on vastav mRNA ka nukleaaside poolt paremini atakeeritav. Bakteriaalse mRNA degradatsioonil osalevad kombineeritult nii ekso- kui endonukleaasid. RNA degradasoom on multiensüümkompleks, kuhu kuuluvad RNaas E ja PNPaas. Lisaks neile kuuluvad kompleksi veel RhlB (DEAD-box RNA helikaas) ja glükolüütiline ensüüm enolaas. RNA degradasoomiga on assotsieerunud ka chaperonid DnaK ja GroEL ning polüfosfaadi kinaas PPK 4. „QUORUM-SENSING“ JA SELLE MÕJU FÜSIOLOOGILISTELE PROTSESSIDELE RAKKUDES. Mitmed morfoloogilised ja füsioloogilised muutused bakterirakus on tingitud keemiliste ja füüsikaliste parameetrite muutustest ümbritsevas keskkonnas. Avastus, et bakterid võivad ise produtseerida ekstratsellulaarseid keemilisi signaale rakkudevaheliseks kommunikatsiooniks näitab, et bakterid on võimelised reguleerima teatud füsioloogilisi protsesse populatsiooni tasemel. Nähtus, mida on hakatud nimetama kvoorumi tunnetamiseks (quorum sensing; QS) või ka rakk-rakk (cell-to-cell) kommunikatsiooniks, põhineb bakterite võimel sünteesida, sekreteerida ja ära tunda teatud kindla struktuuriga madalmolekulaarseid ühendeid, mida on hakatud nimetama autoinduktoriteks (AI). Kui autoinduktori ekstratsellulaarne kontsentratsioon on saavutanud teatud kindla “kriitilise” väärtuse, indutseeritakse rakus signaali ülekande kaskaad, mis käivitab rakus mitmesugused füsioloogilised protsessid. Nende hulka kuuluvad näiteks virulentsusfaktorite produksioon, plasmiidi ülekanne konjugatsiooni protsessis. Quorum sensing nähtust kirjeldati esmakordselt 25 aastat tagasi kahel merebakteril Vibrio fischeri ja Vibrio harveyil. Mõlemal bakteril on valguse produktsioon sõltuv nn. lutsiferaasi operoni luxCDABE ekspressioonist. Nimetatud operon ekspresseerub kõrgel rakutihedusel vastusena signaalmolekuli e. autoinduktori kõrgele kontsentratsioonile keskkonnas. “Quorum sensing” nähtust on kirjeldatud ka mitmetel gram(+) bakteritel. Selle rühma bakteritel on QS signaalmolekulideks tavaliselt lühikesed oligopeptiidid. Nende transport rakust välja toimub ABC transporterite vahendusel. Signaali vastuvõtmisel osaleb nn. kahekomponendiline regulatsiooni süsteem. Preaguseks on qourum sensingu nähtust kirjeldatud Streptococcus spp. (kompetentsus-süsteem ), Enterococcus faecalis (konjugatsioon), Bacillus subtilis (sporulatsiooni-süsteem, kompetentsus-süsteem) jt. Nii et tegemist on bakterite hulgas laialt levinud regulatsiooni-süsteemiga. Gram(-) bakteritel on QS signaalmolekuliks tavaliselt atsüleeritud homoseriinlaktooni molekul (AHL). QS protsesis osalevad valgud, mis kuuluvad LuxI-LuxR valkude perekonda. LuxI-tüüpi valk osaleb AHL sünteesis, LuxR valk on aga retseprorvalguks, mis teatud kindla AHL kontsentratsiooni juures moodustab sellega kompleksi. Selliselt aktiveeritud valk seondub tema poolt kontrollitavate geenide regulaator piirkonnaga. Erinevad LuxR-tüüpi retseptorvalgud on võimelised seonduma ainult teatud kindla AHL molekuliga. AHL seondumine LuxR tüüpi regulaatoriga aktiveerib viimase, kas tänu valgu molekuli konformatsiooni muutusele, aktiivse di- või multimeeri tekkele. V. harveyi rakkudes sünteesitakse kahte erinevat QS signaalmolekuli: AI-1 [N-(2-oksüheksanoüül)-L-homoseriinlaktoon] sünteesi eest vastutavad luxLM, AI-2 [furanosüülboraat diester] sünteesi eest vastutab luxS. V. harveyi QS süsteemi analüüs on näidanud, et selles bakteris kirjeldatud süsteem erineb oluliselt teistest gram(-) bakterites siiani kirjeltatud süsteemidest. Kui enamikel gram(-) bakteritel seondub AHL LuxR tüüpi regulaatorvalguga, siis V. harveyi vastutavad QS signaali äratundmise eest kahekomponendilise regulatsioonisüsteemi sensorvalgud LuxN (AI-1) ja LuxPQ (AI-2). LuxU vahendusel kantakse signaal üle regulaatorvalgule LuxO. Madala autoinduktori kontsentratsioonil on LuxO fosforüleeritud ning lux-operoni töö pärsitud, kontsentratsiooni tõustes toimub aga LuxO defosforüleerimine ning lux-operon hakkab tööle. Mõnedel patogeensetel E. coli tüvedel (EHEC) osaleb virulentsusfaktorite sünteesi regulatsioonis autoinduktor AI-3 (struktuur siiani teadmata). AI-3 negatiivstets EHEC tüvedes on võimalik virulentsusfaktorite sünteesi taastada kui lisada kasvukeskkonda epinefriini või norepinefriini. See asjaolu viitab võimalusele, et AI-3 on struktuurilt sarnane epinefriin/norepinefriinile. QS süsteem koosneb erinevatest komponentidest ja kontrollib väga erinevaid protsesse bakterirakus. Siiani on kirjeldatud QS süsteemi rohkem kui 50 erineval bakteriliigil. Lisaks on selgunud, et väga paljud bakteriliigid on võimelised produtseerima mitut erinevat QS signaalmolekuli. Nii näiteks produtseerib patogeen A. tumefaciens kahte, P. aeruginosa aga nelja erinevat signaalmolekuli. Ka mõnedes E. coli tüvedes on kirjeldatud “quorum-regulated” nähtust. E. coli`l on leitud LuxR tüüpi valk SdiA, mis osaleb raku jagunemise regulatsioonis. Konkreetne signaalmolekul on siiani identifitseerimata.

Lux-geenide ekspressioon. Siiani on kõige enam uuritud QS funktsioneerimist merebakteris V. fischeri. Vastav süsteem koosneb siin kahest valgust – LuxI, mis on vajalik 3-oxo-C6-HSL sünteesiks ja LuxR, millega vastav AHL seondub. AHL seondumine LuxR saab võimalikuks teatud kindlal AHL kontsentatsioonil. LuxR-AHL kompleks seondub lux-operoniga ja käivitab viimase ekspressiooni. LuxR geenil on näidatud kahte funktsionaalset domääni: N-terminaalne AHL seondumise domään ja C-terminaalne DNA-ga seondumise domään. Praeguseks on leitud, et lisaks luxI geenile on V. fischer-is ka teine AHL sünteesi määrav geen – ainS (määrab C8-AHL sünteesi). C8-AHL toimib läbi regulaatorvalgu LuxO (so. nn. “response regulator”). C8-AHL ja oxo-C6-AHL moodustavad ühtse süsteemi, mis kontrollib lux-operoni ekspressiooni. C8-AHL teatud kontsentratsioonil toimub LuxO fosforüleerimine, mille tulemusena blokeeritakse tema seondumine luxR promootor piirkonnaga, mis teeb võimalikuks LuxR valgu sünteesi. Oxo-C6-AHL madalal kontsentratsioonil seondub C8-AHL ka LuxR-iga, mille tulemusena käivitatkse madalal tasemel lux-operoni töö. Oxo-C6-AHL kontsentratsiooni suurenedes moodustub LuxR-oxo-C6-AHL kompleks, mis läivitab lux-operoni ekspressiooni kõrgemal tasemel. Teises merebakteris V. harveyi on lux-operoni ekspressioon reguleeritud kahe erineva AHL poolt – AI-1 ja AI-2. Autoinduktori AI-1 (4-hüdroksüül-C4-AHL) sünteesi määravad AHL-süntetaasid LuxLM. Autinduktori AI-2 (furanosüülboraat diester) sünteesi määrab AHL-süntetaas LuxS. AI-1 ja AI-2 signaali äratundmise eest vastutavad sensor-kinaasid vastavalt LuxN ja LuxPQ, mille kaudu siganaal jõuab LuxU valgu vahendusel regulaatorvalgule LuxO. Madalal rakutihedusel, kui AI-1 ja AI-2 kontsentratsioon on madal, käituvad LuxN ja LuxPQ kinaasidena, mis fosforüleerivad regulaatori LuxO, mis omakorda aktiveerib lux-operoni negatiivse regulaatorvalgu. Kõrgematel AHL kontsentratsioonidel käituvad LuxN ja LuxPQ fosfataasidena. Selle tulemusena kandub fosfaatrühm LuxO-lt LuxU vahendusel LuxN ja LuxPQ, kus fosfaatrühm hüdrolüüsitakse. LuxO defosforüleerimine inaktiveerib valgu ja rakud ei ole enam võimelised sünteesima lux-operoni repressorit. Transkriptsiooni aktivaator LuxR (V. harveyi LuxR-tüüpi valk erineb V. fisheri LuxR valgust) käivitab lux-operoni ekspressiooni. AHL süntees. AHL molekul koosneb homoseriinlaktoon rõngast ja atsüül-külgahelast. Homoseriin sünteesitakse paljudes bakterites kui meteoniin-lüsiin-treoniin biosünteesiraja vaheprodukt, kuid bakterid ei ole võimelised homoseriini (või ka homoseriinlaktooni) jääki lülitama AHL struktuuri. Homoseriinlaktoon rõnga sünteesiks vajalik komponent adenosüülmeteoniin (AdoMet) sünteesitakse meteoniinist ja ATP-st valgu MetK (AdoMet süntetaas) vahendusel. AHL sünteesiks vajalik külgahel saadakse rasvhapete biosünteesil tekkivast atsüül-ACP. Atsüül-külgahel võib olla erineva pikkusega ja sisaldada erinevaid funktsionaalseid rühmasid (=O; -OH). Erinevused külgahelas annavad AHL molekulile spetsiifilisuse, mis võimaldavad tema seondumise ainult teatud kindla retseptorvalguga. Enamikel bakteritel osaleb AHL molekulide sünteesil LuxI tüüpi valgud, mida nimetatakse ka AHL-süntetaasideks. Nimetatud valk kasutab sünteesiks S-adenosüülmetioniini ja atsüülrühma doonorina atsüül-atsüül kandjavalku (acyl-ACP). Analoogiliselt rasvhapete sünteesile, toimub AHL sünteesi esimeses etapis atsüül-ensüüm kompleksi moodustumine, milles ensüümi tsüsteiini või ka seriini jäägid on atsüülrühma aktseptoriks. Nii AdoMet kui ka atsüül-ACP sonduvad AI-süntetaasiga. Toimub atsüül-rühma seondumine AdoMet läbi amiidsideme moodustumisele atsüül- ja aminorühma vahel. Atsüül-AdoMet vaheühendi laktonisatsiooni tulemusena tekivad vastav AHL ja 5`-metüültioadenosiin. AI-2 (furanosüülboraatdiester) sünteesi lähteühendiks on S-adenosüülmeteoniin, millest rakus sünteesitakse üle mitme vaheühendi S-ribosüülhomotsüsteiin (SRH). SRH-st sünteesitakse LuxS (a zinc metaaloenzyme) vahendusel 4,5-dihüdroksü-2,3-pentaandioon(DPD), millest peale mõningasi ümberkorraldusi saadakse AI-2. “Quorum sensing” teistes bakterites. Lisaks lux-operonide regulatsioonile erinevates Vibrio liikides, toimib AHL vahendatud regulatsioon väga erinevates bakterites. Nii näiteks on QS kirjeldatud ka patogeenis P. aeruginosa. Nimetatud patogeen omab kahte QS süsteemi, LasI/LasR ja RhlI/RhlR – RhlI määrab N-butürüül-AHL ja LasI N-heksanoüül-AHL sünteesi. LasR ja RhlR näol on meil tegemist LuxR-tüüpi regulaatoritega. Nende kahe QS süsteemi vahel valitseb omavaheline hierarhia, kus LasR/LasI kontrollib RhlR/RhlI süsteemi tööd. Lisaks sellele on QS-süsteem seotud veel mitmete teiste regulatsiooni süsteemidega (näiteks kahekomponendiline regulatsiooni süsteem GacA/GacS). Selline koordineeritud virulentsusfaktorite süntees võimaldab patogeenil vältida peremeesraku kaitsemehhanismide käivitumist infektsiooni varases staadiumis kui patogeeni arvukus nakatumiskohas on veel madal. Paljudes bakterites reguleerib QS ka plasmiidide ülekannet. Nii näiteks A. tumefaciens tüvedes on Ti-plasmiidide ülekanne reguleeritud TraR/TraI süsteemi poolt. Lisaks sellele kuulub siia süsteemi TrlR valk, mis blokeerib AHL madal kontsentratsioonil aktiivse AHL-TraR kompleksi teket. Rakkude ellujäämine statsionaarses kasvufaasis sõltub paljuski nendes toimuvate füsioloogiliste protsesside õigeaegsest ümberkorraldamisest. Üheks esimeseks tõendiks selle kohta, et QS-süsteem võib signaliseerida rakkude jõudmisest statsionaarsesse kasvufaasi oli statsionaarse kasvufaasi sigmafaktori ζS ekspressiooni seoses QS-süsteemi siganaalmolekuli homoseriinlaktooniga. ζS, geeni rpoS produkt (tuntud ka kui RpoS) on üks olulisi faktoreid nende geenide avaldumiseks, mida bakterid vajavad tingimustes, kus nende kasv on pärsitud. Lisaks

sellele on paljudes mikroorganismides antimikroobsetaktiivsust omavate ühendite produktsioon reguleeritud QS-süsteemi poolt (mupirotsiin P. aeruginosa`s, β-laktaam antibiootik karbapeneem).

5. KAHEKOMPONENDILISED REGULATSIOONISÜSTEEMID. Selleks et muutuvates keskkonna tingimustes ellujääda, peavad bakterid rakus toimuvaid füsioloogilisi protsesse ümberkorraldama vastavalt toimunud muutustele. Ühe võimalusena hankida informatsiooni muutuste kohta ümbritsevas keskkonnas, kasutab bakter nn. kahekomponendilisi regulatsioonisüsteeme. Vastavat protsessi nimetatakse signaalseks transduktsiooniks. Stiimuliteks, mida tunnetatakse kahekomponendiliste süsteemide abil, on näiteks pH, osmolaarsus, kemoatraktandid ja repellandid (eemaletõukajad), taimepatogeenide puhul taime pinnal kahjustatud kohtades sisalduvad signaalmolekulid. Kahekomponendiline süsteem koosneb sensorist (sageli on selleks histidiini kinaas) ja tsütoplasmas asuvast vastuvõtvast (response) regulaatorist. Väliskeskkonna stiimuli tunneb ära sensorvalgu N-terminaalne domeen. Selle tulemusena muutub sensori aktiivsus. Näiteks histidiini kinaasi puhul toimub autofosforüleerumine, kus ATP-lt kantakse fosfaatrühm üle konserveerunud histidiini jäägile valgu C-termiaalses transmitter-domeenis. See omakorda on signaaliks tsütoplasmaatilisele vastuvõtvale regulaatorile. Regulaatori N-terminaalses vastuvõtvas (receiver) domeenis asub konserveerunud aspartaatjääk. Fosfaatrühm kantakse sensorvalgult regulaatori aspartaadile. Sensorid on tavaliselt transmembraansed valgud. Ekstratsütoplasmaatiline domään vastutab signaali vastuvõtu eest väliskeskonnast. Sellele järgneb tänu sensori autokinaasele aktiivsusele valgu ülekandemoodulis oleva konserveerunud histidiini fosforüleerumine. Sensor/kinaasi ülekandemoodulilt kantakse fosfaatrühm vastuvõtva regulaatori konserveerunud aspartaadi jäägile. Regulaatori fosforüülimine põhjustab konformatsioonilisi muutusi väljunddomäänis. Viimane tavaliselt võimaldab valgul seonduda DNA-ga. Kahekomponendiliste regulatsioonisüsteemide aktiivsust pärsivad fosfataasid. Paljudes kahekomponendilistes regulatsiooni süsteemides omavad sensorid nii kinaasset kui ka fosfataasset aktiivsust (EnvZ). Teatud juhtudel võib aga regulaator olla aktiivne just defosforüleeritud kujul. Sensorid võib vastavalt nende paiknemisele rakus jagada kahte klassi: membraansed valgud, omavad transmembraanset domääni (EnvZ) ja tsütoplasmaatilised valgud (NtrB; CheA). Vatavalt struktuurile võib sensorid jagad nn. klassikalised sensorid, mis sisaldavad sisend ja ülekande domääni. Teise rühma moodutavad nn. hübriidsed sensorid, mis sisaldavad veel liskas regulaatorile sarnast vatuvõtudomääni. Vastuvõtvad regulaatorid jaotatakse nelja rühma: tüüpilsed DNA-ga seonduvad transkriptsiooniaktivaatorid (OmpR), konserveerunud järjestus C-terminuses, mis erineb OmpR-ist (Bvg; NalR), NtrC, NifA perekonna valgud, valgud millel on ainult sisenddomään (CheY). Kirjeldatud on ka ühekomponendilisi signaali ülekandesüsteeme. Näiteks Vibrio cholerae transmembraanne ToxR valk. ToxR tunneb ära raku väliseskkonna signaali, mille tulemusena ta aktiveerub ning seondub seejärel tsütoplasmaatilise domeeniga virulentsusgeenide promootorregiooniga. Anorgaaniliste lämmastikühendite assimilatsioon Looduses olev anorgaaniline lämmastiku ühend, mida bakterid saavad kasutada orgaaniliste ühendite (aminohapped) sünteesiks, on ammonium. Ammoniumi puudumisel keskkonnas võib organism kasutada lämmastiku allikana ka histidiini või proliini. Ammoonium on otseseks substraadiks ainult väheste aminohapete (glutamaat, alaniin, aspartaat) sünteesil. Nimetatud aminohappeid kasutab organism ülejäänud aminohapete sünteesil aminorühma doonorina ketohapete prekursorite transamineerimisel. Ammooniumi assimileerimisel vajalikud ensüümid on glutamaadi dehüdrogenaasid (GDH), glutamiini süntetaas (GS) ja glutamaadi süntaas (GOGAT). Alaniini ja aspartaadi sünteesil osalevad alaniini dehüdrogenaas ja aspartaas. Põhiline ühend, mida sünteesitakse, on siiski glutamaat. Bakterid võivad kasutada ammoniumi assimilatsiooniks erinevaid metabolismiradu: 1. Kui ammoniumi kontsentratsioon keskkonnas on madalam kui 1 mM on GDH poolt läbiviidava reaktsiooni tasakaal nihutatud, mistõttu glutamaadi sünteesi enam ei toimu. Nendes tingimustes aktiveeritakse seni osaliselt inaktiivne GS. Viimane katalüüsib glutamiini sünteesi, glutamiini hulk rakus tõuseb ja sellest sünteesitakse glutamaadi süntaasi GOGAT toimel glutamaat (reaktsioonis osalevad glutamiin, α-ketoglutaraat ja NADPH). 2. Ammooniumi ülehulgas domineerib glutamaadi süntees α -ketoglutaraadist ja ammooniumist glutamaadi dehüdrogenaasi GDH toimel, kasutades NADPH-d. Vähesel hulgal sünteesitakse ka glutamiini süntetaasi GS toimel glutamiini (glutamaat + ammoonium, toimub ATP hüdrolüüs) NtrB/NtrC süsteem ammooniumi assimileerimise regulatsioonis Selleks, et võimalikult täpselt reguleerida siin osalevate geenide ekspressiooni, on ammoniumi assimilatsioonis osalevad geenid allutatud kahekomponedilise regulatsiooni süsteemi GlnL / GlnG kontrollile. Kahe-komponendilise regulaatorsüsteemi geenidega ühes operonis paikneb ka glutamiini süntetaasi kodeeriv geen glnA. GlnL on tuntud ka nimetuste all NtrB ja NRII ning GlnG asemel kasutatakse sageli nimetusi NtrC ja NRI. Enamlevinud on siiski nimetused NtrB ja NtrC.

Bakterites toimub lämmastiku assimilatsioonil osalevate valkude aktiivsuse kontroll ka biokeemiliste mehhanismide abil. Bakteri rakkudes olev adenülüültransferaas (GlnE) on bifunktsionaalne ensüüm, mis võib glutamiini süntetaasi (GlnS) türosiinijäägile adenüülrühma kas üle kanda või elimineerida. Selles protsessis osaleb ka valk GlnD, millel on uridülüültransferaasi (UT) aktiivsus ja uridülüülrühma kõrvaldav (UR) aktiivsus. Madalatel glutamiini kontsentratsioonidel toimub selle valgu mõjul uridülüülrühma ülekanne valgule PII, glutamiini kontsentatsiooni tõustes aga toimub vastupidine protsess. Adenüleeritud GlnS-i vorm on inaktiivne. Selle vormi tekkimist soodustab valk PII see vorm, mis ei sisalda uridülüülgruppi. Lisaks biokeemilisele regulatsioonile toimub ammoniumi assimilatsioonil osalevate geenide kontroll ka transkriptsiooni tasemel. Juhul, kui N-allikat on bakterite kasvukeskkonnas piisavalt, toimub transkriptsioon nõrkadelt σ70-sõltuvatelt promootoritelt glnAp1 ja glnLp. Lämmastikuallika kontsentratsiooni langedes aktiveerib fosforüleeritud NtrC-P transkriptsiooni glnAp2 geeni σ54-sõltuvalt promootorilt. NtrC fosforüleeritakse sensorvalgu NtrB poolt. NtrB-l on bifunktsionaalne valk, millel on nii autokinaasi kui ka fosfataasi aktiivsus, mida kontrollib bifunktsionaalne ensüüm PII. UT aktiivsus on stimuleeritud N-vaeguse korral, kus glutamiini kontsentratsioon on rakus madal ja α-ketoglutaraadi kontsentratsioon kõrge. Selle tulemusena tekib PII uridüleeritud vorm UMP-PII, mis stimuleerib NtrB-l kinaasi aktiivsust ja NtrC fosforüleeritakse. Kõrgel ammooniumi kontsentratsioonil domineerib PII UR-aktiivsus. UR-aktiivsusega valk interakteerub NtrB-ga, stimuleerides NtrB fosfataasset aktiivsust, mille tulemusena NtrB defosforüleerib NtrC. Bakteris Klebsiella pneumoniae on nitrogenaasi sünteesi eest vastutavad geenid nifHDK samuti fosforüleeritud NtrC poolt aktiveeritavad. N-limitatsioonis aktiveerib NtrC-P nifA transkriptsiooni ning NifA omakorda nifHDK geenide transkriptsiooni. NtrB/NtrC poolt on kontrollitud ka selliste operonide transkriptsioon nagu näiteks hut-operon, mis kodeerib histidiini utiliseerimist ja put-operon, mis kodeerib proliini utiliseerimist.

6. BAKTERIRAKU STRUKTUUR JA FUNKTSIOONID Nukleoidid Enamikes bakterites lokaliseerub DNA tsütoplasma piirkonnas, mis on tsütoloogiliselt erinev regioon, kuid mis ei ole ülejäänud tsütoplasmast eraldatud tuumamembraaniga. Vastavat piirkonda nimetatakse nukleoidiks. DNA on rakus kokkupakitult mitmesuguste histooni-sarnaste valkude osavõtul. Tänapäeva avardunud mikrosoopia võimalused kirjeldavad DNA-valk kompleksi bakteris kui nn. koralli-sarnast struktuuri. Tänapäeval on selgunud, et multiploidsus on iseloomulik ka bakteritele. Kõrge kromosoomi koopiate arv rakus on seotud rakkude kiire kasvamise ja jagunemisega. Rakkudes on kirjeldatud ka terve rida valke – ParB/SpoOJ – mis osalevad mitoosi sarnases protsessis, mis tagab nukleoidide oriC piirkonna liikumise raku poolustele. Bakterirakus on leitud kahte tüüpi nukleaarkehasid – kestaga seotud nukleoidid ja vabad nukleoidid. Kestaga seotud nukleoid sisaldab lisaks DNA-le RNA-d, valke, lipiide ja peptidoglükaani. Vaba-nukleoid sisaldab vähem mitte-DNA komponente. E. coli genoom on pakitud nukleosoomi sarnasesse struktuuri, mille koosseisus on kirjeldatud 12 erinevat valku. HU - on eukarüootsete histoonide prokarüootne homoloog, mis koos Fis valguga on üks põhilisi nukleoidi komponente. HU valgud koosnevad kahest 10kDa alaühikust, HU-α ja HU-β Teoreetiliselt peaks olema DNA-ga seondunud üks HU dimeer iga 300 – 400 bp tagant. Fis - on väike aluseline DNA-ga järjestusspetsiifiliselt seonduv valk, mis kirjeldati esmalt lühikeste DNA piirkondade inversioonil (viburite faasi variantsioonil). Fis on oluline ka eksponentsiaalses faasis tugevalt ekspresseeruvate geenide (rRNA ja tRNA geenid) transkriptsioonil ja DNA replikatsioonil. Fis on kasvavates rakkudes üheks põhiliseks nukleoidiga assotsieeruvaks valguks. Kui statsionaarses kasvufaasis olevad rakud külvata rikkale-söötmele, suureneb Fis molekulide arv rakus 100-lt 50000-le. H-NS - on globaalne transkriptsiooni repressor, mis kontrollib üle 35 geeni ja operoni tööd, sealhulgas ka järjestus-spetsiifilises rekombinatsioonis osalevate geenide ekspressiooni. CbpA (curved DNA-binding protein A) seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt ja on detekteeritav alles hilises statsionaarses faasis. 36 tunni vanuses rakukultuuris on seda valku 3% totaalvalgust, mis teeb ligikaudu 15000 valgumolekuli raku kohta. CbpB (Rob) (curved DNA-binding protein B, right origin binding protein) ekspresseerub maksimaalsel tasemel eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes, kus teda on üle 10000 molekuli raku kohta. Statsionaarse faasi rakkudes väheneb CppB hulk 60%-le maksimaalsest tasemest. Selle valgu osalust on näidatud nii transkriptsiooni kui ka replikatsiooni kontrollis. DnaA (DNA-binding protein A) on DNA-ga järjestus-spetsiifiliselt seonduv valk, mis on olulise tähtsusega DNA replikatsiooni initsiatsioonil, kuid käitub paljudel juhtudel ka transkriptsiooni aktivaatorina või repressorina. DnaA-d on rakus 900 – 2700 molekuli: maksimaalne kontsentratsioon on tuvastatav eksponentsiaalse faasi keskmises osas ning teine kontsentratsioonitõus ilmneb statsionaarses faasis. Dps (DNA-binding protein from starved cells) rakusisene hulk on maksimaalne (150000 – 200000 molekuli raku kohta) statsionaarses faasis või oksüdatiivse stressi korral. Selle valgu seondumine DNA-ga näib toimuvat mittespetsiifiliselt. Eksponentsiaalse faasi rakkudes on ligikaudu 6000 Dps molekuli raku kohta. Valgu hulk suureneb statsionaarse faasi käigus.

Hfq (host factor for phage Qb ), tuntud ka faktori i nimetuse all, seondub nii DNA-ga kui ka RNA-ga. Seondumine on mittespetsiifiline, kuid toimub eelistatult paindunud DNA-le. Eksponentsiaalses faasis on Hfq-d ligikaudu 55000 molekuli raku kohta. Statsionaarses faasis valgu hulk langeb järk-järgult, jõudes tasemeni, mis vastab 1/3-le maksimaalsest. Lisaks DNA-le on Hfq assotsieerunud ka ribosoomidega ning kontrollib mitmete mRNA-de translatsiooni (näiteks statsionaarse faasi sigma faktorit kodeeriva rpoS mRNA ja DNA mismatch-reparatsiooni ensüümi MutS kodeeriva mutS mRNA translatsiooni). IciA (inhibitor of chromosome initiation A) seondub spetsiifiliselt 3-le 13 nt pikkusele kordusjärjestusele DNA replikatsiooni alguspunkti oriC piirkonnas ning inhibeerib DNA replikatsiooni initsiatsiooni, blokeerides DnaA poolt vahendatud DNA ahelate lahtisulamise oriC regioonis. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 400 IcaA dimeeri ja statsionaarses faasis on IcaA hulk langenud 250 dimeerile. IHF (integration host factor) seondub DNA-ga spetsiifiliselt heterodimeerina. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on üle 12000 IHF-i monomeeri raku kohta ning IHF-i hulk hakkab tõusma rakkude kasvu aeglustumisel, jõudes statsionaarses faasis 55000 monomeerini raku kohta. Sügavamas statsionaarses faasis langeb IHF-i hulk poolele maksimaalsest väärtusest. IHF on DNA-d tugevalt painutav valk, mistõttu tema seondumine DNA-ga on nii struktuurse kui ka funktsionaalse tähtsusega. IHF osalust on näidatud nii transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsioonil, DNA replikatsiooni initsiatsioonil kui ka geneetilise materjali ümberkorraldustel. E. coli IHF-defektsete mutantide puhul on mõningates süsteemides täheldatud IHF-i funktsiooni komplementeerimist HU poolt. Lrp (leucine-responsive regulatory protein) on globaalne transkriptsiooni regulaator mis kontrollib nii positiivselt kui ka negatiivselt rohkem kui 75 geeni transkriptsiooni. Kasvavates rakkudes on 1200 – 1300 Lrp dimeeri, kuid statsionaarse faasi rakkudes langeb nende hulk 10 korda. Võrreldes rikka söötmega on minimaalsöötmel kasvates rakkudes Lrp hulk ligikaudu 2,5-korda kõrgem. Nälgivates rakkudes aktiveeritud geenide puhul toimib Lrp positiivse transkriptsiooni faktorina. StpA (supressor of td mutant phenotype A) on H-NS-i homoloog, mis avastati faagi T4 td fenotüübi supressorina. StpA on võimeline komplementeerima H-NS-i mutante. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 25000 StpA molekuli raku kohta, statsionaarse faasi rakkudes 8000 – 10000. Rakupind Rakupind kaitseb raku sees paiknevaid komponente väliskeskkonna kahjuliku toime eest. Enamike bakterite rakupinda katab kristallilise struktuuriga S-kiht. S-kiht koosneb tavaliselt kas valgulistest või glükoproteiinsetest subühikutest. Rakupinna ehitus varieerub erinevatel bakteritel märkimisväärselt. Gram (+) bakteritel on S-kiht seotud peptidoglükaan kihiga või sellega seotud sekundaarsete rakuseina polümeeridega. Gram (-) bakteritel on S-kiht seotud välismembraani lipopolüsahhariididega. Tavaliselt sisaldavad selles kihis paiknevad valgud rohkesti happelisi ja hüdrofoobseid aminohappeid, vähe on neis leitud arginiini, histidiini ja meteoniini. S-kiht täidab erinevaid funktsioone bakterites, sealhulgas osaleb ta rakkude kinnitumisel pindadele või peremeesorganismi rakkudele (näit. patogeenide puhul). Rakukest 1884-ndal aastal märkas taani mikrobioloog Christian Gram, et bakterirakkude värvimisel kristallvioletiga säilus osadel bakterirakkudel värvus ka pärast rakkude töötlemist 95%-lise etanooliga. Vastavaid baktereid hakati nimetama grampositiivseteks. Neid baktereid, mille rakkudelt õnnestus värv etanooliga maha pesta, nimetatakse gramnegatiivseteks bakteriteks. Võrreldes grampositiivsete bakteritega on gramnegatiivsete bakterite raku pinnaehitus märksa komplekssem. Mõlemat tüüpi bakteritel on mureiinkesta põhiliseks komponendiks peptidoglükaan. Archaedel moodustab rakukesta pseudomureiin ja sellega seotud S-kiht (koosneb valkudest ja glükoproteiinidest). Paljudel Archedel on S-kiht ainuke pinna struktuur, mis paikneb väljaspool plasma-membraani. Gram (+) bakteritel on eristatavad rakukest ja rakumembraan. Nende rakukest koosneb paljudest peptidoglükaani kihtidest. Peptidoglükaan on lineaarne polümeer, mis koosneb β-1,4-N-atsetüülglükosamiinist (NAG) ja N-atsetüülmuraamhappest (NAM), mis on omavahel ühendatud β-1,4-glükosiidsidemega. Ahelad on omavahel ühendatud võrgustikuks. NAM piimhappe jäägiga on seotud kindlatest aminohapetest koosnev tetrapeptiid. Ahelas oleva diaminohappe aminorühma ja naaberahela tetrapeptiidi terminaalse D-ala karboksüülrühma vahel moodustub peptiidside. Selliselt tekkiv võrgustik annab bakterirakule kindla ja püsiva kuju. Läbi peptidoglükaani kihtide ulatuvad lipoteihohappe molekulid, mis on suunatud membraani pinnale. Gram (-) bakteritel on suhteliselt õhuke peptidoglükaan-kiht. See-eest on neil kaks membraani – välis- ja sisemembraan, mille vahel on periplasmaatiline ruum. Periplasmaatiline ruum ei ole tühi. Seal asuvad mitmed ensüümid ja muud valgud (hüdrolüütilised ensüümid, retseptorid, transporti vahendavad valgud). Mureiinhüdrolaasid Peaaegu kõik bakterid sünteesivad ensüüme, mis hüdrolüüsivad erinevaid sidemeid peptidoglükaani struktuuris. 1. Glükaanahelat hüdrolüüsivad ensüümid Endo-N-atsetüülmuramidaasid Endo-N-atsetüülglükoosamidaasid

2. Peptiidahelaid hüdrolüüsivad ensüümid 3. N-atsetüülmuramoüül-L-alaniin amidaas Hüdrolüüsib sidet glukaan- ja peptiidahela vahel.

Eelpool loetletud ensüümid omavad rolli rakkude kasvamisel, jagunemisl, kompetentsuse saavutamisel transformatsioonil ja ka toksiinide ning eksoensüümide sekretsioonil. (Osa autoreid seostab neid ensüüme ka apoptoosiga ebasoodsates keskkonnatingimustes). Peptidoglükaani süntees. See on mitmeastmeline protsess, mille erinevad etapid toimuvad tsütoplasmas, membraanidel ja ka periplasmas. Polümeeri põhikomponendid NAM ja NAG sünteesitakse tsütoplasmas. Esmalt liidetakse N-atsetüülglükoosamiin-1-P (GlcNac-1-p) molekulile UTP, mille tulemusena moodustub UDP-GlcNAc. Osa UDP-GlcNAc muudetakse UDP-N-atsetüülmuraamhappeks (UDP-MurNAc). Viimasele liidetakse järjest aminohapped – L-Ala, D-Glu, m-DAP ja lõpuks D-Ala dimeer. Peptiidsidemete süntees kasutab ATP energiat. Lõpptulemusena saadakse UDP-N-atsetüülmuramoüülpentapeptiid. Edasised reakstsioonid toimuvad lipiidsekandja (undekaprenüülfosfaat) pinnal. Kasvavas rakus toimub pidevalt peptidoglükaani osaline lõhkumine ja asendamine uue materjaliga. Peptidoglükaani sünteesi eest vastutavad geenid paiknevad E. coli kromosoomis ühtse suure klastrina. Selles piirkonnas paiknevad geenid murC, murD, murE, ddl, murF, mraY ja murG osalevad peptidoglükaani sünteesi erinevatel etappidel, mille tulemusena UDP-GlcNAc-st moodustub undekaprenüül-UDP-N-atsetüülmuramoüülpentapeptiid. murC – L-alaniin liitmine murD – D-glutamaadi liitmine murE – diaminopimelaadi liitmine ddl – D-alaniin: D-alaniin ligaas murF – D-alanüül-D-alaniini liitmine mraY – UDP-N-atstüülmuramoüülpentapeptiidtransferaas murG – N-atsetüülglükoosaminüültransferaas Teihoehape ja lipoteihoehape. Teihoehapet on leitud ainult gram(+) bakterites. Teihoehape on polümeer, mis koosneb kas ribitoolfosfaadi või glütseroolfosfaadi monomeeridest, mis on omavahel seotud fosfodiestersideme kaudu. Teihoehappega võivad olla seotud suhkrud ja aminohapped. Teihoehappe molekulid on kovalentselt seotud peptidoglükaaniga. Teihoehappe molekulid ulatuvad raku pinnale ja on olulised antigeensed determinandid. Lipoteihoehape (LTA) on membraanseoseline polümeer, milles 16-40 omavahel fosfodiestersidemega seotud glütseroolfosfaadi jääki on kovalentselt seotud membraanides olevate glükolipiididega. LTA üheks füsioloogiliseks rolliks on autolüsiini produktsiooni regulatsioon. Membraanid. Nii gram (+) kui ka gram (-) bakterite membraani põhikomponentideks on fosfolipiididest ja lipopolüsahhariididest koosnev lipiidne kaksikkiht. Gram (-) bakteritel on välismembraan kovalentselt seotud peptidoglükaan kihiga. Lipiidne kaksikiht on asümeetriline: väline kiht koosneb valdavalt lipopolüsahhariididest, sisemine kiht aga fosfolipiididest. Lipopolüsahhariidses komponendis võib eristada kolme regiooni. Gram (-) bakteritel paiknevad välismembraanis spetsiifilised valgud –poriinid -, mis on vajalikud mitmesuguste molekulide transpordiks läbi välismembraani periplasmaatilisse ruumi. Hüdrofiilsed komponendid suurusega kuni 600 – 700 Da (suhkrud, aminohapped, mitmed ioonid) läbivad poorid passiivse difusiooni teel. Mõned poriinid osalevad ainult teatud kindlate metaboliitide liikumisel läbi välismembraani. Lipopolüsahhariid (LPS) koosneb kolmest elemendist – O-antigeenist (koosneb erinevatest suhkrutest), oligosahhariidsest südamikust (koosneb sisemisest ja välimisest kihist) ja lipiid A-st (koosneb D-glükoosamiini dimeeridest, mille hüdroksüülrühmad on asendatud rasvhapetega). Kõik kolm komponenti sünteesitakse eraldi ja seejärel ligeeritakse kokku ning transporditakse välismembraani. O-antigeen on heteropolümer, mis koosneb korduvatest trisahhariidsetest ühikutest, mis sisaldavad N-atsetüül-D-glükoosamiini, N-atsetüül-D-mannoosaminuroonhapet ja 4-atseetamido-4,6-dideoksü-D-galaktoosi. E. coli oligosahhariidse südamiku välimise osa sünteesi eest vastutavad geenid paiknevad rfaKJIGB operonis, sisemise osa sünteesis osalevad geenide rfaC,D produktid. Lipiid A süntees toimub 3 etapis: 1. UDP-GlcNAc atsüleerimine, 2. disahhariidi moodustumine, 3. KDO (2-keto-3-deoksüoktülosoonhape) ülekanne ja atsüleerimine. Tsütoplasmaatiline membraan. Tsütoplasmaatiline membraan takistab ainete vaba difusiooni tsütoplasmasse. Membraan koosneb fosfolipiidide kasikkihist, millega on seotud valgud. Valgud paiknevad mosaiikselt, kusjuures osa valke läbib membraane. Kaua aega käsitleti rakumembraani kui struktuuri, mille läbi toimub ainete diffusioon tänu pH ja ioonsejõu erinevusele tsütoplasma ja väliskeskkonna vahel. Rakumembraan on vajalik osmootse barjääri kujunemiseks ja ainete valikulise läbilaskvuse tagamiseks. Lisaks sellele toimuvad siin veel mitmed raku elutegevuse jaoks tähtsad protsessid: oksüdatiivnefosforüleerimine, raku seina biosüntees, fosfolipiidide biosüntees, ekstratsellulaarsete ensüümide sekretsioon. Rakkude jagunemisel seonduvad replitseerunud DNA molekulid spetsiifiliste retseporsaitidega, mis tagab nende sattumise mõlemasse tütarrakku.

Periplasma. Gram (-) bakteritel paikneb sise- ja välismembraani vahel nn. periplasmaatiline ruum. Praeguseks on näidatud, et see ruum on täidetud periplasmaatilise geeliga, mille põhiosa koosneb peptidoglükaanist. Mesosoomid. Paljude gram(+) bakterite rakumembraanis on leitud erinevaid membraanseid-struktuure, mis on nähtavad elektronmikroskoobis. Neid struktuure on hakatud nimetama mesosoomideks. Nitromonas europaea ja teised nitrifitseerivad bakterid omavad selgelt eristatavaid membraanseid süsteeme. Selliste membraansete organellide esinemine nitrifitseerivates organismides (muudavad NH4+ → NO2- ja NO3) on ilmselt kuidagi seotud energia omastamisega nendes protsessides. Praeguste teadmiste kohaselt on nende membraansete struktuuride seos vastavate oksüdatsiooni-protsessidega tõestamata. Kapsel. Bakterirakk on lisaks rakukestale sageli ümbritsetud lima või ka kapsliga. Kapsel koosneb tavaliselt polüsahhariidist – on kirjeldatud nii homo- kui ka heteropolüsahhariidseid kapsleid. Paljudel E. coli tüvedel koosneb kapsel kolaanhappest e. M- antigeenist. Pneumokokkidel moodustab kapsli polüsahhariid, mis koosneb glükopüranoosi ja glukuroonhappe jääkidest, mis on omavahel seotud β-1,3- ja β-1,4-sidemetega.

7. BAKTERITE JAGUNEMINE Selles peatükis käsitleme protsesse, mis on vajalikud rakkude normaalseks jagunemiseks. Rakkude jagunemisele eelneb rakus oleva DNA kahekordistumine e. replikatsioon. Sellele järgneb mitmeasmeline protsess, mis tagab rakuvaheseina sünteesi ja selle lõppedes kahe tütarraku moodustumise. DNA replikatsioon. Nagu juba eespool mainitud toimub vahetult enne rakkude jagunemist DNA replikatsioon, mis kindlustab mõlemad tütarrakud geneetilise materialiga. Rakkudes toimub DNA replikatsioon poolkonservatiivse mudeli järgi. DNA sünteesi viib läbi DNA polümeraas III, kasutades selleks olemasolevat DNA ahelat. E. coli on kirjeldatud viit erinevat DNA-polümeraasi: Pol I (polA), Pol II (dinA), Pol III (dnaE), Pol IV (dinB) ja Pol V (umuDC). DNA süntees toimub 5`→3`suunas ja ensüüm vajab sünteesi alustamiseks vaba 3`OH rühmaga praimerit. DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm. Multiensüümkompleks on V- kujuline, sisaldab 2 apoensüümi, ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud a, e ja q. E. coli tüve K-12 kromosoom on 4639221 bp pikkune. Bakteri kromosoomi replikatsioon algab teatud kindlast piirkonnast, mida nimetatakse oriC ja toimub mõlemas suunas. Kogu genoomi replikatsiooniks (C periood, eukarüootidel vastab sellele S-faas) kulub 40 minutit. Replikatsiooni terminatsioonijärgselt toimub tütarmolekulide dekatenatsioon ja jaotumine, rakuvaheseina moodustumine ning 20 minutit pärast replikatsiooni terminatsiooni tütarrakud jagunevad (D periood, eukarüootidel vastavalt mitoos ja tsütokinees). Seega kulub replikatsiooni initsiatsioonist rakkude jagunemiseni kokku 60 minutit (C + D periood). Aeglaselt kasvavate rakkude puhul (generatsiooniajaga üle 60 minuti) eristatakse ka B perioodi(eukarüootidel vastavalt G1 faas), kus tütarrakkudes ei toimu seni replikatsiooni, kuni nad on saavutanud teatud suuruse, initsiatsiooni massi. oriC järjestus on 245bp pikkune ja sisaldab oma koosseisus kolme 13 nukleotiidi pikkust AT rikast järjestust (L, M, R ja R1) ja nelja 9 nukleotiidi pikkust DnaA-box´i (R1-4). SeqA on replikatsiooni negatiivne regulaator, mis eraldab oriC membraanist (täpsemalt välismembraanist). SeqA seondumine takistab replitseeruval kromosoomil uue replikatsiooni initsiatsiooni. oriC sisaldab GATC saite, mis on metüleeritavad. Kromosoomi replikatsioon initseeritakse ainult selliselt molekulilt, mille mõlemad ahelad on metüleeritud. Pärast replikatsiooni initsiatsiooni jääb oriC teatud ajaks ainult ühest DNA ahelast metüleerituks. Võimalik, et GATC saite aitab hemimetüleerituna hoida SeqA. DNA replikatsiooni regulatsioonis osaleb ka nn. datA järjestus. DatA järjestus paikneb oriC läheduses ning konkureerib DnaA seondumise pärast oriC- järjestusega. Replikatsioonis osaleva DnaA seondumiseks oriC-le on vajalik mitme nn. abivalgu seondumine oriC piirkonda: HU valk, mis seondub kaksikahelalise DNA-ga ja soodustab DNA paindumist ning DNA ahelate lahtikeerdumist. Lisaks seob oriC DNA-d painutavaid valke IHF ning Fis. oriC piirkonnas paikneb kaks promootorit, mioC, millelt toimub transkriptsioon oriC suunas ning gidA, millelt transkriptsioon oriC suhtes eemaldub. Mis käivitab DNA replikatsiooni? Ühe võimalusena pakutakse välja, et replikatsiooni initsiatsioon sõltub aktiivse DnaA (DnaA-ATP) ja nn DnaA-sõltuva initsiatsiooni-hüperstruktuuri tasemest rakus. Replikatsiooni terminatsioon toimub replikatsioonikahvlite jõudmisel järjestusteni terC ja terB vasakult ning terD ja terA paremalt. Nende kahe regiooni vahe on 275 kb. Lisaks osaleb protsessis valk Tus, mis seostub ter järjestustega ja blokeerib replikatsioonikahvli liikumiseks vajaliku helikaasi töö. Rekombinatsioon dif saitides XerD rekombinaasi toimel tagab tütarmolekulide teineteisest eraldumise, dekatenatsiooni. FtsK valk, mis lokaliseerub jagunevate rakkude vahel moodustuvas rakuvaheseinas, modifitseerib moodustunud Holliday struktuuri sobivaks substraadiks rekombinaasile XerD, mis osaleb replitseerunud kromosoomi dekatenatsioonis.

Divisoomi moodustumine. Enne rakkude pooldumist valgu FtsZ molekulid agregeeruvad ja moodustavad pooldumissaidis tsütoplasmaatilise membraani sisepinnale ringi, mis on signaaliks tsütokineesile ja rakuvaheseina moodustumisele. Lisaks FtsZ valgule osaleb selle ringstruktuuri moodustamisel veel terve rida nn. abivalkusid, mis inhibeerivad rakkude jagunemist kuid ei mõjuta nende pikenemist. Moodustunud ringstruktuuri ja selle komponente nimetatakse divisoomiks. Siia kuuluvad valgud, mis osalevad peptidoglükaani sünteesil ja rakkude jagunemisel. Rakkude pooldumisel osalev FtsZ on GTP-aasse aktiivsusega ja sisaldab eukarüootsetele tubuliinidele kõrgelt konserveerunud järjestusega GGGTGSG sarnanevat järjestust GGGTGT. Mutatsioonide teke sellesse regiooni viib valgu aktiivsuse kadumisele. Arvatakse, et eukarüootne tubuliin on evolutsioneerunud FtsZ-ist. Divisoomi kuuluvad membraanseoseline valk ZipA, aktiini homoloog, mis on vajalik rakkude jagunemiseks. ZipA valk võib täita kahesugust funktsiooni: üheltpoolt käitub see kui FtsZ membraaniga siduv valk, teiseltpoolt aga stabiliseerib ta moodustuvat FtsZ polümeeri. Lisaks neile kahele valgule osaleb divisoomi moodustumisel veel terve rida valke – FtsQ, FtsL, FtsI, FtsN, FtsK. Kõik nimetatud valgud on vajalikud rakuvaheseina moodustumise initsiatsiooni etapis, kuid lisaks sellele osalevad mõned neist ka kromosoomi replikatsioonil tekkinud DNA dimeeride lagundamisel. Olulist rolli omab ka valk EnvA, mille puudumine põhjustab kiiresti kasvavate rakkude puhul aheldunud rakkude teket (põhjuseks on rakkude kasvamine pikkuses kuid kuna ei toimu normaalset vaheseina teket, tekivadki pikad rakkude ahelad). Nimetatud valgu näol on meil tegemist N-atsetüülglükoosaminüül-L-alaniin amidaasiga, mis lagundab sidet peptidoglükaani molekulis N-atsetüülmuraamhappe jäägi ja pentapeptiidahela vahel. Rakkude pooldumist mõjutavad ka mõned antibiootikumid, näiteks β-laktaamid. Raku pooldumismehhanismide uurimiseks kasutatakse tavaliselt temperatuuritundlikke mutante mis kasvavad normaalselt 30°C juures, kuid defektne fenotüüp avaldub 42°C juures. Rakkude jagunemisel osalevad valgud võib jagada kolme suurde rühma. Esimesse rühma kuuluvad valgud, mis osalevad peptidoglükaan ümbrise moodustumisel ümber kasvava raku. Nende valkude puudumisel omandavad rakud sfäärilise kuju ja suurenevad ilma jagunemata. Teise rühma moodustavad valgud, mis on vajalikud arenevale peptidoglükaan ümbrisele silidrilise kuju andmiseks. Siia rühma kuuluvad nn. RodA-PBP2 süsteemi valgud. Nimetatud valgud peavad funksioneerima kogu rakupinna ulatuses, v.a. raku poolused. Kolmanda rühma moodustavad valgud, mis on vajalikud uue rakuvaheseina moodustamiseks. Need valgud toimivad rakus perioodiliselt ja ainult rakuvaheseina moodustumise kohal. β-laktaam-antibiootikumid põhjustavad pikkade multituumsete filamentsete ilma vaheseinteta rakkude tekkimise. Üheks olulisemaks valguks selles rühmas on PBP3 (geen ftsI), PBP3 on peptidoglükaani transpeptidaas, mis viib läbi peptidoglükaani transglükosüleerimise ning ahelate krosslinkimise. Lisaks interakteerub PBP3 ka teiste valkudega – FtsA, FtsQ, FtsW ja RodA- peptidoglükaani sünteesi regulatsioonis. Arvatakse, et FtsZ interakteerub FtsA-ga, mis seejärel aktiveerib PBP3. Dimeersed valgud PBP2-Rod2 ja PBP3-FtsW osalevad vajalike morfoloogiliste modifitseerimiste läbiviimisel, mis on vajalikud kasvava mureiin ümbrise modifitseerimisel. PBP3 ning temaga assotsieerunud valkude toimel moodustub peptidoglükaani kaksikkiht jaguneva raku keskele. EnvA toimel toimub nende kihtide eemaldumine ja sellele järgneb välismembraani sissekasvamine.

Rakkude jagunemine on tihedalt seotud kromosoomi replikatsiooniga, sest tekkivad tütarrakud peavad omama ka funktsionaalset kromosoomi. E. coli rakus on terve rida valke, mis osalevad replikatsiooni käigus tekkinud dimeeride lagundamisel. Siin toimivad kaks valku XerC ja XerD – järjestus-spetsiifilised rekombinaasid, protsessis osalevad ka topoisomeraas IV ja geenide parA ja parE produktid. Lisaks on näidatud, et rakuvaheseinas peab olema ka valk FtsK, et saaks toimuda Xer-vahendatud kromosoomide lahknemine. Ühe kontseptsiooni kohaselt toimub tsütokinees alles siis, kui duplitseerunud nukleoidid on täielikult lahknenud. Optimaalsel kasvutemperatuuril nukleoidid lahknevad normaalselt ja FtsZ rõngas paikneb raku keskel. Kõrgemal temperatuuril nukleoidide lahknemine ei ole täielik ja FtsZ rõngas paigutub rakus asümmeetriliselt. See toob endaga kaasa nukleoidi mittesisaldavate rakkude tekkimise, mis tavaliselt hukkuvad. Rakkude jagunemisel omavad tähtsat rolli ka min-operoni valgud. Normaalsetes kasvutingimustes, paikneb vaheseina moodustumise koht täpselt raku keskel. Potensiaalsed jagunemiskohad paiknevad ka raku poolustel, kuid MinC, D ja E valgud blokeerivad nende kasutamise. Kui MinC ja MinD blokeerivad vaheseina moodustumise, siis MinE blokeerib MinC/D toime raku keskel paiknevas pooldumiskohas. MinC ja/või MinD

mutantid produtseerivad arvukalt minirakke, mis näitab, et jagunev rakk kasutab kõiki vaheseina moodustumise kohti.

8. GENEETILISE INFORMATSIOONI ÜLEKANNE BAKTERITES. Konjugatsioon. Konjugatsiooni protsessis toimub DNA ülekanne ühest bakteritakust teise tänu kahe rakuvahelise agregaadi e. ristuva paari kompleksi (maiting pair formation complex – Mpf) tekkele. Selles protsessis võib eristada erinevaid etappe: relaksosoomi teke (valk/DNA kompleks oriT-piirkonnas), DNA translokatsioon (transmembraansete kanalite kaudu), rakk-rakk kompleksi e. agregaadi teke piilide vahendusel. DNA protsessing konjugatsiooni protsessis algab üksikahelalise katkega oriT saidis. Selles protsessis osaleb terve valkude kompleks, mis tagab katkemise T ahelas (ülekanduv DNA ahel). DNA 5´otsaga seonduvatest valkudest üks tähtsamaid on relaksaas, mis võib koos DNA-ga kanduda üle retsipientrakku. Lisaks on näidatud, et retsipienti kanduvad üle ka valgud, mis ei ole seotud DNA. Selliste valkude hulka kuulub näit. plasmiidi ColIb-B9 Sog-primaas; F ja RP4 ülekandel RecA valk. Agrocacterium tumefacisens´i T-DNA mutandid on võimelised ülekandma VirE2 ja VirF valke taimerakku. See näitab, et konjugatsioonil võib valkude ülekanne toimuda sõltumatult DNA ülekandest. Konjugatsioonil osalevad veel kahte tüüpi faktorid – sidestusvalgud (coupling proteins) ja chaperonid – mis on vajalikud DNA ja valguliste faktorite suunamiseks transmembransesse kanalisse kuid ei ole vajalikud relaksosoomi moodustumisel. Sidestusvalgud kuuluvad TraG valkude perekonda; TraG RP4 ja Ti plasmiidides; TrwB R388-s; TraD F-s ja VirD4 T-DNA ülekandes. Praeguseks on kogunenud andmeid, et nimetatud valgud osalevad ka paljudes tüüp IV sekretsiooni süsteemides. Nende funktsiooniks on DNA-valgu kompleksi sidumine transmembraanse kanaliga. Chaperonide hulka kuuluvad näiteks VirC1 ja VirC2, mis osalevad T-DNA ülekandel. Ühe võimaliku mudeli kohaselt muudavad VirC valgud VirD2 T-DNA kompleksi konformatsiooni sobilikuks transportimiseks läbi kanali taimerakku. Erinevad konjugatsiooni süsteemid kasutavad morfoloogiliselt erinevaid piilisid. F-rühma plasmiidid määravd pikkade (~8nm) painduvate piilide sünteesi, mis võimaldavad plasmiidide efektiivset ülekannet vedelsöötmes. IncP, N, W ja Rh1 mittesobivusgruppi kuuluvad plasmiidid ning T-DNA ülekandesüsteem kasutab lühemaid ja jäigemaid piilisisd, mis võimaldavad DNA efektiivset ülekannet tardsöötmel. Kui kaua aega arvati, et piilide funktsiooniks on agregaadi tekitamine kahe raku vahel, siis praeguseks on näidatud, et RP4 derivaadid, mis on defektsed pilide sünteesi määravate geenide osas, moodustavad agregaate sarnaselt normaalsele RP4-le, kuid DNA ülekannet siiski ei toimu. Seega võivad piilid vähemalt osade plasmiidide puhul osaleda aktiivselt ka DNA ülekandel. Ka gram (+) bakterites võib toimud plasmiidse DNA ülekanne konjugatsiooni protsessis. Enterokokkides on kirjeldatud kahte tüüpi plasmiide: 1. plasmiidid, mis kanduvad üle kõrge sagedusega – pAD1, pPD1, pAM1 jt., 2. plasmiidid, mis kanduvad üle ainult filtril ristamisel – pAC1, pIIP501 jt. Plasmiidide ülekanne on reguleeritud retsipientraku poolt produtseeritud lühikeste oligopeptiidide e. seks-feromonide poolt. Plasmiidi pAD1 ülekanne algab plasmiidse repressorvalgu valgu TraA inaktiveerimisega. Retsipiendi poolt sünteesitav feromon cAD1 interakteerub doonorraku pinnal oleva permeaasiga ning transporditakse rakku. Doonoris moodustub cAD1-TraA kompleks, mis blokeerib repressori seondumise. Sellele järgneb positiivse regulaatori TraE süntees, mis käivitab teiste konjugatsiooniks vajalike valkude sünteesi, sealhulgas ka Asa1 e. agregatsiooni-substantsi produktsiooni. Agregatsiooni substanst on rakupinnal paknev mikrofibrillaarne struktuur, mis on vajalik agregaadi tekkeks doonori ja retsipiendi vahel. Peale plasmiidi ülekandumist retsipienti käivitatakse selles inhibiitori iAD1 süntees, mis seob ekstratsellulaarse cAD1 neutraliseerides selle efekti. Transfomatsioon. Geneetilise informatsiooni ülekanne bakterirakku ei eelda mitte alati rakkude vahelist kontakti. Griffith avastas 1928 a. fenomeni, mida ta nimetas transformatsiooniks. Mõned aastakümned hiljem tõstati, et transformatsioonil kandub bakterirakku DNA, mis eelnevalt seondub raku pinnaga, millele järgneb ühe DNA ahela sisenemine rakku. Gram (+) bakterites toimub transformatsioon nn. Streptococcus-Bacillus mudeli järgi. Kompetentsus - faas on lühiajaline ning saavutatakse rakkude poolt teatud kindlas kasvufaasis. Pneumokokid muutuvad kompetenseks kui nende poolt sünteesitud kompetentsust-stimuleeriv valk (CPS valk) saavutab keskkonnas teatud kindla kontsentratsiooni. CPS valk seondub tsütoplasmaatilises membraanis paikneva retseptoriga, mille tulemusena indutseeritakse rakus kümnekonna transformatsiooniks vajaliku valgu süntees. Sellele järgnevalt seondub DNA raku pinnal olevate retseptorsaitidega, mida nimetatkse ka transformosoomideks. Sellele järgnevalt toimub ühe DNA ahela sisenemine rakku, mis seejärel rekombineerub raku kromosoomiga. Teatud kasvufaasis CPS valk (comC geeni produkt) protsessitakse ning saadud valk transporditakse rakust välja. Teatud kindlal kontsentratsioonil aktiveerib CPS valk kahekomponendilise regulatsioonisüsteemi ComD/E vahendusel kompetensus-spetsiifilise operoni comCDE. Nimetatud geenide produktid osalevad transformosoomi

moodustamisel ja lisaks modifitseerivad nad rakuseina selle ümber. Kompetensuse teke on veel üks näide quorum-sensingust. Peale DNA ahela sisenemist rakku rekombineerub see kromosoomiga. Võimalikud valesti paardumised kõrvaldab spetsiifiline Hex-reparatsioonisüsteem (E. coli´s oleva MutLS süsteemi analoog). B. subtilis´es seondub DNA membraanis paiknevate ComEA valkudega ja jääb nendega seotuks nii kauaks kuni see transporditakse rakku. B. subtilis´el sõltub kompetentsus toitainetest, kasvufaasist ja raku tüübist. Kompetensuse saavutamine toimub kahes etapis: I etapis sünteesitakse kaks feromoni e. quorum sensingu signaali CSF ja ComX. Feromonide teatud kontsentratsioonil käivitatkse ComS valgu süntees; II etapis vastusena ComS valgu sünteesile järgnevalt käivitatakse regulaatorvalgu ComK süntees, mis aktiveerib teiste kompetentsusvalkude sünteesi. ComK seondub rakus adaptor valguga MecA ja tekkinud kompleks on rakus degradeeritav ClpCP proteaasi poolt. ComS valgu kontsentratsiooni tõustes rakus seostub see valk eelistatult ClpCP proteaasiga ning ComK valgu hulk rakus tõuseb. Gram (-) bakteris nagu Neisseria gonorrheae ja Haemophilus influenzae ei ole kompetensus indutseeritud CSF valgu poolt, vaid rakkude vastuvõttlikkus DNA-le tõuseb kui rakud on jõudnud statsionaarsesse kasvufaasi. Transformatsioon osades gram(-) bakterites on järjestus-spetsiifiline. Neisseria transformatsioonil sõltub DNA seondumine raku pinnaga spetsiifilise järjestuse GCCGTCTGAA olemasolust transformeeritavas DNA-s. DNA transpordiks rakku moodustub tüüp IV piilide sarnane struktuur, milles osalevad tsütoplasmaatilises membraanis paiknevad valgud PilD, T, F ja G. Piili ise on moodutunud valgust PilE, mis ulatub raku pinnale läbi PilQ moodustunud poori. DNA transpordiks vajaliku kanali moodustumisel osaleb valk PilC. Haemophilus influenzae ei sekreteeri mingeid kompetentsusfaktoreid. Rakud muutuvad peaaegu 100% kompetenseteks kui nad satuvad C-allika nälga. Kompetensus on sõltuv ka cAMP hulgast rakus. cAMP hulga tõus rakus aktiveerib ka kompetensuse saavutamiseks vajalike valkude sünteesi rakus. Seda reguleerib ka valk Sxy. Kompetentsuse saavutamiseks vajalikud geenid paiknevad comA-comF operonis. Lisaks osalevad siin valgud Por (periplasmas lokaliseeruv valk, mis on vajalik ComA-ComC valkude õigeks kokkupakkimiseks) ja DprA (osaleb DNA transpordil läbi tsütoplasmaatilise membraani). Efektiivseks transformatsiooniks peab DNA sisaldama spetsiifilist järjestust AAGTGCGGTCA. Transduktsioon. DNA-d on võimalik bakterirakku ülekanda ka faagide abil. Seda protsessi nimetatkse transduktsiooniks. Üldise-transduktsiooni vahendusel on võimalik ülekanda ühest rakust teise suvalist bakteri genoomi osa. Sellisel juhul sisaldab faagi partikkel ainult bakteri DNA-d. Kui rakku sisenemise järgselt ei toimu DNA integreerumist kromosoomi nimetatkse protsessi abortiivseks-transduktsiooniks. Spetsialiseeritud-transduktsiooni vahendusel kandub üle DNA fragment, mis paikneb faagi integratsiooni saidi (att-sait) läheduses. Selle protsessi korral sisaldab rakus moodustunud uus partikkel nii bakteri kui ka faagi DNA-d.

9. ENERGIA TOOTMINE. Energia Kõige enam kasutatakse bioloogiliste protsesside läbiviimiseks rakus ATP-sse salvestatud energiat. ATP-d genereeritakse rakus kahel moel: substraadi tasemel toimuva fosforüülimise kaudu ja oksüdatiivsel fosforüleerimisel. Substraatsel fosforüülimisel moodustub ATP fosforüülrühma ülekandmisel ADP-le mõnelt makroergiliselt katabolismi vaheproduktilt. EMP rajas moodustub glütseeraldehüüd-3-P-st → 1,3-difosfoglütseraat. Üks fosfaatrühmadest on substraadiga seotud makroergilise sideme abil. 1,3-difosfoglütseraadist 3-fosfoglütseraadi moodustumisel (fosfoglütseraadi kinaasi abil) toimub fosforüülrühma ülekandmine ADP-le ja ATP moodustumine. ATP erilised füüsiko-keemilised omadused võimaldavad tal energiat ülekanda seda vajavatele süsteemidele. Sellisel juhul on energia ülekanne seotud fosforüülrühma ülekandega. Teistes süsteemides võib energia ülekanne olla seotud elektronide ja prootonite ülekandega redoksreaktsioonides. Sünteesitavate ATP molekulide arv sõltub sellest, millist katabolismi rada süsivesikute lagundamiseks kasutatakse. Nii tekib pentooside fermentatsioonil ühe mooli pentoosi kohta 2 mooli ATP kui vaheühendina tekib atsetüülfosfaat. Fosfoketolaas lagundab pentoosi atsetüülfosfaadiks ja glütseeraldehüüd-3-P. Atsetüülfosfaat võidakse muuta atsetaatkinaasi vahendusel atsetaadiks, mille käigus vabaneb 1 mool ATPd. Glütseeraldehüüd-3-P võidakse lagundad EMP rada mööd, mis annab veel 2 mol ATP-d. Mitmed bakterid sünteesivad ATP-d membraansel e oksüdatiivsel fosforüleerimisel. Selles protsessis energia salvestatakse rakumembraaniga seostunud ATPaasi abil anorgaanilise fosfaadi liitmise teel ADP molekulile Prootonite H+ ning elektronide ülekandmisel metabolismiradade (näiteks glükolüüsi ja tsitraaditükli) vaheühenditelt membraanseoseliste tsütokroomide abil tekib rakumembraani sise- ja väliskülje vahele elektrokeemiline gradient. Prootonid või elektronid, mis on ärastatud oksüdeeritavatelt substraatidelt sisenevad ETAsse (orgaaniliste ainete oksüdatsiooni puhul on nende doonoriks NADH) ja nende terminaalseks elektronaktseptoriks aeroobsetes tingimustes on hapnik, anaeroobsetes tingimustes aga näiteks nitraat. ETA kuuluvad flavoproteiinid, FeS-valgud, kinoonid ja tsütokroomid. Elektronide transportimisel vabanenud energiat kasutatakse prootonite rakust väljapumpamiseks. Sel viisil tekkinud elektrokeemilist potentsiaali (laengu ja pH

erinevust), mida nimetatakse ka prootonpotentsiaaliks (proton motive force) kasutatakse ATP genereerimiseks. Energia hulk, mis saadakse membraansel fosforüülimisel sõltub elektroni doonori ja aktseptori loomusest. Üks paremini uuritud elektrontranspordi ahel (ETA) on E. coli´l. Selles ETA toimuvad järgmised protsessid: 1. Esimese reaktsiooni käigus toimub NADH-lt NADH-dehüdrogenaasi abil 2 elektroni ja 2 prootoni ülekanne flavoproteiinkompleksis sisalduvale FMN-le. Reaktsiooni tulemusena tekib FMNH2. 2. Sellele järgneb elektronide ülekanne Fe-S rühmale. Paralleelselt elektronide ülekandega vabaneb 2 prootonit (H+). Koos elektronide ülekandega kaasneb prootonite transport rakust välja, millega genereeritakse prootonpotentsiaali (proton motive force PMF). 3. Järgmises etapis toimub elektronide ülekanne Fe-S rühmalt ubikinoonile. Selle tulemusena moodustub hüdrokinoon ja toimub 2 elektroni (2 e-) ülekanne, millega kaasneb ka 2 prootoni (2 H+) ülekanne. 4. Aeroobsetes tingimustes liiguvad elektronid hüdrokinoonilt tsütokroom o kompleksile (kodeeritud geenide cyoABCDE poolt). Rakust transporditakse välja veel (2 H+), mille tulemusena suureneb prootonpotentsiaal veelgi. Kui hapnikku on keskonnas vähe, kantakse elektronid tsütokroom d kompleksile (kodeeritud geenide cydAB poolt), mis sisaldab hapnikule kõrge afiinsusega terminaalset oksüdaasi. Vastavate geenide transkriptsiooni reguleerib ArcB-ArcA 2-komponendiline süsteem. ATP sünteesi katalüüsib ATP-süntaas. ATP-süntaas koosneb kahest nii funktsionaalselt kui ka struktuuriliselt erinevast komponendis. F1 ehk “peaosa”, mis paikneb membraani sisepinnal ja F0 ehk “sabaosa”, mis läbistab membraani ning milles paikneb prootoneid juhtiv kanal. F1 komponent koosneb viiest subühikust: α3 β3 γ δ ε; F0 komponent kolmest subühikust a1 b1 c10±1. F1 kujutab struktuurilt heksameeri, mille α ja β subühikud moodustavad aktiivtsentri, kus ADP muudetakse ATP-ks ja vastupidi. ATPaas võib töötada ka vastupidises suunas, s.t. pumbata prootoneid rakust välja, genereerides prootonpotensiaali, mis on vajalik viburite liikumiseks ja transportsüsteemide töös hoidmiseks. F1 subühiku α3 β3 heksameer katalüüsib ka ATP hüdrolüüsi. Märkimist väärib ka regulatsiooni süsteem, mis tagab kõigi ATPaasi subühikute sünteesi õiges vahekorras. Kõik ATPaasi sünteesi eest vastutavad geenid paiknevad ühes operonis, mis viitab sellele, et erinevate subühikute süntees ei ole reguleeritud transkriptsiooni tasemel. Ilmselt saavutatakse kontroll tänu iga geeni ees paiknevale translatsiooni initsiatsiooni regioonile (TIR), mis põhjustab ribosoomide seondumise erineva efektiivsuse SD järjestusega.

10. METABOLIITIDE TRANSPORT. Raku tsütoplasmaatiline membraan moodustab hüdrofoobse barjääri, mis on läbimatu paljudele hüdrofiilsetele molekulidele. Järelikult peavad bakterites eksisteerima spetsiifilised mehhanismid, mis transpordivad ühendeid rakust välja ja sisse. Gram (-) bakterite välismembraanis paiknevad kitsad kanalid, mis võimaldavad suhkrute, aminohapete ja mõnede ioonide passiivset difusiooni periplasmasse (ained mille molekulmass on väiksem kui 700 daltonit). Nende kanalite moodustumisel osalevad spetsiifilised valgud poriinid (OmpF, OmpC jt). Mõnede ainete nagu näiteks vitamiin B12. oligosahhariidid, transport rakku toimub spetsiifiliste transportvalkude või kanalite kaudu (maltoosi transpordil osalevad maltoporiinid). Enamus raku elutegevuseks vajalikke aineid vajab spetsiifilisi transpordi süsteeme sisemebraani läbimiseks, et jõuda tsütoplasmasse. Soodustatud difusioon. See on ainuke transpordi süsteem, mis ei vaja energiat. Selles süsteemis toimub ainete transport läbi spetsiifiliste pooride kontsentratsioonigradiendi languse suunas. Sageli osaleb selles protsessis nn. difusiooni soodustav valk, mis kiirendab protsessi (see on vajalik substraadi kontsentratsiooni madala gradiendi korral). Glütserooli difusioon bakterirakkudesse toimub poriin tüüpi kanalite kaudu, mille põhiliseks struktuurseks komponendiks on valk GlpF. Viimati nimetatud valgu sünteesi määrav geen glpF on ühes operonis glpK (glütseroolkinaas) geeniga. Ka vee sisenemiseks ja väljumiseks rakust läbi lipiidide kihi on olemas spetsiifilised kanalid, millede moodutumisel on vajalik Aqp valk. Kuna aga aqp- mutatsioon ei ole rakule letaalne, on rakus ilmselt ka teisi kanaleid vee molekulide transpordiks. Mehhano-tundlikud kanalid MscL, MscS ABC-transporterid. Periplasmas paiknevate valkude hulgas on üks rühm valkusid, mida nimetatakse seostusvalkudeks (binding proteins). Need valgud võivad rakku transportida S04 2-, aminohappeid, suhkruid. Gram(+) bakteritel kujutavad nimetatud valgud endast lipoproteiine või raku pinnaga seotud valke. Seostusvalgud kannavad nendega seostunud substraadi molekuli(d) spetsiifilise neljast membraanseoselisest valgust koosneva kompleksi juurde. Selle kompleksi kaks liiget sisaldavad oma struktuuris ATP sidumise motiivi (Walker A box`i). Substraadi ülekanne seostusvalgult membraan kompleksile käivitab ATP hüdrolüüsi, mis omakorda põhjustab pooride avanemise ja substraadi ühesuunalise liikumise raku tsütoplasmasse. Kemo-osmoos vahendatud transport (chemiosmotic-driven transport). See süsteem tagab molekulide liikumise läbi memebraani tänu eelnevalt moodustunud ioon-gradiendile (prooton- ja naatriumgradient). Membraanil luuakse prootongradient ja läbi transporteri kanali sisenevad rakku

nii prootonid kui ka transporditavad molekulid. Enamasti töötavad need süsteemid vastu kontsentratsioonigradienti ja vajavad toimimiseks energiat. Seega on tegemist aktiivse transpordiga. Transportimisel eristatakse 3 süsteemi: 1. Sümport – ühe kandja poolt vahendatud kahe substraadi samaaegne transport samas suunas. Prootongradient võimaldab sümportida vastupidiselt laetud ioone või neutraalseid molekule (näiteks laktoosi transportimine rakku laktoosi permeaasi LacY abil). 2. Antiport – kahe sarnaselt laetud ühendi samaaegselt vastassuunaline transportimine. Sellesse süsteemi kuulub näiteks Na+ ja H+ ioonide transportimine NhaA ja NhaB abil, mis võimaldab rakkudel aluselises keskkonnas kasvamisel säilitada tsütolasmas neutraalse pH. 3. Uniport – transporditava substraadi membraani läbimine ei sõltu teiste ühendite kontsentratsioonist või transportimisest. Põhimõtteliselt toimub sel viisil eelpoolkirjeldatud glütserooli soodustatud difusioon. Spetsiifilised transpordi süsteemid ATP seoselised ioonpumbad. Sellese rühma kuulub kahte tüüpi ioon pumpasid F-tüüpi (F1F0) ja P-tüüpi (E1E2) ATPaasid. F-tüüpi ATPaasid pumpavad H+ välja või kaasneb H+ rakku sissepumpamisega ATP tootmine. Erinevad P-tüüpi ATPaasid on märkimisväärselt sarnased üksteisega, vaatamat sellele, et nad osalevad väga erinevate ioonide transpordis (K, Na, Mg, Cd). E. colis on kirjeldatud ioonide transpordis osalevat Kdp ATPaasi. See koosneb kolmest subühikust A2B2 C2. KdpB valk lokaliseerub membraanis ja on homoloogne teiste P-tüüpi ATPaasidega, mis seostuvad ATPga ning milledel on ATP hüdrolüüsiv toime. KdpA subühik on membraani läbiv transporter, mis moodustab kanali K+ ioonide transpordiks. Kui P-tüüpi ATPaaside puhul kaasneb ühe iooni transpordiga rakust välja teise iooni transport rakku (K+ Na+ ATPaas), siis Kdp ATPaasi korral toimub ainult ioonide transport rakku. Kogu süsteemi kontrollib KdpD/KdpE kahekomponendiline regulatsioonisüsteem. Raua transport Enamus baktereid vajab normaalseks elutegevuseks rauda. Raud kuulub paljude ensüümide aktiivtsentrisse. Aeroobses keskkonnas esineb raud III-valentsena ja on organismidele raskesti omastatav. Paljud bakterid produtseerivad selliseid aineid – siderofoore -, mis moodustavad Fe3+ kompleksi ja moodustunud kompleks võimaldab raua transpordi rakku. Bakterite poolt sünteesitud siderofoorid on erineva struktuuriga. E. coli sünteesib siderofoori enteroheliin. Vastav siderofoor moodustab Fe3+ kompleksi – ferrienteroheliin, mis transporditakse Fep valkude vahendusel rakku. Transpordisüsteemi kuuluvad FepA – võimaldab Fe3+ transpordi üle välismembraani. FepB – transpordib ferrienteroheliini sisemembraanis paikneva FepCDG kompleksini, mis omakorda viib raua iooni rakku. Rakku transporditud Fe3+ redutseeritakse Fe2+. Viimase kontsentratsiooni tõustes blokeeritakse rakus Fe3+ ioonide transpordiks vajalike valkude süntees. Fosfotransferaas-süsteem. Selles süsteemis toimub transpordi käigus ka substraadi fosforüülimine. Nimetatud transpordi süsteemi on põhjalikult uuritud E. coli´s. Esimeses etapis fosforüülitakse valk PstI PEP arvel ja sellelt kantakse fosfaatrühm üle valgule PstH (histidiin kinaas) ja sealt edasi valgule EII. Süsteemi kuuluv valk EII on suhkruspetsiifiline ja koosneb kolmest domäänist IIA, IIB ja IIC. Selles ülekandesüsteemis kantakse fosforüülrühm PEP-ilt eespool mainitud valkude vahendusel rakku transporditavale suhkrule. Valk IIC moodustab transpordikanali ja osaliselt ka suhkruspetsiifilise seondumissaidi. EII valgud võib grupeerida, vastavalt järjestuse homoloogiale, nelja klassi: mannitool, glükoos, mannoos ja laktoos klass.

11. LÄMMASTIKU METABOLISM N2 fikseerimine atmosfäärist. Looduses on kirjeldatud mitmeid baktereid, kes on võimelised omastama N2 atmosfäärist (näiteks mitmed Rhizobium’i liigid, Klebsiella pneumoniae) ja muutma selle ammooniumiks. Protsessi viib läbi multikomponentne nitrogenaasi süsteem. Erinevatel bakteritel on nitrogenaasi süsteem üllatavalt sarnase ehitusega. See koosneb kahest komponendist: 1. komponent I – dinitrogenaas (molübdeeni ja rauda sisaldav kahest subühikust koosnev valk) ja 2. komponent II – dinitrogenaasi reduktaas (raua ja väävli-seoseline valk, mis kannab elektronid dinitrogenaasile). Üldiselt on N2 fikseerimine energiakulukas protsess, mis vajab toimumiseks 12-16 molekuli ATP-d. Reaktsiooni tulemusena tekib ammoonium ning vabaneb ka H2. N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Üks paremini kirjeldatud nitrogenaasi süsteem on K. pneumoniae. Siia süsteemi kuuluv dinitrogenaas (komponent I) on α2 β2 tetrameerne multiensüümkompleks. Dinitrogenaas on kodeeritud geenide nifK ja nifD poolt. Lisaks kuulub süsteemi dinitrogenaasi reduktaas (komponent II), mille süntees on kodeeritud nifH geeni poolt. Kolmanda komponendina kuulub süsteemi rauda ja molübdeeni sisaldav kofaktor FeM-Co, mille sünteesil osalevad 6 erinevat nif geeni (nifQBVNEH). nif geenide transkriptsiooni reguleerivad geenid nifLA, mis on lämmastiku limitatsioonis aktiveeritavad valgu NtrC poolt. NifA on positiivne transkriptsiooni aktivaator, mis aktiveerib transkriptsiooni ζ 54-sõltuvalt promootorilt. nifL geeni produkt interakteerub NifA-ga, takistades

NifA-vahendatud transkriptsiooni aktivatsiooni fikseeritud lämmastiku (ammoonium või aminohapped) olemasolul. Lämmastiku fikseerimine sümbioosis elevate bakterite poolt. Sümbioos sellise bakteri nagu Sinorhizobium meliloti ja peremestaime (näit. Medicago sativa) vahel kulmineerub mügarate e. Noodulite moodustumisega, mis kujutavad endast kõrgelt diferentseerunud taimeorganeid. Kui bakterid sattuvad taimerakku, hakkavad nad seal paljunema ja differentseeruvad N2 siduvateks bakteroidideks, mis on taimeraku tsütosoolist eraldatud spetsiifilise membraaniga. Noodulite moodustumine on keeruline protsess, milleks on vajalik teatud kindlate taime- ja bakteri geenide koordineeritud ekspressioon. Noodulite moodustumiseks on vajalik bakterites olevate nn. nod geenide aktivatsioon. Nod geenide induktoriks on taimerakus sünteesitavad flavonoidid. Lisaks noodulite moodustumisele indutseerivad osad flavonoidid ka bakterite kasvu ja kemotaksist. Reeglina paiknevad nod geenid plasmiidis, mida nimetatkse Sym plasmiidiks. Noodulite sünteesiks vajalike geenide ekspressioon on reguleeritud positiivse transkriptsiooni fakori NodD poolt (induktoriks on taimede poolt sünteesitavad flavonoidid). nodABC geenid on leitud kõigil rhizobiumi tüvedel. Nimetatud geenide ekspressioon on vajalik mitmete polüsahhariidide sünteesiks: suktsinoglükaan (EPS I), eksopolüsahhariid II (EPS II). Nitrogenaasi komponentide sünteesil osalevad nif-geenid. Lisaks osalevad lämmastiku fikseerimisel veel mitmed fix-geenide produktid. Kui bakter varustab taime lämmastikuga, siis vastusena varustab taim bakteroidi süsiniku allikaga. Sym-plasmiidil paiknevad lisaks lämmastiku fikseerimises osalevatele geenidele ka geenid, millede produktid on vajalikud taimedes sünteesitavate dikarboksüülhapete (suktsinaat, malaat, fumaraat) transpordiks bakterisse (dct-geenid). Dikarboksüülhappeid on bakterid võimelised kasutama energiaallikana. Anorgaaniliste lämmastikühendite assimilatsioon. Looduses olev anorgaaniline lämmastiku ühend, mida bakterid saavad kasutada orgaaniliste ühendite (aminohapped) sünteesiks, on ammonium. Ammoniumi puudumisel keskkonnas võib organism kasutada lämmastiku allikana ka histidiini või proliini. Ammoonium on otseseks substraadiks ainult väheste aminohapete (glutamaat, alaniin, aspartaat) sünteesil. Nimetatud aminohappeid kasutab organism ülejäänud aminohapete sünteesil aminorühma doonorina ketohapete prekursorite transamineerimisel. Ammooniumi assimileerimisel vajalikud ensüümid on glutamaadidehüdrogenaas (GDH), glutamiinisüntetaas (GS) ja glutamaadisüntaas (GOGAT). Alaniini ja aspartaadi sünteesil osalevad alaniinidehüdrogenaas ja aspartaas. Põhiline ühend, mida sünteesitakse, on siiski glutamaat. Bakterid võivad kasutada ammoniumi assimilatsiooniks erinevaid metabolismiradu. 1. Kui ammoniumi kontsentratsioon keskkonnas on madalam kui 1 mM on GDH poolt läbiviidava reaktsiooni tasakaal nihutatud, mistõttu glutamaadi sünteesi enam ei toimu. Nendes tingimustes aktiveeritakse seni osaliselt inaktiivne GS. Viimane katalüüsib glutamiini sünteesi, glutamiini hulk rakus tõuseb ja sellest sünteesitakse glutamaadi süntaasi GOGAT toimel glutamaati (reaktsioonis osalevad glutamiin, α -ketoglutaraat ja NADPH). 2. Ammooniumi ülehulgas domineerib glutamaadi süntees α -ketoglutaraadist ja ammooniumist glutamaadi dehüdrogenaasi GDH toimel, kasutades NADPH-d. Vähesel hulgal sünteesitakse ka glutamiini süntetaasi GS toimel glutamiini (glutamaat + ammoonium, toimub ATP hüdrolüüs) NtrB/NtrC süsteem ammooniumi assimileerimise regulatsioonis Selleks, et võimalikult täpselt reguleerida siin osalevate geenide ekspressiooni, on ammoniumi assimilatsioonis osalevad geenid allutatud kahekomponedilise regulatsiooni süsteemi GlnL/GlnG kontrollile. Kahe-komponendilise regulaatorsüsteemi geenidega ühes operonis paikneb ka glutamiini süntetaasi kodeeriv geen glnA. GlnL on tuntud ka nimetuste all NtrB ja NRII ning GlnG asemel kasutatakse sageli nimetusi NtrC ja NRI. Enamlevinud on siiski nimetused NtrB ja NtrC. Bakterites toimub lämmastiku assimilatsioonil osalevate valkude aktiivsuse kontroll ka biokeemiliste mehhanismide abil. Glutamiinsüntetaasi aktiivsust reguleerivad valgud GlnE ja PII. Bakteri rakkudes olev adenülüültransferaas (GlnE) on bifunktsionaalne ensüüm, mis võib glutamiinsüntetaasi (GlnS) türosiinile adenüülrühma kas üle kanda või elimineerida. Selles protsessis osaleb ka valk GlnD, millel on uridülüültransferaasi (UT) aktiivsus türosiinile ja uridülüülrühma kõrvaldav (UR) aktiivsus. Madalatel glutamiini kontsentratsioonidel toimub selle valgu mõjul uridülüülrühma ülekanne valgule PII, glutamiini kontsentatsiooni tõustes aga vastupidine protsess. Adenüleeritud GlnS-i vorm on inaktiivne. Selle vormi tekkimist soodustab valgu PII see vorm, mis ei sisalda uridülüülgruppi. Lisaks biokeemilisele regulatsioonile toimub ammoniumi assimilatsioonil osalevate geenide kontroll ka transkriptsiooni tasemel. Juhul, kui N-allikat on bakterite kasvukeskkonnas piisavalt, toimub transkriptsioon nõrkadelt ζ 70-sõltuvatelt promootoritelt glnAp1 ja glnLp. Lämmastikuallika kontsentratsiooni langedes aktiveerib fosforüleeritud NtrC-P transkriptsiooni glnAp2 geeni ζ54-sõltuvalt promootorilt. NtrC fosforüleeritakse sensorvalgu NtrB poolt. NtrB-l on bifunktsionaalne valk, millel on nii autokinaasi kui ka fosfataasi aktiivsus, mida kontrollib bifunktsionaalne ensüüm PII. UT aktiivsus on stimuleeritud N-vaeguse korral, kus glutamiini kontsentratsioon on rakus α -ketoglutaraadi kontsentratsioon kõrge. Selle tulemusena tekib PII uridüleeritud vorm UMP-PII, mis stimuleerib NtrB-l kinaasi aktiivsust ja NtrC fosforüleeritakse. Kõrgel

ammooniumi kontsentratsioonil domineerib PII puhul UR-aktiivsus. UR-aktiivsusega valk interakteerub NtrB-ga, stimuleerides NtrB fosfataasset aktiivsust, mille tulemusena NtrB defosforüleerib NtrC. Bakteris Klebsiella pneumoniae on nitrogenaasi sünteesi eest vastutavad geenid nifHDK samuti fosforüleeritud NtrC poolt aktiveeritavad. N2-limitatsioonis aktiveerib NtrC-P nifA transkriptsiooni ning aktiveeritud NifA omakorda nifHDK geenide transkriptsiooni. NtrB/NtrC poolt on kontrollitud ka selliste operonide transkriptsioon nagu näiteks hut operon, mis kodeerib histidiini utiliseerimist ja put operon, mis kodeerib proliini utiliseerimist.

12. VALKUDE TRANSPORT (TÜÜP I-IV SEKRETSIOONI SÜSTEEMID). Ligikaudu 20% bakterites sünteesitud polüpeptiididest paikneb osaliselt või täielikult väljaspool tsütoplasmat. Suurem osa valkudest transporditakse rakust välja nn. üldise sekretsiooni mehhanismi e. Sec-sõltuv mehhanismi (general secretory pathway – GSP) vahendusel. Kõik sekreteeritavad valgud omavad N-terminaalset signaaljärjestust, mille funktsiooniks on valkude sidumine membraaniga. Signaaljärjestus koosneb 15-30 aminohappest. Enne transporti seondub valguga kas “trigger factor” või SRP kompleks (signal recognition partical). SRP koosneb Ffh valgust ja ffs RNA-st (4.5S RNA). SRP-ga seondunud valgud transporditakse (kotranslatsiooniline eksport) membraan-seoselise retseptorvalgu FtsY juurde. Sec-sõltuva transpordisüsteemi põhiline komponent on SecYE translokon, mis paikneb tsütoplasmaatilises membraanis. Osa sekreteeritavaid valke interakteeruvad kõigepealt “trigger factor”–iga ja seejärel chaperoniga SecB. Seejärel transporditakse valk SecA (ATPaas) valgu juurde, mis on seotud translokoniga SecYE. Valgu transport periplasmasse toimubki läbi SecYE translokoni. SRP-kompleksiga interakteeruvad valgud seonduvad tsütoplasmaatilises membraanis paikneva retseptoriga FtsY, millele järgnevalt transporditav valk lülitatakse membraani või suunatakse SecYE translokoni. Translokatsiooni ajal või vahetult peale seda eemaldatakse valgust signaaljärjestus signaalpeptidaasi (LepB) poolt. Valkude transport läbi välismembraani. Tüüp I sekretsioon (ABC transporterid). See on lihtsaim valkude sekretsioonisüsteem, mis koosneb kolmest komponendist: välismembraanis paiknevast kanalist, sisemembraanil paiknevast ABC transporterist ja periplasmas lokaliseeruvast valgust. Kaks viimast komponenti on substraadi spetsiifilised. E. coli´s on kirjeldatud sekretsiooni süsteemi, mis on vajalik hemolüsiini (HlyA) transpordiks rakust välja. Sisemembraanil paiknev transporter (HlyB2) sisaldab ATP seondumise kassetti, süsteemi kuulub veel preiplasmas paiknev valk HlyD. Välismembraanis paikneb valk TolC. Tüüp II sekretsioon. Seda süsteemi nimetatakse sageli ka Sec-sõltuva sekretsioonitee põhiharuks. Valk transporditakse periplasmasse üldise sekretsiooni mehhanismi vahendusel, periplasmast välja toimub transport spetsiifilise süsteemi abil, mis sõltub konkreetsest valgust. Tüüp II sekretsiooniteed kasutab V. cholerae koolera toksiini transpordiks rakust välja. Toksiini A ja B subühikud trasnporditakse periplasmasse Sec-sõltuva mehhanismi abil. Periplasmas toimub toksiini subühikute assambleerimine ning funktsionaalne toksiin transporditakse läbi välismembraani sptsiifiliste Esp valkude vahendusel (spetsiifiline tüüp II sekretsioonisüsteem). Nimetatud bakteris EpsD valk moodustab sekretsiooni poori, EpsE, EpsL ja EpsM reguleerivad ekstratsellulaarset sekretsiooni. Valgud EpsG, H, I, J ja K osalevad pili sarnase struktuuri moodustamisel, mis on vajalik valkude sekretsioonis. Paljud taimepatogeenid kasutavad ekstratsellulaarsete ensüümide sekretsiooniks nn. out-süsteemi. See süsteem sisaldab tavaliselt 12 valku, mis moodustavad pili-sarnase struktuuri. Tüüp II sekretsioonisüsteem erineb kõikidest teistest selle poolest, et see süsteem transpordib eelnevalt periplasmas kokkupakitud valke rakust välja. Tüüp III sekretsioon. Tüüp kolm sekretsioonisüsteemi kuuluvad valgud moodustavad süstla-sarnase struktuuri, mis tagab valgu transpordi bakteri tsütoplasmast otse eukarüoodirakku. Seda tüüpi sekretsioonisüsteemi kasutavad patogeenid toksiinide või farmakoloogiliselt aktiivsete valkude transpordiks peremees rakku. Sekretsioonisüsteemi moodustavate valkude süntees suureneb oluliselt patogeeni sattumisel peremees organismi. Nii näiteks on fütopatogeenil Ralstonia solanacearum kolmest valgust (PrhA, PrhI ja PrhR) koosnev süsteem, mis kontrollib tüüp III sekretsioonisüsteemi valkude produktsiooni. Sekretsioonisüsteemi valkude produktsiooni mõjutavad keskkona pH, homoseriinlaktoonid, kahevalentsed ioonid ja paljud teised keskkonna faktorid. Sekretsioonisüsteemi baasalosa, mis koosneb tsütoplasmaatilises membraanis ja välismembraanis paiknevast ringstruktuurist, sarnaneb viburite basaalkehaga. Kõikidele tüüp III sekretsioonisüsteemidele on iseloomulik nõela-sarnane struktuur, mis ulatub rakupinnale ja mis koos basaalosaga (kaks ringstruktuuri), moodustab ühtse terviku. Fütopatogeenidel on nõela-sarnane osa asendatud valkude kompleksiga, mis oma struktuurilt meenutab pilit. Patogeenide hulka, mis omavad tüüp III sekretsioonisüsteemi kuuluvad: Yersinia liigid, Salmonella enteritica, Shigella flexneri, jt. Sekreteeritavad valgud transporditakse tsütoplasmaatilise membraani juurde spetsiifiliste chaperonide vahendusel. Nii näiteks paljudes Yersinia tüvedes on tsütotoksiini YopE sekretsiooniks vajalik selle eelnev seondumine tshaperoniga SycE.

Tüüp VI sekretsioonisüsteem (T4SS). Mitmed patogeenid kasutavad sekretsiooni süsteemi, mille komponendid sarnanevad konjugatsiooni süsteemile (see osaleb DNA ülekandes doonorist retsipient-rakku. Vt. konjugatsioon). Mõnede patogeenide nn. adhesiivsete pilide moodustumine raku pinnale on sarnane tüüp IV sekretsiooni kompleksi moodustumisele. Uropatogeense E. coli vajab rakkudele kinnitumiseks P-pilisid, millede sünteesi kodeerivad pap-geenid. Pili koosaneb kuuest subühikust Pap A, G, K, E, F ja G. Pilide moodustumiseks vajalike valkude transpordiks periplasmas on vajalik chaperoni PapC. Agrobacterium tumefaciens kasutab tüüp IV sekretsiooni süsteemi T-DNA ja effektorvalkude liikumisel bakterist taimerakku. VirB/VirD süsteem on üks paremini kirjeldatud tüüp IV süsteem. T4SS süsteemi kuuluvad virB-operoni poolt kodeeritud 11 valku (VirB1-B11) ja valk VirD4. Kanali moodustumisel osalevad valgud VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 ja VirB10 ning lisaks veel VirD4. Protsessi efektiivseks toimumiseks vajatakse ka kahte ATPaasi – VirB4 ja VirB11. Heliobacter pylori kasutab seda tüüpi sekretsiooni süsteemi CagA valgu transporiks imetajarakkudesse. Valkude proteolüütiline protsessing E. coli rakkudes on identifitseeritud üle 20 endoproteaasi. Paljudel neist on nn. “housekeeping” funktsioon, kuid mõningad proteaasid omavad ka regulatoorset funktsiooni, et hoida teatavate valkude hulk rakus madal kas pidevalt või muuta valkude ekspressioonitaset vastusena keskkonna signaalidele. Miks bakterid lagundavad rakus olevaid valke, millede sünteesiks on kulutatud palju energiat? Proteaaside põhiliseks ülesandeks on kõrvaldada rakust mittefunktsionaalsed vigaselt transleeritud, muteerunud, valesti volditud või organismile võõrad valgud. Sellised anormaalsed valgud kõrvaldatakse rakust tunduvalt kiiremini kui nende normaalsed teisikud. Rakkude sattumisel ebasoodsasse keskkonda (madal pH; kõrge temperatuur) suureneb rakus mittefunktsionaalsete valkude hulk. Osadel proteaasidel on rakus regulatoorne funktsioon, mis tagab teatud regulatoorsete valkude õige koguse rakus. Näiteks reguleerib proteaas ClpXP sigma faktori ζS hulka rakus sõltuvalt kasvufaasist. Enamus E. coli proteaase kasutavad ATP energiat. Individuaalsete valkude poolestusaeg on rakus väga erinev, see võib varieeruda mõnest päevast kuni mõne tunnini. Näiteks valgud, mis reguleerivad DNA replikatsiooni või rakkude jagunemist, alluvad väga kergesti proteolüüsile ja nende poolestusaeg võib olla isegi alla paari minuti. Väga ebastabiilne on näiteks SulA valk. Valkude allumine proteolüütilisele degradatsioonile sõltub märkimisväärselt rakkude kasvutingimustest. Kui eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes degradeeritakse 15% valke poolestusajaga alla 5 tunni, siis nälgivates rakkudes tõuseb selliste valkude osakaal juba 50%-ni. Kasvavates E. coli rakkudes degradeeritakse 60% valkudest ATP-sõltuvate proteaaside Lon ja Clp poolt Lon proteaas Lon proteaas on ATP-sõltuv seriini endoproteaas, mis degradeerib nii ebanormaalseid valke kui ka spetsiifilisi regulaatorvalke nagu näiteks raku jagunemise inhibiitor SulA, kapsli sünteesi reguleerivat valku RcsA. Kui SulA-d rakus ei degradeerita, moodustuvad pikad rakkude filamendid ning rakud surevad. Lon on tetrameerne valk, mis koosneb 87 kDa suurustest subühikutest ja mis lagundab ainult kokkupakkimata valke. Substraadi lagundamise tulemusena tekivad 5 – 20 aminohappe pikkused oligopeptiidid. lon mutantides tõuseb looduslikult ebastabiilsete valkude eluiga, samuti temperatuuri-tundlike valkude ning organismile võõraste valkude (näiteks teisest organismist kloneeritud geenide produktid) eluiga. Clp proteaas Clp proteaasis paiknevad ATPaasne ja proteaasne aktiivtsenter erinevates valgu subühikutes. ClpP proteaasset aktiivsust omav subühik võib rekombineeruda kas ClpA või ClpX ATPaasse subühikuga, mille tulemusena tekivad vastavat ClpAP või ClpXP proteaas. ClpAP proteaas molekulmassiga 750 kDa on dodekameerne 21,5 kDa suuruste ClpP subühikute osas ja heksameerne ClpA subühikute osas. ClpA-l on ATPaasne aktiivsus, ClpP-l proteaasne aktiivsus. ClpA puudumisel võib ClpP degradeerida väikesi peptiide ning denatureerida suuri valke. Suuremate valkude degradatsioonil on oluline, et ClpP subühikud oleksid assotsieerunud ClpA-ga. ClpP ja ClpA hulk tõuseb rakkudes eksponentsiaalse kasvufaasi lõpus. LexA repressori autoproteolüütiline inaktivatsioon DNA kahjustuste tulemusena (näiteks UV kiirguse toimel) vallandub rakkudes terve rea valkude süntees, mis püüavad tekkinud kahjustust kõrvaldada. Sellist kompleksset protsessi rakus nimetatkse SOS vastuseks. Rakus toimub aktiivse repressori LexA autokatalüütiline inaktivatsioon Gly-Ala sideme degradeerimise kaudu. LexA proteolüütilist aktiivsust mõjutab ssDNA-ga assotsieerunud RecA kompleks. Repressori lagundamisel kulutatakse ATP energiat. RecA käitub rakus kui aktivaator ka faag lambda CI valgu ja UmuD autoproteaassele aktiivsusele.

13. SUBSTRAATIDE METABOLISM (v.a. glükoos). Vaatamata sellel, et glükoos on heterotroofsete bakterite eelistatuim süsiniku- ja energiaallikas, on bakterid glükoosi puudumisel võimelised kasutama ka mitmeid teisi suhkruid kui süsiniku ja energia allikaid. Kui bakter kasutab näiteks polüsahhariide, lagundatakse need esmalt eksoensüümide toimel rakku transporditavateks molekulideks. Di- ja oligosahhariidid lagundatakse tavaliselt vaheühenditeks (sageli glükoosiks või glükoos-6-P), mis siseneb kas EMP, Entner-Doudoroff´i või teistesse tsentraalsetesse lagundamis radadesse. Paljude

alternatiivsete süsinikuallikate kasutamine on võimalik peale nn. induktsiooni perioodi, mis on vajalik vastava lagundamisraja ensüümide sünteesiks. Laktoos. E. coli vajab laktoosi kasutamiseks spetsiifilist permeaasi (suhkru transpordiks rakku) ja β-galaktosidaasi. Laktoos lagundatakse rakus D-galaktoosiks ja D-glükoosiks. D-galakoosist moodustub galaktokinaasi toimel galaktoos-1-fosfaat, mis muudetakse fruktoos-6-p (Leloir rada). Tekkiv fruktoos-6-P siseneb EMP ratta. Mõningad bakterid, kellel puudub lac-operon (Lactobacillus casei) on siiski võimelised kasutama laktoosi. Sellisel juhul transporditakse laktoos fosfoenoolpüruvaadi (PEP) ja fosfotransferaas süsteemi (PTS) vahendusel rakku. Rakku transporditud laktoos lagundatakse fosfo-β-galaktosidaasi vahendusel glükoosiks ja galaktoos-6-P. Viimane lagundatakse mööda tagatoos-6-P rada glütseeraldehüüd-3-P ja dihüdroksüatsetoon-P. Maltoos E. coli vajab maltoosi kasutamiseks spetsiifilist transpordi süsteemi – malEGF, malK ja lamB – ja malPG operoni poolt sünteesitavaid amülomaltaasi ja maltodekstriinfosforülaasi. Rakku transporditud maltoos hüdrolüüsitakse amülomaltaasi toimel D-glükoosiks ja maltodekstriiniks (polüsahhariid). Maltodekstriin muudetakse maltodekstriinfosforülaasi toimel glükoos-1-P, mille isomerisatsioonil fosfoglükomutaasi toimel saadakse glükoos-6-P. Nii tekkinud glükoos kui ka glükoos-6-P lagundatakse mööda EMP rada. Mannitool. Mannitooli ja teiste heksitoolide (sorbitool, D-galaktitool) kasutamine eeldab spetsiifilise fosfoenoolpüruvaadi (PEP) ja fosfotransferaasi süsteem (PTS) olemasolu bakteris. Fosforüleeritud suhkrud oksüdeeritakse rakus spetsiifiliste heksitoolfosfaatdehüdrogenaaside vahendusel. Mannitooli puhul oksüdeeritakse mannitool-1-P spetsiifilise NAD-sõltuva dehüdrogenaasi toimel fruktoos-6-P, mis lagundatakse mööda EMP rada. E. coli võib toimuda ka mannitooli oksüdatsioon ribuloos-5-P moodustamisega, mis on tasakaalus riboos-5-P ja ksüloos-5-P-ga. Pektiinid. Pektiin on üks põhilise taime rakuseina komponente. Tegemist on polümeeriga, mis koosneb metüleeritud polü-β-1,4-D-galakturoonhappest. Paljud fütopatogeensed bakterid on võimelised lagundama pektiini, põhjustades sellega taimedel mitmesuguseid haigusi. Lisaks sellele on bakterid võimelised kasutama pektiini lagundamisel tekkivaid oligogalakturoniide ka süsiniku ja energia allikana. Pektiini lagundamisel osalevad erinevad ensüümid, mis järkjärgult lagundavad polümeeri. Kõigepealt eemaldatakse pektiinmetüülesteraaside poolt C-6 küljes olevad metoksüülrühmad, mille tulemusena tekib polügalakturonaat, mis edasi lagundatakse pektaatlüaaside ja polügalakturonaaside toimel oligogalakuroniidideks. Need lagundatakse 2-keto-3-deoksü-6- fosfoglükonaadiks (KDPG), mis lagundatakse mööda Entner-Doudoroff´I rada püruvaadini. Tselluloos. Tselluloos on polümeer, milles D-glükoosi jäägid on omavahel seotud β-1,4-glükosiidsidemetega. Tselluloosi lagundamisel osalevad kolme tüüpi ensüümid: 1) endo-β-1,4-glükanaasid, 2) exo-β-1,4-glükanaasid ja 3) β-glükosidaasid. Tselluloosi on võimelised lagundama mitmed filamentsed seened, aktinomütseedid, aga ka mitmed fütopatogeensed bakterid ja rohusööjate soolestikus olevad bakterid. Aromaatsed ühendid. Viimasel sajandil on tänu tööstuse ja põllumajanduse kiirele arengule sattunud loodusesse erinevaid sünteetilisi orgaanilisi ühendeid, mida teadaolevalt looduses ei leidu. Üheks peamiseks keskkonna saastajaks on mitmesugused aromaatsed ühendid (fenooli, benseeni jt. derivaadid). Ent sellest hoolimata on paljud bakterid võimelised kasutama neid ühendeid süsiniku ja energia allikana. Selline paindlik metabolism on bakteritel väga oluline, kuna see suurendab võimalike süsinikuallikate ringi. Süsivesinikud, mis sisaldavad aromaatset tuuma püütakse muuta selliselt, et oleks võimalik aromaatne tuum avada. Aeroobsetes tingimustes liidavad mono- ja dioksügenaasid tuumale hüdroksüülrühma, mis soodustab aromaatse tuuma lagunemist. Bakterid kasutavad aromaatsete ühendite lagundamiseks erinevaid ensüüme, mis muudavad erinevad aromaatsed ühendid tsentraalseteks vaheproduktideks, mis seejärel lagundatakse üldistes katabolismiradades. Selliseks ühendiks mitmesuguste fenoolsete ühendite lagundamisel on katehhool. Katehhooli aromaatse tuuma edasine lagundamine toimub kas kahe hüdroksüülrühma kõrvalt (meta asendist) või kahe hüdroksüülrühma vahelt (orto asendist). Meta-lagundamisraja lõpp produktideks on püruvaat ja atseetaldehüüd, orto-lagundamisrada lõpeb β-ketoadipaadi moodustumisega, mis lagundatakse suktsinaadiks ja atsetaadiks.

14. BAKTERITE STRESSI VASTUSED Bakterirakk vajab normaalseks kasvuks ja paljunemiseks piisavalt toitaineid, optimaalset temperatuuri, pH-d. Kui mõni neist parameetritest muutub, siis põhjustavad need muutused bakterirakkudes stressi. Kiire kasvutingimuste muutuse tunnetamine ja raku kogu füsioloogilise aparaadi ümberkorraldamine vastavalt muutunud tingimustele, on äärmiselt tähtis bakterite ellujäämise seisukohalt. Väljaspool laboritingimusi elavad bakterid pidevalt stressi tingimustes, mis on viinud kompleksse süsteemi väljakujunemiseni, mis võimaldab bakteritel oma elu ümberkorraldada vastavalt muutuvatele keskkonnatingimustele.

Lahustunud ainete kontsentratsioon mängib olulist rolli mikroobide kasvamisel. Tavaliselt kasvatatkse baktereid söötmetes, mille osmolaarsus on madal. Paljude bakterite jaoks hüpertoonilise või hüperosmootsed tingimused põhjustavad vee kaotust tsütoplasmast (plasmolüüsi). Hüpotoonilised või hüpoosmootsed tingimused põhjustavad vee tungimise tsütoplasmasse, mis põhjustab rakkude paisumist. See protsess võib lõppeda ka osmootse lüüsiga. Vee liikumine rakku toimub diffusiooni teel, kuid lisaks sellele toimub see ka läbi spetsiifiliste kanalite e. akvaporiinide. Bakterirakus on soolade kontsentratsioon kõrgem, kui teda ümbritsevas söötmes. See põhjustab märkimisväärse rõhu rakuseinale, kuna raku ruumala püüab suureneda samal ajal kui rakusein takistab rakku paisumast. Rakkude elutegevuse seisukohalt on oluline, et rakuseinale rakenduks kindla väärtusega siserõhk e. turgor. Kui raku väliskeskkonna osmootne rõhk tõuseb, peab turgori säilimiseks tõusma ka tsütoplasma osmootne rõhk. Kui osmootne rõhk rakus suureneks ainult soolade kontsentratsiooni tõusu arvel, inhibeeriks see ensüümid. Selleks, et ensüümid ei inaktiveeruks, kuid turgor rakus siiski säiluks, sünteesitakse rakkudes betaiini, ektoiini, trehhaloosi, glütserooli, sahharoosi, proliini ja väikeseid peptiide. Need ühendid on lahustuvad kõrgel kontsentratsioonil, keemiliselt neutraalsed, ei mõjuta ensüümide aktiivsust vaid pigem stabiliseerivad ensüüme denatureerivate soolade suhtes ning tagavad rakus kõrge osmootse rõhu. Trehhaloosi sünteesi eest vastutab otsAB operon. OtsA on trehhaloos- 6-fosfaat süntetaas ja OtsB trehhaloos-6-fosfaat fosfataas. Neid ühendeid on rakkudel võimalik hankida ka kasvukeskkonnast. E. coli`s ja S. enterica`s vastutavad nende transpordi eest kaks permeaasi – ProP ja ProU. Kõrge osmolaarsus. Kui kasvukeskkonna osmolaarsus suureneb, turgor langeb ning selle tulemusena aeglustub ka rakkude kasv. Makromolekulide süntees ja hingamine aeglustuvad. Raku kõige kiirem vastus sellisele muutusele on kiirendada K+ ioonide transporti rakku. E. coli`s on vähemalt kolm erinevat süsteemi, mis osalevad K+ ioonide transpordil rakku: Trk, Kdp ja Kup-süsteem. Trk ja Kdp süsteeme on kirjeldatud ka teistes bakterites. Trk-süsteem koosneb kolmest valgust TrkA, TrkE ja TrkH või TrkG. Kdp-süsteemist oli juttu eespool. Põhiline anioon, mis osaleb osmoregulatsioonis on glutamaat. Glutamaadi transport sõltub K+ ioonide transpordist. Glutamaati sünteesivad glutamaatdehüdrogenaas (GDH) ja glutamaat süntetaas (GS). Madal osmolaarsus. Kui keskkonna osmolaarsus langeb (hüpoosmootiline shokk), kaasneb sellega kiire veevool rakku, mis suurendab turgorit. See omakorda põhjustab raku ruumala suurenemist, millega võivad kaasneda “mõrad” membraanides või ka olemaolevate pooride väljavenimine. Rakkude permeaablus suureneb, kuid see on ajutine nähtus. Geeni ekspressiooni osmootne kontroll. Keskkonna osmootse rõhu muutumisega kaasnevad ka ulatuslikud muutused raku üldises metabolismis. Rakkude kasv on ajutiselt inhibeeritud, aktiveerub statsionaarse faasi-spetsiifiline sigma faktor ζS, rakkudesse koguneb ppGpp. E. coli välismembaanis paiknevad valgud OmpC ja OmpF, mille ekspressioonitase sõltub väliskekkonna osmootsest rõhust. OmpC ja OmpF on poriinid, millest moodustuvad raku välismembraani akvapoorid. Väliskeskkonna madala osmolaarsuse korral on ülekaalus OmpF, kõrge osmolaarsuse korral aga OmpC. Nende valkude ekspressiooni reguleerib kahekomponendiline-regulatsioonisüsteem EnvZ ja OmpR. EnvZ on transmembraanne sensorvalk, mis kõrge osmolaarsuse korral autofosforüleerub. Seejärel transfosforüleerib vastuvõttev regulaator OmpR, mis kontrollib ompC ja ompF geenide transkriptsiooni. Geenid paiknevad kromosoomi erinevates piirkondades. OmpR-P madala kontsentratsiooni korral on aktiveeritud ainult ompF transkriptsioon, kuna sel juhul toimub regulaatori seondumine kõrge afiinsusega saitidele. OmpR-P kontsentratsioonitõusu korral toimub seondumine ka madala afiinsusega saitidele. Selle tulemusena aktiveeritakse ompC geeni transkriptsioon ning pärsitakse ompF geeni transkriptsiooni. Madala osmolaarsuse korral avaldub EnvZ-il fosfataasne aktiivsus, mille tulemusena defosforüleeritakse nii EnvZ kui ka OmpR. OmpF-i ekspressioonitaset kontrollitakse ka antisens-RNA kaudu. ompF-i mRNA translatsiooni inhibeerib antisens-RNA micF, mida transkribeeritakse ompC geenist vastupidises suunas ja mis on komplementaarne ompF mRNA 5’ otsaga. micF transkriptsioon on aktiveeritud kõrge osmolaarsuse korral. EnvZ-OmpR süsteem ei reguleeri rakus mitte ainult poriinide sünteesi vaid osaleb ka viburi valkude, raku jagunemise, rasvhapete ja paljude muude protsesside kontrollis. Oksüdatiivne stress. Aeroobse hingamise käigus tekivad rakus reaktiivsed hapniku vormid ensümaatiliste ja spontaansete keemiliste reaktsioonide tulemusena. O2 + e-+oksüdatiivne ensüüm → O2– ' NADPH+H++2O2→NADP++ O2_' + H2O2 Superoksiidid võivadkse keemiliste reaktsioonide käigus konverteeruda kõrgelt aktiivseteks ühenditeks nagu vesinikperoksiid, hüdroksüülradikaal, jt. Oluline reaktiivse hapniku detoksifitseerimine toimub mitmesuguste ensüümide abil: katalaasid, peroksüdaasid ja superoksiid-dismutaasid. O2- ' konverteeritakse superoksiidi dismutaasi (SOD) abil vesinikperoksiidiks, mis on vähem toksiline 2H2O2→2H2O+ O2 (katalaas)

O2- ' +O2- '+→ O2+ H2O2 (SOD) E. coli produtseerib kahte tsütoplasmaatilist SOD – Mn-SOD (SodA) ja Fe-SOD (SodB). Nende ensüümide suhtes mutantsed tüved kasvavad aeglasemalt ja on tundlikumad DNA kahjustuste suhtes kui algsed tüved. Periplasmas lokaliseeruv Cu/Zn-SOD (SodC) kaitseb periplasma ja membraani komponente reaktiivsete hapnikuradikaalide eest. Reaktiivsete hapnikuradikaalide mitteensümaatiline kahjutustamine toimub glutatiooni toimel. O2- ' , ·OH ja H2O2 redutseerimisel glutatiooni abil tekib H2O. Glutatiooni rakusisene kontsentratsioon on kõrge (kuni 10 mM). Oksüdatiivse stressi vastased kaitsemehhanismid. Normaalse metabolismi käigus tekivad bakterirakus superoksiid ja vesinikperoksiid. Nendest kahest ühendist võivad tekkida väga reaktiivsed hüdroksüülradikaalid, mis kahjustavad rakus bioloogilisi makromolekule. Praeguseks on täpsemalt kirjeldatud kahte süsteemi, mis reguleerivad oksüdatiivse-stressi vastust rakkudes, need on OxyR ja SoxRS. OxyR-regulon koosneb üheksast geenist, millede ekspressioon on aktiveeritud vesinikperoksiidi poolt. Kõikide nende geenide ekspressiooni kontrollib OxyR. Nimetatud valk kuulub klass I tüüpi aktivaatorite hulka, mis olles seondunud DNAga interakteerub RNA polümeraasi α-subühikuga. OxyR aktiveerimiseks on vajalik tema oksüdeerimine, mille tulemusena tekib disulfiidside tsüsteiini jääkide vahel positsioonides C199 ja C208. OxyR reguleerib järgmiste geenide ekspressiooni: katalaas (katG), glutatioonreduktaas (gorA), jt. SoxRS reguloni kuulub üheksa geeni, millede ekspressioon on aktiveeritud superoksiidi kuid mitte vesinikperoksiidi poolt. Esmalt tunneb signaali ära SoxR valk, mis kannab selle üle SoxS valgule, mis omakorda seondub oksüdatiivse stressi reguloni teiste geenidega. SoxR valgu aktiivtsentris paikneb kaks stabiilset 2Fe-2S aktiivtsentrit, mis on seotud nelja tsüsteiinijäägiga. Oksüdatiivsestressi tingimustes nimetatud aktiivtsentrid oksüdeeruvad kiiresti. Muutused valgu redoksolekus indutseerivad valgu ülemineku aktiivsesse vormi, kuid ei muuda tema seondumise afiinsust – nii SoxR redutseeritud kui ka oksüdeeritud vormid seonduvad soxS promootoriga. pH-stress. Keskonna pH mõjutab mikroobide kasvu, kusjuures see mõju võib olla nii otsene kui ka kaudne. Enamus mikroobe eelistab kasvukeskkonda, mille pH on neutraalne või sellele lähedane (pH 5-8). Selliseid baktereid nimetatakse neutrofiilideks (E. coli, S. enterica, Bacillus subtilis). Bakterite hulgas leidub aga ka selliseid, kes suudavad elada soodajärvedes, kus pH võib olla 11, selliseid baktereid nimetatakse alkalofiilideks. Teise äärmusse kuuluvad atsidofiilid suudavad ellujääda ka keskkonnas, kus pH~1.0. Kui mikroobid satuvad äärmuslikult madala pHga keskkonda, lülituvad tööle spetsiifilised kaitsemehhanismid. Sellises situatsioonis lülituvad sageli tööle ensüümid, mis muudavad happelised metaboliidid neutraalseteks või neutraalsed metaboliidid aluselisteks. Headeks näideteks selliste ensüümide kohta on glutamaatdekarboksülaas, lüsiindekarboksülaas, ureaas, mille ekspressioon indutseeritakse vastusena pH langusele keskkonnas. Mõnedes bakterites on tolerantsus happelise pH suhtes seotud ka Mg2+ sõltuvate ATPpaasidega. Võimet hoida tsütoplasmaatilist pH-d konstantsena sõltumata väliskeskkona pH-st nimetatakse homöostaasiks. Gram(-) bakterid kasutavad enamasti stabiilse pH säilitamiseks, kas prootonpumpa või ka K+/H+ või Na+/H+ antiportereid. Kui bakterirakke on lühiajaliselt inkubeeritud pH 4,3-6,0 juures, on nende ellujäävus pH 3,0 juures märksa kõrgem, kui neutraalse pH juures kasvanud sama organismi rakkudel. Geneetilisi ja füsioloogilisi muutusi, mis rakkus toimuvad nimetatakse ka acid tolerance response (ATR). Happeline keskkond indutseerib statsionaarse faasi sigmafaktori σS ekspressiooni, mis kutsub rakus esile üleüldise stressivastuse. Rakud on adapteerunud tänu uute valkude sünteesile. Kokku indutseeritakse rakus ATR korral ligikaudu 50 uue valgu süntees, vastavaid valke on hakatud nimetama happeshoki valkudeks (acid shock protein). Aeglase kasvukiirusega või statsionaarse faasi rakud on happelise keskkonna suhtes märksa resistentsemad kui eksponentsiaalse faasi rakud. Tsütoplasma pH muutustega aktiveeritakse rakus ka mitmed DNA reparatsioonisüsteemid, nende hulgas näiteks SOS DNA reparatsiooni süsteemi komponendid. Temperatuuristress Temperatuuri kõikumisel optimaalsest üles või alla põhjustab rakkude kasvu aeglustumise või peatumise. Suurte temperatuuri kõikumiste korral tekivad häired membraanide normaalses funktsioneerimises. Temperatuuritõusu korral suureneb membraanide lipiidse kihi voolavus, mis põhjustab mõnede ioonide kontrollimatut liikumist läbi membraanide. Selle tulemusena kaob prootongradient. Termofiilidel (kasvavad edukalt 80° C juures) on seetõttu välja kujunenud energiagenereerimise süsteem, mis pumpab prootonite (H+) asemel rakku Na+ ioone, kuna membraani läbilaskvus Na+ ioonide suhtes temperatuuritõusu korral märkimisväärselt ei suurene. Selleks, et membraanide läbilaskvus püsiks enam-vähem ühesugune, sünteesitakse erinevatel temperatuuridel erinevaid rasvhappeid. Madalal temperatuuril sünteesitakse lühikese ahelaga ja lahustuvaid (kullastamata e. unsaturated) rasvhappeid, temperatuuritõusu korral aga lahustumatuid, pika ahelaga rasvhappeid. Muutused membraani lipiidses komponendis ei vaja üldjuhul uute ensüümide sünteesi, kuna vastavate ensüümide aktiivsust mõjutab temperatuur. Kui temperatuur tõuseb bakteri kasvamiseks optimaalsest kõrgemale, võib see viia valkude denatureerumisele ning selle tulemusena väheneb rakus toimuvate füsioloogiliste protsesside aktiivsus. Põhimõtteliselt tõuseb

ensüümi aktiivsus temperatuuri tõstmisel 10° C võrra ligikaudu 2-korda. Ülempiiriks on ensüümi stabiilsus. Termofiilsete bakterite ensüümid on termostabiilsemad tänu mittekovalentsetele interaktsioonidele aminohapete vahel. Üldist seaduspärasust on siin raske välja tuua, kuna iga ensüümi puhul on sidemete kombinatsioon erinev. Temperatuuri tõustes peab rakk suutma stabiliseerida rakus olevat DNA. Üheks kaitsemehhanismiks on DNA positiivse superspiralisatsiooni suurendamine. Lisaks on DNA kaetud histoonilaadsete ja teiste DNA-ga seonduvate valkudega. Temperatuuri tõustes 30°C juurest 40°C indutseerib E. coli rakus terve hulga valkude sünteesi, mida nimetatakse kuumashoki valgud (heat shock proteins, HSP). Paljud neist on vajalikud ka rakkude elutegevuseks kõrgematel temperatuuridel – DnaJ ja DnaK; GroES ja GroEL (shaperonid), Lon-proteaas, LysU. Kokku indutseritakase ligikaudu 50 valku. ζH-regulon kontollib tsütoplasmaatiliste HSP valkude sünteesi. E. coli`s kodeerib selle faktori sünteesi rpoH lookus. rpoH transkriptsioon võib toimuda mitmelt erinevalt promootorilt. Promootorid P1, P4 ja P5 on transkribeeritavad normaalsel temperatuuril, P3 HS vastusena (σE kontrolli all) ja P5 on reguleeritud cAMP poolt. Promootorite P4 ja P3 ees on DnaA boxid. ζ H tase rakus on reguleeritud peamiselt transkriptsioonijärgselt. Regulatsioon toimub nii translatsiooni efektiivsuse, mRNA stabiilsuse kui ka valgu stabiilsuse kaudu. rpoH mRNA 5’ otsas on järjestus, mille baasil moodustub sekundaarstruktuur, mis blokeerib osaliselt translatsiooni initsiatsiooni. Selle sekundaarstruktuuri püsivus rakus sõltub temperatuurist. Kõrgemal temperatuuril sekundaarstruktuur laguneb, muutes mRNA ribosoomidele kättesaadavaks. ζ H vahendatud regulatsioon on rakus seotud DnaK-DnaJ-GrpE shaperonidega. Madalal temperatuuril DnaK-DnaJ-GrpE kompleks blokeerib ζH seondumise RNA-polümeraasiga. Temperatuuri tõstmisel suureneb rakus vigaste valkude hulk, mis seondudes vähendavad vaba kompleksi DnaK-DnaJ-GrpE hulka, mis omakorad tõstab vaba ζ H hulka. Selles regulatsiooni süsteemis osaleb alarmon diadenosiintetrafosfaat, mida sünteesib aminoatsüül-tRNA süntetaas madala tRNA kontsentratsioonil. ζ E regulon kaitseb ekstratsütoplasmaatilise stressi eest. ζ E reguleerib degP (htrA) periplasmas lokaliseeruva proteaasi, fkpA ja rpoE rseABC operonide ekspressiooni. RseA on transmembraanne valk, mille tsütoplasmas paiknev domään interakteerub ζ E kui anti sigma faktor. Lisaks interakteerub RseA ka periplasmas paikneva RseBga. Stressi tingimustes proteaas DegS lagundab RseA, mille tulemusena viimane kaotab oma mõju ζ E. Normaalsel temperatuuril RseB kaitseb RseAd DegSi proteolüütilise aktiivsuse eest. Sellese süsteemi kuulub ka kahekomponendiline regulatsioonisüsteem – CpxR/A. Nälgivas kultuuris tekkiv stress. Bakterirakkude kasvukiirus sõltub toitainete kättesaadavusest kasvukeskkonnast ning keskkonna füüsikalistest parameetritest. Looduses on tavaliselt võimalike toitainete hulk väga limiteeritud. Kui E. coli satub keskkonda, kus toitainete kättesaadavus on piiratud, reprogrammeeritakse rakus ümber paljud füsioloogilised protsessid, mida nimetatakse ka “starvation-stress response” (SSR). SSR võimaldab bakteritel ellujääda tingimustes, kus toitaineid normaalseks kasvuks ei ole küllaldaselt. Bakterite kasvamine sellistes tingimustes muudab ta ka resistentsemaks paljude teiste stressi faktorite suhtes (kõrge temperatuur, pH, osmootne stress). Eristada tuleb kindlasti kahte tüüpi rakke ja neis olevat füsioloogilist situatsiooni: nälgivad rakud ja statsionaarse-faasi rakud. Statsionaarse-faasi rakud ei paljune, kuigi see ei ole tingitud toitainete või mõnede muude kasvuks vajalike ainete puudumisest (kasvu pärssivad tegurid ei ole sageli selgelt defineeritavad). Nälgivas rakukultuuris aga on limiteerivaks faktoriks mingi kindel komponent (süsinikuallikas, vitamiin, aminohape). Teiseks põhiliseks erinevuseks statsionaarses-faasis oleva kultuuri ja nälgiva kultuuri vahel on rakkude arvukus 1 ml kultuuris. Lisaks sellele on nälgivad rakud nii morfoloogiliselt kui füsioloogiliselt normaalsetest rakkudes erinevad. Kõige esmane vastus süsinikuallika limitatsioonile keskkonas on mehhanismide käivitumine rakus, mis võimaldaksid bakteril hakata kasutama mingit alternatiivset süsinikuallikat. Vajadusest kogu raku füsioloogilised protsessid ümberkorraldada, annavad bakterile märku kahe nn. signaalmolekuli kogunemine rakus. Kaks olulist signaalmolekuli, mis nälgivates rakkudes kogunevad on: tsükliline 3`-5`adenosiinmonofosfaat (cAMP) ja guanosiin 3`-5`difosfaat (ppGpp). Lisaks sellele osalevad SSR protsessis ka kaks alternatiivset sigmafaktorit: ζS ja ζE . Nimetatud faktorid kontrollivad SSR nn. globaalse regulatsiooni tasandil. Lisaks sellele osalevad siin ka nn. spetsiifilised regulaatorid, mis kontrollivad üksikute geenide ekspressiooni. Nende hulka kuuluvad: Fis (factor for inversion stimulation), FadR (regulator of fatty acid metabolism, (represseerib rasvhapete biosünteesi ja soodustab degradatsiooni), Lrp (leucine-reponsive protein), ArcA/ArcB regulatsiooni süsteem jt. Stringent response Kõikide vajalike toitainete olemasolu korral kasvukeskkonnas paljunevad bakterid optimaalse kiirusega. Kui keskkonnatingimused muutuvad toitainete ammendumise tõttu ebasoodsamaks, toimub rakkudes RNA hulga vähenemine (eriti rRNA ja tRNA), aeglustub DNA replikatsioon ja valkude, lipiidide, nukleotiidide biosüntees. Samuti pidurdub paljude makromolekulide transport rakku. Sellist kompleksset ümberkorraldust rakus on hakatud nimetama stringent response või stringent control (SR). SR vallandub rakkudes vastusena aminohapete näljale ja võimaldab neil adapteeruda tingimustes, kus energiaressursid on väiksemad. Selle tulemusena pikeneb rakkude generatsiooniaeg.

Kiiresti kasvavates rakkudes kulutatakse suurem osa energiast ribosoomide sünteesiks. Ribosoomide sünteesi blokeerimine on üks põhilisi energia konserveerimise viise. Pikemaajalise nälgimise puhul võib rakkude kasv hoopis peatuda ja rakud püsivad puhkeasendis e. statsionaarses faasis. Statsionaarsesse faasi minekul võib olla ka muid põhjuseid kui ainult toitainete nälg. Kui kasvu limiteerivaks faktoriks on aminohapete nälg, hakatakse rakkudes sünteesima ebaharilikku nukleotiidi ppGpp-d (guanosiintetrafosfaat). Mingi aminohappe puudusel seondub transleeriva ribosoomi aktseptorsaiti laadimata tRNA molekul. Selle tulemusena translatsioon peatub ning aktiveerub ribosoomi 50S subühikuga seondunud RelA. Nimetatud valk on (p)ppGpp süntetaas I, mis katalüüsib ATP-lt pürofosforüülrühma ülekande GTP 3’ hüdroksüülrühmale. ppGpp sünteesi puhul on kirjeldatud ka RelA-sõltumatut rada, milles osaleb (p)ppGpp süntetaas II nimetusega SpoT. SpoT aktiveerub vastusena pikemaajalisele C-näljale ja ei sõltu ribosoomide seisundist. Kui kasvukeskkond normaliseerub (kõik vajalik bakteri normaalseks kasvuks on olemas), ppGpp lagundatakse. ppGpp degradatsiooni GDP-ks viib läbi SpoT.

16. SOS VASTUS JA DNA REPARATSIOON. Raku elutegevuse seisukaohalt on äärmiselt tähtis, et ta oleks võimeline kõrvaldama DNA-s tekkinud mutatsioone. Bakterites on kirjeldatud mitmesuguseid mehhanisme, mis vastutavad DNA ahelasse valesti lülitatud või mutageenide ning kiirguse toimel muutunud nukleotiidide kõrvaldamise eest. Reparatsiooni süsteeme võib jaga pre- ja postreplikatiivseteks. Osa reparatsiooni protsesse on sõltuvad RecA valgust. RecA on valk, mis osaleb homoloogilse rekombinatsiooni läbiviimisel. Lisaks RecA valgule on homoloogilise rekombinatsiooni toimumiseks vajalik RecBCD osalemine. RecBCD kompleksil on helikaasne aktiivsus, millega kaasneb ka eksonukleaasne aktiivsus, mis avaldub siis, kuni kompleks jõuab Chi saidini (asümeetriline 8-nukleotiidne järjestus) ning seal toimib RecBCD endonukleaasina. Chi sait inaktiveerib RecBCD eksonukleaasse aktiivsuse ning edasi käitub RecBCD kompleks ainult kui helikaas. RecA valk seondub ssDNA-ga ja moodustunud ssDNA-RecA kompleks seondub teise kaksikahelalise DNA molekuliga. Homoloogiliste piirkondade olemasolul moodustub kahe DNA molekuli vahel “Holliday” struktuur kus DNA ahelad on risti. “Holliday” riststruktuur liigub edasi helikaaside RuvA ja RuvB toimel. Kui homoloogiline regioon kahe DNA molekuli vahel lõpeb, lagundatakse tekkinud Holliday struktuur RuvC valgu toimel. RecA valk osaleb ka nn. postreplikatsioonilises reparatsioonis. Kui näiteks DNA ahelast ei ole kõrvaldatud pürimidiini dimeeri enne DNA replikatsiooni, jääb selle vastu uuesti sünteesitavas ahelas tühimik, sest DNA polümeraas ei ole võimeline kasutama dimeeri templeidina. Selle defekti kõrvaldamiseks viib RecA homoloogia alusel omavahel kontakti kahjustusega ja intaktse DNA molekuli. RecA valk osaleb ka DNA rekombinatsioonilises reparatsioonis ssDNA ja dsDNA katkete puhul. DNA kahjustuste (UV-kiirgus, alküleerivad ühendid, tümiini vaegus, ravimid) tagajärjel tekib rakkudes sageli ssDNA. Viimane aktiveerib RecA valgu ning moodustub nukleoproteiinne struktuur. RecA aktiveeritud vorm RecA* interakteerub LexA-ga, mis on paljude reparatsioonil osalevate regulonide repressoriks. RecA*-ga interakteerumise tagajärjel toimub LexA autoproteolüüs. Raku sellist reaktsiooni DNA kahjustusele nimetatkse SOS vastuseks. Lisaks tümiini dimeeride tekkele DNA ahelas on raku füsioloogiliseks vastuseks UV kiirgusele ka raku jagunemise peatumine. Selle tulemusena tekivad väljaveninud nn. filamentsed rakud. LexA valgu lagundamine rakus käivitab SulA valgu sünteesi, mis on oma funktsioonilt raku jagunemise inhibiitor, blokeerides ftsZ geeni ekspressiooni. Aeglustunud rakkude jagunemine võimalda reparatsiooni süsteemidel kõrvaldada DNA kajustused enne replikatsiooni ja vältida sellega nende pärandumist. Ühe SOS vastusena käivitatakse rakkudes ka SOS mutagenees. Selle protsessi tulemusena DNA ahelast vigu ei kõrvaldata, vaid jätkatakse vigade rohket DNA replikatsiooni. LexA valgu puudumisel aktiveeritakse umuDC operon. RecA valgu toimel aktiveeritakse UmuD ning tekib aktiivne UmuD’. Vigaderohkel DNA replikatsioonil osaleb UmuD2’C kompleks. UmuD intaktne valk on SOS mutageneesi inhibiitoriks, ta moodustab inaktiivse UmuD-UmuD’ heterodimeeri. Kui replikatsioon peatub vigase nukleotiidi juures, lülitatakse sünteesitavasse ahelasse juhuslik nukleotiid ja replikatsioon saab jätkuda. Praeguse mudeli kohasel UmuD2’C toimel väheneb DNA polümeraas III 3’ → 5’ “proofreading” aktiivsus. Lisaks mõjutavad modifitseerimata UmuD ja UmuC rakkude kasvu nälgivas kultuuris, mis annab rakkudele lisaaega mutatsioonide kõrvaldamiseks. Sellele järgneb RecA sõltuv UmuD modifitseerimine, mis võimaldab UmuD2’C replikatsiooni kohtades, kus vigased lämmastikalused jäid kõrvaldamata. DNA reparatsioon. DNA ahelast vigade (valede nukleotiidide) kõrvaldamiseks on bakteritel mitmeid võimalusi. Replikatsioonil DNA ahelsse valesti lülitunud nukleotiidi võib kõrvaldada DNA polümeraas III tänu 3´→5´eksonukleaassele aktiivsusle. Kõige lihtsamaks ja otsesemaks mehhanismiks on vea parandamine kohapeal, ilma nukleotiide DNA ahelast kõrvaldamiseta. Alküleerivate ühendite (lämmastikushape) toime võib põhjustada alküülrühma lisamist lämmastikalusele. Tekkinud kahjustuste kõrvaldamine toimub metüültransferaaside abil. Nii näiteks kannab metüültransferaas Ada metüülguaniinilt O6-MeG metüülrühma iseenda tsüsteiini jäägile (Cys-321). Mitmed

DNA reparatsioonisüsteemid kõrvaldavad DNA kahjustust sisaldava segmendi ühest ahelast ja sünteesivad puuduva DNA järjestuse teise ahela nukleotiidse järjestuse baasil. Lisaks võib toimuda defektse järjestuse asendamine korrektsega rekombinatsioonilise vahetuse teel (RecA valgu vahendusel). Mitmete reparatsioonisüsteemid kõrvaldavad DNA ahelas oleva kahjustatud nukleotiidi väljalõikamise teel. Sageli satuvad bakterid UV kiirguse kätte, mille tulemusena tekivad DNA ahelas kahjustused. Selliste kahjustuse kõrvaldamise eest vastutab UvrABC kompleks. Kuigi uvrA, uvrB ja uvrD geene transkribeeritakse rakus pidevalt, on nende transkriptsioonitase LexA repressori poolt mahareguleeritud ning tõuseb SOS vastuse käigus. UvrA (defektset N-alusti tundev valk) ning UvrB tunnevad DNA-l ära vigase koha, seejärel dissotsieerub kompleksist UvrA ning sellele järgnevalt seondub UvrB ja defektse alaga UvrC. UvrB omab endonukleaasset aktiivsust ning ta kõrvaldab vigastatud nukleotiidi koos külgneva ~12 nukleotiidiga. DNA poloümeraas I ja UvrD helikaas kõrvaldavad väljalõigatud piirkonna ning asemele sünteesitakse ilma veata DNA fragment. Rakus omab tähtsat rolli ka nn. “mismatch” reparatsiooni süsteem, millesse kuuluva mutH, mutL ja mutS. Nimetatud “mismatch” reparatsioon kõrvaldab vea vahetult peale DNA replikatsiooni toimumist, kõrvaldades valestipaardunud nukleotiidi metüleerimata DNA ahelast. Väga erinevatel põhjustel võivad bakterirakus tekkida aktiivsed hapnikuradikaalid, mille toimel võib guaniinist moodustuda 8-hüdroksüguaniin (GO). Replikatsioonil viib DNA polümeraas GO võrdse efektiivsusega nii C kui A vastu. Valepaardumisest põhjustatud asendusmutatsioonide vältimiseks on E. coli’s olemas 3 valku – MutM, MutT ja MutY.

17. KEMOTAKSIS. Bakterirakud liiguvad kas viburite abil (enamus grampositiivseid ja gramnegatiivseid baktereid) või libisevad tahkel pinnal (fototroofsed tsüanobakterid). Liikumine toimub viburite abil, mis võivad omada erinevat asetust raku pinnal. Bakterite liikumine on tingitud viburite pöörlemisest. Viburid pöörlevad, kas päripäeva (CW, clockwise) või vastupäeva (CCW, counter clockwise). Kemoatraktandi või mõne muu atraktandi puudumisel keskkonnas on bakteriraku liikumine kaootiline. Viburite pöörlemissuund vahetub perioodiliselt. E. coli´l vahelduvad 1-sekundiline periood, kus viburid pöörlevad vastupäeva perioodiga, kus viburite pöörlemine toimub päripäeva (0,1 sekundit), selle tulemusena rakk tõmbleb ühe koha peal (“tumblig”), kuna iga vibur lükkab rakku erinevas suunas. Seega on raku liikumise trajektoor sik-sakiline. Kemoatraktandina ilmumisel keskkonda, ujuvad bakterirakud selle kontsentratsioonigradiendi suunas. Tavaliselt liiguvad bakterid atraktandi suunas ja eemalduvad ebasoodsatest signaalidest. Liikumist e. taksist stimuleerivad lisaks keemilistele ühenditele ka osmootne rõhk (osmotaksis), valgus (fototaksis), temperatuurimuutused (termotaksis), mehhaanilised stiimulid (tigmotaksis), elektrivool (galvanotaksis) või magnetväli (magnetotaksis). Kemotaksise mehhanismide uurimisel on üheks oluliseks probleemiks selgitada, kuidas bakterid tunnetavad erinevate kemoatraktantide olemasolu keskkonnas ning vastavalt sellele moduleerivad viburite liikumist. E. coli´s reguleerivad viburite liikumist raku membraanis paiknevad retseptorid ja kuus tsütoplasmas lokaliseeruvat Che-valku, mis osalevad signaali ülekandes retseptoritelt viburi mootorile. Che valkude hulka kuuluvad: CheA, CheW, CheY või CheZ. CheY kuulub “response” regulaatorite hulka, mis fosforüleeritud olekus seondub viburi mootorile, pannes selle pöörlema päripäeva. Ülejäänud Che valgud osalevad kas otseselt või kaudselt signaalse transduktsiooni rajas, mis moduleerib CheY fosforüleerimist. Viburi mootor on suur makromolekulaarne kompleks. Selle struktuuriga on seotud Fli valgud, mille kaudu toimub pöörlemise lülitamine CW suunalt CCW suunale ja vastupidi. Fosforüleeritud CheY interakteerub FliM-ga ning vibur hakkab pöörlema CW suunas. Signaali ülekanne rakkudele. Spetsiifilised membraanis paiknevad reteptorid interakteeruvad adaptervalguga CheW, mis omakorda moduleerib histidiini proteiini kinaasi CheA. CheA fosforüleerib nii CheY kui ka CheB. CheY omab ka autofosfataasset aktiivsust, mistõttu ta säilitab fosforüleeritud oleku ainult lühiajaliselt. Lisaks mõjutab CheY defosforüleerimist ka CheZ. Kemoatraktandi seondumisel retseptorvalguga ei interakteeru retseptorvalk CheW-ga ning signaali ülekannet CheY fosforüleerimiseks ei toimu. Seega, kui kemoatraktandi kontsentratsioon tõuseb, viib see alla CheY fosforüleerimise taseme ning viburid pöörlevad vastupäeva (CCW suunas), võimaldades rakkude suunatud liikumist. Juhul, kui rakk puutub aga kokku negatiivse stiimuliga või kui positiivse kemoatraktandi mõju lakkab, käivitub signaalse trasduktsiooni rada, mille tulemusena CheY fosforüleeritakse ning viburite pöörlemine lülitub päripäeva suunale (CW suunale). Rakkude adapteerumine Transmembraansed retseptorvalgud (MCP valgud) võivad olla kas metüleeritud või demetüleeritud olekus. Nendes protsessides osalevad metüültransferaas CheR ja metüülesteraas CheB. Fosforüleeritud CheB, mis käitub metüülesteraasina, hüdrolüüsib metüülrühmad. Arvestades asjaolu, et CheR-i aktiivsus püsib rakus muutumatuna, mõjutab MCP valkude metülatsiooni taset põhiliselt CheB olek rakus – valk võib esineda nii CheB kui ka CheB-P vormis. Positiivsed stiimulid inhibeerivad CheA ning sellises olukorras ei toimu ka CheB aktiveerimist. Kuna metüültransferaas CheR on rakus pidevalt aktiivne, metüleeritakse positiivse stimulatsiooni korral enamus saite. Negatiivse stimulatsiooni puhul on aga ainult vähesed saidid metüleeritud, kuna sel juhul on CheB aktiveeritud.

Kui MCP retseptorvalk on metüleeritud, väheneb selle afiinsus atraktandile. MCP valkude metüleerimine kutsub esile vastupidise efekti kemoatraktandi seondumisele – see soodustab CheA autofosforüleerumist. Selleks, et laguneks retseptori kompleks CheW ja CheA-ga ning viburid hakkaksid uuesti pöörlema CCW suunas, on vaja kõrgemat atraktandi kontsentratsiooni. Seega võimaldab adapteerumine rakkudel otsustada, kas liikuda suunatult edasi või püsida paigal.

18. PURIINIDE JA PÜRIMIDIINIDE SÜNTEES. Puriin ja pürimidiin nukleotiidid on ühed põhilised energia kandjad, nukleiinhapete komponendid ja selliste kofaktorite nagu NAD ja SAM prekursorid. Nukleotiidide sünteesiks on kaks põhilist sünteesirada: de novo ja nn. “päästmis” (salvage) sünteesi tee. De novo sünteesi korral lähtub rada 5-fosforibosüül-1-pürofosfaadist (PRPP) ning lisaks kasutatkse sünteesil selliseid lihtsaid molekule nagu CO2 , aminohapped ja tetrahüdrofolaat. Puriinide süntees Puriin nukleotiidide süntees lähtub 5-fosforibosüül-1-pürofosfaadist (PRPP) ja mitmeetapilisi sünteesiprotsessi tulemusena lõpeb inosiin-5´-monofosfaadi (IMP) tekkega. Sünteesi esimeses etapis toimub amido-rühma ülekanne glutamiinilt PRPP molekulile mida viib läbi ensüüm PRPP amidotransferaas. Kuna PRPP kasutatkse ka histidiini, trüptofani ja NAD sünteesil, mõjutavad häired PRPP sünteesil mitmeid organismi elutähtsaid protsesse. IMP molekuli sünteesiks kulub 5 molekuli ATP-d, 1 molekul glütsiini, 1 molekul glutamiini, 1 molekul CO2, 1 molekul aspartaati ja kaks molekuli formiaati. Formüüljäägi kandjaks on N10-formüül-tetrahüdrofolaat. Moodustunud IMP-st edasi toimub puriinide biosünteesi raja hargnemine. IMP on lähteühendiks nii AMP kui GMP sünteesiks. AMP sünteesiks vajalik energia saadakse GTP hüdrolüüsil ning GMP sünteesiks vajalik energia aga ATP hüdrolüüsil. GTP tarbimine AMP sünteesiks võimaldab hoida rakus AMP ja GMP hulka vajalikul tasemel. GTP liigne akumulatsioon rakus põhjustab AMP sünteesi kiirenemist IMP-st. Liigse GTP kogunemine rakku põhjustab AMP sünteesi kiirenemist IMP-st rakus oleva GMP arvel. Ja vastupidi, kuna GMP süntees IMP-st vajatakse ATP-d, viib ATP kogunemine rakus GMP kiiremale sünteesile võrreldes AMP-ga. Puriinide sünteesi regulatsioon Puriinide tootmist rakus reguleeritakse põhiliselt sünteesiraja kahe esimese ensüümi aktiivsuse kaudu. 5-fosfo-ribosüül-1-pürofosfaadi (PRPP) sünteesi läbiviiva ensüümi PRPP süntetaasi (PrsA) aktiivsuse regulatsioon toimub peamiselt tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu biosünteesiraja lõpp-produkti AMP ja GMP poolt. Inhibitsioon on kõige tugevam siis kui rakus on saavutatud mõlema nukleotiidi optimaalne kontsentratsioon. PRPP amidotransferaasi (PurF) aktiivsuse regulatsioon toimub samuti tagasisidestuslikul inhibitsioonil. Nimetatud ensüüm omab kahte erinevat seondumissaiti, üks ATP, ADP või AMP joks, teine GTP, GDP või GMP jaoks. Nukleotiidi seondumine ensüümiga põhjustab selle inhibitsiooni. PRPP seondumine ensüümiga põhjustab vastupidise efekti. Lisaks toimub puriinide sünteesi regulatsioon biosünteesiraja hargnenud ahelates. IMP dehüdrogenaasi (GuaB) aktiivsus on inhibeeritud tagasisidestusliku inhibitsiooni vahendusel, lisaks represseerib GMP vastava ensüümi sünteesi. Kaks ensüümi, PurA ja PurB, mis osalevad AMP sünteesil, on samuti reguleeritud tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu. Puriini biosünteesi rajas osalevate ensüümide süntees on reguleeritud ka transkriptsiooni tasemel. Kõik puriinide sünteesis osalevad 8 operoni on reguleeritud negatiivse regulaatori PurR ja tema vastatvate korepressorite poolt. purR geeni pealt sünteesitakse aporepressor, mis ühineb korepressorite kas hüpoksantiini või guaniiniga ja blokeerib operonide töö. Pürimidiinide süntees De novo pürimidiinide süntees toimub mööda nn. “orotaat-rada”, kus UMP sünteesitakse karbamoüülfosfaadist. Ühe pürimidiinaluse sünteesiks kulub 1 mool glutamiini, 1 mool ATP-d, 1 mool CO2 ja 1 mool aspartaati. Lisaks on sünteesi lõpus vaja veel 1 mool glutamiini ja ATP-d, et sünteesida UTP-st CTP. Pürimidiin nukleotiidi süntees algab karbamoüülfosfaadist, mis moodustub HCO-3, ATP ja glutamiinist ning mille viib läbi karbamoüülfosfaat-süntetaas. Rakus on veel olemas karbamoüülfosfaatsüntetaas A, mis sünteesib karbamoüülfosfaati arginiini sünteesiks. Kolme järgneva reaktsiooni käigus toimub pürimidiintuuma moodustumine. Edasi toimub PRPP võetud fosforibosüül-rühma liitmine pürimidiintuumaga, mille tulemusena moodustub oroditiin -5-monofosfaat. Viimase dekarboksüleerimisel saadakse esimene pürimidiinnukleotiid UMP. Pürimidiinide süntees erineb puriinide sünteesist kahes olulises punktis. Esiteks, ringstruktuur moodustub kui vaba alus, mitte ei ehitata eda üles PRPP molekuli peale. Siin lisatakse PRPP alles lõplikult sünteesitud pürimidiin alusele (orotic acid), mille tulemusena moodutub orotaatmonofosfaat (OMP), mis järgnevalt dekarboküleeritakse ning moodutud UMP. Teiseks, ei toimu biosünteesiraja hargnemist. UMP fosfolrüleeritakse kaks korda, mille tulemusena moodustub UTP. Esimest fosforüleerimis katalüüsib uridülaatkinas, teis fosforüleerimist nukleosiiddifosfaatkinaas. CTP saadakse UTP-st viimase amineerimisel. Pürimidiinide sünteesi regulatsioon. Pürimidiinide sünteesi regulatsioon toimub põhiliselt raja esimese ensüümi aspartaat-karbamülaasi (ATCaas) kaudu. E. coli´s koosneb vastav ensüüm katalüütilisest (pyrB) ja regulatoorsest (pyrI) subühikust. Ensüümi

aktiivsust sõltub sellest, missugune nukleotiid on seostunud regulatoorse subühikuga – ATP seondumine soodustab, CTP ja UTP seondumine aga inhibeerib ensüümi blokeerides substraadi seondumist ensüümi katalüütilise subühikuga.

19. PEREMEES-PATOGEEN INTERAKTSIOON. Esimene etapp peremees-patogeen interaksioonis on esmane kontakt mikroobi ja peremehe vahel. Sellele järgnevalt võib tekkida kaks situatsiooni: mikroob hukkub või tekib tekivad teatud tüüpi suhted mikroobi ja peremeesraku vahel, mis võib eksisteerida järgmistes vormides: kommensialism – kooselu vorm, mis ei kahjulik ei mikroobile ega peremees rakule, sümbioos – kooselu vorm, mis on kasulik mõlemale osapoolele, parasitism – patogeenne mikroob elab peremees raku arvel. Infektsiooni esimeses etapis toimub patogeeni esmane kinnitumine permees rakule ja sellele järgnev koloniserumine raku pinnal. Tavaliselt kasutab patogeen selleks vibureid või piilisid. Koloniseerimisele järgnevalt toimub kas patogeeni või tema poolt produtseeritud produktide (näit. toksiinide) tungimine nakatatud rakku, millele järgneb mikroobi paljunemine ja levimine nakatunud organismis. Selleks et peremeesorganismis edukalt paljuneda ja levida, peab patogeen olema võimeline rakust omastama vajalikke toitaineid. Nii näiteks on patogeenidel väljakujunenud spetsiifilised mehhanismid, mis võimaldavad neil omastada nakatunud organismist rauda. Kuid kuna ka peremees rakud samuti võistlevad aktiivselt raua omastamise eest, on osadel patogeenidel olemas spetsiifilised süsteemid, mis võimaldavad vabastada peremeesrakust rauda. Nii produtseerivad mõned patogeenid hemolüsiini, mis lüüsib erütrotsüüte ning mille tulemuse vabaneb rakkudes olev hemoglobiin. Adhesioon/Koloniseerimine. Enamus gram(-) patogeene (E. coli, Salmonella enterica jt.) kinnitub peremees raku pinnale viburite või piilide abil. Patogeenid omavad keerulist valkude kompleksi, mis viib läbi nende biogeneesi. Tavaliselt osalevad selles spetssifilised valgud – chaperonid ja “usherid”. Viburit moodustavad valgud transporditakse periplasmasse, kus nad interakteeruvad chaperonidega, et neid stabiliseerida vältimaks nende enneaegset vastastikkust interaktsiooni. Sellele järgnevalt transporditakse nad “usher” valkude juurde, mis moodustavad välismembraanis paikneva kanali, läbi mille toimub nende translokatsioon bakteri pinnale. Samaaegselt translokatsiooniga toimub ka viburite lõpplik assambleerumine funktsioonaalseteks viburiteks. Viburid jagatakse nelja rühma: tüüp I, II, III ja IV. Tüüp I vibureid omaval patogeenil on võime seonduda erütrotsüütide pinnale. Seda seondumis on võimalik blokeerida mannoosi lisamisega keskkonda. Sellepärast nimetatakse seda tüüpi seondumist ka mannoos-tundlikuks hemaglutinatsiooniks (MSHA). Tüüp I vibureid omavad paljud patogeensed E. coli, Salmonella enterica, Klebsiella spp. ja Vibrio spp. tüved. Praeguseks on selgunud, et mitte kõik tüüp I viburid ei ole mannoosi tundlikud, seega esineb ka mannoos-mittetundlikku hemaglutinatsiooni (MRSA). Tüüp II viburid on tüüp I viburite mutantsed vormid, kuna nad on sarnased tüüp I viburitele, kuid on mitte adhesiivsed. Tüüp III viburid võivaldavad MRSH kuid ainult siis kui rakke on eelnevalt töödeldud taniiniga. Tüüp IV viburid on immunoloogiliselt erinevad tüüp I viburitest kuid põhjustavad siiski MRHA. Selline klasifikatsioon on juba vananenud ning praegu kasutatakse klassifikatsiooni, mis põhineb viburite aminohappelise järjestuse võrdlemisel. Lisaks sellele kasutatakse ka klassifikatsiooni, mis põhineb ka viburite spetsiifilistel omadustel: polüonefriidiga seotud viburid (Pap e. p viburid), kimpe moodustavad viburid (BFP viburid), toksiiniga koos reguleeritud viburid (TCP viburid). Praeguseks on üheks paremini biogeneesi seisukohalt uuritud viburiks uropatogeense E. coli Pap vibur e. P vibur, mis võimaldavad patogeenil kinnituda raku pinnal olevatele retseptoritele. Vastavad geenid paiknevad pap-operonis. Viburi põhiliseks subühikuks on valk PapA, mis on seotud bakteri välismembraaniga seotud valgu PapH vahendusel. Viburi tipus paikneb fibrilliin PapE valk ja vibur lõpeb tipu adhesiiniga Pap G, mis on valalik seondumiseks peremees raku pinnal paiknevate glükolipiididega. Preaguseks on kirjeldatud kolme PapG alleeli – klass I, II ja III – mis võimaldavad seondumist eritüüpi retseptoritega. Viburi sünteesis omab tähtsat funktsiooni chaperon PapD. Mitte-viburilised adhesiinid. Hingamisteedes olev patogeen Bordetella pertussis (läkaköha tekitaja) sünteesib nii rakkudele kinnitumiseks nii vibureid kui ka mitteviburilisi-adhesiine. Viimaste hulka kuuluvad sellised nagu filamentne hemaglutinatsiooni põhjustav valk, pektratsiin, läkaköha-toksiin ja BrkA valk. Analoogse funktsiooniga valke on kirjeldatud ka Yersisnia enterocolitica´l – YadA valk (seondub fibronektiiniga), Streptococcus pyogenes´el – valk F ja kompleks M (valk/lipoteihhoehape). Peremeesrakuga seondumise spetsiifilisus. Peremees raku retsptorite ja adhesiini vaheline interaksioon määrab ära selle, millise koe rakkudel patogeen saab koloniseeruda. Nii suudab V. choleae ja enteropatogeensed E. coli tüved (EPEC) koloniseerida kaksteistsõrmiksoole ja peensoole epiteeli rakke. EPEC tüved vajavad kinnitumiseks kimpe moodutavaid vibureid, V. cholerae aga toksiin koreguleeritud vibureid. E. coli enterotoksilised tüved vajavad aga rakkudele

kinnitumiseks K88 vibureid ja koloniatsiooni-faktor antigeeni. Salmonella enterica vajab soole epiteelrakkudega seondumiseks pikki polaarseid plasmiid kodeeritud vibureid. Virulentsusfaktorite sekretsioon. Enamus virulentsusfaktorieid lokaliseerub patgeeni pinnal või sekreteeritakse rakust välja. Gram(-) bakterid kasutavad tüüp I, II. III või IV sekretsioonisüsteemi (vaata sekretsiooni osa lk. …). Tüüp I süsteemi abil sekreteeritakse valke, milledel puudub tüüpiline N-terminaalne signaaljärjestus, küll omavad need valgud C-terminaalses osas 60 aminohappe pikkust järjestust, mis on vajalik nende sekretsiooniks. Selle süsteemi vahendusel transporditakse E. coli α-hemolüsiini, Bordetella pertussis adenülüültsüklaasi, Pseudomonas aeruginosa lipaasi LipA ja proteaasi PrtA. Tüüp II sekretsiooni mehhanismi abil transporditakse Klebsiella oxytoca pullulanaasi, Pseudomonas aeruginosa elastaasi ja eksotoksiin A. Siin toimub protsessi esimene etapp Sec valkude vahendusel, mille tulemusena valk transporditakse periplasmasse. Transport läbi välismembraani toimub spetsiifilise sekretsioonisüsteemi vahendusel (V. cholerae Esp süsteem, Aeromonas hydrophila Exe süsteem). Tüüp III sekretsioonisüsteem (TTSS) on üks enamlevinumaid patogeenide hulgas. Huvitav on see et mitmed TTSS komponendid vajavad enda transpordiks Sec valkusid. TTSS süsteem võimaldab virulentsusfaktorite transpordi otse bakteri tsütoplasmast peremeesraku tsütoplasmasse. Kromosoomi piirkondi, kus paiknevad TTSS ja nende poolt sekreteeritavate valkude sünteesi määravad geenid on hakatud nimetama patogeensus-saarteks (PAI). Tüüp IV sekretsioonisüsteemi (T4SS) kasutavad patogeenid nii valkude (Heliobacter pylori Cag süsteem, mis paikneb PAI-s) kui ka DNA (Agrobacterium tumefaciens VirB/D4 süsteem T-DNA ülekanne; plasmiidse DNA ülekanne konjugatsioonil) trasnpordiks. A. tumefaciens´I T4SS koosneb 11 VirB ja lisaks VirD4 valgust. T4SS sekretsiooni süsteemi funktsioneerimiseks on vajalik ka spetsiifilise ATPaasi olemasolu, mille sünteesi määrab virB11 geen. VirB11 tüüpi ATPaasid on vajalikud nii DNA ülekandel kui ka toksiinide sekretsioonil. Lisaks on osadel patogeenidel kirjeldatud ka autotransportereid, need on valgud, mis kasutavad ainult Sec süsteemi transpordiks periplasmasse, edasi vahendavad nad juba ise enda transporti rakust välja (Shigella flexneri SepA valk).