Microscopía FTIR: una herramienta valiosa para el … Nacional de Toxicología Madrid, 1 de octubre...
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Instituto Nacional de Toxicología
Madrid, 1 de octubre 2013
Fernando Tobalina
Agilent Technologies
Microscopía FTIR: una herramienta valiosa para el
análisis toxicológico y forense
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Evolución ….
Cuando los equipos parecían a:
Cuando las muestras se preparaban así::
Y los resultados se analizaban en las bibliotecas!!!!….
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Hasta hoy…
En cuanto a los equipos, la Transformada de Fourier revoluciónó la
espectroscopía infrarroja aportando:
• Sensibilidad
• Rapidez
• Precisión
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Librerías
El software actual de los equipos
permite el trasvase automático de los
espectros a las librerías de búsqueda
permitiendo la identificación a los pocos
segundos de la muestra estudiada.
Gracias a los programas de
deconvolución y quimiometría se
puede realizar análisis
multicomponente.
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5
Plataformas ópticas de altas prestaciones
5
Almacenaje de
divisores de haz
Ajuste
rápido de
accesorios
Intercambio
rápido de
detectores
Fuente refrigerada
por aire con retro-
reflector
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6
Alta resolución óptica real: < 0.06 cm-1 no apodizada
Análisis del espectro de CO
Agilent Cary 660 Características
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7
Sensibilidad:
Cuantificación de alcohol en agua por ATR.
Application Note: Quantitative Analysis SI-01374/ Ethanol in Water
Agilent Cary 660 Características
LD % v/v Altura Pico
EtOH/H2O 1045 cm-1
Agilent 660-IR 0.08 4.6 x 10-4 abs
Agilent 670/680-IR 0.04 2.5 x 10-4 abs
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10-3 10-1 10-2
10-2 10-1 10-3 10-4 10-5
1
Segundos Milisegundos
Milisegundos Microsegundos
10-6 10-7 10-8
Minutos ... Rapid-Scan
KINETICS mode Todos los equipos Cary 660 670 y 680
Step-Scan
TRS mode Cary 680
10-9
Nanosegundos
“Rapid-scan Kinetics” vs. “Step-scan TRS”
Rapid-scan Kinetics: Aplicable a reacciones reversibles o irreversibles.
Step-scan TRS: Aplicable solo a reacciones reversibles.
Escala temporal disponible en los FTIR Agilent
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Técnicas de muestreo
Las técnicas de ATR o DRIFTS facilitan enormemente los análisis y eliminan la
necesidad de preparar la muestra.
• Uso más sencillo
• Sin necesidad de manipular la muestra
• Buena resistencia física y química
• Mayor reproducilidad Typic
al R
elat
ive
S/N
(pea
k-p
eak,
5 s
ec)
15,000
5,000
0 Varian
660-IR
Varian
670/680-IR
10,000
Test S/N haz abierto
With ATR
Other
Research
FT-IRs
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Determinación de Asbestos/Amianto por DRA
10
Espectro del amianto blanco
SiO---H 3680 cm-1
+
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October 3, 2013
Confidentiality Label
11
Amianto azul o Crocidolita
Si---O a 770 cm-1
Amianto marrón o Amosita
Si---O a 1080 cm-1
Muestra de cemento
Resultado:
1.7% de amianto blanco
Determinación de Asbestos/Amianto por DRA
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Evolución en el análisis microscópico
12
Diseño único totalmente reflectivo
Optica corregida a infinito
Apertura motorizada transparente
Cámara CCD y binoculares
Objetivo IR de Schwardchild 15x (NA=0.5).
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13
Paint chips. Análisis por reflectancia
Multi-Layered Paint-chip Spectra Before Kramers-Kronig
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Sistemas de muestreo.
• La máxima resolución espacial está limitada a 10-15 micras
• Hay pocas muestras forenses analizables por reflexión
• El análisis por transmisión puede requerir una dificil preparación
de muestra
• La máxima resolución espacial con ATR está limitada al punto de
contacto (30-40 micras)
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Como superar esta limitación?
Linear array
Es necesaria una tipología distinta del detector
respecto de los sistemas clásicos de análisis
puntuales o de mapping.
Focal Plane Arrays
15
•Resuelven solo en parte la limitación en resolución.
•Necesitan habitualmente hacer mapping
•No permiten el uso del ATR
Resuelven casi todas las limitaciones
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Detectores Focal Plane Array FPA
16
Los FPA son detectores derivados
de aplicaciones Militares
derivados de telecámaras
sensibles al calor utilizando
elementos de InSb o MCT
Boeing 737
64 x 64 MCT
FPA de 3ª generación. Mayor
sensibilidad, homogeneidad y
frecuencia de lectura, tiempos
de exposición ajustables, menor
susceptibilidad térmica.
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Medidas puntuales vs. medidas con FPA
Superficie de análisis: Pixels: Tiempos : Resolución espacial:
2-D FPA Infrared Imaging 350 x 350 um (700 x 700 um)* 64x64=4,096 ~1 sec 5.5 um, (11 um)
Single Point Mapping 350 x 350 micras 35 x 35 = 1,225 > 3 horas > 10 micras
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Résolución espacial de 1.1 µm
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Mayor campo de visión
FPA Type Number
of pixels
Spatial Resolution, m (Field of View, m)
Ge - ATR Obj. Trans/Ref
15x Obj
15x Obj with “Field
Expanding Optics”
MIR 16x16 256 1.1 (18) 5.5 (88) 11 (175)
MIR 32x32 1,026 1.1 (35) 5.5 (175) 11 (350)
MIR 64x64 4,096 1.1 (70) 5.5 (350) 11 (700)
MIR 128x128 16,384 1.1 (140) 5.5 (700) -
NIR 128x128 16,384 - 4.1 (525) -
FastIR ATR
• Cristal in ZnSe
• Large aire
• Surface analysable de 6.4 x 9.0 mm (avec FPA
128x128 FPA)
•40 x 70 micron/pixel
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Ejemplo de análisis sobre chips de pintura Objetivo para muestras grandes
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Ejemplo de arañazos de pintura
Bandas a 3696cm-1 y 1055cm-1
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Agilent Workshop SPEC 2012
Para el estudio de muestras biológicas es
recomendable la implementación de un
método objetivo Se puede usar una firma biológica para distinguir entre los diferentes
tipos de tejidos y relacionarlo con el diagnóstico deseado, por ejemplo
una alteración del tejido por un tumor, o la presencia de alteraciones
de distinta naturaleza y generar un método objetivo de diagnóstico
Esa firma bioquímica puede
ser obtenida usando la técnica
de Espectroscopía por
transformada de Fourier (FTIR)
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Análisis de tejidos procedentes de Biopsias
pacientes Tinción tradicional de H&E seguida
de una evaluación subjetiva bajo un
microscopio
Sección de tejidos adjacente SIN
TINCION NI MARCAJES usada
para análisis por FTIR de imagen
seguida de un algoritmo cluster
objetivo supervisado o no
supervisado
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Imagen FTIR de un Micro Array de tejidos
(Procedentes de biopsia tejido por aguja)
Desde la recogida del dato hasta la
clasificación en tan solo 8 min.
Los colores son falsos simulando la
tinción H&E para mantener la familiaridad
para los patólogos
~2 cm
~3
cm
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2.2 mm
1.4
mm
Hippocampus section: normal 5 month old mouse, on MirrIR slide (Keveley)
Data kindly provided by Prof. Kathy Gough and Alex Kuzyk, U. Manitoba, Winnipeg, Canada.
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64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
64 × 64
2.2 mm
1.4
mm
4 × 6 mosaic of 64 × 64 FPA
= 98,304 spectra!
Large area tissue analysis
Data kindly provided by Prof. Kathy Gough and Alex Kuzyk, U. Manitoba, Winnipeg, Canada.
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Tissue visualization options
Area of C=O at 1734 cm-1 Area of C=O at 1734 cm-1 Area of C=O at 1734 cm-1 Area of C=O at 1734 cm-1
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4000 3000 2000 1000
0.9
0.6
0.3
0.0
Wavenumber (cm-1)
Ab
sorb
ance
White matter
Significant spectral differences
NH & OH stretch
CH stretch
C=O stretch
Amide I
Amide II
Phospholipids & carbohydrates
Tissue interpretation
4000 3000 2000 1000
0.9
0.6
0.3
0.0
Wavenumber (cm-1)
Ab
sorb
ance
Neuron
4000 3000 2000 1000
0.9
0.6
0.3
0.0
Wavenumber (cm-1)
Ab
sorb
ance
Neuropil
4000 3000 2000 1000
0.9
0.6
0.3
0.0
Ab
sorb
ance
White matter
Neuropil
Neuron
Wavenumber (cm-1)
Changes in CH2 and CH3 peaks illustrate differences in lipid
content between white matter and grey matter.
White matter consists mostly of myelinated axons – myelin is composed largely of lipid tissue veined with capillaries.
Grey matter consists mostly of neural cell bodies, neuropil, glial cells, and capillaries – contains little lipid.
M. Rak, M. R. Del Bigio, S. Mai, D. Westaway, and K. Gough, Biopolymers 87, (2007).
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Ejemplo: Detección de huellas digitales
En muchas ocasiones las huellas dactilares son dificiles de identificar por los
métodos tradicionales
Los métodos tradicionales= Productos fluorescentes u otros productos químicos
No son siempre aplicables
Suponen riesgo de contaminación de otras pruebas por los reactivos químicos
Regogida con la ayuda
de un gel comercial
BVDA ™
Medida macro ATR
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Imagen Macro ATR de una huella digital
5.0 mm
7.6
mm
3351.670 12.5502927.470 0.116
1643.730 0.159Row = 22 Col = 89
3500 3000 2500 2000 1500 1000
0.15
0.10
0.05
0.00
Wavenumber
Absorb
ance
Imagen creada a partir de la banda de
absorción amida I a 1640 cm-1
correspondiente a absorción por proteínas
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SD00223 MILK-PROTEIN HYDROLYSATE PEPTONE
3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Numero d'onda
Assorb
anza
COCAINE HCl in KBr
3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Numero d'onda
Assorb
anza
Ejemplo de detección
October 3, 2013 31
COCAINA
ATR FTIR imaging in forensic science, Agilent
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Trazas de explosivos en la huella digital
a: Huella contaminada con
explosivo PETN
b: localización de los píxels tras
comprobación con la librería de
espectros=espectro PETN
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¿Preguntas?