MIKROBIOLOGISEEN LAADUNHALLINTAAN LIITTYVIEN

ANALYYSIMENETELMIEN KEHITTÄMINEN MEIJERITUOTTEIDEN

VALMISTUKSESSA

Keränen, Maria

Pro gradu -tutkielma

Ravitsemustiede

Lääketieteen laitos

Terveystieteiden tiedekunta

Itä-Suomen yliopisto

Toukokuu 2018

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta

Kansanterveystieteen ja kliinisen ravitsemustieteen yksikkö

Ravitsemustiede

KERÄNEN, MARIA L: Mikrobiologiseen laadunhallintaan liittyvien analyysimenetelmien

kehittäminen meijerituotteiden valmistuksessa

Pro gradu –tutkielma, 55 s.

Ohjaajat: THM Vuokko Niemitalo ja FT Jenni Korhonen

Toukokuu 2018

Asiasanat: meijerituotteet, mikrobiologia, laadunhallinta, validointi, enterobakteerit, koliformiset

bakteerit

MIKROBIOLOGISEEN LAADUNHALLINTAAN LIITTYVIEN ANALYYSI-

MENETELMIEN KEHITTÄMINEN MEIJERITUOTTEIDEN VALMISTUKSESSA

Tausta. Elintarvikelainsäädännön tarkoitus on varmistaa elintarvikkeiden turvallisuus ja laatu,

ja suojella kuluttajaa terveysvaaroilta. Elintarvikkeiden mikrobiologista laadunhallintaa

säädellään Suomen ja EU:n lainsäädännöllä. Teollisuuden toimijoiden omavalvonnalla on

laadunhallinnan toteuttamisessa keskeinen merkitys.

Maito on hyvä kasvualusta mikrobeille. Meijerissä maito lämpökäsitellään mikrobien

tuhoamiseksi, mutta jälkikontaminaatiot ovat mahdollisia. Niitä kontrolloidaan hyvällä

tuotantohygienialla ja varmistetaan mikrobiologisilla analyyseilla tuotannon eri vaiheissa.

Enterobakteerit ja koliformiset bakteerit ovat tärkeitä kontaminaation indikaattoreita.

Mikrobiologisissa analyyseissä käytettävät standardoidut menetelmät eivät sovi sellaisenaan

kaikkiin analyyseihin. Jokaisen laboratorion tulee validoida ne käyttöönsä sopiviksi.

Validoinnilla varmistetaan, että menetelmä antaa oikeita ja riittävän hyviä tuloksia siinä

ympäristössä, missä sitä käytetään.

Tavoite. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kohdemeijerin mikrobiologista laadunhallintaa

ja validoida meijerin enterobakteereille ja koliformisille bakteereille käyttämät

analyysimenetelmät.

Aineisto ja menetelmät. Aineisto kerättiin meijerin laboratorion päivittäistä työskentelyä

seuraten. Validointi toteutettiin standardimenetelmillä ISO4832:2006(E) ja ISO21528-

2:2004(E) ja työhön valittiin viisi erityyppistä meijerin tuotetta tai prosessin välituotetta.

Tulokset. Validoinnissa menetelmien oikeellisuudelle saatiin virherajoiksi ±24 % (koliformiset

bakteerit) ja ±19 % (enterobakteerit). Uusittavuuden keskihajonta oli 0,09–0,17 logaritmista

yksikköä. Tulokset olivat standardin hyväksymissä rajoissa. Toistettavuuden suhteelliseksi

keskihajonnaksi saatiin 8–12 %. Spesifisyys menetelmissä oli hyvä, kun tulkinta tehdään

oikein. Maitonäytteellä lineaarisuus toteutui hyvin, mutta raejuuston kastikkeella se oli heikkoa.

Johtopäätökset. Elintarvikkeen mikrobiologisen laadun analysoinnissa näytemateriaalin

ominaisuuksien tunteminen on tärkeää. Meijeriteollisuuden omavalvontajärjestelmissä on

oltava riittävän hyvät mikrobiologisen laadun hallintamenetelmät, jotta kuluttajille ei aiheudu

vaaraa meijerituotteiden käytöstä. Analyysimenetelmien tulkinta voi olla meijerikohtaista ja

hyväksyttävät virherajat voidaan määrittää säädösten puitteissa meijerikohtaisesti, sillä tulosten

tulkintaan vaikuttavat toimintaympäristö ja tutkittavat materiaalit. Kohdemeijerin tuotteille

käytetyt enterobakteerien ja koliformisten bakteerien määritysmenetelmät sopivat tämän

tutkimuksen mukaan hyvin, joskin lineaarisuus oli toisella matriisilla heikkoa. Koliformisten

bakteerien tulkinta ei ollut menetelmän mukaista, mikä tulisi perustella tai korjata vastaamaan

menetelmää. Lineaarisuutta voidaan tarvittaessa tutkia uudelleen eri näytematriiseilla.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences

School of Public Health and Clinical Nutrition

Nutrition

Keränen, Maria L: The developing of microbiological quality control analysis in dairy industry

Master’s thesis, 55 p.

Supervisors: MSc Vuokko Niemitalo and PhD Jenni Korhonen

May 2018

Keywords: dairy products, microbiology, quality control, validation, enterobacteria, coliforms

THE DEVELOPING OF MICROBIOLOCIGAL QUALITY CONTROL ANALYSIS IN

DAIRY INDUSTRY

Background. The purpose of food legislation is to ensure food safety and quality and protect

the consumer from health hazards. Microbiological quality control is monitored by Finnish law

and EU regulations. In-house control of the food business operator is essential for carrying out

quality control.

Milk is a good medium for microbes. In plants, milk is pasteurized to destroy all

microorganisms but post-pasteurization contaminations may occur. Post-pasteurization is

controlled by good hygiene procedures and ensured by microbiological analyses in different

stages of production. Enterobacteria and coliforms are important indicators of contamination.

Standardized methods are used for microbiological analyses. These methods cannot be applied

to all kinds of analyses as such. Every laboratory has to validate them to their own purposes.

The validation ensures that that method gives right and precise results enough to operation

environment.

Objective. The aim of this study was to assess microbiological quality control in a certain dairy

plant and validate methods of analysis for enterobacteria and coliforms used in plant.

Materials and methods. Daily routines in laboratory were observed in one dairy factory. The

validation process was carried out according to standard methods ISO 4832:2006(E) and ISO

21528-2:2004(E) with five different kinds of dairy products or intermediate products.

Results. The trueness analysis showed deviation of coliforms and enterobacteria were ±24 %

and ±19 %, respectively. The standard deviation of reproducibility was 0,09–0,17 log units. The

results were within the acceptable limits. The relative standard deviation of repeatability was

8–12 %. The specificity of the methods was good when the results were read correctly. The

linearity of the method was good for milk samples, but for dressing in cottage cheese it was

weak.

Conclusions. When analyzing microbiological quality of foodstuffs, it is important to know

specifications of sample materials. The dairy industry has to have methods good enough for

microbiological quality control in their in-house control systems. Thus consumers will not be

in any danger when using dairy products. One dairy plant can interpret methods of analyses in

a different way than the other and acceptable limits of deviations or errors can be determined

differently in different factories. Every laboratory has its own operation environment and its

own specimens and they have influence in the reading of the results. In any case, all regulations

by law have to be followed when limits are determined. Methods of analyses used in this study

were suitable to products of the dairy plant, although the linearity of one material was weak.

Coliform analysis results were not read correctly in the factory and this must be justified or

changed. For the linearity analysis, another study can be made with different product, if needed.

SISÄLTÖ

1 JOHDANTO ....................................................................................................................... 7

2 MIKROBIOLOGISET LAATUVAATIMUKSET MEIJERITEOLLISUUDESSA ......... 8

2.1 Yleinen elintarvikelainsäädäntö ................................................................................... 8

2.3 Euroopan komission mikrobikriteeriasetus ................................................................. 9

2.4 Maitotuotteiden mikrobiologiset vaatimukset ........................................................... 11

2.5 Omavalvonta .............................................................................................................. 12

3 MAITO JA SEN LAATUTEKIJÄT................................................................................. 14

3.1 Maidon koostumus ..................................................................................................... 14

3.2 Maidon ja maitovalmisteiden ravitsemuksellinen koostumus ................................... 14

3.3 Maitotuotteet mikrobien kasvuympäristönä .............................................................. 15

3.3.1 Raakamaito ......................................................................................................... 15

3.3.2 Lämpökäsitelty maito ......................................................................................... 15

3.4 Maitotuotteiden hyötymikrobit .................................................................................. 17

3.5 Lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä haitallisia mikrobeja ......................... 17

3.5.1 Enterobakteerit.................................................................................................... 18

3.5.2 Koliformiset bakteerit ......................................................................................... 18

3.5.3 Muita lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä mikrobiryhmiä ................. 19

3.5.4 Muita maitotuotteissa esiintyviä patogeeneja ..................................................... 20

4 MAIDON PROSESSOINTI JA MAITOTUOTTEIDEN VALMISTUS MEIJERISSÄ . 21

4.1 Maidon prosessointi ................................................................................................... 21

4.2 Juuston prosessointi ................................................................................................... 23

4.3 Voin prosessointi ....................................................................................................... 25

4.4 Mikrobiologisten näytteiden ottaminen meijerin prosessista .................................... 26

5 MIKROBIOLOGISET MENETELMÄT JA NIIDEN EPÄVARMUUS ........................ 27

5.1 Mikrobiologiset analyysimenetelmät ......................................................................... 27

5.2 Mikrobiologinen analyysi perinteisellä pesäkelaskentamenetelmällä ....................... 27

5.2.1 Elatusaineet ......................................................................................................... 27

5.2.2 Viljely ja kasvatus .............................................................................................. 28

5.2.3 Tulosten tulkinta ja varmistus............................................................................. 29

5.3 Muita mikrobiologisia analyysimenetelmiä ............................................................... 30

5.4 Mikrobiologisten menetelmien epävarmuus .............................................................. 31

5.4.1 Inkubointiolosuhteet ........................................................................................... 32

5.4.2 Alhainen pesäkemäärä maljoilla ......................................................................... 33

5.4.3 Rinnakkaisten maljojen käyttö ........................................................................... 33

6 MIKROBIOLOGISTEN MENETELMIEN VALIDOINTI ............................................ 35

6.1 Validoinnin tarkoitus ................................................................................................. 35

6.2 Validointiin liittyviä suureita ..................................................................................... 35

7 TUTKIELMAN TAVOITE .............................................................................................. 37

8 VALIDOINTIPROSESSI ................................................................................................. 38

8.1 Validoitavat menetelmät ............................................................................................ 38

8.2 Käytettävä maljavalumenetelmä ................................................................................ 38

8.3 Validoinnissa käytettävät elatusaineet, kasvatusalustat ja reagenssit ........................ 39

8.4 Valitut näytematriisit ................................................................................................. 39

8.5 Validointiprosessi ...................................................................................................... 40

8.5.1 Bakteerisuspension valmistus ............................................................................. 40

8.5.2 Siirrostettavan bakteerisuspension pitoisuuden määritys ................................... 41

8.5.3 Näytematriisien esikäsittely ................................................................................ 42

8.5.4 Bakteerisuspension siirrostus näytteisiin ............................................................ 42

8.5.5 Viljely ja kasvatus .............................................................................................. 43

8.5.6 Tulosten tulkinta ................................................................................................. 43

9 TULOKSET ..................................................................................................................... 44

9.1 Pesäkeluvut työn eri osissa ........................................................................................ 44

9.1.1 Oikeellisuus ........................................................................................................ 45

9.1.2 Täsmällisyys ....................................................................................................... 46

9.1.3 Spesifisyys .......................................................................................................... 47

9.1.4 Lineaarisuus ........................................................................................................ 49

10 POHDINTA ...................................................................................................................... 50

10.1 Oikeellisuus ............................................................................................................ 50

10.2 Täsmällisyys ........................................................................................................... 50

10.3 Spesifisyys .............................................................................................................. 51

10.4 Lineaarisuus ........................................................................................................... 52

10.5 Validoinnin onnistuminen ...................................................................................... 52

LÄHTEET ................................................................................................................................ 53

7

1 JOHDANTO

Elintarvikelainsäädännön tarkoituksena on varmistaa elintarvikkeiden turvallisuus ja hyvä

terveydellinen laatu, sekä suojella kuluttajaa terveysvaaroilta. Mikrobiologista laadunhallintaa

elintarvikelaitoksissa säädellään suomalaisella ja Euroopan unionin lainsäädännöllä. Euroopan

unionin asetukset ovat kansallisen lainsäädännön yläpuolella, mikäli ne ovat ristiriidassa

keskenään. Teollisuuden toimijoiden omavalvonnalla on laadunhallinnan toteuttamisessa

keskeinen merkitys. Laki velvoittaa toimijoita laatimaan näytteenottosuunnitelman ja

perustamaan toimintansa HACCP-periaatteisiin mukaiseen menettelyyn. Sillä tarkoitetaan

tuotannon kriittisten pisteiden löytämistä ja hallintaa.

Maito sisältää monipuolisesti ravinteita, joten se on hyvä kasvualusta mikrobeille. Raakamaito

sisältää useita ympäristökontaminaationa tulleita mikrobeja, mutta suurin osa niistä tuhoutuu

kun maito pastöroidaan meijerissä. Pastöroinnin jälkeinen kontaminaatio on merkittävä

mikrobeihin liittyvä riski, joka meijerin pitää hallita. Jälkikontaminaatiota kontrolloidaan

hyvällä tuotantohygienialla ja varmistetaan mikrobiologisilla analyyseilla tuotannon eri

vaiheissa. Enterobakteerit ja koliformiset bakteerit ovat tärkeitä jälkikontaminaation

indikaattoreita.

Mikrobiologisissa analyyseissä käytetään standardoituja menetelmiä. Vaikka valmiiksi

standardoituja menetelmiä on elintarvikkeille ja maitotuotteillekin olemassa, eivät menetelmät

sovellu suoraan mihin tahansa analyyseihin. Jokaisen laboratorion tulisi validoida menetelmät

omaan käyttöönsä sopivaksi. Validoinnilla varmistetaan, että menetelmä antaa oikeita, riittävän

tarkkoja ja spesifisiä tuloksia juuri siinä ympäristössä, jossa sitä käytetään.

Mikrobiologisten menetelmien haasteena on niiden epävarmuus, jota analyyseissa aiheuttavat

useat tekijät. Mikrobeja voidaan tutkia useilla menetelmillä, joista tunnetuin ja yleisin on

maljaviljely ja kvantitatiivisissa analyyseissa siihen liittyvä pesäkelaskenta.

Tämän tutkielman tavoitteena on validoida meijerin enterobakteereille ja koliformisille

bakteereille käyttämät analyysimenetelmät. Näitä menetelmiä ei oltu aiemmin meijerin

käyttöön validoitu. Lisäksi tavoitteena oli arvioida meijerin mikrobiologisen laadunhallinnan

tasoa ja lakisääteisten vaatimusten toteutumista meijerissä. Validointi auttaa kohdemeijeriä

kehittämään toimintaansa, erityisesti mikrobiologisia analyysimenetelmiä, joita myös pro gradu

-tutkielman yhteydessä kohdemeijerissä kehitettiin.

8

2 MIKROBIOLOGISET LAATUVAATIMUKSET

MEIJERITEOLLISUUDESSA

2.1 Yleinen elintarvikelainsäädäntö

Kuten kaikkia elintarvikehuoneistoja, myös meijerien toimintaa säätelee sekä kansallinen että

Euroopan unionin lainsäädäntö. Yleistä suomalaista elintarvikelakia (23/2006) tarkentavat

valtioneuvoston, maa- ja metsätalousministeriön sekä sosiaali- ja terveysministeriön asetukset

(Taulukko 1). Euroopan unionin elintarvikehygieniaan liittyvät asetukset ovat kansallisen

elintarvikelainsäädännön yläpuolella, sillä Euroopan unionin lainsäädännössä asetukset sitovat

aina jäsenmaita sellaisenaan (Eurooppatiedotus 2015). Mikrobiologiseen laatuun liittyvistä

vaatimuksista säädetään erityisesti Euroopan komission (EY) asetuksessa elintarvikkeiden

mikrobiologisista laatuvaatimuksista 2073/2005.

Taulukko 1. Elintarvikehygieniaan liittyvät tärkeimmät kansallisen lainsäädännön ja Euroopan unionin

lait ja asetukset.

Suomalainen lainsäädäntö Euroopan unionin asetukset

Elintarvikelaki 23/2006 Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus

elintarvikelainsäädäntöä koskevista yleisistä

periaatteista ja vaatimuksista (EY) N:o 178/2002

STMa 461/2000 Talousveden laatuvaatimukset

ja valvontatutkimukset

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus

elintarvikehygieniasta N:o 852/2004

MMMa ilmoitettujen elintarvikehuoneistojen

elintarvikehygieniasta 1367/2011

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus

eläinperäisiä elintarvikkeita koskevista erityisistä

hygieniasäännöistä (EY) N:o 853/2004

MMMa laitosten elintarvikehygieniasta

795/2014

Komission asetus (EY) N:o 2073/2005

elintarvikkeiden mikrobiologisista vaatimuksista,

muutoksineen ((EY) N:o 1441/2007, (EY) N:o

365/2010)

MMMa 9/EEO/2003 hygienialain mukaisten

näytteiden ottamisesta

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus rehu- ja

elintarvikelainsäädännön sekä eläinten terveyttä ja

hyvinvointia koskevien sääntöjen mukaisuuden

varmistamiseksi suoritetusta virallisesta

valvonnasta (EY) N:o 882/2004

9

2.3 Euroopan komission mikrobikriteeriasetus

Elintarvikealan toimijoiden on noudatettava niitä mikrobiologisia vaatimuksia, joita on säädetty

Euroopan komission (EY) asetuksessa N:o 2073/2005. Tämä mikrobikriteeriasetus määrittelee

elintarvikeluokittain ne mikrobipitoisuuksien raja-arvot, joiden perusteella tuotetta tai

tuotantoprosessia voidaan pitää mikrobiologiselta laadultaan hyväksyttävänä. (Komission

asetus (EY) N:o 2073/2005.) Jokainen elintarvikealan toimija määrittelee itse, kuuluvatko

toimijan tuottamat elintarvikkeet mikrobikriteeriasetuksen piiriin (Eviran ohje 10501/2).

Mikrobikriteeriasetus jaottelee mikrobiologiset vaatimukset tuotteen turvallisuutta koskeviin

ja prosessihygieniaa koskeviin vaatimuksiin. Elintarvikkeen turvallisuutta koskeva

vaatimus tarkoittaa ”vaatimusta, jolla määritetään tuotteen tai elintarvike-erän hyväksyttävyys

ja jota sovelletaan markkinoille saatettuihin tuotteisiin” (Komission asetus (EY) N:o

2073/2005). Elintarvikkeen turvallisuutta koskevan vaatimuksen tarkoituksena on estää

elintarvikkeen välityksellä tapahtuva ruokamyrkytysmikrobien tai niiden tuottamien toksiinien

leviäminen. Turvallisuusvaatimuksena esitettyä mikrobiraja-arvoa ei siis saa ylittää. Raja-arvon

ylittyessä tai sitä epäiltäessä on elintarvikealan toimijan huolehdittava kontaminoituneen

elintarvikkeen poistamisesta markkinoilta. Samoin hänen on tiedotettava valvontaviranomaisia

ja kuluttajia markkinoilta poistamisen syystä. (Eviran ohje 10501/2.)

Prosessin hygieniaa koskeva vaatimus tarkoittaa ”vaatimusta, joka osoittaa tuotantoprosessin

hyväksyttävän toimivuuden. -- Siinä asetetaan viitteellinen kontaminaatioarvo, jonka ylittyessä

vaaditaan korjaavia toimia, jotta prosessin hygieniataso säilyy elintarvikelainsäädännön

mukaisena” (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Prosessihygieniavaatimuksien osalta

raja-arvojen ylitykset johtavat korjaaviin toimiin ja mahdollisesti omavalvontasuunnitelman

tarkistamiseen. Mainittua indikaattorimikrobia tai toimenpiteitä aiheuttavaa raja-arvoa voidaan

muuttaa, mikäli asetuksen vaatimusta vastaava elintarviketurvallisuustaso pystytään takaamaan

(Eviran ohje 10501/2).

Mikrobikriteeriasetuksen liitteessä on esitetty sekä turvallisuusvaatimusten että

prosessihygieniavaatimusten todentamista varten näytteenottosuunnitelma (Eviran ohje

10501/2). Suunnitelmassa jokaiselle vaatimukselle on asetettu standardoitu vertailumenetelmä,

jolla saatua tulosta pidetään oikeana. Vaatimuksen kohdalla on annettu hyväksyttävät

mikrobipitoisuuksien raja-arvot, jotka perustuvat vertailumenetelmään. Elintarvikealan toimija

voi käyttää vertailumenetelmästä poikkeavia analyysimenetelmiä omassa näytteenotossaan,

mikäli menetelmät on hyväksytty asetuksessa kuvatulla tavalla. (Eviran ohje 10501/2.)

10

Taulukko 2. Esimerkki mikrobikriteeriasetuksen mukaisesta kriteeristä ja siihen liittyvästä

näytteenottosuunnitelmasta (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005 ).

Elintarvike-

luokka

Mikro-

organismit

Näytteenotto-

suunnitelma Analyyttinen

vertailu-

menetelmä

Vaatimuksen

soveltamis-

vaihe

Toiminta

saataessa

epätyydyttäviä

tuloksia n c m M

Lämpö-

käsitellystä

maidosta ja

herasta

valmistetut

juustot

E. coli 5 2 100

pmy

/g

1000

pmy/g

ISO 16649-1

tai -2

Valmistus-

prosessin

aikana, kun

E. coli -

bakteerien

oletetaan

olevan

suurimmillaan

Tuotannon

hygieniatason ja

raaka-aineiden

valinnan

parantaminen

Esimerkiksi juustoihin liittyvässä prosessihygieniavaatimuksessa (ks. Taulukko 2)

määritellään, että lämpökäsitellystä maidosta ja herasta valmistetuista juustoista on tutkittava

valmistusprosessin aikana Escherichia coli -bakteerin määrä. Näytteitä tulee ottaa viisi (n = 5),

ja E. colia saa olla näytteissä korkeintaan 100 pmy/g (raja-arvo m). Jos E. colia kuitenkin

esiintyy, saa niitä olla korkeintaan kahdessa osanäytteessä (c = 2), kunhan bakteeripitoisuus on

korkeintaan 1000 pmy/g (raja-arvo M).

Yksi näyte koostuu kaikista osanäytteistä (n), jotka tutkitaan erillisinä näytteinä (Eviran ohje

10501/2). Asetuksessa annettua osanäytteiden määrää tulisi pitää vähimmäisvaatimuksena

silloin, kun halutaan tutkia erityisesti tietyn elintarvike-erän tai prosessin hyväksyttävyyttä.

Osanäytteiden määrää tulee kuitenkin lisätä esimerkiksi tilanteessa, jossa epäillään saastumista.

Osanäytteiden määrää voidaan valvontaviranomaisen luvalla myös vähentää, jos voidaan

osoittaa, että elintarvikehuoneiston hallintajärjestelmä toimii. (Eviran ohje 10501/2.)

Elintarvikealan toimijan on lisäksi seurattava analyysituloksia pitkällä aikavälillä (Eviran ohje

10501/2). Jos tulokset pysyvät pitkään hyväksyttävällä tasolla, voidaan näytteenottoa tietyissä

tapauksissa myös harventaa. Mikäli pitkän aikavälin tulokset osoittavat epätyydyttävää

kehitystä, on korjaaviin toimenpiteisiin ryhdyttävä välittömästi, vaikka tulokset olisivatkin

vielä hyväksyttäviä.

Mikrobikriteeriasetuksessa ei anneta maitoalan laitoksille määräyksiä näytteenottotiheyksistä

(Eviran ohje 10501/2). Eviran ohje antaa niistä sen sijaan suosituksia, jotka on osin jaoteltu sen

mukaan, kuinka paljon raakamaitoa laitos vastaanottaa vuosittain. Mitä enemmän raakamaitoa

vastaanotetaan, sitä tiheämmin suositellaan näytteitä otettavan.

11

Näytteenottotiheydet vaihtelevat yhdestä viiteentoista kertaan vuodessa riippuen

maitotuotteesta, maitoalan laitoksen koosta ja tutkittavasta mikro-organismista (Eviran ohje

10501/2). Esimerkiksi E. coli tulee tutkia lämpökäsitellystä maidosta valmistetuista juustoista

(Taulukko 2) 4–8 kertaa vuodessa, kun maitoalan laitos vastaanottaa yli 2 000 000 litraa

raakamaitoa vuodessa.

2.4 Maitotuotteiden mikrobiologiset vaatimukset

Maitotuotteissa esiintyvät mikrobit, joille turvallisuusvaatimuksia on esitetty, ovat Listeria

monocytogenes, Salmonella, enterotoksigeeniset stafylokokit ja Cronobacter sakazakii (ennen

2007 Enterobacter sakazakii) (Komission asetus (EY) N:o 365/2010). Näissä

turvallisuusvaatimuksissa mainitut raja-arvot m ja M ovat samat. Yhdessäkään osanäytteessä

annettu raja-arvo M ei siis saa ylittyä. (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005.)

Listeriavaatimus koskee kaikkia sellaisenaan syötäviä elintarvikkeita (Komission asetus (EY)

N:o 2073/2005, Eviran ohje 10501/2). Erilliset näytteenottosuunnitelmat on annettu imeväisille

tarkoitetuille tuotteille (äidinmaidonkorvikkeet), elintarvikkeille, jotka toimivat kasvualustana

listerialle (lähes kaikki maitotuotteet) ja elintarvikkeille, jotka eivät voi toimia kasvualustana

listerialle (kovat juustot ja UHT-tuotteet).

Salmonellavaatimus koskee raakamaidosta tai pastörointia heikommin lämpökäsitellystä

maidosta valmistettua juustoa, voita tai kermaa, maito- ja herajauhetta sekä jäätelöä, jos sen

valmistusprosessi tai koostumus ei poista salmonellariskiä (Komission asetus (EY) N:o

2073/2005). Lisäksi salmonellavaatimus koskee alle kuuden kuukauden ikäisille tarkoitettuja

jauhemaisia äidinmaidonkorvikkeita ja vieroitusvalmisteita.

Enterotoksigeenisia stafylokokkeja ei mikrobikriteeriasetuksen turvallisuusvaatimuksen

mukaisesti saa esiintyä juustossa, maito- ja herajauheessa (Komission asetus (EY) N:o

2073/2005). Cronobacter sakazakii -vaatimus koskee alle kuuden kuukauden ikäisille

tarkoitettuja äidinmaidonkorvikkeita tai muita jauhemaisia ruokavaliovalmisteita.

Maitotuotteisiin liittyviä prosessihygieniavaatimuksia on säädetty enterobakteereille,

Escherichia colille, koagulaasipositiivisille stafylokokeille ja Bacillus cereukselle (Komission

asetus (EY) N:o 2073/2005).

12

Enterobakteerivaatimus on annettu pastöroidulle maidolle ja muille pastöroiduille nestemäisille

maitotuotteille, maito- ja herajauheelle, jäätelölle ja maitopohjaisille jäädytetyille jälkiruoille

sekä imeväisikäisten äidinmaidonkorvikejauheille ja jauhemaisille vieroitusvalmisteille

(Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Kuitenkaan vaatimus ei koske sellaisia pastöroituja

nestemäisiä maitotuotteita tai maito- ja herajauhetta, jotka jatkojalostetaan teollisuudessa.

Enterobakteerivaatimusta on muutettu vuonna 2010 komission asetuksella (EY) N:o 365/2010.

E. coli -vaatimus koskee lämpökäsitellystä maidosta ja herasta valmistettua juustoa (ks.

Taulukko 2), raakamaidosta tai pastörointia heikommin lämpökäsitellyistä maidoista

valmistettua voita ja kermaa (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Vaatimusta käytetään

valmistusprosessin hygieniatason osoittamiseen. Juuston kohdalla vaatimusta tulee soveltaa

siihen prosessin kohtaan, jolloin E. coli -pitoisuuden voi olettaa olevan suurimmillaan.

Koagulaasipositiivisten stafylokokkien vaatimus koskee kypsennettyjä juustoja, tuorejuustoja

sekä maito- ja herajauhetta (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005).

Bacillus cereus tutkitaan prosessihygieniavaatimusten mukaan jauhemaisista

äidinmaidonkorvikkeista ja imeväisikäisten muista jauhemaisista ruokavaliovalmisteista

(Komission asetus (EY) N:o 2073/2005).

Koliformisia bakteereja ei EU:n mikrobikriteeriasetuksen mukaan tarvitse maitotuotteista

tutkia, mutta Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkeviranomainen FDA (Food and Drug

Administration) suosittelee koliformisten bakteerien tutkimista pastöroiduista maidoista ja

maitotuotteista prosessin hygienian osoittamiseksi (FDA 2015). Raja-arvoina koliformisille

bakteereille FDA (2015) suosittelee 10 pmy/ml nestemäisille ja 10 pmy/g kiinteille näytteille.

Mikrobikriteeriasetuksessa raja-arvoiksi E. coli -bakteerille on annettu 100 pmy/g juustoille ja

pastörointia heikommin lämpökäsitellylle voille ja kermalle 10 pmy/g (Komission asetus (EY)

N:o 2073/2005).

2.5 Omavalvonta

Omavalvonta tai siihen viittaavat käsitteet esiintyvät kaikessa elintarvikelaitosten toimintaa

määrittelevässä lainsäädännössä. Elintarvikelain (23/2006) mukaan omavalvonnalla

tarkoitetaan ”elintarvikealan toimijan omaa järjestelmää, jolla toimija pyrkii varmistamaan, että

elintarvike, alkutuotantopaikka ja elintarvikehuoneisto sekä siellä harjoitettava toiminta

täyttävät niille elintarvikemääräyksissä asetetut vaatimukset”. Elintarvikealan toimijalla on

13

oltava kirjallinen omavalvontasuunnitelma, jota toimija noudattaa, päivittää ja pitää

toteutumisesta kirjaa (Elintarvikelaki 23/2006).

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen elintarvikehygieniasta (852/2004) mukaan

vastuu elintarvikkeiden turvallisuudesta on ensisijaisesti elintarvikealan toimijalla (EPNAs N:o

852/2004). Elintarvikealan toimijalta edellytetään elintarviketurvallisuuden takaamiseksi

HACCP-periaatteisiin (Hazard Analysis and Critical Control Points) pohjautuvaa pysyvää

menettelyä. Tällä tarkoitetaan tuotannon kriittisten valvontapisteiden löytämistä ja hallintaa.

Maa- ja metsätalousministeriön asetuksen mukaan omavalvonta on sellainen kokonaisuus,

jossa huomioidaan EU:n elintarvikehygienia-asetuksen (852/2004) ja yleisen

elintarvikeasetuksen (178/2002) toteutuminen, ja jonka osaksi HACCP-periaatteiden mukainen

ohjelma voidaan tarvittaessa liittää. (MMMa 1367/2011.)

Mikrobikriteeriasetuksen määrittelemiä mikrobiologisia vaatimuksia tulee Eviran ohjeen

(10501/2) mukaan käyttää todentamaan omavalvontajärjestelmän toimivuutta. Sitä varten

elintarvikealan toimijan omavalvontasuunnitelmassa tulee tarvittaessa olla mukana

näytteenotto- ja tutkimussuunnitelmat.

Omavalvonnassa voidaan tutkia muitakin kuin mikrobikriteeriasetuksen säätämiä mikrobeja,

kuten elintarvikkeiden mikrobiologista laatua kuvaavia indikaattoribakteereita (Eviran ohje

10501/2).

14

3 MAITO JA SEN LAATUTEKIJÄT

3.1 Maidon koostumus

Ihmiset käyttävät ravintonaan eläinten, pääasiassa lehmän maitoa. Tässä työssä maidosta

puhuttaessa tarkoitetaan vain lehmän maitoa.

Maito on nisäkkäiden maitorauhasten tuottama neste, jonka alkuperäinen tarkoitus on toimia

vastasyntyneen jälkeläisen ravintona ja tarjota poikaselle kaikki kasvuun tarvittavat

ravintoaineet (Fernandes 2009).

Maidosta suurin osa (87 %) on vettä (Fernandes 2009, Nsofor ja Frank 2013).

Käsittelemättömässä maidossa energiaravintoaineista rasvaa on 3,7–3,9 %, proteiinia 3,2–3,5

% ja hiilihydraatteja (lähinnä laktoosia) 4,8–4,9 %. Lisäksi maito sisältää kivennäisaineita ja

proteiineihin kuulumattomia typpiyhdisteitä. Lehmänmaidon koostumus vaihtelee esimerkiksi

vuodenajan, lehmien ruokinnan ja niiden yksilöllisten erojen mukaan.

3.2 Maidon ja maitovalmisteiden ravitsemuksellinen koostumus

Ravitsemuksellisesti maito ja maitovalmisteet ovat hyviä proteiinin, kalsiumin, jodin ja D-

vitamiinin lähteitä (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014). Maitoproteiinin biologinen

hyödynnettävyys on hyvä, sillä se sisältää kaikkia välttämättömiä aminohappoja (Weder ja

Belitz 2003). Maitovalmisteet ovat suomalaisen ruokavalion merkittävin kalsiumin lähde; noin

kaksi kolmasosaa suomalaisten saamasta kalsiumista tulee maitovalmisteista (Terveyden ja

hyvinvoinnin laitos 2013).

D-vitamiinin ruokalähteistä kolmen tärkeimmän joukossa ovat D-vitaminoidut maitovalmisteet

(Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013). Nuoremmilla aikuisilla (25–44 -vuotiaat)

maitovalmisteet kattavat 40 % D-vitamiinin saannista, kun vanhemmilla (55–74 -vuotiaat) noin

kolmasosa D-vitamiinista saadaan maidosta.

Maito mainitaan Finravinto 2012 -tutkimuksessa myös A-vitamiinin, riboflaviinin, niasiinin,

pyridoksiinin, B12-vitamiinin, folaatin sekä kaliumin ja fosforin lähteenä suomalaisessa

ruokavaliossa (Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013).

15

Maitovalmisteet kuuluvat rasvan tärkeimpiin lähteisiin suomalaisessa ruokavaliossa

(Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013). Maidon rasvasta kaksi kolmasosaa on tyydyttynyttä,

ja maitotuotteet suositellaan valitsemaan rasvattomina tai vähärasvaisina, sillä tyydyttyneen

rasvan runsas saanti lisää sairastuvuutta (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2013).

3.3 Maitotuotteet mikrobien kasvuympäristönä

Maidon korkea vesipitoisuus, lähellä neutraalia oleva pH-arvo ja monipuolinen

ravintoainekoostumus tarjoavat erilaisille mikrobeille hyvän kasvualustan (Nsofor ja Frank

2013). Maidon hyvä säilyvyys perustuu tehokkaaseen hygieniaan, lämpökäsittelyihin,

kylmäsäilytykseen ja riittävän nopeaan markkinoille saattamiseen.

3.3.1 Raakamaito

Käsittelemätön maito eli raakamaito on lehmän maitorauhasissa syntyessään steriiliä, mutta se

kontaminoituu mikrobeilla, joita on utareen sisä- ja ulkopuolella, lehmän iholla ja

lypsyvälineissä sekä millä tahansa ympäristön mikrobeilla, joita maitoon on mahdollista lypsyn

yhteydessä päästä (Fernandes 2009).

Maito jäähdytetään välittömästi lypsyn jälkeen, pidetään kylmässä lämpökäsittelyihin asti ja

myös sen jälkeen, kunnes se päätyy kulutukseen. (Nsofor ja Frank 2013.) Kylmäsäilytys

minimoi mikrobien kasvun, mutta mahdolliset psykrotrofiset organismit maidossa voivat

lisääntyä säilytyksen aikana (Fernandes 2009). Psykrotrofiset organismit ovat mikrobeja, jotka

kykenevät kasvamaan myös viileissä lämpötiloissa, esimerkiksi Pseudomonas-suvun bakteerit

ja Listeria monocytogenes (Bell ym. 2005).

EU:n alueella lypsyhygieniasta, maidon säilyttämisestä, kuljetuksesta ja käsittelystä annetaan

asetuksissa yksityiskohtaisia määräyksiä (EPNAs N:o 853/2004). Niissä esimerkiksi säädetään,

että maito on jäähdytettävä lypsyn jälkeen lämpötilaan 8 °C, jos maidonkeräys on päivittäistä,

ja lämpötilaan 6 °C, jos keräystä ei toimiteta päivittäin.

3.3.2 Lämpökäsitelty maito

Pastörointi on yleisesti hyväksytty maidon lämpökäsittelytapa (Fernandes 2009). Pastöroinnin

tarkoitus on taata maidon turvallisuus ja lisätä maidon säilyvyyttä. Pastöroinnin lämpötila ja

aika saattavat vaihdella maakohtaisesti (Fernandes 2009), mutta esimerkiksi Yhdysvaltain

16

elintarvike- ja lääkevirasto FDA on määritellyt ne pastörointiolosuhteet (Taulukko 3), jotka

ovat riittävät mikrobien tuhoutumiseksi ja jotka ovat Yhdysvalloissa vaatimuksena ns. A-

luokan maidolle (FDA 2015). Suomalaisissa meijereissä käytetään pastöroinnissa

pääsääntöisesti 15 sekunnin käsittelyä vähintään lämpötilassa 72 °C.

Taulukko 3. Vaihtoehtoisia pastörointiolosuhteita (FDA 2015).

Lämpötila (°C) Aika

63 30 min

72 15 s

89 1 s

90 0,5 s

94 0,1 s

96 0,05 s

100 0,01 s

Pastörointi tuhoaa kaikki maidosta peräisin olevat taudinaiheuttajamikrobit (FDA 2015), myös

lähes kaikki psykrotrofiset organismit (Fernandes 2009). Pastörointi ei kuitenkaan tuhoa

joidenkin mikrobien tuottamia toksiineja (FDA 2015) eikä itiöivien bakteerien itiöitä, jos niitä

on ennen pastörointia maitoon muodostunut (Jay ym. 2005). Termoduriset ja termofiiliset

mikrobit sen sijaan voivat selvitä pastöroinnista. Termoduriset mikrobit eivät välttämättä kasva

pastörointilämpötiloissa, mutta termofiilisten mikrobien kasvuun tarvitaan korkea lämpötila

(optimilämpötila 55–65 °C). (Jay ym. 2005.)

Pääosa pastöroitujen maitotuotteiden sisältämistä mikrobeista on peräisin pastöroinnin

jälkeisestä kontaminaatiosta (psykrotrofiset organismit) (Schmidt 2016, Fernandes 2009).

Lisäksi pastöroinnista selvinneet termoduriset psykrotrofiset organismit voivat pilata

maitotuotteen (Fernandes 2009).

Maidolle voidaan tehdä UHT (Ultra High Temperature) -käsittely tai sterilointi, jotka ovat

pastörointia tehokkaampia lämpökäsittelyjä ja tuhoavat lähes kaikki taudinaiheuttajamikrobit

ja itiöt, ainoastaan erittäin lämmönkestävien Bacillus-sukuun kuuluvien bakteerien itiöt

saattavat selvitä näistä käsittelyistä vahingoittumatta (Fernandes 2009). Eri lähteiden mukaan

17

sterilointi tarkoittaa 20–30 minuutin käsittelyä lämpötilassa 115–120 °C (Fernandes 2009,

Chandan 2016) ja UHT-käsittely 1–15 sekunnin käsittelyä lämpötilassa 135–150 °C. (Jay ym.

2005, Fernandes 2009, Chandan 2016.) Näihin käsittelyihin kuuluu yleensä aseptinen

pakkaaminen ja siten tuotteet säilyvät huoneenlämpötilassa pitkään (Fernandes 2009).

Muut maitotuotteet poikkeavat mikrobien kasvuympäristönä nestemäisistä maitotuotteista

esimerkiksi alhaisemman pH-arvon (hapatetut maitotuotteet), suuremman suolapitoisuuden

(suolattu voi), alhaisen vesiaktiivisuuden (maitojauhe) tai hyödyllisen mikrobisisällön

(hapatebakteerit jogurtissa tai juustossa, homeella kypsytetyt juustot) vuoksi. (Nsofor ja Frank

2013, Fernandes 2009, Chandan 2016.)

3.4 Maitotuotteiden hyötymikrobit

Maitoon liittyvistä mikrobeista kaikki eivät ole haitallisia. Maitohappobakteereita, jotka ovat

alun perin ympäristöperäisiä, käytetään fermentoitujen maitotuotteiden, kuten jogurtin ja

juuston valmistuksessa (Schmidt 2016). Maitohappobakteerit ovat määritelmän mukaan

bakteereita, jotka pystyvät fermentoimaan maitotuotteiden laktoosia maitohapoksi. Niitä

esiintyy useissa bakteerisuvuissa, ja osalla niistä on myös probioottisia ominaisuuksia. Myös

hiivoja ja homeita hyödynnetään maitotuotteiden valmistuksessa (kefiiri, viili, juustot).

(Schmidt 2016, Fernandes 2009.)

3.5 Lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä haitallisia mikrobeja

Eviran ohjeen (10501/2) mukaan mikrobikriteeriasetuksessa mainitut mikro-organismit

voidaan jakaa kolmeen ryhmään:

1. Patogeeniset mikro-organismit, enterotoksiinit ja aineenvaihduntatuotteet.

2. Patogeenisten bakteerien esiintymisen ja ulostesaastutuksen indikaattorina käytettävät

bakteerit.

3. Hygienian arvioinnin indikaattorina käytettävät bakteerit.

Tämän tutkielman kannalta merkityksellisimpiä ovat kohdissa 2 ja 3 mainitut

indikaattoribakteerit, joten niiden esittelyyn paneudutaan yksityiskohtaisemmin. Muut

tutkimuksen kohteena olleen meijerin käyttämät mikrobitutkimukset esitellään lyhyemmin.

18

3.5.1 Enterobakteerit

Enterobakteerit ovat Enterobacteriaceae-heimoon kuuluvia bakteereita, joita löytyy yleisesti

ympäristöstä, mutta joista monet ovat suolistoperäisiä (Bell ym. 2005). Heimoon kuuluvia

sukuja ovat muun muassa Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Proteus,

Salmonella, Serratia, Shigella ja Yersinia (Jay ym. 2005). Enterobakteerit ovat

gramnegatiivisia ja fakultatiivisesti anaerobisia sauvabakteereja. Ne eivät muodosta itiöitä,

fermentoivat glukoosia, ovat oksidaasinegatiivisia ja katalaasipositiivisia sekä resistenttejä

sappisuoloille. (Bell ym. 2005.)

Pastörointikäsittely tuhoaa enterobakteerit, joten niiden esiintyminen elintarvikkeessa

kuumennuksen jälkeen on merkki joko epäonnistuneesta lämpökäsittelystä tai sen jälkeen

tapahtuneesta kontaminaatiosta (Bell ym. 2005). Enterobakteereja pidetäänkin

elintarviketeollisuudessa niin sanottuna indikaattorina prosessin hygienian arvioinnissa (Eviran

ohje 10501/2). Enterobakteerien esiintyminen elintarvikkeessa voi olla merkki myös

patogeenisen salmonellan esiintymisestä (Cordier 2013), mutta toisaalta jo vuonna 2007

päivitetty komission asetus (EY) N:o 1441/2007 toteaa, että salmonellabakteerin ja

enterobakteerien esiintymisen välillä ei ole mahdollista havaita korrelaatiota (EY 1441/2007).

Mikrobikriteeriasetuksessa enterobakteerit edellytetään tutkittavaksi osasta maitotuotteista

prosessin hygienian osoittamiseksi, kuten aiemmin tässä tutkielmassa on esitetty (Komission

asetus (EY) N:o 2073/2005, katso kappale 2.4).

3.5.2 Koliformiset bakteerit

Useimmat koliformiset bakteerit ovat Enterobacteriaceae-heimon bakteereita, jotka

fermentoivat laktoosia (Bell ym. 2005, Jay ym. 2005, Schmidt 2016). Näihin kuuluvat ainakin

suvut Citrobacter, Enterobacter, Escherichia ja Klebsiella. Myös Aeromonadaceae-heimon

Aeromonas-bakteeri on joissakin lähteissä luokiteltu koliformiseksi (Martin ym. 2016).

Ulosteperäiset koliformit pystyvät kasvamaan hieman muita koliformeja korkeammissa

lämpötiloissa (43–45 °C) (Bell ym. 2005). Mikäli elintarvikkeesta pystytään eristämään

ulosteperäistä koliformia, se viittaa siihen, että elintarvike on ollut kosketuksissa suoraan tai

välillisesti eläimen tai ihmisen ulosteen kanssa. (Bell ym. 2005.) Nykyiset tutkimukset

kuitenkin osoittavat, että suurempi osa koliformeista on peräisin ympäristöstä eikä ulosteista

(Martin ym. 2016).

19

Koliformisista bakteereista Escherichia coli -bakteeria käytetään yleisimmin ulosteperäisen

saastumisen ja patogeenisten bakteereiden esiintymisen indikaattorina (Eviran ohje 10501/2).

Mikrobikriteeriasetuksessa edellytetään E. colin tutkimista tietyistä maitotuotteista prosessin

hygienian osoittamiseksi (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005, katso kappale 2.4).

Useat E. coli -bakteerin alatyypit ovat patogeenisia ja liittyvät elintarvikevälitteisiin

sairastumisiin (Schmidt 2016). Näistä enterohemorraaginen E. coli (EHEC) on patogeenina

erityisen merkityksellinen: sen infektiivinen annos on hyvin pieni (alle 100 solua) ja sen

aiheuttamat sairaudet vakavia, varsinkin korkean riskin yksilöille (Schmidt 2016, Fernandes

2009). Lisäksi EHEC on E. colin alatyypeistä useimmin liittynyt elintarvikevälitteisiin

epidemioihin, erityisesti serotyyppi O157:H7 (Meng ym. 2016, Schmidt 2016).

E. coli tuhoutuu pastöroinnissa eikä kasva hyvin jääkaappilämpötiloissa (Schmidt 2016). Siten

sen esiintyvyys ja lisääntyminen maitotuotteissa on seurausta epäonnistuneesta pastöroinnista

tai jälkikontaminaatiosta sekä väärästä säilytyslämpötilasta. EHEC-serotyypin O157

tarttuminen ihmisiin on liittynyt erityisesti pastöroimattoman maidon ja siitä valmistettujen

tuotteiden käyttöön, mutta myös tuotteisiin, joissa pastörointi on epäonnistunut tai joihin

bakteeri on tullut jälkikontaminaation seurauksena (Schmidt 2016).

EHEC elää yleisesti naudan suolistossa ja sitä on eristetty eri puolilta maailmaa naudan

ulosteesta. Esimerkiksi vuonna 2002 FDA:n Yhdysvalloissa tekemässä tutkimuksessa ilmeni,

että 38,5 % lypsykarjatiloista esiintyy EHEC-bakteeria ja 4,3 % lehmistä kantaa E. coli O157 -

serotyyppiä. (Meng ym. 2016.) Suomessa tämän verotoksigeenisen E. colin serotyyppiä O157

on vuonna 2003 eristetty ulosteesta 0,4 prosentilla naudoista ja ei-O157-serotyyppiä 30

prosentilla naudoista (EFSA 2016). Suomalaisissa teurastamoissa on vuodesta 2004 lähtien

tarkkailtu EHEC-serotyypin O157 esiintyvyyttä naudoissa. (EFSA 2016.)

3.5.3 Muita lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä mikrobiryhmiä

Yleisenä elintarvikehygieniaindikaattorina käytetään myös aerobisten mikro-organismien eli

mesofiilisten aerobisten bakteerien määrää (Eviran ohje 10501/2, Cordier 2013). Kun tutkitaan

aerobiset mikro-organismit, saadaan selville laajasti eri mikrobeja, jotka kasvavat tietyissä

olosuhteissa yleisellä kasvualustalla (Bell ym. 2005).

Tätä indikaattoria voidaan käyttää hyvän hygienian toteamisen lisäksi myös raakamaidon

kokonaislaadun selvittämiseen (Schmidt 2016). Kasvatusolosuhteista johtuen indikaattorilla ei

20

saada selville esimerkiksi psykrotrofisten organismien määrää, eikä esimerkiksi patogeenien

esiintymistä voi täysin sulkea pois aerobisten mikro-organismien tutkimisen avulla.

Aerobisten mikro-organismien määrää ei voi käyttää indikaattorina fermentoitujen

elintarvikkeiden kohdalla, koska niissä mikro-organismit ovat toivottuna osana

valmistusprosessia (Bell ym. 2005). Hapatemikrobeja sisältäville maitotuotteille voidaan

soveltaa menetelmää vieraiden mikrobien tutkimisesta (ISO 13559:2002(E), Meijerin ohje

vieraista mikrobeista 2014). Menetelmässä käytetään sellaista kasvualustaa, jolla

maitohappobakteerit eivät kasva.

Hiivat ja homeet voivat pilata hapatettuja maitotuotteita, sillä ne voivat kasvaa happamissa

olosuhteissa (Nsofor ja Frank 2013). Hiivat ja homeet ovat usein merkkinä

jälkikontaminaatiosta (Fernandes 2009, Schmidt 2016). Ne kasvavat hitaammin kuin bakteerit,

joten ne ovat erityisenä riskinä tuotteille, joilla on pitkä säilytysaika (Bell ym. 2005).

3.5.4 Muita maitotuotteissa esiintyviä patogeeneja

Maitotuotteissa esiintyviä muita patogeenisia bakteereja ovat Listeria monocytogenes,

Salmonella-lajit, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ja Cronobacter-lajit (Schmidt 2016).

Näistä L. monocytogenes, Salmonella-lajit, B. cereus ja S. aureus tuhoutuvat pastöroinnissa,

samoin osa Cronobacter-lajeista. Näitä mikrobeja voi esiintyä raakamaidossa, mutta myös

pastöroidussa maidossa puutteellisen lämpökäsittelyn tai jälkikontaminaation seurauksena.

Listeria monocytogenes on psykrotrofinen organismi eli se voi kasvaa jääkaappilämpötiloissa

(Schmidt 2016). Bakteerin aiheuttama listerioosi aiheuttaa vakavan vaaran riskiryhmille.

Salmonella-lajit eivät ole psykrotrofeja, mutta jotkut lajeista voivat kasvaa hitaasti

jääkaappilämpötiloissa (Fernandes 2009, Schmidt 2016). Salmonella-lajit kestävät

lämpökäsittelyjä paremmin, jos tuotteessa on alhainen vesiaktiivisuus (maitojauheet) tai korkea

rasvapitoisuus (Fernandes 2009).

Staphylococcus aureus ei ole psykrotrofinen organismi, mutta se tuottaa lämmönkestävää

enterotoksiinia (Schmidt 2016). Cronobacter-kantoja on löytynyt erityisesti

äidinmaidonkorvikejauheista ja kannat ovat aiheuttaneet vastasyntyneille erittäin vakavia

seurauksia, jopa kuolemia. Bacillus cereus -bakteeri on aerobinen psykrotrofi, joten se voi

kasvaa pastöroiduissa maitotuotteissa. Sen itiöt selviävät pastöroinnista.

21

4 MAIDON PROSESSOINTI JA MAITOTUOTTEIDEN VALMISTUS

MEIJERISSÄ

4.1 Maidon prosessointi

Tiloilta tuleva maito saapuu jäähdytettynä meijeriin ja siellä se siirretään säiliöihin (Kuva 1,

Chandan 2016). EU:n alueella maito täytyy jäähdyttää jalostuslaitokseen saapuessaan

välittömästi korkeintaan lämpötilaan 6 °C ja säilyttää tässä lämpötilassa jalostukseen asti, ellei

jalostusta aloiteta neljän tunnin kuluessa meijeriin saapumisesta, tai ellei korkeampi lämpötila

ole hyväksyttyä teknisistä syistä tiettyjen meijerituotteiden valmistuksessa (EPNAs N:o

853/2004).

Käsittelyn aluksi maito separoidaan: kerma ja rasvaton maito erotetaan toisistaan

sentrifugoimalla (Kuva 1, Chandan 2016). Vakioinnilla valmistetaan maitoa erilaisilla

rasvapitoisuuksilla sekoittamalla kermaa ja rasvatonta maitoa keskenään sopivassa suhteessa.

Sen jälkeen maitoon voidaan lisätä mahdolliset lisäaineet, kuten vitamiinitäydennykset.

(Chandan 2016.)

Vakioidulle maidolle tehdään pastörointi (tai muu lämpökäsittely) ja homogenointi (Chandan

2016). Homogenoinnissa rasva pilkotaan pienempään kokoon, jolloin kerma ei enää erotu

maidon pinnalle. Pastöroinnilla tuhotaan taudinaiheuttajat ja pilaajamikrobit. Tämän jälkeen

nestemäisiksi maitotuotteiksi päätyvä maito jäähdytetään, pakataan ja siirretään varastoon

odottamaan kuljetusta kuluttajien käyttöön. (Chandan 2016.)

22

Kuva 1. Maidon prosessointi meijerissä (mukaillen Chandan 2016).

23

4.2 Juuston prosessointi

Juuston valmistus perustuu maidon kaseiiniproteiinin koagulointiin juustomassaksi, jossa

maidon mahdollinen rasva on myös mukana (Fernandes 2009). Lämmitettyyn maitoon lisätään

koagulointia varten juoksute ja hapate. Koaguloitunut juustomassa leikataan ja massaa

keitetään. Hera erottuu prosessissa juustomassasta. (Kuva 2.)

Kuva 2. Esimerkki juustonvalmistusprosessista (mukaillen Fernandes 2009).

24

Juustoja voidaan luokitella niiden kosteuden, kypsytysmenetelmän ja kypsytysasteen mukaan

(Fernandes 2009). Heran erotuksen jälkeiset toimenpiteet vaihtelevat juustotyypin mukaan.

Esimerkiksi Cheddar-juuston valmistuksessa tarvitaan suolaus, puristaminen ja kypsyttäminen

(Kuva 2) ja raejuustoa ei kypsytetä ollenkaan, vaan juustomassaan lisätään kastike (Kuva 3).

Kuva 3. Esimerkki juustonvalmistusprosessista (mukaillen Chandan 2016).

25

4.3 Voin prosessointi

Voi kirnutaan maidosta erotetusta pastöroidusta kermasta (Kuva 4, Chandan 2016). Voita

voidaan valmistaa joko hapatetusta tai hapattamattomasta kermasta. Hapatebakteerit voidaan

lisätä kermaan myös vasta kirnuamisen yhteydessä. Kirnuamisessa muodostuvasta voimassasta

eroaa kirnumaito. Mahdollinen suolaus tehdään kirnumaidon erottumisen jälkeen, kun

voimassaa vielä työstetään. (Chandan 2016, Patel, Sharma ja Patel 2016.)

Kuva 4. Voin prosessikaavio (mukaillen Chandan 2016).

26

4.4 Mikrobiologisten näytteiden ottaminen meijerin prosessista

Edellä kuvatuissa prosesseissa elintarvikkeen tai prosessin mikrobiologista laatua tutkitaan

asetusten ja elintarviketoimijan omavalvontasuunnitelman mukaan.

EU:n asetuksen (EPNAs N:o 853/2004) mukaan tiloilta tulevan raakamaidon mikrobiologinen

laatu tulee olla sellainen, että siinä oleva pesäkemäärä lämpötilassa 30 °C ei ylitä 100 000

pesäkettä millilitrassa. Samoin asetuksen mukaan on varmistettava, että tuotteiden

valmistukseen käytettävän raakamaidon pesäkemäärä on ennen lämpökäsittelyä alle 300 000

pmy/ml ja lämpökäsittelyn jälkeen alle 100 000 pmy/ml. (EPNAs N:o 853/2004.)

Meijerin prosesseista tehdään kaikki komission asetuksen (EY) N:o 2073/2005 säätämät

mikrobitutkimukset. Asetuksessa mainitut turvallisuusvaatimukset koskevat markkinoille

saatettuja tuotteita eli valmiita tuotteita, ja prosessihygieniavaatimuksia maitoalan laitokselle

on annettu sekä valmiille tuotteille että puolivalmisteille (Eviran ohje 10501/2).

Jos prosesseissa käytetään talousvettä, määrää sosiaali- ja terveysministeriön asetus (STMa

461/2000) tutkimaan myös sen mikrobiologisen laadun.

Elintarviketurvallisuus varmistetaan yleensä ennaltaehkäisevästi hyviä hygieniakäytäntöjä

toteuttaen (Eviran ohje 10501/2). Asetusten säätämien tutkimusten lisäksi omavalvontaan voi

kuulua myös muita mikrobiologisia tutkimuksia. Nämä tutkimukset ja niihin liittyvät raja-arvot

määrittelee toimija itse.

27

5 MIKROBIOLOGISET MENETELMÄT JA NIIDEN EPÄVARMUUS

5.1 Mikrobiologiset analyysimenetelmät

Mikrobiologiassa voidaan tutkia näytteen mikrobeja kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti (Bell

ym. 2005). Kvalitatiivisissa tutkimuksissa selvitetään, sisältääkö näyte ja tietty näytemäärä

kyseistä tutkimuksen kohteena olevaa mikrobia vai ei. Tätä menetelmää käytetään yleensä

patogeenisten organismien toteamiseen. Kvantitatiivisissa menetelmissä selvitetään, kuinka

paljon mikrobia näyte sisältää tiettyä näytemäärää kohti. Mikrobimäärän laskemisessa voidaan

käyttää esimerkiksi pesäkelaskentaa tai MPN-menetelmää. Pesäkelaskennassa tulos ilmoitetaan

yksikössä pmy/ml tai pmy/g (pmy = pesäkettä muodostava yksikkö) ja MPN-menetelmässä

yksikössä ’most probably number’ eli todennäköisin määrä organismia. MPN-menetelmässä

tuloksen laskemiseen käytetään tilastollista menetelmää ja se on herkempi menetelmä varsinkin

vähäisten mikrobimäärien toteamiseen. (Bell ym. 2005.)

5.2 Mikrobiologinen analyysi perinteisellä pesäkelaskentamenetelmällä

Maljaviljely ja pesäkelaskenta ovat perinteinen menetelmä näytteen elävien mikrobien

pitoisuuden selvittämiseen (Jay ym. 2005). Menetelmä on käytössä tutkimuksen kohteena

olleessa meijerissä, joten sen tekemistä kuvaillaan tarkemmin. Esimerkkinä käytetään tässä

työssä validoitavia menetelmiä enterobakteerien (ISO 21528–2:2004(E)) ja koliformien

(ISO4832:2006(E)) tutkimisesta. Kaikki analyyseihin liittyvät tekijät koskevat aerobisten

mikro-organismien kasvatusta, anaerobeille menettelyohjeet ovat erityisesti

kasvatusolosuhteiden osalta erilaiset.

5.2.1 Elatusaineet

Elatusaineet sisältävät mikrobeille sopivia energiaravintoaineita, tärkeimpänä niistä typpeä

sisältävät yhdisteet (Bell ym. 2005). Energianlähteen lisäksi elatusaine sisältää

kivennäisaineita, vitamiineja ja sopivan pH-arvon säilyttämiseen tarvittavia puskureita.

Elatusaineet voivat olla kaikkien mikrobien kasvatukseen tarkoitettuja yleisiä elatusaineita tai

selektiivisiä elatusaineita. Selektiiviset elatusaineet sisältävät komponentteja, jotka suosivat

tietyn mikrobin kasvua tai ehkäisevät häiritsevän mikrobin kasvua ja helpottavat näin

kohdemikrobin havaitsemista.

28

Enterobakteerien määrityksessä selektiivinen elatusaine sisältää muun muassa glukoosia ja

sappisuoloja (ISO 21528–2:2004(E)). Koliformisten bakteerien kasvatuksessa selektiivinen

elatusaine sisältää muun muassa laktoosia (ISO4832:2006(E)).

Yleisessä elatusaineessa voidaan kasvattaa laajasti erilaisia mikrobeja (Bell ym. 2005).

Kasvatusolosuhteet kuitenkin määräävät, mitkä mikrobit voivat yhtä aikaa yleisessä

elatusaineessa kasvaa, sillä eri mikrobilajeilla on erilaiset kasvuvaatimukset. Yleisiä

elatusaineita käytetäänkin tiettyjen mikrobiryhmien kasvattamiseen, esimerkiksi aerobisten

mikrobien tai hiivojen ja homeiden kasvatukseen, ja kasvatusolosuhteet valitaan halutun

mikrobiryhmän mukaan.

Mikrobien kasvatuksessa käytetään sekä nestemäisiä että geelimuodossa olevia elatusaineita

(Bell ym. 2005). Nestemäisiä elatusaineita käytetään useimmiten kasvattamaan

mikrobipitoisuutta niin, että mikrobia voidaan siirrostaa muihin näytteisiin tai mikrobia itseään

voidaan tarkemmin tutkia. Kun elatusaineeseen lisätään agaria (levästä eristetty polysakkaridi),

saadaan kasvatusalustasta kiinteä. Tällaista kasvatusalustaa käytetään mikrobien

kvantitatiiviseen määritykseen.

5.2.2 Viljely ja kasvatus

Kvantitatiivisessa mikrobimäärityksessä käytetään tavallisesti maljaviljelyä (Bell ym. 2005).

Maljaviljelyssä petrimaljalle annostellaan agaria sisältävää elatusainetta. Kaadettaessa sulana

oleva agar jähmettyy pian huoneenlämmössä hyytelömäiseksi. Agar on mikrobien

kvantitatiivista määrittämistä varten hyvä kasvualusta, sillä se pysyy kiinteänä myös

lämpökaapissa mikrobikasvulle optimaalisessa lämpötilassa. Mikrobit eivät myöskään käytä

agaria ravinnokseen.

Maljaviljelymenetelmänä voidaan käyttää maljavalua tai pintaviljelyä (Bell ym. 2005).

Maljavalussa petrimaljalle siirrostetaan ensin näytettä tietty tilavuus ja sen jälkeen kaadetaan

sulaa agaria näytteen päälle. Ennen agarin jähmettymistä näyte sekoitetaan siihen

homogeeniseksi seokseksi. Joissakin analyyseissä voidaan valaa jähmettyneen agarin päälle

vielä ns. peittokerros, muutama millilitra agarliuosta tasaiseksi pinnaksi.

Pintaviljelyssä jähmetetään maljalle ensin agar ja sen jälkeen viljelysauvan avulla levitetään

agarin pinnalle pieni määrä näytettä (Bell ym. 2005).

29

Mikrobien kasvattaminen tapahtuu lämpökaapissa, jossa maljoja inkuboidaan kullekin

mikrobityypille sopivissa olosuhteissa ja riittävän kauan (Bell ym. 2005). Kasvatusolosuhteita

säätelemällä voidaan rajata mikrobikasvua niin, että vain haluttu mikrobi tai mikrobiryhmä

pystyy maljalla kasvamaan. Esimerkiksi psykrotrofiset mikrobit kasvavat matalassa

lämpötilassa (7 °C) hyvin, kun taas termofiiliset kannat suosivat korkeaa lämpötilaa (55 °C).

Enterobakteerit kasvavat parhaiten lämpötilassa 37 °C (ISO 21528–2:2004(E)).

5.2.3 Tulosten tulkinta ja varmistus

Maljaviljelyn tuloksena saadaan maljoja, joissa näytteen mahdollisesti sisältämät mikrobit ovat

kasvaneet näkyviksi toisistaan erottuviksi pesäkkeiksi (Bell ym. 2005). Näiden pesäkkeiden

määrän perusteella pystytään laskemaan alkuperäisen näytteen mikrobipitoisuus. Pesäkemäärä

ilmoitetaan yksikössä pmy/ml tai pmy/g (pmy = pesäkettä muodostava yksikkö). Pesäkkeet

voidaan yleensä luotettavasti tulkita silloin, kun niitä yhdellä maljalla on 1–100 kappaletta

(myös 30–300 tai 15–150), riippuen käytettävän menetelmän tarkkuudesta. Menetelmän ohjetta

pesäkelaskennasta tulee noudattaa. (Bell ym. 2005.)

Maljalta voidaan tehdä myös kvalitatiivisia havaintoja, esimerkiksi kaasunmuodostuksesta tai

epätyypillisistä pesäkkeistä (Bell ym. 2005). Pesäkkeiden varmistukseen käytetään erilaisia

testejä, jotka voivat perustua esimerkiksi kohdemikrobin morfologiaan, biokemiallisiin

testeihin tai kasvatukseen erilaisella kasvatusalustalla.

Kasvatusalustat ovat harvoin täysin selektiivisiä (Bell ym. 2005). Toisinaan tutkittava mikrobi

voi kasvaa menetelmälle epätyypillisenä pesäkkeenä, toisinaan maljalla kasvaa muita kuin

kohdemikrobeja joko samalla tai erilaisella tavalla kuin kohdemikrobi. Tämä voi aiheuttaa

vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia. Siksi saatua menetelmälle tyypillistä tulosta

yleensä pidetään ns. oletettuna positiivisena tuloksena ja saadut pesäkkeet pitäisi varmistaa.

Myös epätyypillisiä pesäkkeitä voidaan varmistaa.

Enterobakteerien tutkimisessa elintarvikkeista pelkästä maljaviljelystä saadaan tulokseksi

oletettu enterobakteeri, ja tyypilliset pesäkkeet varmistetaan oksidaasikokeella ja glukoosin

fermentointitestillä (ISO 21582–2:2004(E)). Koliformisten bakteerien tutkimiseen käytetty

menetelmä taas hyväksyy maljalta lasketut tyypilliset pesäkkeet koliformisiksi bakteereiksi, ja

vain epätyypilliset pesäkkeet tulisi varmistaa laktoosin hyödyntämiskokeella (ISO

4832:2006(E)).

30

5.3 Muita mikrobiologisia analyysimenetelmiä

Maljaviljelyn lisäksi mikrobien kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määritykseen voidaan

käyttää useita muita menetelmiä. Etenkin uudemmat genotyypitykseen perustuvat menetelmät

ovat entistä suositumpia (Jay ym. 2005). Mikrobeja tunnistetaan tai lasketaan myös niiden

metabolisen aktiivisuuden, immunologisten tai fysikaalisten ominaisuuksien perusteella. Nämä

menetelmät ovat usein nopeampia ja herkempiä kuin tavalliset viljelyyn perustuvat menetelmät.

Mikrobien kvantitatiivisen määrityksen voi tehdä esimerkiksi mikroskoopin avulla (Jay ym.

2005). Tähän sopii kalvosuodatusmenetelmä, jossa nestemäinen näyte suodatetaan tiheän

kalvon läpi, ja mikrobit jäävät kalvolle. Mikrobit voidaan kerätä kalvolta talteen, värjätä ja

käsitellä niin, että ne voidaan laskea mikroskoopilla. Vaihtoehtoisesti kalvo voidaan asettaa

sopivalle kasvatusalustalle, jolla mikrobeja kasvatetaan ja lasketaan pesäkkeitä muodostavat

yksiköt. Kalvosuodatusmenetelmä on nopea, ellei se sisällä kasvatusvaihetta. Mikroskoopilla

laskettaessa myös elinkyvyttömät mikrobit tulevat laskentaan mukaan. (Jay ym. 2005.)

Kemialliset menetelmät mikrobimäärityksissä perustuvat mikrobien metabolisen aktiivisuuden

mittaamiseen (Jay ym. 2005). Esimerkiksi patogeenin Staphylococcus aureus -kantojen

esiintymistä voidaan mitata sen tuottamaa lämpöstabiilia nukleaasia mittaamalla.

Gramnegatiiviset bakteerit voidaan tunnistaa niiden tuottamien endotoksiinien avulla

käyttämällä hyväksi endotoksiineille erityisen herkkää lysaattiproteiinia, joka geeliytyy

endotoksiinien läsnä ollessa. Tätä menetelmää on käytetty esimerkiksi maitotuotteiden

hygieenisen laadun mittaamiseen koliformisten bakteerien tutkimisen sijaan. (Jay ym. 2005.)

Kemiallisiin menetelmiin kuuluu myös solujen tarvitseman ATP-molekyylin mittaaminen (Jay

ym. 2005). ATP-molekyylin määrä on elävissä soluissa yleensä vakio, ja sen määrän

mittaaminen tuottaa kvantitatiivista tietoa näytteen mikrobeista (Jay ym. 2005). Radiometriassa

mikrobien kasvatusalustaan laitetaan radioaktiivista hiiltä sisältävää metaboliittia, jota mikrobit

hyödyntävät tuottaen mitattavaa radioaktiivista hiilidioksidia.

Immunologiset menetelmät mikrobimäärityksissä perustuvat mikrobien antigeenien

tunnistamiseen ja sopivien vasta-aineiden käyttöön (Jay ym. 2005). Menetelmiä voidaan

käyttää mikrobin tunnistamiseen ja kvantitatiivisiin määrityksiin.

Genotyypin tunnistamiseen perustuvissa menetelmissä tehdään usein ensin

polymeraasiketjureaktio (PCR) DNA:n monistamiseksi (Jay ym. 2005). Monistettuja DNA-

pätkiä voi sen jälkeen tutkia usealla eri tavalla, kuten erityyppisillä geelielektroforeeseilla.

PCR-menetelmillä on hyvä herkkyys ja spesifisyys, sekä hyvä kaupallinen sovellettavuus.

31

DNA-koettimet sisältävät tutkittavan organismin DNA-sekvenssiä, ja haluttu organismi

tunnistetaan sen perusteella, että koettimen DNA hybridisoituu halutun organismin DNA:n

kanssa (Jay ym. 2005). Tutkittavaa organismia voidaan muunnella siirtämällä sen perimään

spesifisen bakteriofaagin avulla uusia geenejä. Tätä menetelmää käytetään esimerkiksi

luminesenssin aikaansaamiseksi kohdemikrobiin.

Fingerprinting-menetelmien tarkoitus mikrobitutkimuksissa on karakterisoida ja erotella

mikrobilajeja ja -kantoja niiden DNA-profiilien perusteella (Jay ym. 2005).

Fysikaalisiksi luokiteltuja mikrobien analysointimenetelmiä ovat esimerkiksi biosensorit,

impedanssimittaus, mikrokalorimetria ja virtaussytometria (Jay ym. 2005). Biosensorit ovat

laitteita tai menetelmiä, jotka tunnistavat näytteen mikrobin tai sen aktiivisuuden ja muuntavat

havaintonsa mitattavaksi signaaliksi. Impedanssimittaus perustuu siihen, että mikrobien

metabolinen aktiivisuus tuottaa johtokykyisiä metaboliitteja ja kasvuliuoksen impedanssiarvo

samalla vähenee. (Jay ym. 2005.)

Virtaussytometriassa voidaan mitata yksittäisten solujen ominaisuuksia ja luokitella solut

yhden tai useamman ominaisuuden perusteella (Jay ym. 2005). Soluista voidaan tutkia

esimerkiksi fluoresenssia, absorbanssia ja valon hajontaa.

5.4 Mikrobiologisten menetelmien epävarmuus

Epävarmuus kuvaa mittaustulokseen liittyvää todennäköisintä hajontaa (Corry ym. 2007). Se

ei tarkoita samaa kuin mittausvirhe, joka kuvaa mitatun tuloksen ja todellisen arvon välistä eroa,

ja jota ei voida oikeastaan edes saada selville. Mikrobiologisissa analyyseissa epävarmuutta voi

aiheutua esimerkiksi näytteenotossa tai sen käsittelyssä tulleista virheistä, analyysien aikana

tulleista viivästyksistä, mikrobien elatusaineen koostumuksen ja valmistustavan vaihtelusta,

inkubaatio-olosuhteiden vaihtelusta ja näytteen mikrobiston kokonaisuudesta. Virhe voi olla

satunnainen, systemaattinen virhe analyysin tekemisessä tai analyysimenetelmän

soveltamisvirhe vaikkapa tietyn laboratorion sisällä. (Corry ym. 2007, Jarvis ym. 2007.)

Mikrobin esiintyminen tai mikrobipitoisuus näytteessä selvitetään yleensä kasvattamalla

mikrobia sopivalla kasvatusalustalla. Kohdemikrobia sisältävä näyte otetaan analyysiin mukaan

sellaisenaan tai sopivana laimennoksena, ja yksittäisessä viljelyssä mukana on vain pieni määrä

näytettä tai sen laimennosta. Kvantitatiivista määritystä varten näytettä yleensä laimennetaan

sellaiseen pitoisuuteen, että yksittäisten solujen muodostamat pesäkkeet on mahdollista laskea.

Tämä tarkoittaa sitä, että yksittäisessä analyysissä on mukana muutamia kymmeniä,

32

korkeintaan muutamia satoja soluja. Siksi rinnakkaisten näytteiden analyyseissä tulokset voivat

poiketa toisistaan paljonkin ilman, että voidaan puhua virheestä. (Elintarvikevirasto 1997.)

Tutkittavan näytemateriaalin kemiallinen koostumus ja sen sisältämät häiritsevät mikrobit

voivat aiheuttaa analyysituloksiin vaihtelevuutta. Sama analyysimenetelmä ei anna samanlaisia

tuloksia, kun mikrobia tutkitaan erilaisissa kasvuympäristöissä. (Elintarvikevirasto 1997.)

Mikrobiologit ovat yleensä arvioineet kvantitatiivisten määritysten virherajaksi ±0,5

logaritmista yksikköä eli noin ±3,16 pesäkettä muodostavaa yksikköä (Corry ym. 2007).

Mikrobiologisten analyysien tuloksilla tai määritetyillä raja-arvoilla ei kuitenkaan ole mitään

merkitystä sinänsä, ellei niitä liitetä johonkin tiettyyn käyttötarkoitukseen, esimerkiksi

lainsäädännön vaatimuksiin tai merkitykseen kansanterveydelle. Näitä tarkoituksia varten

tarvitaan myös tuloksen epävarmuuden arviointia. (Corry ym. 2007.)

Maljaviljelyyn liittyvistä epävarmuustekijöistä perehdytään tässä tarkemmin

inkubointiolosuhteisiin, rinnakkaisten maljojen käyttöön ja alhaisen pesäkemäärän

aiheuttamaan epävarmuuteen, ja joitakin tutkimustuloksia epävarmuudesta esitetään.

5.4.1 Inkubointiolosuhteet

Bell ym. (2005) mukaan lämpökaappiin saisi pinota maljoja enintään kuuden maljan pinoihin.

Samoin määrittelevät yleiset ohjeet mikrobiologisista analyyseistä (ISO 7218:2007(E)). Eräissä

tutkimuksissa on havaittu, että esimerkiksi 10 maljan pinoissa keskimmäisillä maljoilla kesti

13,5 tuntia saavuttaa tavoitelämpötila 37 °C, kun reunimmaisilla maljoilla meni 2,7 tuntia

(Corry ym. 2007). Lämpökaapissa ei ollut tuuletinta, mutta tutkimuksessa jossa sellainen oli,

E. coli -pitoisuudet olivat huomattavasti suuremmat maljapinon keskellä. Tutkimus osoitti

myös, että kun maljoja oli pinossa yli kuusi, 44 °C tavoitelämpötilan saavuttaminen siirtyi niin

paljon, että tässä tilanteessa maljoilla kasvoi bakteeri, jonka ei pitänyt kasvaa tarkoitetussa

lämpötilassa. (Corry ym. 2007.)

Inkubointiaika on standardimenetelmissä yleensä aika tarkkaan ilmaistu ja niissä on usein

virherajana ±2 tuntia (Corry ym. 2007). Tästä inkubointiajasta poikkeaminen aiheuttaa harvoin

häiriötä tuloksiin, mutta tietyissä tapauksissa se on mahdollista. Esimerkiksi kromogeenisillä

alustoilla tai VRB-alustalla (koliformisten bakteerien määrityksessä (ISO4832:2006(E))

tyypilliset pesäkkeet ilmaantuvat vasta menetelmässä ilmoitetun minimiajan jälkeen. Toisaalta

joissakin tapauksissa pesäkkeet haalenevat ajan myötä ja joskus epätoivotut organismit

kasvavat liian pitkän inkuboinnin seurauksena. (Corry ym. 2007).

33

5.4.2 Alhainen pesäkemäärä maljoilla

Tuloksen epävarmuudesta on vaikea antaa arviota myös siinä tapauksessa, kun saatu

pesäkemäärä on hyvin matala tai pesäkkeitä ei ole (Forster 2009). Joissakin analyyseissa tai

joillekin näytteille tämä voi olla normaali tilanne. Forster (2009) raportoi tutkimusta, jossa

selvitettiin pesäkelaskentamenetelmässä tulosten hajontaa erilaisilla pesäkemäärillä, ja totesi,

että alhaisilla pesäkemäärillä (alle 20 pesäkettä) hajonta on huomattavasti suurempaa kuin

suuremmilla pesäkemäärillä. Tutkimuksessa oli mukana viittä erilaista mikrobiryhmää ja

näytteitä tutkittiin yhteensä 92 kappaletta.

Standardimenetelmä enterobakteerien määrittämiseksi elintarvikkeista (ISO 21528–2:2004)

esimerkiksi sallii kaikkien pesäkkeiden laskemisen maljoilta, joilla niitä on alle 150 kappaletta,

mutta antaa lisäksi 95 % luottamusvälin pesäkemäärille 1–15. (ISO 21528–2:2004.)

Koliformien tutkimiseen tarkoitettu menetelmä taas sallii niiden maljojen laskemisen, joilla

pesäkkeitä on 10–150 (ISO 4832:2006(E)).

5.4.3 Rinnakkaisten maljojen käyttö

Kaikissa tämän tutkimuksen lähteinä olleissa standardimenetelmissä ohjeistetaan viljelemään

näytteistä kaksi rinnakkaista maljaa, tai jos käytetään samasta näytteestä kahta eri laimennosta,

riittää yksi malja laimennosta kohti. Bell ym. (2005) mukaan ihannetapauksissa rinnakkaisia

maljoja tulee käyttää, mutta rutiinityössä käytetään usein vain yhtä maljaa yhtä laimennosta

kohti. Tämä ohje on kuitenkin ilmaistu yhteydessä, jossa samasta näytteestä oletetaan tehtävän

useita eri laimennoksia. (Bell ym. 2005). Myös Corry ym. (2007) mukaan rinnakkaisiin

maljoihin perustuva laadunhallinta kuuluu laboratorion rutiinityöskentelyyn ja se on yksi keino,

jolla voidaan varmistaa laboratorion pätevyys ja pitää tulosten epävarmuutta hyväksyttävällä

tasolla. Standardissa ISO 7218:2007(E) suositellaan myös käyttämään rinnakkaisia maljoja.

34

Niemelä (2002) on arvioinut tilastollisesti pesäkelaskennan hajontaa, kun käytetään yhtä maljaa

näytettä kohti tai kun käytetään useampaa maljaa. Hajonnan arvio perustuu siihen, että

mikrobien oletetaan noudattavan Poissonin jakaumaa näytteessä. Keskihajontaa voidaan

arvioida käyttämällä kaavaa

𝑠 =1

√𝑐,

Kaava 1. Suhteellinen keskihajonta.

jossa c = maljalla tai maljoilla olevat pesäkkeet yhteensä. (Niemelä 2002.) Kun hajontaa

arvioidaan esimerkiksi tilanteessa, jossa yhdellä maljalla on pesäkkeitä 10 ja kahdella maljalla

samassa analyysissä yhteensä 25, hajonnat olisivat 0,32 ja 0,2, tässä järjestyksessä. Jos

pesäkemäärät ovat hyvin pieniä (alle kymmenen), hajonta on suurempaa.

35

6 MIKROBIOLOGISTEN MENETELMIEN VALIDOINTI

6.1 Validoinnin tarkoitus

Mikrobiologisen analyysimenetelmän validoinnilla pyritään osoittamaan, että menetelmä on

käyttökelpoinen juuri siihen tarkoitukseen, mihin sitä käytetään. Validoitu menetelmä antaa

luotettavia tuloksia tutkittavasta aiheesta. Laajasti käytössä olevat standardisoidut

mikrobiologiset menetelmät validoidaan yleensä laajoilla laboratorioiden välisillä

tutkimuksilla. Laboratoriokohtaisesti validointi tarkoittaa yleensä standardoidun tai muun

yleisesti käytössä olevan menetelmän käyttöönottoa ja validoinnilla osoitetaan, että laboratorio

hallitsee menetelmän. (Elintarvikevirasto 1997.)

6.2 Validointiin liittyviä suureita

Oikeellisuudella tarkoitetaan sitä, kuinka hyvin validoitava menetelmä antaa oikean tuloksen.

Tämän tutkimiseksi tarvitaan tietoa mikrobin todellisesta pitoisuudesta. Todellista

mikrobipitoisuutta on vaikea määrittää elävästä materiaalista, joten oikeellisuuden toteamiseksi

voidaan käyttää sertifioituja referenssi- eli vertailumateriaaleja, joille ilmoitettuja pitoisuuksia

pidetään oikeina. Tällaiset referenssimateriaalit ovat kalliita ja niitä ei aina ole saatavilla, joten

referenssinä voidaan käyttää joko sertifioimattomia referenssimateriaaleja tai näytteitä, joihin

on siirrostettu tutkittavaa mikrobia. (Elintarvikevirasto 1997.)

Menetelmän suhteellinen oikeellisuus tarkoittaa sitä, kuinka hyvin referenssimenetelmä ja

validoitava menetelmä vastaavat toisiaan tai kuinka lähekkäiset tulokset niillä saadaan, kun

tutkitaan samoja näytteitä. Validoitavalla menetelmällä saatu positiivinen tulos on

virhepositiivinen, jos referenssinäyte ei sisällä tutkittavaa mikrobia. Virhenegatiivisuudella

tarkoitetaan validoitavan menetelmän antamaa negatiivista tulosta silloin, kun referenssinäyte

sisältää tutkittavaa mikrobia. (Elintarvikevirasto 1997.)

Menetelmän täsmällisyyttä kuvaavat sen toistettavuus ja uusittavuus. Toistettavuudella

tarkoitetaan sitä, kuinka lähellä toisiaan lyhyellä aikavälillä tehtyjen peräkkäisten toistojen

antamat tulokset ovat, kun tutkitaan identtisiä näytteitä samalla menetelmällä, samoissa

olosuhteissa ja samojen henkilöiden toimesta. (Elintarvikevirasto 1997.)

36

Uusittavuudella tarkoitetaan eri henkilöiden tekemien analyysitulosten lähekkäisyyttä, kun

tutkitaan identtisiä näytteitä samoilla menetelmillä joko samassa tai eri laboratoriossa.

(Elintarvikevirasto 1997.)

Validoitavan menetelmän toteamisrajalla tarkoitetaan pienintä mahdollista

mikrobipitoisuutta, joka voidaan luotettavasti menetelmällä todeta. Toteamisrajaan vaikuttavat

menetelmän spesifisyys, selektiivisyys ja näytematriisi. (Elintarvikevirasto 1997.)

Määritysraja on kvantitatiivisen menetelmän validointiin liittyvä suure. Sillä tarkoitetaan

alhaisinta mikrobipitoisuutta, joka menetelmällä voidaan luotettavasti määrittää. Nestemäisillä

näytteillä määritysraja on yleensä alle 1 pmy/ml maljavalussa tai alle 10 pmy/ml

pintalevityksessä. Kiinteillä näytteillä vastaavat määritysrajat ovat yleensä alle 10 pmy/g tai

alle 100 pmy/g. Määritysrajaan vaikuttavat menetelmän spesifisyys, selektiivisyys ja

näytematriisi mikrobistoineen. (Elintarvikevirasto 1997.)

Standardin ISO 7218:2007(E) mukaan mikrobiologisille analyyseille tyypillinen luotettava

määritysraja on 4 pesäkettä määritystä kohti. Jos pesäkkeitä on vähemmän, tulosta voidaan pitää

vain osoituksena mikro-organismin esiintymisestä näytteessä. (ISO 7218:2007(E).)

Spesifisyys kuvaa menetelmän kykyä havaita tutkittava mikrobi tai mikrobit näytteessä olevista

häiritsevistä tekijöistä huolimatta (Elintarvikevirasto 1997). Häiritsevinä tekijöinä ovat yleensä

muut näytteen mikrobit, jotka voivat tulla analyysissä esille esimerkiksi epätyypillisinä

pesäkkeinä. Menetelmän spesifisyyttä voidaan tutkia lisäämällä näytematriisiin tunnettu määrä

sellaista häiritsevää mikrobia tai mikrobityyppiä, jota kyseisessä matriisissa on mahdollista

esiintyä. Tämän jälkeen viljelemällä näytettä selvitetään, vaikuttaako häiritsevä mikrobi

tuloksen tulkintaan. (Elintarvikevirasto 1997.)

Herkkyys eli sensitiivisyys kuvaa validoitavan menetelmän kykyä todeta vähäiset vaihtelut

tutkittavien mikrobien pitoisuuksissa. Tämä on tärkeä suure etenkin silloin, kun verrataan kahta

eri menetelmää toisiinsa. (Elintarvikevirasto 1997.)

Lineaarisuus on menetelmän kyky antaa sellaisia tuloksia, jotka ovat suoraan verrannollisia

näytteen mikrobipitoisuuteen. Todellisen mikrobipitoisuuden muuttuessa lineaarisen

menetelmän antama tulos muuttuu samassa suhteessa. (Elintarvikevirasto 1997.) Lineaarisuutta

tutkitaan viljelemällä näytteestä erilaisia laimennoksia, joista löytyy sopivalla laskenta-alueella

oleva mikrobipitoisuus.

37

7 TUTKIELMAN TAVOITE

Tämän tutkielman tavoitteena on selvittää, mitä vaatimuksia ja suosituksia meijeriteollisuuden

tulee ottaa huomioon mikrobiologisen laadun hallinnassa.

Tavoitteena on lisäksi selvittää, onko meijerin mikrobiologinen laadunvalvonta sellaisella

tasolla, että meijeri voi laadunvalvonnan menetelmillään osoittaa tuotteidensa olevan

mikrobiologiselta laadultaan hyväksyttäviä. Mahdolliset laatupoikkeamat tulisi saada

laadunvalvonnan menetelmillä selville riittävällä varmuudella.

Tutkielmassa raportoidaan lisäksi enterobakteerien ja koliformisten bakteerien

määritysmenetelmille tehty validointiprosessi.

38

8 VALIDOINTIPROSESSI

8.1 Validoitavat menetelmät

Tutkimuksessa validointiprosessiin valittiin laboratoriossa käytettävät standardoidut

menetelmät ISO 4832 (koliformisten bakteerien kvantitatiivinen määritys elintarvikkeista ja

rehuista) sekä ISO 21528-2 (enterobakteerien määritys elintarvikkeista ja rehuista). Menetelmiä

ei oltu laboratorion tarkoituksiin aiemmin validoitu.

8.2 Käytettävä maljavalumenetelmä

Sekä koliformisten että enterobakteerien määrittäminen tehdään maljavalumenetelmällä, jossa

petrimaljalle pipetoidaan ensin näytettä tai sen laimennosta (1 ml tai 0,1 ml), jonka jälkeen

kaadetaan nestemäistä agarliuosta näytteen päälle noin 15 ml sekoittaen. Kun agar on

jähmettynyt, päälle kaadetaan noin 4 ml peittokerros agaria. Peittokerroksen annetaan

jähmettyä ja malja siirretään ylösalaisin lämpökaappiin.

Koliformisten bakteerien määrittäminen tehdään käyttäen spesifistä VRB (Violet Red Bile) –

agaria, jolle koliformiset bakteerit muodostavat tyypillisiä vaaleanpunaisia pesäkkeitä.

Viljeltyjä maljoja inkuboidaan 24 tuntia ± 2 tuntia. Koska tutkittavat näytteet ovat

maitotuotteita, kasvatuslämpötila on 30 °C ± 1 °C. Menetelmän mukaisesti tyypillisiä

pesäkkeitä ei tarvitse varmistaa, mutta epätyypilliset pesäkkeet voidaan varmistaa tutkimalla

niiden laktoosin hajotuskykyä. Tätä ei validoinnissa kuitenkaan tehty.

Enterobakteerien määrityksessä käytetään glukoosia sisältävää VRBG-agaria (Violet Red Bile

Glucose), jolle enterobakteerit muodostavat tyypillisiä vaaleanpunaisia, punaisia tai violetteja

pesäkkeitä, kun maljoja inkuboidaan 24 tuntia ± 2 tuntia lämpötilassa 37 °C ± 1 °C. Pesäkkeiden

ympärille voi muodostua saostumavyöhyke. Pesäkkeet voidaan varmistaa biokemiallisilla

testeillä. Tässä validointityössä varmistusta varten yksittäisistä pesäkkeistä tehdään

puhdasviljelmä yleisalustalle ja vuorokauden inkuboinnin jälkeen pesäkkeille tehdään

oksidaasikoe, joka on negatiivinen enterobakteereille.

39

8.3 Validoinnissa käytettävät elatusaineet, kasvatusalustat ja reagenssit

Tavanomaisten laboratoriossa käytettävien tarvikkeiden lisäksi validointityössä tarvittiin

tutkittavien mikrobien kasvattamiseksi BHI (Brain Heart Infusion, Labema) -elatusainelientä

ja yleiskasvatusmaljaksi verimaljoja. Varmistustesteihin käytettiin Baird-Parker-maljoja,

DNAasi-maljoja sekä TSA-maljoja. (Ks. Taulukko 4.)

Taulukko 4.Validoinnissa käytettävät aineet ja kasvatusalustat.

Käytettävä tarvike Käyttötarkoitus

BHI (Brain Heart Infusion Broth), Labema Elatusaine

Peptonijauhe Laimennokset

Trinatriumsitraatti-dihydraatti Laimennokset

Natriumhydroksidi pH-arvon säätely laimennoksissa

Oksidaasikokeen reagenssi Oksidaasikoe

MPC (milk plate count) Yleiskasvatusalusta

VRBA (Violet red bile agar) Selektiivinen kasvatusalusta

VRBGA (Violet red bile glucose agar) Selektiivinen kasvatusalusta

Verimalja Yleiskasvatusalusta

TSA-malja Yleiskasvatusalusta

Baird-Parker-malja Selektiivinen kasvatusalusta

DNAasi-malja Selektiivinen kasvatusalusta

8.4 Valitut näytematriisit

Lopulliseen validointiprosessiin valittiin näytematriiseiksi viisi erilaista elintarvikematriisia,

joista laboratoriossa päivittäin tutkitaan mikrobipitoisuuksia. Taulukko 5 esittelee

näytematriisit ja niiden koodaukset.

40

Taulukko 5. Näytteiden koodaus.

Näytemateriaali Koodaus

Säiliömaito, rasvaa 1,5 %, ennen pakkaamista M

Raejuusto, rasvaa 2 %, valmis tuote J

Raejuuston kastike (kurri), rasvaa 0 %, lisätty suola ja K-sorbaatti KU

Raejuuston kastike (kerma), rasvaa 10 %, lisätty suola ja K-sorbaatti KE

Voi, normaalisuolainen V

8.5 Validointiprosessi

Validointiprosessi tehtiin kahdessa osassa: ensimmäisessä osassa (osa 1) tarkoituksena oli

tutkia menetelmien oikeellisuutta, täsmällisyyttä, spesifisyyttä ja lineaarisuutta. Toisessa osassa

(osa 2) tutkittiin myös menetelmien täsmällisyyttä selvittämällä, poikkeavatko laboratorion eri

työntekijöiden tekemien analyysien tulokset toisistaan. Kolme eri työntekijää osallistui osan 2

toteuttamiseen. Toteamis- ja määritysrajoja ei tutkittu.

Osassa 1 käytettiin näytteinä kaikkia viittä näytematriisia. Osan 2 tutkimus toteutettiin vain

kahdella näytteellä, juustolla ja maidolla. Molemmissa osissa tehtiin validoitavan menetelmän

mukaisesti jokaisesta viljelystä kaksi rinnakkaista maljaa, paitsi nollanäytemaljoista vain

satunnaisesti. Jokaisesta näytteestä valmistettiin maljat kahdella eri pitoisuudella.

Molempia työn osia varten valmistettiin ensin sopivalla pitoisuudella olevat

kontrollibakteerisuspensiot, joita näytteisiin oli tarkoitus siirrostaa. Sopiva pitoisuus

varmistettiin tekemällä bakteerisuspensiosta laimennossarja, jota kasvatettiin 37 °C

lämpötilassa.

8.5.1 Bakteerisuspension valmistus

Positiivisena kontrollibakteerina käytettiin Escherichia coli -kantaa ATCC 25922 ja

häiritsevänä negatiivisena kontrollina Staphylococcus epidermidis -kantaa ATCC 12228.

Kylmäkuivatut kontrollikannat herätettiin rikkomalla kylmäkuivattu solupelletti

säilytysputkessa olevaan peptonisuolaliuokseen. Bakteerit siirrostettiin suspensiosta

verimaljalle ja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C noin 22 tuntia. Tämän jälkeen verimaljalta

41

siirrostettiin 1 µl viljelysilmukalla molempien kantojen bakteerimassaa 15 millilitraan BHI

(Brain Heart Infusion Broth, Labema) -elatusainelientä ja inkuboitiin liemiputkia lämpötilassa

37 °C noin 21 tuntia.

8.5.2 Siirrostettavan bakteerisuspension pitoisuuden määritys

Validointiprosessissa haluttiin, että maljoilla oleva pesäkemäärä olisi muutamia kymmeniä,

mutta alle 100, jotta se olisi helposti laskettavissa. Tätä varten tehtiin alustava tutkimus BHI-

liemen bakteeripitoisuuden selvittämiseksi, minkä perusteella bakteeripitoisuus oli noin 108–

109 pmy/ml.

Sopivan mikrobimäärän siirrostamiseksi näytematriiseihin valmistettiin laimennossarjat

molemmista bakteerisuspensioista. Laimennossarja pitoisuudesta 10-1 pitoisuuteen 10-9

valmistettiin peptonisuolaliuosputkiin (Maximum recovery diluent, Labema), joissa oli 9 ml

steriloitua peptonisuolaliuosta. Nämä laimennosputket valmistettiin ja steriloitiin itse

laboratoriossa.

Laimennossarjan laimennoksista 10-5–10-9 tehtiin tarkan mikrobipitoisuuden määrittämiseksi

viljelyt MPC (Milk Plate Count) -maljoille inkuboiden niitä vuorokausi lämpötilassa 37 °C.

Laimennosten 10-7 ja 10-8 pesäkemäärien (Taulukko 6) perusteella laskettiin kontrolliliuosten

mikrobipitoisuudet. Tulosten perusteella näytteisiin siirrostettiin positiivista kontrollia (E. coli)

laimennoksesta 10-5 ja negatiivista kontrollia (S. epidermidis) laimennoksesta 10-4. Negatiivisen

kontrollin kasvu osoittautui hieman heikommaksi kuin positiivisen kontrollin kasvu.

Taulukko 6. Mikrobipitoisuudet kontrollibakteerien suspensioissa.

Pesäkkeet E. coli S. epidermidis

Laimennos 10-7 79 65 30 33

Laimennos 10-8 11 16 4 3

Mikrobipitoisuus (pmy/ml) 7,32 · 108 4,82·108

42

8.5.3 Näytematriisien esikäsittely

Maito ja juuston kastikkeet otettiin validointiin ilman esikäsittelyä. Raejuusto punnittiin

steriiliin Lab Blender -pussiin, homogenoitiin ja sekoitettiin laimennosveteen

(trinatriumsitraattiliuos). Bakteerisuspensio siirrostettiin pussissa olevaan näytteeseen.

Voita punnittiin dekantterilasiin ja siirrostettiin mahdolliset bakteerisuspensiot ennen

sulattamista. Sulatus tehtiin vesihauteessa (lämpötila 47 °C) laimennosveden

(peptonisuolaliuos) kanssa. Tutkittava näyte otettiin sulamisessa erottuneesta vesifaasista.

8.5.4 Bakteerisuspension siirrostus näytteisiin

Jokaiseen näytematriisiin siirrostettiin kontrollibakteeria tai -bakteereita kolmella tai neljällä

tavalla (Taulukko 7). Nollanäytteeseen ei siirrostettu bakteereita, yhteen näytteeseen

siirrostettiin vain positiivista kontrollia, ja kahteen sekä positiivista että negatiivista kontrollia

niin, että positiivista kontrollia oli näissä näytteissä eri pitoisuudet. Kaksi eri pitoisuutta

valmistettiin osassa 1 vain maito- ja kurrinäytteille ja osassa 2 molemmille näytteille.

Taulukko 7. Näytteisiin siirrostetut bakteerisuspensiomäärät.

Näyte Näytemäärä g (punnittu) E. coli (ml 10-5) S. epid. (ml 10-4)

M1 100,73 0 0

M2 100,20 0,4 0

M3 100,57 0,4 0,4

M4 101,82 0,2 0,4

KE1 99,99 0 0

KE2 102,76 0,4 0

KE3 100,52 0,4 0,4

KU1 99,95 0 0

KU2 100,08 0,4 0

KU3 100,17 0,4 0,4

KU4 101,90 0,2 0,4

V1 50,33 0 0

V2 50,31 0,2 0

V3 50,57 0,2 0,2

J1 10,21 0 0

J2 10,45 0,4 0

J3 10,37 0,4 0,4

43

Siirrostuksien perusteella viljellyistä näytteistä laskettiin teoreettiset pesäkeluvut (Taulukko 8).

Nollanäytteissä (koodit M1, KE1, KU1, V1 ja J1) kasvua ei tulisi olla. Näytteenotto tehtiin

kaikissa tapauksissa noin 10 minuutin jälkeen bakteerisuspension siirrostamisesta.

Taulukko 8. Teoreettiset pesäkeluvut näytteissä, pmy/ml tai pmy/g.

Näyte M2 M3 M4 KE2 KE3 KU2 KU3 KU4 V2 V3 J2 J3

E. coli 29 29 14 28 28 29 29 14 29 29 280 282

S. epidermidis 0 192 189 0 192 0 192 189 0 189 0 1859

8.5.5 Viljely ja kasvatus

Kaikista tutkittavista näytteistä tehtiin enterobakteerimääritys sekä koliformisten bakteerien

määritys kappaleessa 8.2 kuvatulla tavalla. Jokaisesta näytteestä viljeltiin kaksi eri laimennosta

vähintään kahdella rinnakkaisella maljalla. Menetelmän toistettavuutta tutkittaessa rinnakkaisia

maljoja tehtiin neljä. Inkubointi suoritettiin menetelmien mukaan enterobakteereille

lämpötilassa 37 °C ± 1 °C ja koliformisille bakteereille lämpötilassa 30 °C ± 1 °C, molemmissa

tapauksissa inkubointiaika oli 24 tuntia ± 2 tuntia.

8.5.6 Tulosten tulkinta

Inkuboinnin jälkeen enterobakteerien ja koliformisten bakteerien maljoilta laskettiin tyypilliset

pesäkkeet. Epätyypilliset pesäkkeet varmistettiin tekemällä niistä puhdasviljelmä kaupalliselle

yleisalustalle (TSA-malja, Tryptic Soy Agar), inkuboitiin vuorokausi lämpötilassa 37 °C ± 1

°C ja varmistettiin pesäkkeet oksidaasikokeella. Kaupallisella oksidaasireagenssilla

(TestOxidase Reagent, Labema) kostutettuun suodatinpaperiin hierotaan silmukallinen

puhdasviljelmää, ja mikäli paperi ei muutu tummansiniseksi kymmenen sekunnin sisällä, tulos

on negatiivinen ja tutkittu pesäke kuuluu enterobakteereihin. Validoinnissa varmistus tehtiin

vain satunnaisesti, ei kaikkien näytteiden kohdalla.

44

9 TULOKSET

9.1 Pesäkeluvut työn eri osissa

Koska Escherichia coli -bakteeri havaitaan molemmilla validoitavilla menetelmillä

(koliformiset bakteerit ja enterobakteerit), tulisi pesäkelaskennan tulokset olla eri menetelmillä

samat. Negatiivinen kontrollibakteeri Staphylococcus epidermidis kasvoi menetelmissä

käytetyillä selektiivisillä maljoilla epätyypillisellä tavalla yhtenäisenä massana (Kuva 5), joten

pesäkelaskenta ei ollut tälle bakteerille mahdollista. Verimaljalla bakteeri kasvoi selvästi

erottuvina pesäkkeinä (Kuva 6).

Kuva 5. Staphylococcus epidermidis enteromaljalla.

Kuva 6. Staphylococcus epidermidis verimaljalla.

Pesäkelaskennan tulokset löytyvät seuraavista taulukoista (Taulukko 9, Taulukko 10 ja

Taulukko 11). Tulokset on laskettu yhteensä 4–8 rinnakkaisen ja eri laimennosten painotettuna

keskiarvona siten, että alle kymmenen pesäkkeen maljoja painotetaan vähemmän kuin

kymmeniä pesäkkeitä sisältäviä maljoja. Tulos on ilmoitettu yksikössä pmy/ml.

45

Taulukko 9. Pesäkeluvut maidossa, kermassa ja kurrissa (pmy/ml).

Näyte M1 M2 M3 M4 KE1 KE2 KE3 KU1 KU2 KU3 KU4

Koliformiset bakteerit 0 36 40 19 0 33 33 0 45 47 9

Enterobakteerit 0 37 39 17 0 35 32 0 40 40 12

Taulukko 10. Pesäkeluvut voissa ja juustossa (pmy/g).

Näyte V1 V2 V3 J1 J2 J3

Koliformiset bakteerit 0 45 29 0 455 323

Enterobakteerit 0 34 29 0 432 432

Taulukko 11. Pesäkeluvut työn osassa 2.

Näyte M1 M2 M3 M4 J1 J2 J3 J4

Koliformiset bakteerit

N 0 33 46 18 0 477 390 291

R 0 30 38 19 0 500 527 241

M - 30 35 17 - 495 559 382

Keskiarvo 0 31 40 18 0 491 492 305

Enterobakteerit

N 0 44 42 17 0 505 600 250

R 0 39 47 25 0 609 464 223

M - 38 47 17 - 641 632 338

Keskiarvo 0 40 45 20 0 585 565 270

9.1.1 Oikeellisuus

Suhteellisen oikeellisuuden arviointiin käytetään validoinnin osan 1 tuloksia. Suhteellista

oikeellisuutta arvioidaan teoreettisten pesäkelukujen ja analyysissa kokeellisesti saatujen

pesäkelukujen avulla.

Niemelän (2002) mukaan suhteellisen virheen laskemiseen voidaan käyttää

logaritmimuunnosta, koska mittaustulosten suhteellinen virhe on likimain yhtä suuri kuin

logaritmimuunnettujen mittaustulosten absoluuttinen virhe. (Niemelä 2002.) Menetelmän

suhteellisen epävarmuuden laskemiseksi teoreettisille pesäkeluvuille ja kokeellisille

pesäkeluvuille tehtiin logaritminen muunnos luonnollista logaritmia käyttäen.

46

Suhteellinen epävarmuus laskettiin seuraavasti: Kaikista näytteistä laskettiin

logaritmimuunnettujen pesäkelukujen erotusten neliöt (Kaava 2) ja näistä neliöistä laskettiin

vielä keskiarvo.

(ln 𝑧1 − ln 𝑧2)2

Kaava 2: 𝒛𝟏 = teoreettinen pesäkeluku, 𝒛𝟐 =kokeellinen pesäkeluku.

Keskiarvoksi saatiin koliformisten organismien määritysmenetelmälle 0,11 ja enterobakteerien

määritysmenetelmälle 0,07. Keskimääräinen suhteellinen menetelmän epävarmuus saatiin, kun

keskiarvo jaettiin vielä kahdella ja otettiin siitä neliöjuuri. Tulokseksi saatiin samassa

järjestyksessä 0,24 ja 0,19. Nämä arvot kuvaavat teoreettisten ja kokeellisten tulosten välillä

olevaa suhteellista virhettä ja tulkitaan niin, että koliformisten bakteerien pesäkelaskennan

virhetulos voi olla ±24 % ja enterobakteerien ±19 %.

Tuloksissa ei esiintynyt virhepositiivisuutta tai virhenegatiivisuutta. Jokainen näyte, johon

bakteeria oli lisätty, tuotti positiivisen tuloksen, ja jokainen nollanäyte negatiivisen tuloksen.

Lisäksi häiritseväksi bakteerikannaksi lisätty kontrollikanta ei tuottanut validoitavan

menetelmän mukaisia positiivisia tuloksia eikä siten aiheuttanut virhenegatiivisuutta.

9.1.2 Täsmällisyys

Validoitavan menetelmän täsmällisyyttä arvioitiin sekä osan 1 että osan 2 tulosten avulla.

Toistettavuutta arvioitiin osan 1 tulosten avulla. Toistettavuutta tutkittiin tekemällä kahdesta eri

maitonäytteestä neljä rinnakkaista viljelyä kahtena erilaisena laimennoksena. Toistettavuus

tarkistettiin erikseen kullekin näytetyypille laskemalla niistä suhteellinen hiukkastilastollinen

keskihajonta (Kaava 3). Kaikkien näytteiden hajonnat olivat välillä 8-12 %.

𝑢𝐶 = √1

𝐶,

Kaava 3. Suhteellinen keskihajonta. C = yhden näytetyypin pesäkelukujen summa.

47

Uusittavuuden arviointi tehtiin osassa 2. Kolme laboratorion työntekijää teki analyysit samoista

näytteistä. Kaikki viljelyt tehtiin samassa laboratoriossa kolmen tunnin sisällä näytteiden

käsittelyn ja siirrostuksen jälkeen. Uusittavuutta arvioitiin laskemalla kunkin työntekijän

pesäkelukemat jokaisesta näytetyypistä ja sen jälkeen laskemalla logaritmimuunnettujen

pesäkelukemien keskihajonnoista keskiarvo (Taulukko 12).

Taulukko 12. Hajonta uusittavuuskokeessa, logaritmista yksikköä.

Koliformiset bakteerit Enterobakteerit

Maitonäytteet 0,09 0,13

Juustonäytteet 0,15 0,17

9.1.3 Spesifisyys

Validoitavat menetelmät olivat suhteellisen spesifejä, sillä niillä löydettiin näytteisiin

siirrostettu bakteeri molemmissa validoitavissa menetelmissä. Siirrostettu Escherichia coli

kasvoi maljoilla tyypillisinä pesäkkeinä. Häiritseväksi tekijäksi siirrostettiin Staphylococcus

epidermidis -kantaa, ja se kasvoi epätyypillisenä muodostelmana maljoilla. Häiritsevä bakteeri

ei siis voinut aiheuttaa virhepositiivisuutta.

Häiritseväksi tekijäksi siirrostettu mikrobi kasvoi epätyypillisenä sekä koliformisten bakteerien

että enterobakteerien kasvatusalustoilla. Se ei estänyt haluttujen bakteerien löytämistä

menetelmällä, mutta saattoi vaikeuttaa maljojen lukemista, jos E. coli -pesäkkeet jäivät

voimakkaan S. epidermidis -kasvuston alle tai reunoille. Tyypilliset E. coli -pesäkkeet voidaan

yleensä erottaa S. epidermidis -kasvuston alta (Kuva 7), koska ne kasvavat selvinä

vaaleanpunaisina pesäkkeinä joko agarin pinnassa tai sisässä.

48

Kuva 7. Tyypillistä ja epätyypillistä bakteerikasvustoa enterobakteerimaljalla.

Kaikissa tilanteissa ei kuitenkaan ollut täysin selvää, mitkä pesäkkeet S. epidermidis -kasvuston

reunoilla ovat menetelmälle tyypillisiä pesäkkeitä (Kuva 8).

Kuva 8. Vaikeatulkintainen enterobakteerimalja.

49

9.1.4 Lineaarisuus

Lineaarisuutta tutkittiin työn osassa 1 kahdella erilaisella näytematriisilla; maidolla

(näytekoodit M2-M4) ja rasvattomalla raejuuston kastikkeella (koodit KU2-KU4). Näytteisiin

M2, M3, KU2 ja KU3 siirrostettiin kaksinkertainen määrä tutkittavaa bakteeria verrattuna

näytteisiin M4 ja KU4. Maidon kohdalla (näytteet M2-M4) kasvu näyttää olevan hyvin

lineaarista (ks.Taulukko 9) sekä koliformien määrityksessä että enterobakteerien

määrityksessä, mutta raejuuston kastikkeessa (näytteet KU2-KU4) pienempi siirrostettu

pitoisuus ei ole johtanut kovin lähelle odotettua tulosta.

Tilastolaskentaohjelmalla toteutettu lineaarisuustesti antoi maitonäytteiden

korrelaatiokertoimeksi (R-arvo) 0,93, selitysasteeksi (𝑅2) 0,86 ja lineaarisuuskertoimeksi 0,47

(merkitsevyystaso p < 0,001), joka on lähellä siirrostettujen pitoisuuksien suhdetta (0,5).

Juuston kastikkeelle lineaarisuutta tutkittiin pareittain näytteille KU2 ja KU4

(korrelaatiokerroin 0,72, selitysaste 0,43 ja lineaarisuuskerroin 0,17 (p = 0,045)) sekä näytteille

KU3 ja KU4 (korrelaatiokerroin 0,80, selitysaste 0,59, lineaarisuuskerroin 0,17 (p = 0,016)).

50

10 POHDINTA

10.1 Oikeellisuus

Yleisesti mikrobiologien arvioima kvantitatiivisten määritysten virheraja ±0,5 logaritmista

yksikköä (Corry ym. 2007) alittui tässä tutkimuksessa. Keskimääräiset tulokset epävarmuudelle

±0,24 (koliformiset bakteerit) ja ±0,19 (enterobakteerit) voidaan tulkita logaritmisiksi

yksiköiksi, koska ne on laskettu logaritmimuunnosten avulla.

Menetelmän oikeellisuutta tutkittaessa on otettava huomioon mikrobiologisten

analyysimenetelmien epävarmuus. Suuretkin erot teoreettisessa ja validoitavalla menetelmällä

saadussa bakteeripitoisuudessa voivat olla hyväksyttäviä, kuten kirjallisuusosuudessa on

todettu. Koliformisten bakteerien määritysmenetelmässä arvioidaan luottamusvälin vaihtelevan

välillä 16 %–52 % riippuen tuloksena saaduista pesäkemääristä, ja käytännössä vaihtelevuus

voi olla suurempaakin (ISO 4832:2006(E)). Saadut tulokset ovat tämän vaihteluvälin sisällä.

Enterobakteereille tällaista vaihteluväliä ei anneta, mutta niiden kohdalla voitaneen hyväksyä

vaihteluväliksi yleisesti käytössä oleva raja ±0,5 logaritmista yksikköä.

Validoitava menetelmä antoi positiivisen tuloksen, kun näytteessä oli bakteereja, ja negatiivisen

tuloksen, kun niitä ei ollut (nollamaljat). Virhepositiivisia ja virhenegatiivisia tuloksia ei tullut.

Negatiivisena kontrollina toiminut bakteerikanta kasvoi menetelmälle epätyypillisenä

muodostelmana, joten se ei tuottanut menetelmässä virheellistä positiivista tulosta.

10.2 Täsmällisyys

Menetelmien toistettavuudessa oli hajontaa 8–11 % (koliformiset bakteerit) ja 8–12 %

(enterobakteerit), kun maljoja viljeltiin yhdestä näytteestä kahdeksan. Hajonta on sitä

pienempää, mitä enemmän maljoja samasta näytteestä viljellään. Tulosten suuruusluokat olivat

samoilla näytteillä samanlaisia ja myös aika lähellä toisiaan, joten toistettavuuden voi olettaa

olevan menetelmällä hyvä.

51

Uusittavuuskokeen hajonnat olivat välillä 0,09–0,17 logaritmista yksikköä. Koliformisten

bakteerien määritysmenetelmässä mainitaan, että menetelmän uusittavuuden keskihajonnat

ovat vaihdelleet maksimissaan 0,35 logaritmisen yksikön verran (ISO 4832:2006(E)), ja näissä

rajoissa pysyttiin. Enterobakteerien määritysmenetelmälle ei tällaista arvoa anneta.

Uusittavuuden hajonta juustonäytteissä oli keskimäärin hieman suurempaa kuin

maitonäytteissä, mikä on luontevaa, koska juustonäytteen analysointi vaatii esikäsittelyjä,

joissa vaihtelevuutta voi esiintyä.

Täsmällisyyttä pesäkelaskennassa ei tässä tutkimuksessa selvitetty. Samojen maljojen

lukemisessa voi tulla hajontaa saman tai eri henkilöiden lukiessa uudestaan samat maljat. Corry

ym. (2007) raportoi 5–7,7 % hajontaa yhden henkilön toistuvassa pesäkelaskennassa ja 10–18

% hajontaa useamman henkilön pesäkelaskennassa. Tämän tutkimuksen kohteena olevassa

meijerissä pesäkelaskennan täsmällisyys ei välttämättä ole tärkeimpiä validoitavia kohteita,

koska pesäkelaskennan tulos on usein alle kymmenen pesäkettä eikä tulkintaeroja pääse

syntymään. Mikäli halutaan, voidaan täsmällisyyttä kuitenkin tutkia niissä analyyseissa, joissa

pesäkemäärä on tyypillisesti suurempi.

10.3 Spesifisyys

Menetelmien spesifisyys on suhteellisen hyvä, sillä se löytää halutut mikrobit näytteestä.

Lukemista voi vaikeuttaa häiritsevän kontrollibakteerin kasvu maljalla. Epäselvissä tapauksissa

on varminta laskea vain menetelmälle tyypilliset, selkeät vaaleanpunaiset pesäkkeet ja tehdä

muille varmistuskoe. Menetelmän spesifisyydessä voi siis olla puutteita, mutta toisaalta

käytetty negatiivinen kontrollibakteeri S. epidermidis ei välttämättä toimi parhaiten tässä

tarkoituksessa, sillä vaikka se ei kasva valikoitaville menetelmille tyypillisinä pesäkkeinä, se

on oksidaasinegatiivinen ja hyödyntää glukoosia aineenvaihdunnassaan, kuten

enterobakteeritkin, joten siitä muodostuneita pesäkkeitä ei voi varmistaa enterobakteerien

tunnistukseen käytetyn menetelmän varmistustesteillä.

52

10.4 Lineaarisuus

Lineaarisuutta tutkittiin eri näytteissä kahdella erilaisella pitoisuudella. Luotettavammat

tulokset olisi mahdollista saada, jos tutkittaisiin lineaarisuutta useammalla eri pitoisuudella.

Maitonäytteen lineaarisuus toteutui kuitenkin erinomaisesti kahdellakin pitoisuudella.

Juuston kastikkeella menetelmät eivät tuottaneet lineaarisuuskertoimen (0,17) perusteella

hyvää lineaarisuutta, tilastollinen merkitsevyyskin toteutui juuri ja juuri. Raejuuston kastike oli

rasvatonta, ja siihen oli lisätty suolaa ja kaliumsorbaattia säilöntäaineeksi valmistusprosessiin

kuuluvalla tavalla. Nämä lisäykset saattavat vaikuttaa E. coli -bakteerin kasvua ehkäisevästi,

mutta sillä ei lineaarisuustutkimuksen kannalta ole merkitystä. Sen sijaan lineaarisuuden

toteutumiseen on voinut vaikuttaa se, että lineaarisuuden tutkimiseen tarkoitetuissa näytteissä

oli mukana myös häiritsevää negatiivista kontrollia. Tuloksen perusteella riskinä voi kuitenkin

olla, että menetelmä ei näytä tarpeeksi hyvin pieniä enterobakteerin tai koliformisten bakteerien

määriä tästä näytetyypistä. Lineaarisuutta voisi olla hyvä tutkia vielä muilla näytemateriaaleilla.

10.5 Validoinnin onnistuminen

Validoitavien menetelmien tulee toimia meijerissä tarkoituksenmukaisella tavalla. Menetelmät

osoittivat riittävän hyvää oikeellisuutta, toistettavuutta ja uusittavuutta sekä suhteellisen hyvää

spesifisyyttäkin. Vielä meijerin kannalta merkityksellistä olisi ollut selvittää määritysrajaa tai

toteamisrajaa, ovathan jo muutamat pesäkkeet meijerin analyyseissä merkityksellisiä.

Lineaarisuudesta saatu tulos olisi luotettavampi, jos mukana ei olisi ollut häiritsevää

negatiivista kontrollia.

Käytännön työn suorittamiseen aikaa oli turhan vähän, jolloin validoinnin suunnittelu jäi

vähäiseksi ja vaikutti lopputuloksen laatuun. Seuraavaa validointia tehdessä tulee perehtyä

ajantasaiseen aiheeseen liittyvään kirjallisuuteen vielä monipuolisemmin.

Validointiin otettiin mukaan viittä eri näytematriisia, jotka edustivat hyvin meijerissä tutkittavia

tuotteita ja joiden käsittelyssä tarvittiin useita meijerin päivittäisissä rutiineissa käytettyjä

menetelmiä. Validien menetelmien tulee sopia kaikkiin näytematriiseihin, joihin niitä

käytetään.

Validoinnissa tehtiin riittävän paljon rinnakkaisia tutkimuksia ottaen huomioon näytematriisit

ja meijerin laatutavoitteet tutkittaville mikrobeille.

53

LÄHTEET

Bell C., Neaves P., Williams AP. Food microbiology and laboratory practice. Oxford: Blackwell Science

2005.

Chandan RC. Dairy processing and quality assurance: an overview. Kirjassa Chandan RC, Kilara A,

Shah NP, toim. Dairy processing and quality assurance. Chichester, England: Wiley Blackwell 2016, s.

33–93.

Cordier J. Microbiological criteria and indicator micro-organisms. Kirjassa Doyle MP, Buchanan RL,

toim. Food microbiology: fundamentals and frontiers. Washington D.C: ASM Press 2013, s. 81–89.

Corry JEL, Jarvis B, Passmore S, Hedges A. Critical review of measurement uncertainty in the

enumeration of food micro-organisms. Food Microbiology 2007;24:230–253.

Elintarvikelaki 23/2006.

Elintarvikevirasto. Mikrobiologisten menetelmien validointiohje. Helsinki: Valvonta 13/1997.

(http://www.evira.fi/files/attachments/fi/evira/lomakkeet_ja_ohjeet/elintarvikkeet/elintarvike_ja_rehut

utkimus/mibi/validointiohje_13_1997.pdf)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 852/2004 elintarvikehygieniasta.

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 853/2004 eläinperäisiä elintarvikkeita koskevista

erityisistä hygieniasäännöistä.

Eurooppatiedotus, ulkoasiainministeriö. EU-lakien suhde Suomen lakiin.

https://eurooppatiedotus.fi/suomi-ja-eu/eu-lakien-suhde-suomen-lakiin/ (päivitetty 17.5.2017).

European Food Safety Authority (EFSA). Trends and sources of zoonoses and zoonotic agents in

foodstuffs, animals and feeding stuffs. Finland: Annual National Report 2016.

Eviran ohje 10501/2. Elintarvikkeiden mikrobiologiset vaatimukset, komission asetuksen (EY) No

2073/2005 soveltaminen sekä yleisiä ohjeita elintarvikkeiden mikrobiologisista tutkimuksista.

FDA. Food and Drug Administration. Grade ”A” pasteurized milk ordinance. U.S Department of Health

and Human Services, Public Health Service. Washington DC 2015.

Fernandes R, toim. Microbiology handbook: Dairy products. Leatherhead: Royal Society of Chemistry

2009.

Forster LI. Conclusions on measurement uncertainty in microbiology. J AOAC Int 2009;92:312–319.

ISO 13559:2002(E). Butter, fermented milks and fresh cheese – Enumeration of contaminating micro-

organisms – Colony-count technique at 30 °C.

ISO 7218:2007(E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and

guidance for microbiological examinations.

ISO 4832:2006(E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the

enumeration of coliforms – Colony-count technique.

ISO 7932:2004(E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the

enumeration of presumptive Bacillus cereus – Colony-count technique at 30 °C.

ISO 21528-2:2004(E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal methods for the

detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: Colony-count method.

ISO 4833-1:2013(E). Microbiology of the food chain – Horizontal method for the enumeration of micro-

organisms – Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique.

54

ISO 6611:2004(E). Milk and milk products – Enumeration of colony-forming units of yeasts and/or

moulds – Colony-count technique at 25 °C.

Jarvis B, Hedges AJ, Corry JEL. Assessment of measurement uncertainty for quantitative methods of

analysis: Comparative assessment of the precision (uncertainty) of bacterial colony counts. Int J Food

Microbiol 2007;116:44–51.

Jay JM, Loessner MJ, Golden DA. Modern food microbiology. New York: Springer 2005.

Komission asetus (EY) N:o 2073/2005 elintarvikkeiden mikrobiologisista vaatimuksista.

Komission asetus (EY) N:o 1441/2007 elintarvikkeiden mikrobiologisista vaatimuksista annetun

asetuksen (EY) N:o 2073/2005 muuttamisesta.

Komission asetus (EY) N:o 365/2010 elintarvikkeiden mikrobiologisista vaatimuksista annetun

asetuksen (EY) n:o 2073/2005 muuttamisesta siltä osin kuin on kyse enterobakteerien esiintymisestä

pastöroidussa maidossa ja muissa pastöroiduissa nestemäisissä maitotuotteissa sekä Listeria

monocytogenes –bakteerin esiintymisestä elintarvikekäyttöön tarkoitetussa suolassa.

Maa- ja metsätalousministeriön asetus ilmoitettujen elintarvikehuoneistojen elintarvikehygieniasta

MMMa 1367/2011.

Martin NH, Trmčić A, Hsieh TH, Boor KJ ja Wiedmann M. The evolving role of coliforms as indicators

of unhygienic processing conditions in dairy foods. Front. Microbiol. 2016;7:1549.

Meijerin menetelmäohjeet näytteiden analysoinnista. Päivitetty 2014.

Meijerin menetelmäohje vieraiden mikrobien tutkimisesta. Päivitetty 3.4.2014.

Meijerin mikrobiologisten menetelmien ohjeet. Päivitetty 2014.

Meijerin näytteenottosuunnitelma (toimintajärjestelmän liite 41). Päivitetty 16.9.2014.

Meijerin ohje kasvatusalustoista, näytteen käsittelystä ja laimentamisesta sekä viljelymenetelmistä.

Päivitetty 7.4.2014.

Meijerin ohje laboratorion hygieenisestä työskentelystä ja aikataulusta. Päivitetty 26.2.2014.

Meijerin ohje laboratorion sisäisestä laadunvarmistuksesta. Päivitetty 27.5.2014.

Meijerin ohje laimennosvesien valmistuksesta. Päivitetty 4.4.2014.

Meijerin ohje poikkeavan tuotteen hallinnasta Päivitetty 19.3.2014.

Meijerin tuotantoprosessien kuvaukset. Päivitetty 11.3.2015.

Meng J, LeJeune JT, Zhao T, Doyle MP. Enterohemorrhagic Escherichia coli. Kirjassa Doyle MP,

Buchanan RL, toim. Food microbiology: fundamentals and frontiers. Washington D.C: ASM Press

2013, s. 287–309.

Mutanen M, Voutilainen E. Energiaravintoaineet, ravintokuitu ja alkoholi. Kirjassa Aro A, Mutanen M,

Uusitupa M, toim. Ravitsemustiede. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2012, s. 42–75.

Niemelä, S.I. Uncertainty of quantitative determinations derived by cultivation of micro-organisms.

Advisory commission for metrology. Helsinki 2002.

Nsofor ON, Frank JF. Milk and dairy products. Kirjassa Doyle MP, Buchanan RL, toim. Food

microbiology: fundamentals and frontiers. Washington D.C: ASM Press 2013, s. 169–185.

55

Patel AA, Sharma P, Patel H. Butter and fat spreads: Manufacture and quality assurance. Kirjassa

Chandan RC, Kilara A, Shah NP, toim. Dairy processing and quality assurance. Chichester, England:

Wiley Blackwell 2016, s. 474–507.

Schmidt RH. Microbiological considerations related to dairy processing. Kirjassa Chandan RC, Kilara

A, Shah NP, toim. Dairy processing and quality assurance. Chichester, England: Wiley Blackwell 2016,

s. 203–278.

Sosiaali- ja terveysministeriön asetus talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista. STMa

461/2000.

Terveyden ja hyvinvoinnin laitos. Finravinto 2012 -tutkimus. Tampere: THL raportti 16/2013.

Valtion ravitsemusneuvottelukunta. Terveyttä ruoasta! Suomalaiset ravitsemussuositukset. Tampere:

Suomen yliopistopaino Oy 2014.

Weder JKP, Belitz HD. Protein. Food sources. Kirjassa Caballero B. Encyclopedia of food sciences and

nutrition. Amsterdam: Academic Press 2003;8:s.4818–4824.