Microscopia L'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del: Microscopio ottico...
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MicroscopiaL'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del:Microscopio otticoMicroscopio elettronico
Microscopio ottico: si usa prevalentemente nelle applicazioni di routine
Si utilizzano comunemente vari tipi di microscopi ottici:in campo chiaro, in campo scuro, a contrasto di fase e a fluorescenza.
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Microscopio in campo chiaro
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Ingrandimento: prodotto degli ingrandimenti rispettivamente degli obiettivi e degli oculari Valore massimo di ingrandimento: 1500 volte.
Risoluzione: capacità di distinguere due punti adiacenti come distinti e separati. E' di 0,2 μm con illuminazione a luce bianca
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Obiettivi a seccoObiettivi ad immersione (per maggiori ingrandimenti) Olio (di legno di cedro- di vaselina): ha lo stesso indice di rifrazione del vetro.
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Microscopio a contrasto di faseParticolarmente utile per lo studio delle cellule viventi
Principio:quando i raggi luminosi attraversano un corpo trasparente alcuni di essi vengono ritardati causa della differente densità delle diverse zone dello stesso: il ritardo corrisponde a circa ¼ della lunghezza d'onda (tali raggi si trovano fuori fase rispetto agli altri raggi luminosi)
Tali differenze di fase sono trasformate in differenze di intensità luminosa
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Spirillum volutans
Clostridium botulinum
Paramecium
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Microscopio in campo oscuroIl campione appare luminoso mentre il campo appare oscuro
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Treponema pallidum
Volvox e Spirogyra
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Microscopio a fluorescenzaPrevede l'impiego di sostanze fluorescenti che assorbono le onde ultraviolette e le rimettono sotto forma di onde luminose visibili di lunghezza d'onda maggiore
I microrganismi trattati con un colorante fluorescente appaiono come corpi colorati e brillanti su di un fondo oscuro
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Preparati per l'osservazione al microscopio ottico in campo chiaro
1-Osservazione a fresco. Osservazione del microrganismo vitale Si sospende il campione in una goccia di acqua e si osserva fra due vetrini
L'osservazione a fresco è preferibile quando: - si osservano i batteri a spirale - si osservano i microrganismi mobili (a goccia pendente su cellula di Koch)
Metodo valido per l'osservazione dei microrganismi di maggiori dimensioni come funghi e protozoi
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2- Osservazione mediante colorazione Le cellule sono meglio visibili Si può studiare la diversa affinità dei batteri ai vari coloranti
Colorante:sale che per idrolisi si scinde in anioni e cationi A- Colorante basico: lo ione colorante porta la carica positiva B- Colorante acido: lo ione colorante porta la carica negativa C- Colorante neutro: sale complesso di un acido colorante con una base colorante
Coloranti derivati dall'anilina: A- basici: blu di metilene, violetto di genziana, cristalvioletto, fucsina basica B- acidi: eosina, rosso congo, fucsina acida C- neutri: eosinato blu di metilene
La cellula batterica ha affinità per i coloranti basici che si legano ai gruppi fosforici degli acidi nucleici con carica negativa.
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Mordenzanti: favoriscono l'attecchimento del colore all'interno della cellula es. acido fenico, soluzione iodo-iodurata (Liquido di Lugol)
Differenziatori: sono sostanze decoloranti es. alcool etilico assoluto
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Allestimento del vetrino
Distensione: del materiale sul vetrinoEssiccamento: a temperatura ambienteFissazione: - rende il materiale aderente al vetrino - rende inalterabili la forma della cellula e degli elementi morfologici - rende la cellula più permeabile ai coloranti
Fissazione al calore (120°- 130°C) Fissazione con agenti chimici (es. formaldeide, alcool etilico, ecc.)ColorazioneAsciugamentoOsservazione microscopica
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Colorazione semplice
Flambaggio
Distensione
Essiccamento
Fissazione
Cristalvioletto
Lavaggio
Asciugamento
Osservazione
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Colorazione differenziale A- Colorazione di Gram
Mordenzante
Decolorante
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B- colorazione di Ziehl-NeelsenServe per evidenziare i Micobatteri i quali sono difficilmente colorabili con gli altri metodi di colorazione a causa delle particolari caratteristiche della parete cellulare ( alto contenuto in lipidi)
I Micobatteri sono acido-resistenti