Microorganismos extremófilosDr. J.V. Sinisterra

Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy

Universidad Complutensewww.biotransformaciones.com

Tabla 1 Tipos de microorganismos extremófilos

AMBIENTE COMPORTAMIENTO PARÁMETRO EJEMPLO ORGANISMO

Temperatura HipertermófiloTermófiloPsicrófilo

Crecimiento > 80ºCCrecimiento 60-80ºCCrecimiento < 15ºC

Pyrolobus fumarii (113ºC)Synechoccus lividisPsychrobacteria (algunos insectos)

Radiación Atomófilos Superior a 6000 rad/hr; 15 Mradtot.

Deinococcus radiodurans

Presión Barófilos Por encima de los gigapascals Sh. Oneidensis, E. coli

Sequedad Xerófilos Ausencia de agua Artemia salina, hongos, etc

Salinidad Halófilos 2-5 M NaCl Halobacteriaceae, D. salina

pH (Acidez/alcalinidad)

AlcalófilosAcidófilos

pH > 9pH < 0

Natronbacterium, B. FirmusCyanadium caldarium (pH 0)

Presión de oxígeno AnaerobioMicroaerófilos”

No tolera O2Tolera bajas [O2]

Methanococcus jannaschiiClostridium

Extremos químicos GasesMetales

Atmosfera pura de CO2Elevadas concentraciones de metales

Cyanidium caldariumFerroplasmic acidarmanus

Total 1,9 x 107 1,2 x 105 0,65

Virus 13 x 104 - 13 x 106 5 x 103 0,04

Archea ?? 500 ??

Bacteria 4 x 104 - 4 x 106 4,8 x 103 0,12

Hongos 1,5 x 106 69 x 103 5

Algas 6 x 104 4 x 104 67

ReinoReinoEspecias Especias EstimadasEstimadas

Especies Especies Conocidas Conocidas

19951995%%

ConocidoConocido

BIODIVERSIDAD

BIODIVERSIDADBiotopoBiotopo

% Microorganismos% Microorganismoscultivablescultivables

Lodos Activos 1 – 15

Agua Marina 0,001 – 0,1

Agua Dulce 0,25

Lagos Mesotrópicos 0,1 – 1

Aguas de Estuario 0,1 – 15

Sedimentos 0,25

Suelo 0,30

Arqueas (Archaea)

Microorganismos primitivos cuyas biomoleculas, enzimas y mecanismo metabólicos son diferentes de los de otros microorganismos

Suelen estar adaptadas a vivir en condiciones extremas de T, pH, salinidad etc

HipertermófilosHalófilosMetanogéncios

Diferencias con los organismos mesófilos1) No tienen triglicéridos en las membranas sino polietersformados por uniones de glicerol y unidades de isopreno

OHO

O

O

OO

O

OO

OO

HO

OO

OH

2) Microorganiosmo acidófilosSulfolobus sp. HO

OH

Paredes celulares con pseudo-peptidoglicanos deNAG beta-1-3 y NAT beta 1,3-resistentes a la lisozima

bacteriana

HO OH

HHO

H

HOHH OH

OHAcetil-CoA via oxidación y no via glicolisis normal

Lactato Acetil-CoA CH3- tetrahidrometopterina

CO2

CO-deshidrogenasa(especifica de arqueas)

2)Metabolismo especial

CO2 + 4H2 CH4 + H2 O Δ Go = -131 kJ/mol

4 CO + 2 H2O CH4+ 3 CO2Δ Go = -220 kJ/mol

4 HCOOH CH4 + 3 CO2 + 2 H2O Δ Go = -319 kJ/mol

CH3-NH2 +HCl CH4 + CO2 + 4 NH4 Cl Δ Go = -230 kJ/mol

2CH3OH CH4 + CO + 2H2O Δ Go = -319 kJ/mol

CH4 -COOH + H2O CH4 + CO2Δ Go = -31 kJ/mol

Microorganismo metanogénicos

Aplicaciones industriales

1.- Arqueas metanogénicas .- producción de metano a partir de residuos urbanos

2.- DNA polimerasas termoestables de Thermus aquaticus para ensayos de PCR

3.- Alcohol deshidrogenasas resistentes a los medios orgánicos. Sulfolobus sulfataricus

4.- Recuperación de metales Ni, Cu, U, Au etc Sulfolobus sp.

Enzimas mas termoestables que las de los mesofilos

1.- Sustitución aminoácidos flexibles (Gly, Ser, Ala etc) por aminoácidos Rígidos (Thr, Val, Pro)

2.- Sustitución de aminoacidos con grupos reactivos Cys (SH), Glu y Asp(COOH), Asn (CONH2) porotros inertes Ala, Leu etc.3.- Tiene una relación Arg/Lys alta lo que permite fuertes interacciones

polares

EXTREMOFILO HABITAT ENZIMA APLICACIONES REPRESENTATIVAS

Termófilo Elevada temperaturaTermófilos moderados (45-65ºC)Termófilo (65-85ºC)Hipertermófilos (< 85ºC)

AmilasasXilanasasProteasasDNA polimerasas

Glucosa, fructora para edulcorantesBlanqueo del papelFermentaciones, detergentesIngeniería genética

Psicrófilo Baja temperatura ProteasasDeshidrogenasasAmilasas

Maduración del queso, producción de lácticosBiosensoresDegradación de polímeros en detergentes

ACIDÓFILO Bajo pH Oxidación de sulfurosConcentrado de calcopirita

Desulfuración del carbónRecuperación de metales

AlcalinófiloHalófilo

Elevado pHElevada salinidad

Celulasas Degradación de polímeros en detergentes

Barófilos Elevada presión Cualquier microorganismo Formació de geles y almidones granulados

Metalófilo Elevada concentración de metal Cualquier microorganismo Bioremediación, biomineralización

Radiófilo Elevados niveles de radiación Cualquier microorganismo Bioremediación contaminación radionuclear???

Microaerofilo Crecimiento en <21% O2

Aplicaciones industriales de enzimas aisladas de microorganismos termófilos

Hipertermófilos

Se conocen como hipertermófilso aquellos microorganismos que crecen por encima de 80ºC.Hay algunos que crecen por enzima de la temperatura de ebullición del agua.-Pyrolobus fumarii 113ºC

Muchos de ellos corresponden al dominio de las Archeas.

Los hipertermófilos se encuentran en entornos terrestres o marinos, siempre que haya agua Caliente v.g. agua calentada por fuentes termales, geisers o volcanes.

El estudio de secuencias 16S rDNA de los hipertermófilso ha demostrado que se encuentran en lo mas profundo de las ramas de la evolución. Son organismos muy primitivos.

Enzimas de hipertermófilos

Hidrolasas.- Pyrobaculum calidifontis y Sulfolobus solfataricus producenCarboxil-esterasas y esterasas termoresistentes.No se han descrito hasta ahora verdaderas lipasas .-selectivas hacia esteres de ácidos grasos

Pyrococcus furiosus es un excelente productor de proteasasSu perfil de actividad es similar al de la subtilisina

P.furiosus, P.horikoskhii y S. sulfataricus producen enzimas sacarolíticasEstan descritas α-amilasa, β-glicosidasa, β- glucosidasa, β-galactosidasa yExo-β-D- glucosaminidasa

Enzimas de hipertermófilos

Alcohol dehidrogenasas.- P. furiosus, S. solfataricus y Aeropyrum pernixSe han descrito como productores de estas enzimasEn concreto la de P. furiosus tiene 234 aminoacidos y presenta similitudes con las ADH de cadena corta (van der Ost ycol 2001)

Este tipo no suele tener una gran estereospecificidad

O

HO

HO

R- 21.8 U/mg

S- 32.3 U/mg

ADH P. furiosus

Enzimas de hipertermófilos

Alcohol dehidrogenasas.- S. solfataricusTiene 347 aminoacidos y es NADH dependiente. Muestra una buena Enantioselectividad en la reducción de cetonas pequeñas (Esposito y col 2002)

Asi la (R,S) 3-metil-butan-2-ona da el alcohol de configuración S, pero nohay una marcada selectividad hacia la configuración del centro que lleva el metilo

O

HO

ADH S. solfataricus

HO

Enzimas de hipertermófilos

En la actualidad se están identificando los genes de los hipertermófilso que producenlas enzimas de interés para expresarlas en E. coli.

Psicrofilos. Organismos cuya T óptima de crecimiento es <15ºC

Psicrotrofos organismos cuya T óptima de crecimiento es de 15 º<T<20ºC

Psicrotolerantes Organismos mesófilos que pueden adaptarse a vivir a bajas. T

Metodologías para aumentar la actividad enzimática en los organismos Psicrofilos

1.- aumentar la concentración intracelular de enzimas.- Psicrotolerantes y psicrotrofos

2.- Fabricando enzimas cuya actividad es casi independiente de T. ΔG ≈ 0

3.- Fabricando enzimas muy específicas y de elevado turnover

α-amilasa T(ºC) K(s-1) ΔG≠

(kJ/mol)ΔH≠

(kJ/mol)ΔS≠

(J/mol x K)

A.halophantis(psicrof)

15 187 58 71 46

B. amyloliquefaciens 15 34 62 97 122

Subtilisina

B.TA41 (psicrof) 15 25 62 36 -92

B. subtillis 15 5 66 46 -70

La diferencia fundamental es que sus proteínas son muy flexibles para que a bajas T sigan manteniendo la estructura 3D.

Por ello tienen:1)pocos puentes salinos o pares iónicos y por ello la relación (Arg+Lys)/ Lys

es muy baja2) posee pocos enlaces de H. esto hace que se pierdan los contactos

entre los barriles β. Tienen además pocos aminoácidos tipo Ser, Thr, Asn, Gln

3) tienen pocas interacciones de stacking entre anillos aromáticos Tyr, Phe y Trp.4) tiene pocas interacciones bipolares entre C=O y NH en las hélices – α5)sus proteínas tienen poca afinidad por iones estabilizadores de estructuras

tales como Ca(II)6)sus superficies son muy hidrófobas dando valores anormales de pI7) su interior es mas hidrófilo que en los mesofilos pro lo que hace que sedesnaturalicen por el agua.

La Ingeniería de los Procesos Enzimáticos- aplicación a enzimas de termófilosLa Ingeniería de los Procesos Enzimáticos- aplicación a enzimas de termófilos

BÚSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS MÁS EFICIENTESCLONAJE E HIPEREXPRESIÓNMUTACIÓN (PURIFICACIÓN, PROPIEDADES…)MEJOR PROTOCOLO DE PURIFICACIÓNPROTOCOLOS MUY SENCILLOS DE INMOVILIZACIÓN + ESTABILIZACIÓNINGENIERÍA MICROSCÓPICA DEL CATALIZADORINGENIERÍA DE LA REACCIÓNINGENIERÍA DEL REACTOR

RESULTADOS PODRIAN SER ESPECTACULARES

INGENIERIA ENZIMÁTICA COMO INGENIERIA MULTIDISCIPLINAR Y COMPLEJA: NUEVAS POSIBILIDADES EN TECNOLOGIAS DE ALIMENTOS

ENZIMASENZIMASENZIMAS

Biodiversidad Súper-producciónAlteración de la secuencia

de aminoácidos 3D

NUEVOS YMEJORES ENZIMAS

NUEVOS YMEJORES ENZIMAS

MICROBIOLOGÍAMICROBIOLOGÍA BIOLOGÍA MOLECULARBIOLOGÍA MOLECULAR

DNA RECOMBINANTE PCR

Aplicación a la QUIMICA ORGANICA

ENZIMAS DE TERMÓFILOS

““criterio de seleccicriterio de seleccióón naturaln natural””: eficacia biol: eficacia biolóógica gica a altas temperaturasa altas temperaturas

producto de la evoluciproducto de la evolucióón natural: enzimas n natural: enzimas termotermo--resistentesresistentes

criterio seleccicriterio seleccióón natural = criterio seleccin natural = criterio seleccióón industrialn industrial

enzimas muy minoritariaslos microorganismos extremófiloscrecen muy lentamente

Clonación, súper expresión en microorganismos hospedadores adecuados

Microorganismos Termófilos: Viven a Altas TemperaturasMicroorganismos Termófilos: Viven a Altas Temperaturas

ENZIMAS TERMORRESISTENTESENZIMAS TERMORRESISTENTES

PROCESOS A ALTA TEMPERATURA(prevención de contaminaciones, economía del proceso)PROCESOS A ALTA TEMPERATURA(prevención de contaminaciones, economía del proceso)

Microorganismos termófilosMicroorganismos termófilos Enzima minoritariaDifícil de crecer en fermentadores

industriales

Enzima minoritariaDifícil de crecer en fermentadores

industriales

Clonación e hiperexpresión en microorganismos mesófilos hospedantes fáciles de manejar

Clonación e hiperexpresión en microorganismos mesófilos hospedantes fáciles de manejar

BIOLOGIA INDUSTRIA

ENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOSENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOS

ClonajeClonaje, s, súúperper--expresiexpresióónn

Nuevas EnzimasNuevas Enzimas

Homología conenzimas conocidas

Bibliotecade

Secuencias

AmplificaciónDNA

(PCR)

ExtracciónDNA

mRNA

SuelosAguas TermalesAguas de Dorsales

Marinas

Aprovechamiento de evoluciAprovechamiento de evolucióón natural n natural –– TERMTERMÓÓFILOSFILOS

UtilizaciUtilizacióón directa de DNA ( organismos difn directa de DNA ( organismos difííciles de identificar)ciles de identificar)

Mejora por evoluciMejora por evolucióón dirigidan dirigida

Estructura 3D ( Rayos X, modelos matemEstructura 3D ( Rayos X, modelos matemááticos... )ticos... )

Mejora por Mejora por mutagmutagéénesisnesis dirigidadirigida

ENZIMAS INDUSTRIALESENZIMAS INDUSTRIALES

Actividad y selectividad substratos naturalesActividad y selectividad substratos naturalesEstabilidadEstabilidad

Las enzimas deben ser purificadasLas enzimas deben ser purificadas

Alta actividad volumAlta actividad voluméétricatrica

Enzimas puras

Problemas de alergenicidad (solubles)

Ausencia de reacciones laterales catalizados por otras enzimas

contaminantes (oxidaciones, hidrólisis, proteasas solubles o inmovilizadas)

Máxima capacidad de carga de los derivados inmovilizados

Enzimas inmovilizadas y estabilizadasEnzimas inmovilizadas y estabilizadas

Re-uso

Reactores en continuo para tratamiento de grandes volúmenes de sustrato

La enzima no se libera al alimento

(posibilidad de utilizar un mayor número de enzimas)

Derivados inmovilizados y estabilizados para su uso por prolongados periodos de

tiempo

tecnología y economía

Purificación de enzimas industriales mediante procesos cromatográficosPurificación de enzimas industriales mediante procesos cromatográficos

ESTE MÉTODO DE PURIFICACION PUEDE SER:

a). Muy eficiente y útil a escala laboratorio

b). Deberían ser muy útiles a escala industrial pero necesitan simplificarse y optimizarse

Adsorción Selectiva de Enzimas Grandes Sobre Soportes Iónicos Poco ActivadosAdsorción Selectiva de Enzimas Grandes Sobre Soportes Iónicos Poco Activados

Adsorción de enzimas grandes y pequeñas

Adsorción de enzimas grandes y pequeñas

Adsorción selectiva de enzimas grandes Adsorción selectiva de enzimas grandes

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Act

ivid

ad (%

)

0

20

40

60

80

100

Prot

eina

s (%

)

Grado de aminación del soporte (µmols)

Desorción de la β-galactosidasas de Thermus sp. T2, Adsorbida a Soportes MANAE de Diferente Grado de Activación

Desorción de la β-galactosidasas de Thermus sp. T2, Adsorbida a Soportes MANAE de Diferente Grado de Activación

PesselaPessela y col. y col. J. Chromatgr. AJ. Chromatgr. A, 1034, (2004), 155, 1034, (2004), 155--159159. .

AnAnáálisis por filtracilisis por filtracióón en gel de las proten en gel de las proteíínas del extracto crudo de nas del extracto crudo de E. coliE. coliadsorbidas a soportes MANAEadsorbidas a soportes MANAE--agarosa con diferente grado de activaciagarosa con diferente grado de activacióónn

Volumen de Elución (mL)

Prot

eína

s (µ

g/m

l)

0

2

4

6

8

10

12

50 60 70 80 90 100 110

ProteProteíínas adsorbidas a nas adsorbidas a MANAE altamente activadoMANAE altamente activado

ProteProteíínas nas adsorbidas adsorbidas

a MANAE 1 a MANAE 1 μμmolmol/g /g

Purificación de Enzimas Multiméricas de Microorganismos Termófilos Clonadas en Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco ActivadosPurificación de Enzimas Multiméricas de Microorganismos Termófilos Clonadas en

Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco Activados

0

2

4

6

8

10

12

45 55 65 75 85 95 105

Volumen de elución (mL)

Prot

eina

s (u

gr /m

L)

- Se eliminan las proteínas de elevado peso molecular del organismo mesófilo

- La proteína de mayor peso molecular se mantiene intacta (nuestro interés)

PesselaPessela y col. y col. Biotechnol. Biotechnol. ProgrProgr. 20, (2004), 1507. 20, (2004), 1507--15111511

Análisis por Filtración en Gel de PROTEINAS de Microorganismos TermófilosClonadas en Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco Activados

α-galactosidasa

1 2 3 4

9467

43

30

20

1- Patrón de PM

2- Extracto crudo

3- Proteínas tras choque térmico

4- Proteínas adsorbidas a soportescon baja densidad de grupos

1- Patrón de PM

2- Extracto crudo

3- Proteínas tras choque térmico

4- Proteínas adsorbidas a soportescon baja densidad de grupos

Purificación de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 Clonada en E. coliPurificación de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 Clonada en E. coli

PesselaPessela y col. y col. J. J. ChromatogChromatog. A. A, 1055, (2004), 93, 1055, (2004), 93--9898

ENZIMAS DE TERMOFILOS

Elevada estabilidad térmicaElevada estabilidad en presencia de codisolventes orgánicosTemperatura óptima elevadaBaja actividad a temperaturas moderadas

Esterasa de Bacillus stearothermophilusCatecol 2,3 dioxigenasa de Bacillus stearothermophilusAlfa y beta galactosidasa de Thermus sp.Xilanasa de Thermotoga maritima

ESTERASA DE B. stearothermophilus

Temperatura óptima del microorganismo: 60ºCTemperatura óptima de la enzima: 62ºCElevada actividad a temperatura moderadaAmplia especificidad

30

95

0

20

40

60

80

100

60

95

0

20

40

60

80

100

Act

ivid

ad R

esid

ual,

(%)

Act

ivid

ad R

esid

ual,

(%)

Act

ivid

ad R

esid

ual,

(%)

Act

ivid

ad R

esid

ual,

(%)

30% 30% propanolpropanol 500 500 mMmM ClNaClNa

Efecto de Efecto de coco--disolventesdisolventes Efecto de la fuerza iEfecto de la fuerza ióónicanica

ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE B. B. stearothermophilusstearothermophilusEN MEDIOS DESFAVORABLESEN MEDIOS DESFAVORABLES

XY OH

OHZ Z COOHCH

O

XOHY

CatecolCatecol 2,3 2,3 dioxigenasasdioxigenasas

CatecolCatecolSemialdehidoSemialdehido

22-- hidroximuchidroximucóóniconico

CatecolCatecol 2,3 2,3 dioxigenasadioxigenasa de de B. B. stearothermophilusstearothermophilus

EstabilidadEstabilidad ttéérmicarmica elevadaelevada ( ( microorganismomicroorganismo crececrece a 55a 55ººC )C )

Enzimas multimEnzimas multimééricasricasCentro Centro catalcatalííticotico con un con un grupogrupo Fe Fe 2+2+ no no hemohemoMuyMuy inestablesinestablesPosibilidadPosibilidad de ser de ser utilizadasutilizadas

en en ssííntesisntesis de de piridinaspiridinas complejascomplejasEE

0

25

50

75

100

0 25 50 75 100A

ctiv

idad

Act

ivid

adR

esid

ual,

(%)

Res

idua

l, (%

)

EFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUALEFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUALEN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN EN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN

CONDICIONES DESFAVORABLESCONDICIONES DESFAVORABLES

0

25

50

75

100

0,00001 0,001 0,1 10 1000Act

ivid

adA

ctiv

idad

Res

idua

l, (%

)R

esid

ual,

(%)

[[catecolcatecol mMmM]]TemperaturaTemperatura

pH 7, 40pH 7, 40ººCC pH 7, 0.1 pH 7, 0.1 mMmM catecolcatecol

XILANASA DE XILANASA DE ThermotogaThermotoga maritimamaritima

Temperatura crecimiento, 80ºCEnzima muy termoestableMáximo de actividad 105ºCVida Media a 100ºC aproximadamente 10 minutos

Un buen modelo para estudiar la degradaciUn buen modelo para estudiar la degradacióón qun quíímica mica de protede proteíínas correctamente plegadas nas correctamente plegadas

EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD DE LA XILANASA DE T. maritima

Vida

med

ia (m

in)

T, (ºC)

0,01

0,1

1

10

100

1000

10000

95 105 115 125

pH 7

EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD DE LA XILANASA DE T. maritima

Vida

med

ia (m

in)

T, (ºC)

0,01

0,1

1

10

100

1000

10000

95 105 115 125

pH 7

INMOVILIZACIÓN Y ESTABILIZACIÓN DE LA ß-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2.

Enzima tetramérica de elevado peso molecularAltamente termorresistenteActiva y estable en un amplio rango de pH.

Potencialmente útil para hidrolizar lactosa en leche y en sueros de quesería a alta temperatura

INMOVILIZACIÓN MULTIPUNTUAL CON DIFERENTE ORIENTACIONES SOBRE SOPORTES EPÓXIDO

Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas

Inmovilización Multipuntual de Enzimas Sobre Soportes Epóxido

Muy estables: transporte Pueden reaccionar con distintos nucleofilos de la enzima:

inmovilización multipuntual muy favorable Facilidad del bloqueo de epóxidos remanentes

Muy poco reactivos: velocidad de inmovilización extremadamente lentaPosibilidad de modular la enzima sobre el soporte

H2N

HS

HO

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Derivado no estabilizado Derivado no estabilizado

Detección de subunidades enzimáticas no unidas al soporte vía epóxido.DetecciDeteccióón de subunidades enzimn de subunidades enzimááticas no unidas al soporte vticas no unidas al soporte víía epa epóóxido.xido.

+SDS-PAGESDS-PAGE

derivado estabilizadoderivado estabilizado

Mecanismo de Estabilización de Enzimas

SDS Mercaptoetanol, 100ºC

++

Estabilización del Derivado Boronato por Entrecruzamiento con Dextrano Aldehído pH 6,5 70 ºC

1 Patr1 Patróón de peso molecularn de peso molecular2 Derivado boronato sin entrecruzar2 Derivado boronato sin entrecruzar3 Derivado boronato entrecruzado3 Derivado boronato entrecruzado

ββ-- galactosidasagalactosidasade de ThermusThermus sp. T2sp. T2

11 22 33

9797000000

4500045000

3000030000

2010020100

6600066000

1440014400

Act

ivid

ad re

sidu

al,(%

)A

ctiv

idad

resi

dual

,(%)

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

Tiempo (horas)Tiempo (horas)

derivado boronato entrecruzadoderivado boronato entrecruzado

ββ--galactosidasa solublegalactosidasa soluble

Pessela y col. Biotechnol. Prog. 20, (2004), 388-392

AdsorciAdsorcióón en ausencia de Imidazoln en ausencia de Imidazol AdsorciAdsorcióón en presencia de Imidazol n en presencia de Imidazol

Las proteLas proteíínas de elevado peso molecular se pegan mucho mas nas de elevado peso molecular se pegan mucho mas fuertes que las protefuertes que las proteíínas de pequenas de pequeñño peso molecularo peso molecular

AdsorciAdsorcióón de proten de proteíínas sin colas de Polinas sin colas de Poli--HisHis sobre soportes quelatos altamente activadossobre soportes quelatos altamente activados

Adsorción de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 clonada en E. coli á soportes IMAC altamente activados

Pessela Pessela y col. y col. EnzymeEnzyme MicrobialMicrobial TechnolTechnol. 39, (2006), 909. 39, (2006), 909--915915..

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 500

20

40

60

80

100

Act

ivid

ad r

esid

ual ,

%

Prot

eína

s ad

sorb

idas

,%

[Imidazol, mM]

Proteínas totales

Actividad α-galactosidasa

Efecto del Imidazol en la adsorción de la α-galactosidasa y de otras proteínas de E. coli

Grado de activaciGrado de activacióón del soporte: 115 n del soporte: 115 μμMM de quelatos /g de soportede quelatos /g de soporte

9467

43

31

21

1 2 3

9467

43

31

21

1 2 3

LMW (kDa)

PurificaciPurificacióón de la n de la αα-- y y ββ--galactosidasas de galactosidasas de ThermusThermus sp. T2 clonadas en sp. T2 clonadas en E. coliE. coli

1.1.-- Choque tChoque téérmicormico2.2.-- AdsorciAdsorcióón selectiva a soporte IMAC muy activados en presencia de 50 mM dn selectiva a soporte IMAC muy activados en presencia de 50 mM de imidazoe imidazo

α-galactosidasa

Adsorción de la α- y β-galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli ásoportes IMAC altamente activados

LMW (kDa)

1- PM; 2- Extracto crudo; 3- enzima purificada

PesselaPessela y col. y col. EnzymeEnzyme MicrobialMicrobial TechnolTechnol. (In . (In presspress).).

β-galactosidasa

Purificación-Inmovilización-Estabilización de la α- y β-galactosidasasde Thermus sp. T2 sin Poli-His, adsorbidas a soportes IMAC muy activados

PesselaPessela y col. y col. EnzymeEnzyme MicrobialMicrobial TechnolTechnol. (In . (In presspress))

Condiciones de inactivaciCondiciones de inactivacióón: pH 7, 70n: pH 7, 70ººCC

Inactivación Térmica de los Derivados de la α- y β-galactosidasas

β-galactosidasaα-galactosidasa

0

20

40

60

80

100

0 10 20 300

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Sepabeads-EB-IDA-Ni

Soluble

Tiempo (h)

Act

ivid

ad re

sidu

al, (

%)

Sepabeads-EB-IDA-Ni

Soluble