Microscopia. Método de Nomarski

11/2/2015 mcontrsfases

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/mcontrsfases.htm 1/6

1.1.1.5. Microscopia de contraste de fases e interferencia de Nomarski.

Las clulas vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste defases o de contraste de fases interferencial. La posibilidad de que algunos componentesde la clula puedan perderse o distorsionarse durante la preparacin de las muestras noha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La nica solucin a esteproblema es examinar las clulas mientras an estn vivas, sin ningn tipo de fijacinni congelacin. Para este propsito son tiles microscopios con sistemas pticosespeciales. Cuando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa vara enrelacin al ndice de refraccin de la clula: la luz que pasa a travs de una zonarelativamente gruesa o densa de la clula, como por ejemplo el ncleo, se retrasa y sufase queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado atravs de una regin adyacente de citoplasma, ms fina. El microscopio de contraste defases y el microscopio de contraste de fases interferencial aprovechan los efectos deinterferencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas, creandode esta forma una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de microscopios pticosse utilizan habitualmente para visualizar clulas vivas.

1930 Labedeff : Disea primer microscopio de contraste interferencial.1932 Frits Zernike : Inventa microscopio de contraste de fases.1952 Nomarski : Inventa y patenta el sistema de contraste Interferencial quelleva su nombre.1953 Premio Nobel de Fsica otorgado a Zernike.

Objetivo La microscopia de contraste de fases y la del microscopio de interferencia nos dan laposibilidad de observar clulas vivas y sin ninguna preparacin , ya que al realizar otrosprocedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedanperderse o distorsionarse por mtodos como la fijacin, coloracin, congelacin, yotros, asi, estos instrumentos pticos ayudan a resolver el problema.

Principio de la microscopia de contraste Las clulas vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luzpasan a travs sin sufrir prdidas en intensidad.

La luz transmitida a travs de las clulasvivientes, sin embargo, encuentra a su paso,regiones de ndices de refraccin diferentes, ydiferentes grosores y/o densidades, lo que escapaz de alterar su velocidad y su direccin.En la Figura 1 se da la representacinesquemtica en donde dos regionesadyacentes de una misma clula, A y B, de undiferente grosor, t1 y t2 y con diferentesndices de refraccin, n1 y n2, son atravesadaspor un rayo luminoso. Las variaciones engrosor e ndices de refraccin son capaces de producir una diferencia en el curso pticode la luz transmitida por las dos regiones. En este caso especfico, le toma ms tiempopasar a la luz a travs de la fraccin B, cuyo ndice de refraccin es mayor (n2) y por lotanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz deatravesar la porcin A, cuyo ndice de refraccin es ms bajo. Si la diferencia de los ndices de refraccin es pequea, la magnitud del cambio defase inducido igualmente es muy pequea y se mide en trminos de longitudes de onda(). As, en la representacin de la Figura 1, el rayo que pasa a travs de la parte B semuestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( /4) y emerge fuera de fase. con respectoa la transmisin que nos muestra la parte A.



Diseo del instrumento ptico El sistema ptico del microscopio de contraste de fases difiere del microscopioordinario (de luz) solamente en la adicin de un diafragma anular colocado debajo de laplatina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una placa de difraccinmontada en el objetivo, un diagrama representado en la Figura 2, muestra el diseo deun microscopio de contraste de fase y el curso que siguen los rayos que pasan a travsde una estructura celular. La fase relativa de luz desviada, saldra 1/4 de longitud de onda retrasado, s escapturada y cambiada con la introduccin de un material retrasador de fase, en aquellaparte de la placa de difraccin que sea cubierta por cualquiera de los dos rayos,aumentando an ms, otro 1/4 de longitud de onda y logrando retrasar en rayoluminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que se logra que este rayo quedetotalmente fuera de fase con respecto a la luz no desviada. Cuando la diferencia se presenta es por que los ndices de refraccin son diferentes yel microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones en brillo o intensidad.Las estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son objetos pticamenteno homogneos as, la luz que "choca" con el objeto se presenta desviada.

Contraste de fase oscuro o positivo: cuando los rayos de luz, la desviada y la nodesviada tienden a cancelarse creando una interferencia destructiva y hacer que el

objeto aparezca mucho ms oscuro que los alrededores.

Contraste de fase brillante o negativo: se presenta cuando retrasamos la luz nodesviada y la hacemos 1/4 de longitud de onda menor, lo que hace que salga al tiempocon la luz desviada, que tiene un retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando de estamanera que salgan al mismo tiempo y se recombinen para dar brillo, creando unainterferencia constructiva aumentando en esta forma el objeto mientras su contornopermanece con menos intensidad.http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/phasecontrast/phase.html

Microscopio de interferencia



La

microscopia de interferencia o tcnica DIC (DiffentialInterference Contrast) Nomarski, permite la visualizacin de especmenes mucho msdensos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional. Los principios pticos yla operacin del DIC, son bien diferentes a los de microscopia de contraste y suoperacin es compleja. Como los cambios de fase producidos por las estructuras celulares son muypequeos y por lo general de fracciones de longitud de onda, para poder medir estecambio con precisin es necesario separar por completo la luz que se transmitedirectamente de la desviada por el objeto, tal como lo hace el microscopio deinterferencia.

Nomarski differential interference contrast microscopy. Fundamentalmente, la luz que seemplea en este caso es polarizada(blanca o monocromtica), o sea quetiene la propiedad de concentrar losrayos dispersos en uno solo y seadicionan a los lentes objetivos cuatrocomponentes pticos: Polarizador,prisma DIC, sealador DIC y unanalizador. El objeto espcimen que seencuentra en fase toma direccionesdiferentes de acuerdo con los valores degrosor e ndices de refraccin quepresente. El prisma (birrefringente)situado sobre la parte posterior delplano focal del objetivo es usado para

recombinar las dos ondas en un solo rayo. El objeto atravesado por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es elque en realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva), as el planopolarizado es recapturado por un analizador, que transforma esto en ondas de vibracinde la misma longitud y habilita la interferencia como respuesta a estas dos ltimasacciones tenemos que diferentes regiones del objeto estudiado apareceran con msbrillo o menos brillo sobre un fondo oscuro. Los espacios laterales de las dos ondas se miden en trminos de micrmetros y nose exceden en el tamao de la resolucin perceptible al ojo humano, logrando asi queno se presente una doble imagen al observador. En esta microscopia incluir el tipo Nomarski (prisma), lo que obtendremos seruna apariencia seudo tridimensional del objeto.

Aplicaciones



Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases,del microscopio de contraste de fases interferencial y del microscopiode campo oscuro estriba en que los tres permiten observar las clulas enaccin y estudiar los movimientos implicados en procesos como lamitosis o la migracin celular. Puesto que muchos movimientos sondemasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmenteresulta til hacer pelculas o vdeos por el sistema de aceleracin de

movimiento (microcinematografa). En esto casos, se toman fotografas sucesivas,separadas por breves perodos de tiempo, de modo que cuando la pelcula o videoregistrados se proyectan a la velocidad normal los acontecimientos aparecen muyacelerados.

Estatcnicamicroscpicase usa paramedir ndicede refraccin yconcentracinde slidos delas estructuras

celulares utilizando un metodo de refractometra por inmersin, as se sumergen lasclulas en una solucin isotnica cuyo ndice de refraccin puede variarse. Esta refractometra se ha empleado para ser medidos en procesos como la divisincelular y el desarrollo de esporas fungicas. Igualmente es til para determinar masaseca y espesor de las estructuras celulares.

2. Microscopio de interferencia diferencial de Nomarski

2.1. Fundamento La posibilidad de que algunos de los componentes celulares se distorsionen en elmomento del corte y preparacin, ha conducido a los cientficos a crear microscopioscon los cuales se pueda observar clulas vivas sin ningn tipo de fijacin ni decongelacin para este propsito se utilizan sistemas pticos especiales (1).C uando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa vara conrelacin al ndice de refraccin de la clula crendose una interferencia, que retrasa laonda luminosa cuando atraviesa una zona relativamente densa la microscopia deinterferencia diferencial de Nomarski, aprovecha estos efectos de interferencia, paracrear una imagen de la estructura celular viva, ntida y tridimensional (1). Existen en principio tres tipos de microscopios de interferencias: los microscopiosde interferencia de longitud desdoblada, los de dos ondas y los de ondas mltiples. Losde una sola onda, generalmente se denominan microscopios de contraste de fases. Losde dos ondas, son los autnticos microscopios de interferencia. En el sistema deiluminacin, sistemas pticos diversos, desdoblan el rayo incidente en haces prximosunos del otro en forma variable segn lo desee el operador un segundo sistema ptico,simtrico al primero, pero situado detrs del objetivo, recompone los dos haceshacindolos interferir para construir la imagen. Los de ondas mltiples, no sonutilizados en microscopia biolgica sino en metalografa, para medida de la profundidadde las estructuras (3).

2.2. Partes del microscopio de interferencia diferencial de NomarskiLos componentes bsicos del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski soniguales al microscopio ptico, difiriendo en los sistemas que transmiten el rayo de luzincidente (3) estos son:

Filtro polarizador plano: polariza el rayo de luz incidente que proviene de lalmpara en uno solo y con una misma longitud.Prismas de Nomarski modificado por Wollaston: son dos, uno ubicado dentro delcondensador birrefringente que genera dos rayos de luz paralelos formado un



ngulo de 90? elsegundo se ubica en laparte posterior delobjetivo, es ajustable yen l convergen los dosrayos de luz generadospor el prisma inferiorpara que serecompongan.Filtro polarizador oanalizador: se ubica enla parte superior de losobjetivos y del prismasuperior y su funcines recombinar losrayos de luz, paraproducir la imagenseudotridimensionalobservada a travs delocular.

2.3. Principio pticodel microscopio deinterferencia

diferencial de Nomarski La microscopia de contraste de interferencia diferencial de Nomarski usa lacombinacin de un sistema de luz polarizado y dos rayos divididos para crear fases dediferencias en la muestra. Esto provee una imagen tridimensional de la muestra sin loshalos que rodean a la clula en las imgenes generadas en los microscopios de fase decontraste (2). El principio del sistema es el siguiente: se utiliza luz blanca polarizada por el filtroplano, este rayo de luz monocromtico incide en el condensador completamenteabierto y el prisma de Nomarski birrefringente que se encuentra dentro de l, generados rayos de luz paralelos, uno incide sobre la muestra a analizar y el segundo pasa enforma paralela sobre la muestra.Ocurre una diferencia de la trayectoria local del rayo que atraviesa el espcimencausado por el ndice de refraccin y de grosor, creando una fase distorsionada del rayoincidente que se representa por el desplazamiento del mismo luego estos rayosatraviesan los lentes del objetivo y tambin al segundo prisma de Nomarski, allubicado, en diferentes porciones, debido a la ruta desigual en la trayectoria ptica conla cual inciden en l se forma una imagen doble de la muestra lateral ylongitudinalmente. Al atravesar estos rayos polarizados y an paralelos, el filtroanalizador los transforma a un mismo plano de vibracin, es aqu en donde ocurre laonda de interferencia constructiva o destructiva, que es ocasionada por las diferenciasen la trayectoria ptica dentro de la muestra y se manifiestan al observarse en laimagen reas brillantes y opacas o reas claras u oscuras. En donde no ocurre lainteraccin entre el par de rayos, se produce un fondo gris uniforme. Los espacios laterales de las dos ondas se miden en trminos de micrmetros y nose exceden en el tamao de la resolucin perceptible al ojo humano, logrando as queno se presente una doble imagen al observador, sino una apariencia seudotridimensional del objeto estudiado sobre un fondo uniforme.

2.4. Utilidades del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski El uso de este microscopio hace posible determinar el ndice de refraccin, la



concentracin de slidos, la masa seca y el espesor de las estructuras celulares y estoscambios han sido estudiados en los procesos como la mitosis o la migracin celularunido a un mtodo de refractometra por inmersin4.

2.5. Ventajas

Produce una imagen brillante contra un fondo oscuro sin halos de difraccin deuna clula viva.Determinacin del ndice de refraccinDeterminacin de slidos, masa seca y espesor de las estructuras celulares

2.6. Desventajas

Alto costo del equipo por los diferentes aditamentos utilizados en el microscopioCosto alto y mantenimiento cuidadoso de la muestra de clulas vivasLa microcinematografa requerida para mirar los procesos que realiza la clula invivo requiere de equipos especiales y personal entrenado

3. Bibliografa1. Alberts, A., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K y Watson, J. 1994. Biologamolecular de la clula. Ediciones Omega. Barcelona, Espaa. Pg.153154.2. Gerhardt, P. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. AmericanSociety for Microbiology. Washington, D. C. USA. Pp. 14183. Locquin, M y Langeron, M. 1985. Manual de Microscopia. Editorial Labor. Barcelona,Espaa. Pg. 4245.4. Wilson, G y Morrison, J. 1991. Citologa. CECSA. Mxico, D. F. Mxico. Pg. 296.307.

Bibliografa recomendadaAlberts, A. 1996. La clula. Ediciones Omega, Barcelona, Espaa. pg. 155.Celis, J. 1994. Cell biology. A laboratory hanbook. Academic press, Inc. 2: 515.Gerhardt, P., et al. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology.Washington, D.C., USA. pp. 1418.Wilson, G. y Morrison, J. 1991. Citologa. CECSA. Mexico, D.F., Mxico. pg. 296307.

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