Microinmultirea plantelor

7/18/2019 Microinmultirea plantelor

1/251

Florin Stnic

Micronmulirea

plantelor horticole

Editura INVEL-MultimediaBucureti, 2004


2/251

Refereni tiinifici: Prof. univ. dr. Corneliu Petrescu

Prof. univ. dr. Alexandru Teodorescu

2004 Versiune electronic INVEL-MultimediaToate drepturile rezervate.

Nici un fragment din aceast publicaie nu poate fi reprodus, stocat ntr-unsistem de recuperare a informaiilor sau transmis sub orice form sau prinorice mijloace electronice, mecanice, fotocopiere, nregistrare sau de altnatur, fr permisiunea prealabil, n scris, a editurii i autor ului .

INVEL-Multimedia din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRLstr. Fabrica de Chibrituri nr. 24-26, sector 5, BucuretiTel./Fax: 021/430.35.42, e-mail: [email protected]

Colecia www.teze_de_doctorat.ro

ISBN 973-7753-07-0


3/251

Dedic aceast lucrarestudenilor i colaboratorilor mei


4/251

4

Cuvnt nainte

ntr-o er n care progresul tiinei i tehnicii a dus omul n cosmos, n adncurileoceanului, i-a permis s ating viteze supersonice i s dezvolte inteligena artificial, culturilein vitro de celule i esuturi vegetale au aprut, au evoluat i s-au dezvoltat n acelai ritm.

Ptrunderea n universul celulei, n intimitatea proceselor fiziologice i manipulareamaterialului genetic sunt realizri comparabile cu cele prezentate mai sus, avnd aceeaiimportan pentru umanitate.

Suntem n prezent n plin revoluie biotehnologic, materializat printr-un volumimens de aplicaii practice ale culturilorin vitro n domeniul tiinelor agricole, biologice,medicale, n farmacologie i industria alimentar, n industria cosmetic, a coloranilor naturalii a substanelor bioactive.

Cercetrile n biotehnologie vizeaz rezolvarea unor probleme majore ale omenirii cumsunt: criza energetic, malnutriia, valorificarea i conservarea resurselor genetice, reciclareamateriei organice, luarea n cultur i valorificarea terenurilor degradate, reducerea poluriimediului nconjurtor.

Aprut dintr-o necesitate obiectiv, lucrarea Micronmulirea plantelor horticole,aflat la a doua ediie, actualizat i completat, trateaz un domeniu care st la baza oricruitip de producie agricol: obinerea de material sditor i semincer cu nalt valoare biologic.

Conceput ca un instrument de lucru, Micronmulirea plantelor horticole face n prima parte, o prezentare ampl a dotrilor laboratorului de culturiin vitro ., o trecere n revista componentelor mediilor de cultur, pentru a insista n continuare, asupra modului de preparare i sterilizare a acestora.

Un capitol aparte este destinat sterilizrii i asepsiei n culturilein vitro .Materialul abund n informaii utile, tabele ajuttoare, scheme de lucru i fotografii

sugestive, utile organizrii activitii n domeniul culturilorin vitro .n a doua parte a lucrrii, sunt prezentate pe larg principalele tehnici folosite pentru

micronmulirea plantelorin vitro . Sunt prezentate, n tabele sintetice, rezultatele cercetrilor pe tipuri de culturi, la principalele specii horticole.


5/251

5

Sunt prezentate, de asemenea alte tehnici de culturin vitro cu aplicabilitate n

ameliorarea plantelor horticole, conservarea resurselor genetice, fitopatologie. O noutate nliteratura de specialitate romneasc este capitolul referitor lababy plant , o gam de produsedecorative obinutein vitro i deosebit de apreciate pe pia.

Lucrarea se nscrie pe linia continurii tradiiei nvmntului horticol bucuretean ndomeniul biotehnologiilor aplicate n horticultur i este un instrument util la ndemnaspecialitilor, cadrelor didactice, studenilor, cercettorilor i tuturor celor care activeaz nacest domeniu de vrf al tiinei.

Adresez cu aceast ocazie mulumiri, colaboratorilor mei, ef lucrri dr. MonicaDumitracu, ef lucrri dr. Adrian Peticil, drd. ing. Oana Diaconescu i drd. ing. RuxandraGl, referenilor tiinifici i Editurii INVEL-Multimedia.

Tuturor celor care se vor apleca asupra acestei lucrri, o vor studia i analiza critic, leadresez mulumirile mele i invitaia de a ne transmite opiniile lor la [email protected], ajutndu-ne astfel, s mbuntim ediiile viitoare.

Bucureti, august 2004

Conf. univ. dr. Florin STNIC


6/251

6

CUPRINS

CAPITOLUL 1. Istoricul culturilorin vitro

CAPITOLUL 2. Laboratorul de culturiin vitro 2.1. Aspecte generale2.2. Zona nesteril

2.2.1. Camera de pstrare i pregtire a materialului vegetal2.2.2. Magazia de materiale2.2.3. Magazia de substane chimice2.2.4. Camera pentru pregtirea mediilor de cultur2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultur i

presterilizarea materialului vegetal2.2.6. Magazia pentru medii de cultur2.2.7. Camera de cretere2.2.8. Camera (spaiile) de aclimatizare2.2.9. Sera i solariile2.2.10. Spltorul

2.3. Zona steril

CAPITOLUL 3. Mediile de cultur i prepararea lor.3.1. Constitueni cu rol nutritiv

3.1.1. Constitueni minerali3.1.1.1. Macroelementele3.1.1.2. Microelementele

3.1.2. Constitueni organici3.1.2.1. Carbohidr aii3.1.2.2. Aminoacizii3.1.2.3. Vitaminele

3.2. Constitueni cu rol fitoregulator. 3.2.1. Auxinele3.2.2. Citochininele3.2.3. Giberelinele3.2.4. Alte substane cu rol fitoregulator

3.3. Constitueni cu rol stabilizator.3.3.1. Apa

3.3.2. Agenii de solidificare3.3.3. Stabilizatorii osmotici i de pH3.3.4. Substanele antioxidante i absorbante

3.4. Concentraii. Prepararea soluiilor stoc.3.5. Prepararea mediului de cultur3.6. Probleme care apar la pregtirea i folosirea mediilor de cultur.

CAPITOLUL 4. Sterilizarea i asepsia n culturilein vitro .4.1. Ageni sterilizani4.2. Sterilizarea vaselor de cultur i a instrumentarului folosit

4.2.1. nchiderea vaselor de cultur4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultur4.2.3. Sterilizarea instrumentarului


7/251

7

4.3. Sterilizarea mediului de cultur i a apei4.4. Dezinfectarea materialului vegetal4.5. Contaminrile i detectarea lor

CAPITOLUL 5. Micronmulirea plantelor horticole5.1. Consideraii generale5.2. Fazele micronmuliriiin vitro

5.2.1. Pregtirea materialului vegetal5.2.2. Iniierea i stabilizarea5.2.3. Multiplicarea5.2.4. nrdcinarea5.2.5. Aclimatizarea

5.3. Cultura de meristeme i apexuri5.3.1. Clasificarea meristemelor5.3.2. Cultura de meristeme5.3.3. Cultura de apexuri

5.4. Cultura de fragmente uninodale5.5. Cultura de lstari axilari

CAPITOLUL 6. Devirozarea plantelor horticole prin culturiin vitro 6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme6.2. Microaltoirea

6.2.1. Microaltoireain vitro6.2.2. Microaltoireain vivo 6.2.3. Microaltoireaex vitro

6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehniciin vitro

CAPITOLUL 7. Organogenezain vitro 7.1. Organogeneza direct

7.1.1. Organogeneza adventiv de lstari7.1.2. Organogenezaadventiv de rdcini

7.2. Organogeneza indirect

CAPITOLUL 8. Embriogeneza somatic8.1. Formarea embrionilor somatici8.2. Embriogeneza somatic direct

8.3. Embriogeneza indirect8.4. Poliembrionia nucelar8.5. ncapsularea materialului vegetalin vitro

8.5.1. Smna sintetic8.5.2. ncapsularea unor organe i esuturiin vitro

CAPITOLUL 9. Embrioculturain vitro la plantele horticole

CAPITOLUL 10. Producerea haploizilor10.1. Aspecte generale10.2. Androgenezain vitro

10.3. Fecundareain vitro


8/251

8

CAPITOLUL 11. Cultura de calusin vitro .11.1. Cultura de calus11.2. Cultura de protoplati i hibridarea somatic11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singur celul

CAPITOLUL 12. Baby plant12.1. Consideraii generale12.2. Tipuri de produse i materiale folosite la producerea de baby plant

12.2.1. Vase din sticl12.2.2. Alte materiale

12.3. Folosirea mediilor de cultur colorate

BIBLIOGRAFIE SELECTIV


9/251

9

CONTENTS

CHAPTER 1. History of in vitro cultures

CHAPTER 2. In vitro culture laboratory2.1. General aspects2.2. Unsterile area

2.2.1. Biological material preparation room2.2.2. Materials storage room2.2.3. Chemical storage room2.2.4. Culture media preparation room2.2.5. Culture media and biological material sterilization room2.2.6. Culture media storage room2.2.7. Growth chamber2.2.8. Acclimation room2.2.9. Greenhouse and tunnels2.2.10. Washing room

2.3. Sterile area

CHAPTER 3. Culture media and their preparation3.1. Nutrients

3.1.1. Mineral compounds3.1.1.1. Macro elements3.1.1.2. Microelements

3.1.2. Organic compounds

3.1.2.1. Carbohydrates3.1.2.2. Amino acids3.1.2.3. Vitamins

3.2. Growth regulators3.2.1. Auxins3.2.2. Cytokinins3.2.3. Giberellins3.2.4. Other growth regulators

3.3. Stabilization compounds3.3.1. Water3.3.2. Gelling compounds

3.3.3. Osmotic and pH stabilizers3.3.4. Antioxidants and absorbents3.4. Concentrations. Preparation of stock solution.3.5. Culture medium preparation3.6. Problems connected to the culture media preparation and use

CHAPTER 4. Sterilisation and asepsis for in vitro cultures4.1. Sterilising agents4.2. Culture vessels and tools sterilisation

4.2.1. Culture vessels closure4.2.2. Culture vessels sterilisation

4.2.3. Tools sterilisation4.3. Culture medium and water sterilisation


10/251

10

4.4. Biological material disinfection4.5. Contamination and their detection

CHAPTER 5. Horticulture plants micropropagation

5.1. General aspects5.2. In vitro micropropagation stages

5.2.1. Biological material preparation5.2.2. Initiation and stabilisation5.2.3. Multiplication5.2.4. Rooting5.2.5. Acclimatisation

5.3. Meristem and apex culture5.3.1. Meristem classification5.3.2. Meristem culture5.3.3. Apex culture

5.4. Single node culture5.5. Axillary shoots culture

CHAPTER 6. Horticultural plants virus elimination using in vitro cultures6.1. Virus elimination using meristem cultures6.2. Micrografting

6.2.1. In vitro micrografting6.2.2. In vivo micrografting6.2.3. Ex vitro micrografting

6.3. Virus free plant obtaining using other in vitro techniques

CHAPTER 7. In vitro organogenesis7.1. Direct organogenesis

7.1.1. Adventitious shoot organogenesis7.1.2. Adventitious root organogenesis

7.2. Indirect organogenesis

CHAPTER 8. Somatic embryogenesis8.1. Somatic embryo formation8.2. Direct somatic embryogenesis8.3. Indirect somatic embryogenesis

8.4. Nucellar poliembriony8.5. In vitro encapsulation of biological material8.5.1. Synthetic seed8.5.2. In vitro encapsulation of tissues and organs

CHAPTER 9. In vitro embrioculture in horticultural plants

CHAPTER 10. Haploid production10.1. General aspects10.2. In vitro androgenesis10.3. Test-tube fertilisation


11/251

11

CHAPTER 11. In vitro callus culture11.1. Callus culture11.2. Protoplast culture and somatic hybridisation11.3. Plant regeneration from a single cell

CHAPTER 12. Baby plant12.1. General considerations12.2. Products and materials used for baby plant production

12.2.1. Glass ware12.2.2. Other materials

12.3. Use of coloured culture media

SELECTIVE REFERENCES


12/251

12

Capitolul 1

Istoricul culturilorin vitro

Cultivareain vitro a unor celule i esuturi vegetale este o ramur a tiinelor biologice ale cror nceputuri corespunde cu nceputul secolului XX.

Evoluia sa de-a lungul timpului a fost demn de secolul vitezei astfel nct, naceti ultimi ani, vorbim de un ansamblu de tehnici i metodein vitro grupate generic subnumele de biotehnologii vegetale.

Teoria care a stat la baza acestei tiine a fost lansat ns cu mult timp nainte. n1838, Schleiden i Schwan au afirmat c celulele vegetale sunt, ntr-o oarecare msur,autonome i capabile s regenereze pri din plante sau plante ntregi. Aceast proprietate afost numittotipoten i a reprezentat o adevrat provocare pentru un mare numr deoameni de tiin.

Primele ncercri nereuite de a cultiva esuturi vegetalein vitro s-au datorat luiHaberlandt (1902). Au urmat apoi numeroase tentative care au deschis calea spre tot atteadomenii noi de cercetare.

Abia n 1939, dup descoperirea rolului hormonilor n creterea i dezvoltarea plantelor, Nobecourt, Gautheret i White au obinut primele succese reale prin cultivareainvitro timp de mai multe subculturi a calusului.

Dup al doilea rzboi mondial, culturilein vitro s-au dezvoltat rapid datoritmultiplelor domenii de aplicabilitate: nmulirea industrial a plantelor, genetic,ameliorarea plantelor, inginerie genetic, conservarea resurselor genetice, produciaindustrial de substane utile. Trebuie adugat i rolul avut n dezvoltarea unor studii de

anatomie i fiziologia vegetal, fitopatologie, etc.Stadiul atins n prezent deschide perspective ample n zorii mileniului III n ceea ce

privete manipularea materialului genetic i dirijarea proceselor de nmulire, cretere idezvoltare a plantelor n vederea obinerii unor noi forme productive.

Speranele umanitii se ndreapt spre gsirea unor soluii pe termen lung pentruasigurarea necesarului de hran pentru o populaie aflat n cretere rapid.

Aceste soluii pot fi cutate n multitudinea de posibiliti pe care biotehnologiilein

vitro le au n ceea ce privete valorificarea superioar a resurselor genetice i modelarea


13/251

13

acestora n folosul omului. Pe lng obiectivul creterii productivitii ecosistemeloragricole, se urmrete obinerea unor plante de cultur care s poat valorifica zoneleneproductive, deertice, srturate, etc.

n acelai timp se are n vedere extinderea i perfecionarea tehnologiilor deobinere a unor noi produse de biosintez, cu aplicabilitate n industria alimentar,farmaceutic, n industria coloranilor, zootehnie.

Cineva spunea parafrazndu-l pe Malraux, c: Secolul XXI va fi un secol al biotehnologiei sau nu va fi deloc.

n tabelul 1.1. sunt prezentate cele mai importante etape din evoluia biotehnologiilor vegetale.

Tabelul 1.1.Istoricul culturilor vegetale in vitro

Anul Ipoteze, teorii, ncercri, realizri Autorii0 1 2

1838 Teoria totipotenei celulare Schleiden iSchwan

1892 Plantele sintetizeaz substane care sunt distribuite polar Sachs1902 Primele ncercri de culturi de esuturi vegetale Haberlandt

1904 Prima ncercare de embriocultur la crucifere Hnnig1909 Prima fuziune de protoplati nereuit Kuster1922 Germinarea seminelor de orhideein vitro n absena

simbionilorKundson

1922 Culturain vitro a apexurilor de rdcin Robbins1925 Embriocultura aplicat n ncrucirile interspecifice la

Linum Laibach

1929 Folosirea embrioculturii pentru nlturareaincompatibilitii la ncruciare

Laibach

1934 Primele ncercri nereuite de cultivare a esutuluicambial la arbori i arbuti

Gautheret

1934 Cultivareain vitro a rdcinilor de tomate White1936 Embriocultura la diferite gimnosperme La Rue


14/251

14

Continuare tabelul 1.1.0 1 2

1939 Creterea timp de mai multe subculturi a calusuluiobinut din esuturi vegetale

Nobecourt,Gautheret, White

1940 Cultivarea esutului cambial deUlmus i studiereaformrii lstarilor adventivi

Gautheret

1941 Folosirea pentru prima dat a laptelui de cocos pentrucultivarea embrionilor de Datura

Van Overbeek

1944 Prima cultur de Nicotiana tabacum pentru studiereaformrii de lstari adventivi (organogeneza direct)

Skoog

1945 Cultura unor specii de Asparagus in vitro Loo1946 Obinerea primelor plante de Lupinus i Tropaeolum Ball1948 Organogeneza direct de lstari i rdcini la tutun sub

influena raportului auxin/adeninSkoog i Tsui

1950 Regenerarea unor organe din calus laSequoia sempervirens

Ball

1952 Obinerea de plante de Dhalia devirozate prin culturi demeristeme

Morel i Martin

1952 Realizarea primelor microaltoiri Morel i Martin1953 Obinerea calusului haploid laGingko biloba din polen Tulecke1954 Obinerea unei plante ntregi dintr-o singur celul Muir i colab.1955 Descoperirea chinetinei Miller i colab.1956 Realizarea primelor culturi celulare n suspensie pentru

obinerea de produi secundariTulecke i Nickell

1957 Descoperirea influenei raportului citochinine/auxineasupra proceselor de organogenez

Skoog i Miller

1958 Regenerareain vitro a unor embrioni somatici din nucella Citrus

Maheshwari iRangaswamy

1958 Regenerarea de pro-embrioni din calus i suspensiicelulare la Daucus carota

Reinert i Steward

1959 Publicarea primei cri privind cultura de celule iesuturi vegetale

Gautheret

1960 Prima polenizarein vitro la Papaver rhoeas Kanta


15/251

15


1960 Degradarea pereilor celulari pentru obinerea protoplatilor

Cocking

1960 nmulirea vegetativ a orhideelor prin culturi demeristeme

Morel

1962 Formularea i publicarea reetei mediului de culturMurashige & Skoog

Murashige & Skoog

1964 Obinerea primei plante haploide din grunciori de polenla Datura

Guha i Maheswari

1964 Regenerarea de lstari i rdcini din calus de Populustremuloides

Mathes

1965 Inducerea nfloririi n esutul de tutun cultivatin vitro Aghion-Prot1967 Inducia floral la Lunaria annua prin vernalizarein vitro Pierik1969 Obinerea plantelor haploide de tutun din grunciori de

polenBourgin i Nitsch

1969 Prima izolare reuit de protoplati din suspensii celularela Hapopappus gracilis

Eriksson i Jonassen

1970 Selecia de mutani obinui cu ageni chimiciin vitro Carlson1970 Obinerea haploizilor la ovz prin embriocultur Kasha i Kao1970 Realizarea cu succes a fuziunii de protoplati Power i colab.1971 Regenerarea primei plante din protoplati Takebe i colab.1972 Realizarea hibridrii interspecifice prin fuziunea de

protoplati la dou specii de Nicotiana Carlson i colab.

1973 Folosirea citochininelor pentru ntreruperea dormansuluila explante de capitul laGerbera

Pierik i colab.

1974 Inducerea lstririi axilare prin folosirea citochininelor ncultura de apexuri la Gerbera

Murashige i colab.

1974 Regenerarea de haploizi din protoplati la Petuniahybrida

Binding

1974 Obinerea de hibrizi prin fuziunea protoplatilor haploizi Melchers i Labib1974 Transformarea genetic n cultura de esuturi vegetale Reinhard


16/251

16


1974 Descoperirea rolului plasmei Ti n formarea tumorilor la Agrobacterium tumefaciens

Zaenen i colab.Larebeke i colab.

1975 Selecia pozitiv n culturi de calus rezistente la Helminthosporium maydis

Gengenbach i Green

1976 Iniierea culturilor din apexuri de lstari crioconservaila garoaf

Seibert

1976 Hibridarea somatic interspecific prin fuziunea de protoplati ntre Petunia hybrida i Petunia parodii

Power i colab.

1977 Integrarea plasmidei Ti de la Agrobacteriumtumefaciens n genomul plantelor

Chilton i colab.

1978 Hibridarea somatic ntre tomate i cartof Melchers i colab.1979 Folosirea co-cultivrii pentru transformarea genetic a

protoplatilor vegetali cu Agrobacterium tumefaciens Marton i colab.

1981 Introducerea termenului de variaie somaclonal Larkin i Scowcroft1982 Introducerea de ADN pur n protoplati. Transformarea

cu ADN izolat devine posibilKrens i colab.

1982 Fuziune de protoplati prin electrostimulare Zimmermann1983 Hibridarea citoplasmatic intergeneric ntre ridiche i

rapiPelletier i colab.

1984 Transformarea celulelor vegetale cu plasmida ADN Paszkowski i colab.1985 Infecia i transformarea discurilor foliare cu

Agrobacterium tumefaciens i regenerarea de plantetransformate

Horsch i colab.

Dup1985

ncepe Era Organismelor Modificate Genetic(OMG)


17/251

17

Capitolul 2

Laboratorul de culturiin vitro

2.1. Generaliti

Activitatea n domeniul culturilorin vitro se desfoar n laboratoare cu structuri dotare specific.

Mrimea acestor laboratoare variaz de la civa zeci de metri ptrai, n cazulstructurilor cu finalitate didactic sau de cercetare, pn la suprafee de mii de metri ptrain cazul complexelor industriale de micronmulire (foto 2.1.).

Foto 2.1. Complexul industrial de micronmulire Vitroplant, Cesena, Italia

Dotarea laboratoarelor difer n funcie de volumul de material biologic care esteinoculat i crescutin vitro . Diferenele se refer n primul rnd la capacitatea unei anumitestructuri din dotare i nu la funciile acesteia.

Una din condiiile eseniale ale realizrii unui laborator este asigurarea curenieiimpecabile. Acest lucru nu se refer doar la pardoseli i perei, dar i la aer. Acesta trebuies fie lipsit pe ct posibil de particule de praf i bine-neles de spori de ciuperci sau particule bacteriene care pot constitui surse de infecie.


18/251

18

Pentru realizarea unei curiri a aerului se recomand folosirea unor instalaii decondiionare prevzute cu filtre de aer eficiente (ex. filtru HEPA). O soluie alternativ ar fifolosirea unor instalaii de condiionare a aerului cu presiune pozitiv care sunt ns ceva

mai costisitoare.O alt grup de faciliti se refer la controlul temperaturii n laborator. Acest

lucru se realizeaz, pentru spaiile comune, prin folosirea instalaiilor de nclzirecontrolat cu diferite tipuri de agent termic.

O atenie deosebit se va acorda ns dirijrii temperaturii n camerele de cretere,n camerele de aclimatizare i n ser. Sistemele care se vor folosi vor fi prevzute cusenzori i sisteme de alarmare n caz de avarie pentru o reducere la minimum posibil riscul

pierderilor.Laboratoarele industriale trebuie prevzute i cu grupuri electrogene care s fac

fa rapid penelor de curent. Nu vor lipsi n orice laborator sistemele de dubl protecie, senzori de gaz, senzori

de temperatur (pentru depistarea incendiilor) i sistemele de alarmare corespunztoare,lmpi de avarie, hidrani, extinctoare etc.

Laboratoarele vor fi dotate cu truse de prim ajutor i cu instruciuni precise

privind acordarea acestuia n caz de arsuri, intoxicaii i alte accidente posibile. Nu n ultimul rnd se vor prevedea sisteme de protecie antiefracie i de protecie

a datelor, informaiilor i tehnologiilor folosite.Laboratoarele de tip industrial (figura 2.2.) au suprafee de lucru mult mai ample,

fa de laboratoarele de cercetare sau didactice i bine-neles, cteva structuricaracteristice.

n toate cazurile suprafaa unui laborator este mprit n dou zone:

- zona nesteril;- zona steril.


19/251

19

camere aclimatizare camertransfer

" "n vivo

camerrepaos

sal deedin

camermedii

camersteril

camerculturi

autoclave

magazie

spltor

camer rece

birou

birou

microscopie

laboratorbiochimie

virusologie

camer am balare

ramp livrare

birou

ser

Figura 2.2. Structura unui laborator industrial de micronmulire

(modificat dup Gamborg, 1995)

2.2. Zona nesteril

Zona nesteril este reprezentat de totalitatea spaiilor n care asepsia nu esteobligatorie. Aceast zon este mprit n mai multe ncperi care vor fi prezentate ncontinuare.

2.2.1. Camera de pstrare i pregtire a materialului vegetal

Pentru pregtirea materialului vegetal n vederea inoculrii este nevoie de oncpere curat, cu perei faianai i pardosii cu gresie. Dotrile obligatorii se refer la apacurent, canalizare i curent electric (220 V, 50 Hz), iar cele opionale la frigidere,dulapuri, mese, etc.

n aceast ncpere, materialul vegetal iniial provenit din cmp sau ser, estesortat, curat (prin splare), fasonat, parafinat, eventual sterilizat superficial prin folosireaunor fungicide i bactericide.


20/251

20

n cazul pstrrii mai ndelungate a materialului vegetal (bulbi, rizomi, tubero- bulbi, tuberculi, smburi, semine, ramuri etc.) acesta este ambalat corespunztor i trecutn frigider la 3-4 C.

2.2.2. Magazia de materiale

n funcie de amploarea activitii desfurate n laborator este necesar existena,n anumite situaii, a unei magazii de materiale.

n aceast magazie se va pstra o gam larg de materiale cum ar fi: sticlria nou,folii din aluminiu, din polietilen, ghivece noi, blocuri de repicat, tifon, vat, ambalaje pentru livrarea materialului vegetal, etichete etc.

2.2.3. Magazia de substane chimice

Substanele chimice folosite pentru prepararea mediilor de cultur, pentrusterilizarea materialului vegetal, spaiilor i instrumentarului se vor pstra ntr-o magaziespecial amenajat n acest scop.

O astfel de ncpere este dotat cu:- rafturi pentru substanele care se pstreaz la temperatura camerei;

- dulapuri pentru pstrarea substanelor la ntuneric;- frigidere i congelatoare pentru pstrarea unor hormoni, vitamine, soluii stoc

etc.- balane i inventar specific: scafe, spatule, vase pentru cntrire etc.Foarte important este ca fiecare recipient cu substane s fie bine nchis, corect

etichetat i asigurat mpotriva rsturnrii, spargerii, deteriorrii, etc.Pentru a uura cutarea unei anumite substane se recomand numerotarea

recipienilor i anexarea pe ua fiecrui dulap sau frigider a unui opis cu numerele deidentificare i coninutul acestora.

n acelai timp, substanele puternic toxice, corozive, cancerigene, inflamabile,ntr-un cuvnt, periculoase, vor fi amplasate separat n locuri marcate corespunztor cuindicatoare de avertizare.

Acidul clorhidric concentrat (HCl) i hidroxidul de amoniu (NH4OH) nu trebuie pstrate n acelai loc, datorit riscului formrii de NH4Cl toxic, prin combinarea vaporilorde clor i amoniac.


21/251

21

Substanele higroscopice trebuie pstrate n recipiente ermetic nchise i uneori nesicatore.

Pentru a putea fi folosite substanele pstrate n congelator se vor introduce de

asemenea n esicatoare pn vor atinge temperatura camerei. Msura este obligatorie pentru enzime i alte proteine i are ca efect eliminarea condensrii apei i reducerea pierderilor de substan activ.

Pentru cazurile cnd se lucreaz cu substane volatile sau care eman gaze iritantesau toxice se recomand ca n aceast magazie s existe i o ni cu ventilaie forat aaerului.

2.2.4. Camera pentru pregtirea mediilor de culturPregtirea mediilor de cultur este o operaie foarte important care presupune

existena unei camere prevzut cu dotri specifice (Foto 2.3.)

Foto 2.3. Camera pentru prepararea mediilor de cultur la Vitroplant Cesena

n ceea ce privete dotrile i instalaiile de baz, trebuie precizat c ncpereatrebuie s fie faianat i pardosit cu gresie sau materiale uor lavabile. Mesele, de reguluna aezat central i celelalte lng perei, trebuie s fie faianate i prevzute cuminirafturi pentru sticlrie, etc. n camer vor mai exista dulapuri pentru pstrarea sticlriei

curate.


22/251

22

Camera trebuie prevzut cu instalaii de ap curent rece i cald (eventual cu un boiler), chiuvete antiacid, canalizare, instalaie de gaz natural sau butelie, instalaie decurent electric (220 V, 50 Hz). Toate instalaiile de mai sus trebuie prevzute cu sisteme de

protecie, robinete suplimentare, vane, circuite de mpmntare, tablouri cu siguranefuzibile, etc. conform normelor n vigoare.

Din inventarul camerei pentru pregtirea mediilor de cultur nu trebuie slipseasc un aparat pentru distilat ap, un deionizator, plite cu agitator magnetic, plitediverse, eventual becuri cu gaze, cuptor de microunde, sisteme de filtrare (Millipore etc.), balan analitic cu patru zecimale, balan cu dou zecimale, mixere, micropipete, pH-metru, distribuitoare de mediu, cronometru de laborator etc.

Distribuitoarele de mediu pot fi simple de tipul unor seringi cu limitator gradat, pentru volume de mediu cuprinse ntre 1 i 10-15 ml (foto 2.4. i 2.5.), sau de dimensiunimai mari de tipul unor cuve nclzite electric prevzute cu pompe aspiro-respingtoare, pentru volume de mediu cuprinse ntre 25-200 ml (foto 2.6.).

Foto 2.4. Distribuitor-dozator pentru mediul de cultur (volume reduse)

Foto 2.5. Sering pentru repartizarea mediului de cultur


23/251

23

Foto 2.6. Repartizarea mediului de cultur n vase mari,

n flux industrial (Vitroplant)

De asemenea, se folosete sticlrie specific; pahare Berzelius, pahareErlenmayer, baloane cotate, cilindri gradai, pipete, biurete, vase pentru ap distilat.

Dup preparare mediul se repartizeaz n diferite tipuri de recipiente din sticl saumase plastice speciale. Pentru volume reduse de mediu se folosesc fie eprubetele, fievasele Petri.

Pentru cantiti mai mari de mediu se folosesc recipiente din sticl sau material

plastic de forme i mrimi diferite. nchiderea lor se face folosind diferite materiale isoluii tehnice (vezi subcapitolul 4.2.1.).

2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultur i presterilizarea

materialului vegetal

Dup prepararea mediului de cultur i repartizarea n vase acesta este trecut ncamera de autoclavare. Aceast ncpere este dotat cu instalaie de curent electric(recomandabil 380 V), instalaie de gaz, instalaie de alimentare cu ap i autoclave.


24/251

24

Autoclavele sunt instalaii complexe, prevzute cu instrumente pentru controlultemperaturii i presiunii, temporizatoare i dispozitive de siguran folosite pentrusterilizare n mediu umed (autoclavare).

Parametrii de lucru a unui autoclav sunt n general 121C, pentru temperatur i1,1 atmosfere, pentru presiune.

Dup sursa de energie autoclavele sunt de dou feluri: electrice i cu gaz, iar duptipul constructiv sunt verticale sau orizontale (foto 2.7. i 2.8.). Volumul util al unuiautoclav variaz de la civa litri pn la cteva sute de litri, n funcie de cantitatea demediu care se autoclaveaz n mod uzual.

Foto 2.7. Autoclav orizontalde capacitate redus

Foto 2.8. Autoclav verticalde capacitate medie

n complexele industriale de micronmulire se folosesc autoclave orizontale demare capacitate prevzute cu dou ui:

- una pentru umplere din camera pentru pregtirea mediului de cultur;- una pentru golire din camera pentru pstrarea mediului sau din zona steril.n autoclave, vasele cu mediu se introduc n couri speciale sau n pupinele.n anumite situaii n camera de autoclavare care se afl n vecintatea zonei

sterile se face i o presterilizare a materialului vegetal pregtit pentru inoculare.Presterilizarea se face prin imersarea acestuia n soluii de fungicide i/sau

bactericide urmnd apoi sterilizarea propriu-zis sub hota cu filtru laminar.


25/251

25

2.2.6. Magazia pentru medii de cultur

Dup autoclavare, mediile de cultur trebuie s fie pstrate cel puin 24 de orenainte de a fi folosite. Acest lucru se poate face ntr-o ncpere perfect curat situat n

vecintatea camerei de inoculare.Pstrarea trebuie fcut la ntuneric pentru a preveni degradarea compuilor

fotolabili sub influena luminii. n acelai timp, temperatura de pstrare se recomand sfie ct mai sczut (ideal 3-4C). Unele laboratoare industriale folosesc camere frigorificespecial amenajate pentru pstrarea mediului de cultur, dar i pentru pstrarea vaselor cuexplante pentru ealonarea produciei de material vegetal n funcie de cerine, comenzi,anotimp, etc.

n laboratoarele mici pstrarea vaselor cu mediul de cultur se poate face ndulapuri bine nchise n apropierea camerei sterile.

Pstrarea mediului de cultur nu trebuie fcut pe o perioad mai mare de 14 zilentru-ct crete riscul deteriorrii caracteristicilor acestuia.

2.2.7. Camera de cretere

Dup inocularea explantelor pe mediul de cultur vasele sunt trecute n camera de

cretere. Ca i celelalte ncperi ale laboratorului, aceasta trebuie s fie perfect curat,faianat i s fie totodat dotat cu instalaii specifice (Foto 2.9.).

Foto 2.9. Una din camerele de culturi ale firmei Vitroplant Cesena, Italia


26/251

26

ntreaga camer este ocupat cu rafturi pe care se aeaz vasele de cultur.Distana dintre dou polie pe vertical este de minimum 40-50 cm, iar nlimea total n jur de 2 m. Limea unei polie este de 1-2 m.

Poliele se realizeaz din materiale care s permit circulaia aerului printre vaseevitndu-se astfel supranclzirea mediului de cultur.

Pentru aezarea eprubetelor pe rafturi se folosesc supori, de regul nclinai, care permit o mai bun iluminare a explantelor.

Un alt element important n camera de cretere este reprezentat de instalaia deiluminat. Realizat n general din tuburi fluorescente distanate la 15-20 cm unele de altele,aceast instalaie trebuie s aib nite caracteristici tehnice bine stabilite.

Astfel, intensitatea luminoas trebuie s fie de 3000-4000 de luci. Se cunoscsituaii cnd se recurge la intensiti mai reduse sau chiar la lipsa total a luminii:- timp de 3-4 zile dup inocularea meristemelor pentru reducerea oxidrilor;- n anumite culturi de calus;- n embriogeneza somatic la conifere;- n faza de inducie naintea fazei de organogenez direct din limb foliar;

Frecvent este nevoie de lumin diferit colorat pentru obinerea unor rezultate mai

bune la diverse tipuri de culturi.Intereseaz apoi lungimea ciclurilor lumin-ntuneric. De regul durata zilei

este stabilit la 6-12 ore, restul pn la 24 fiind ocupate de ntuneric. Rezultatele obinutede Teodorescu Al. i colab. (1994, 1995) la ICPP Piteti-Mrcineni au dovedit c prinreducerea lungimii ciclurilor de lumin se realizeaz importante economii de energie. Pe baza rezultatelor obinute, autorii recomand reducerea duratei de iluminare cu 4-6 ore pezi, respectiv realizarea unui fotoperiodism de 12-10 ore.

Un alt parametru care trebuie controlat este nivelul temperaturii n camera decretere. n general, temperatura folosit este 22-24C1C, Trebuie precizat c n funciede specie, tipul de cultur i scopul urmrit temperatura poate s varieze ntre 10 i 32C.n general, speciile provenite din zonele calde cresc bine la temperaturi mai ridicate (26-28C).

Umiditatea este un alt factor esenial. Valoarea optim a umiditii aerului ncamere de cretere este de 80-85%, Scderea umiditii sub aceast valoare duce ladeshidratarea rapid a mediului de cultur cu consecine grave asupra explantelor.


27/251

27

Controlul factorilor de mediu n camera de cretere trebuie s fie fcut riguros,acest lucru influennd direct mersul culturilor. Pentru a urmri evoluia temperaturii iumiditii n camerele de cretere acestea sunt prevzute cu termohigrometre.

Orice avarie trebuie semnalat imediat prin intermediul unor sisteme de avertizareluminoase i sonore.

2.2.8. Camera (spaiile) de aclimatizare

Aclimatizarea este etapa cea mai dificil n desfurarea procesului demicronmulire. Pentru reuita acestei operaii trebuie s se dispun de spaii prevzute cuinstalaii eficiente de iluminare, nclzire i umidificare a aerului.

n mod frecvent, n complexele industriale, aclimatizarea se face n solarii sau serespeciale (Foto 2.10.).

Foto 2.10. Sera cu dubla protecie, folosit la aclimatizarea

materialului micronmulit (Vitroplant)

Cu ct controlul factorilor de mediu este mai bun, cu att se reduc riscurile pierderii de material n procesul aclimatizrii. Dirijarea factorilor de mediu pe parcursulfazei de aclimatizare este prezentat n subcapitolul 5.2.5.


28/251

28

2.2.9. Sera i solariile

Materialul aclimatizat este trecut apoi n solarii sau sere pentru a-i desfura primele faze de cretere nainte de livrare sau nainte de a fi folosit n cmp. Acest proces,

numit fortificare, are loc n structuri prevzute cu sisteme de control al factorilor devegetaie, n special umiditate i temperatur (foto 2.11. i 2.12.).

Mrimea suprafeelor ocupate cu sere i solarii depinde de cantitatea de materialnmulit.

Foto 2.11. Ser folosit pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant)

Foto 2.11. Vi de vie n container fortificat ntr-un solar (Vitroplant)


29/251

29

O soluie economic de realizare a unei sere de dimensiuni mai reduse esteamplasarea acestei pe partea de sud a construciei care gzduiete laboratorul. Acoperiulse poate construi cu o singur pant, unul din perei fiind reprezentai de peretele cldirii

(figura 2.2.).

2.2.10. Spltorul

Spltorul este o ncpere prezent n orice fel de laborator de micronmulire.Aa cum spuneam mai devreme de gardul de curenie depinde n bun msur

sntatea culturilor i bunul mers al activitii.n spaiul reprezentat de spltor se cur sticlria i celelalte componente ale

instrumentarului folosit pentru realizarea culturilorin vitro .ncperea trebuie s fie faianat i prevzut cu instalaii specifice de alimentare

cu ap, canalizare, alimentare cu curent electric i eventual gaze.n spltor trebuie s existe mai multe chiuvete (unele cu scurgtor) alimentate cu

ap cald sau rece. n lipsa unei instalaii de ap cald aceasta se poate obine cu ajutorulunui boiler electric sau cu gaze (tip Vaillant).

Pentru splarea sticlriei mai sunt necesare vase din plastic de diferite dimensiuni,

perii i detergeni.Din spltor sunt nelipsite scurgtoarele de tot felul pentru vase mari, pentru vase

de cultur, pentru eprubete. Vor fi prezente i recipiente cu amestec cromic folosit lasplarea sticlriei (atenie, este puternic toxic i coroziv, vezi subcapitolul 4.2.) irecipiente cu ap distilat folosit la cltire.

n laboratoarele de mari dimensiuni se folosesc perii electrice pentru uurareasplrii, sau chiar maini i instalaii pentru splat care efectueaz toate operaiile de

splare, cltire i uscare a sticlriei.Dup nlturarea mediului de cultur din vase acestea se spal superficial n curent

de ap fierbinte i se trec apoi ntr-un vas cu ap cald cu detergeni.n cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea s fie autoclavate nainte

de a fi deschise pentru a se evita rspndirea infeciei n laborator.Vasele folosite pentru topirea mediului sau pentru distribuirea mediului cu agar

vor fi splate imediat cu ap fierbinte pentru a se evita rcirea agarului i fixarea pe pereiiacestuia.


30/251

30

Tehnologia modern presupune i existena unor maini de splat cu ultrasunete,extrem de eficiente (foto 2.12.).

Foto 2.12. Main de splat cu ultrasunete

Dup splarea propriu-zis, sticlria se cltete n ap curent i este trecut ntr-un alt vas cu ap distilat unde va fi lsat timp de mai mult ore. Urmeaz apoi zvntarea pe scurgtoare i depozitarea n dulapuri speciale destinate acestui scop, pn n momentul

folosirii.Mediul de cultur i celelalte resturi se vor colecta n pungi din plastic care se vor

lega i duce n spaii de colectare a gunoiului.Pentru laboratoarele mici uneori spltorul face parte integrat din camera de

pregtire a mediului de culturn aceleai situaii, n spltor se poate face i pregtirea materialului vegetal

pentru inoculare. Este vorba, n special de operaiile de splare, presterilizare i eventualfasonare a materialului.

n ceea ce privete organizarea activitii de splare a sticlriei i instrumentaruluin laborator trebuie precizat c n micile laboratoare nu exist personal angajat special pentru acest scop. De aceea trebuie instituit regula potrivit creia fiecare din cei carelucreaz n laborator trebuie s lase n urma sa aa cum a gsit, adic curat.

Fiecare i va spla sticlria folosit, o va depozita n locurile special destinate, nordine i va cura spltorul la terminarea activitii.


31/251

31

Tot n ansamblul de reguli dup care trebuie organizat activitatea n laboratoareledidactice i de cercetare se nscrie i planificarea aciunilor pe zile i persoane, realizndu-se astfel un flux continuu fr suprapuneri sau goluri.

2.3. Zona steril

"Inima" laboratorul de culturiin vitro este reprezentat de camera steril. n acestspaiu se execut toate operaiile de sterilizare, inoculare i transferuri pe mediul de culturn condiii sterile.

Camera steril trebuie s fie ferit de orice surs de praf i murdrie. n acest sensferestrele vor fi prevzute cu un sistem de filtrare iar dac este posibil ncperea va avea la

intrare o camer tampon.Laboratoarele mai sofisticate au instalaii de climatizare cu presiune pozitiv de

aer steril care mpiedic ptrunderea prafului, sporilor sau altor forme ale agenilor patogeni din exterior.

n trecut sterilizarea spaiului interior se realiza cu ajutorul unor lmpi cuultraviolete. Era apoi obligatorie aerisirea ncperii pentru eliminarea ozonului care seformeaz. Cu aceast ocazie era posibil ca n ncpere s ptrund din nou spori de

ciuperci, bacterii i alte microorganisme, iar operaia era ineficient. n plus, ozonul estetoxic i puternic mutagen i crete astfel riscurile expunerii personalului la accidente.

Componenta de baz a camerei sterile este hota (nia) steril. Folosind un sistemde filtrare complex hota creeaz, ntr-un spaiu nchis, un flux de aer steril care sedeplaseaz cu o anumit vitez spre operator.

Exist mai multe tipuri constructive de hote care funcioneaz pe acelai principiu:mpingerea cu ajutorul unor ventilatoare a aerului printr-o baterie de filtre, reinerea

particulelor de praf i a microorganismelor i formarea unui flux de aer steril care iese dinincinta steril, "mpiedicnd n acelai timp ptrunderea aerului nesteril din exterior.

Cele mai folosite hote sterile sunt hotele cu flux laminar orizontal. Ele pot avea un post de lucru, dou sau mai multe (foto 2.13.)


32/251

32

Foto 2.13. Hota steril cu flux laminar orizontal

Pentru lucrri n care se folosesc ageni patogeni sau transformri cu Agrobacterium tumefaciens se recomand s se foloseasc hote sterile cu flux vertical carempiedic rspndirea acestor microorganisme n exterior (foto 2.14.).

Foto 2.14. Hota steril cu flux vertical

n general, o hot este alctuit dintr-o baterie de ventilatoare n partea din spate, prefiltre care rein particulele de praf mai grosiere i bateria de filtre bacteriologice care

reine particule mai mari de 0,2 m.n partea din fa hota prezint o minicamer cu un perete liber alctuit dintr-o

mas de lucru, acoperit cu tabl din inox, doi perei laterali transpareni i un sistem deiluminare cu tuburi din neon n partea de sus.

Hotele de construcie mai veche erau prevzute i cu lmpi de U.V. folosite pentrusterilizare.


33/251

33

n acelai timp hota prezint una sau mai multe prize electrice pentru a asigurasursa de curent pentru microscoape, lupe binocular, minibalane, incineratoare (Bacti-Cinerator) sau sterilizatoare electrice pentru instrumentar (foto 2.15.).

Foto 2.15. Hot modern pentru lucrri de cercetare (Vitroplant)

Acolo unde exist instalaie cu gaz la hot se ataeaz 1-2 becuri Mnsen cu gaz pentru flambarea instrumentarului (foto 2.16.). Hota mai este dotat cu ntreruptoare precum i eventual cu un regulator de turaie a ventilatorului care modific viteza fluxuluide aer.

n timpul lucrului n hot se vor gsi de asemenea, supori pentru instrumentarsteril, (ace, spatule, pense, bisturie etc.), un pulverizator cu alcool pentru dezinfeciaexteriorului vaselor de cultur, a masei i a minilor operatorului precum i materiale pentru nchiderea vaselor de cultur (folie de aluminiu, folie autosigilant, etc.).

Foto 2.16. Dotare minimal ntr-o hot cu flux laminar steril


34/251

34

n camera steril trebuie s mai existe scaune (eventual rotative, ergonomice, etc.)msue pentru depunerea vaselor cu medii, a vaselor folosite la sterilizarea materialului, asticlelor cu ageni sterilizani i ap, a materialului vegetal pregtit pentru sterilizare).

Foarte practice sunt msuele multietajate cu rotile care se pot deplasa uor dintr-un loc naltul (foto 2.17).

Foarte importante sunt lucrrile de ntreinere a hotei. Acestea constau n primulrnd n curirea prefiltrelor cu ajutorul unor aspiratoare. Cele mai eficiente sunt cele carefuncioneaz fr sac de praf, cu colectarea impuritilor n ap (tip Rainbow).

n cazul folosirii intense, bateria de filtre trebuie schimbat anual.

Foto 2.17. Msu multietajat cu rotile

n acelai timp, se va acorda o atenie deosebit cureniei n camera steril. Zilnicse va spla podeaua cu ap i detergeni specifici, se vor terge pereii i n general, se vor

nltura orice surse posibile de praf.La intrarea n camera steril se va schimba mbrcmintea i nclmintea,aceasta din urm fiind principala surs de praf i ageni contaminani.

nainte de nceperea lucrului cu cel puin 20-30 de minute, hota se pornete pentrua se steriliza interiorul incintei. De asemenea, se pulverizeaz alcool de 96% pe parteainterioar a acesteia i pe vasele cu medii sau celelalte materiale care se introduc sub hot.


35/251

35

Capitolul 3

Mediile de cultur i prepararea lor

Mediul de cultur reprezint suportul fizic i chimic necesar pentru creterea idezvoltarea explantelorin vitro .

Graie unor cercetri minuioase efectuate de-a lungul timpului un mare numr decercettori au formulat diferite reete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturiinvitro la marea majoritate a speciilor vegetale.

Momentul de rscruce n acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, cndT. Murashige i F. Skoog au publicat reeta de mediu care le poart numele, realizat iniial pentru culturi de esuturi de tutun.

Acest mediu a fost apoi preluat cu succes n nenumrate situaii, la cele mai diferitespecii, fiind n prezent cea mai folosit reet de mediu, alturi de varianta modificatLinsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferena dintre cele dou reete const n nefolosireaacidului nicotinic, piridoxinei, glicinei i creterea concentraiei de tiamin la 0,4 mg/l, ncazul variantei modificate, LS.

Alte reete de medii larg folosite sunt B5 (Gamborg i colab. 1968), N6 (Chu,1978), Nitsch&Nitsch (NN, 1969). Pentru culturain vitro a speciilor pomicole dar i aaltor plante lemnoase se folosesc mediile Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW(Driver&Kuniyuki, 1984) i WPM Lloyd and McCown, 1980).

Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un mediu de cultur sunt:- s corespund cerinelor nutritive i hormonale ale speciei cultivate pentru faza n

care se gsete (stabilizare, proliferare, calogenez, nrdcinare, etc.);- s asigure condiii optime de cretere i dezvoltare n ceea ce privete presiunea

osmotic, pH-ul, umiditatea, etc.- s fie echilibrat din punct de vedere ionic;- s nu conin ioni sau substane toxice;- s fie uor de preparat i reproductibil;- s fie stabil dup autoclavare (s-i menin neschimbat compoziia i

caracteristicile fizico-chimice;


36/251

36

- s fie ieftin i s conin ct mai puini constitueni naturali costisitori ineomogeni;

- eventual, s poat fi reciclat.Mediile folosite la culturain vitro a explantelor vegetale au n general o structur

complex, fiind alctuite dintr-un mare numr de constitueni de natur divers i cu roldiferit.

Aceti constitueni pot s fie grupai n:- constitueni cu rol nutritiv: elemente minerale: macro i microelemente i

elemente organice: zaharuri (ca surs de carbon), aminoacizi (ca surs de azot organic) ivitamine;

- constitueni cu rol hormonal fitoregulator al creterii i dezvoltrii explantelorinvitro : auxine, citochinine, gibereline i alte substane cu rol stimulator sau inhibitor: acidabscisic, etilen, colchicin, paclobutrazol, etc.

- constitueni cu rol n stabilizarea mediului de cultur: apa, ageni de solidificare,stabilizatori osmotici i de pH, antioxidani i substane absorbante.

3.1. Constitueni cu rol nutritiv

3.1.1. Constitueni mineraliSubstanele minerale care intr n componena mediilor de cultur sunt sruri care

conin cele 6 macroelemente fundamentale: azotul (N), fosforul (P), potasiul (K), calciul(Ca), magneziul (Mg) i sulful (S) precum i un mare numr de microelemente: fier (Fe),mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), cupru (Cu), molibden (Mo), sodiu (Na),cobalt (Co) i iod (I).

3.1.1.1. Macroelementele

Concentraia macroelementelor folosite variaz n limite destul de largi, n modobinuit, folosindu-se cantiti de 1-40 mM, respectiv, 300-19.000 mg/l.

Microelementele se folosesc n concentraii mult mai reduse de ordinulmicromolilor, respectiv 0,0025-0,5 mg/l.

n funcie de concentraia molar total mediile de cultur se mpart n treicategorii:- medii concentrate (36-50 mM): Murashige & Skoog, Quoirin & Lepoivre, Eriksson, etc.;

- medii cu concentraie mijlocie (27-35 mM): Nitsch&Nitsch;- medii cu concentraie sczut (7-26 mM): White, Heller;


37/251

37

Foarte important este compoziia ionic a mediilor de cultur tiindu-se c nsoluie srurile disociaz n ionii componeni. Trebuie avut n vedere echilibrul acestor ionii posibilitatea de a se combina i de a forma compui toxici greu solubili sau insolubili.

n general toate mediile de cultur conin urmtorii ioni: NH4+, K +, Ca2+, Mg2+, Na+, NO3-, PO43-, SO42-, Cl-.

Prin folosirea preponderent a srurilor sub form de cloruri crete concentraiaionului Cl- care nefiind folosit n nutriie, are efect toxic asupra explantelor determinndclorozarea i ulterior moartea acestora. Efecte similare are i excesul de sodiu (Na+) dinmediul de cultur.

Dintre macroelemente un rol important este jucat deazot. Acesta este furnizat n

mediul de cultur prin folosirea azotailor de amoniu, potasiu, calciu, sodiu, etc.n soluie se gsete att azot sub form nitric (NO3-) ct i sub form amoniacal

(NH4+).Rolul celor dou forme de azot este diferit i uneori cercetrile efectuate au scos n

eviden rezultate contradictorii. Astfel, ntr-o prim faz, s.a afirmat c ionul amoniu(NH4+) ar induce formarea embrionilor somatici la morcov spre deosebire de ionul nitrat(NO3-) care nu ar avea acest efect (Halperin i Wetherell 1967, citai de Cachi, 1987).

Totui experienele lui Reinert i colab. (1966), au dovedit c este posibilobinerea de embrioni din esut de morcov pe un mediu care coninea numai ioni nitrat(NO3-).

Important este raportul n care se gsesc cei doi ioni n mediul de cultur. n mareamajoritate a reelelor folosite, raportul NH4+/NO3- este de 1/2-1/3, putnd s ajung la 1/5.

Azotul are un rol fiziologic deosebit de important, fiind indispensabil nmetabolismul proteic i glucidic. Lipsa azotului sau carena acestuia determin acumularea

antocianilor n vacuole i moartea rapid a celulelor.La salat, absena azotatului de amoniu din mediul de cultur a determinat formarea

calusului din cotiledoane fr a se obine nici un fel de tip de regenerare.Fosforul are i el un rol important n metabolismul general al explantelor prin

formarea compuilor nucleotizi cu valoare energetic ridicat (ADP i ATP) carerealizeaz captarea, pstrarea i eliberarea energiei chimice i care sunt determinani n biosinteza acizilor nucleici (Neamiu i colab. 1989).


38/251

38

Dup azot, cea mai mare pondere o deinepotasiul (K). Acesta s-a dovedit a fi denenlocuit datorit rolului pe care-l are n reglarea permeabilitii membranei celulare i avscozitii protoplasmei. Este deosebit de activ n cadrul schimburilor de ioni la nivelulmembranelor celulare i este cerut n cantiti mai mari de ctre explantele tinere la nivelulcrora determin activarea diviziunii celulare.

Carena potasiului se concretizeaz prin reducerea creterii sau chiar involuiaexplantelor de tutun. La aceeai specie i la via de vie, cultivarea pe medii bogate n potasiu a avut ca efect stimularea creterii explantelor (Heller 1947-1953, citat de Cachi,1987).

Calciul este prezent n majoritatea mediilor de cultur sub form de clorur de

calciu (CaCl2 .2H2O) sau azotatul de calciu (Ca(NO3)2 . 4H2O).Alturi de potasiu, calciul are un rol important n reglarea permeabilitii

membranelor la nivel celular. Este cunoscut, de asemenea i rolul antitoxic al calciului.Avnd n vedere faptul c este solicitat n cantiti mai mari n metabolismul

esuturilor senescente datorit acumulrii n membrane, la culturile meristematicein vitro nevoile de calciu sunt mult mai reduse.

Totui carena calciului determin necrozarea apexurilor la lstarii cultivaiin vitro

iar lipsa lui duce la moartea celulelor.Mrirea concentraiei de calciu din mediu prin adugarea clorurii de calciu (CaCl2)

trebuie fcut cu discernmnt pentru c peste anumite limite se manifest toxicitateaionilor de clor (Cl-).

La cultivarea gutuiului pe un mediu Quiorin & Lepoivre (1977) bogat n calciuapar uneori simptome de cloroz datorit blocrii fierului (Stnic, 1996).

Magneziul intr n compoziia clorofilei i carena sa determin perturbri

importante n funcionarea frunzei, ducnd n final la moartea explantului.Relaia Ca-Mg este foarte strns, cele dou macroelemente putndu-se chiar

substitui n anumite reacii metabolice.Sulful intr n compoziia multor aminoacizi eseniali i este nelipsit din mediile de

cultur unde se afl n componena ionului sulfat (SO42-). Reducerea coninutului de clordin mediul de cultur prin nlocuirea clorurilor cu sulfai are ca efect o cretere aconcentraiei sulfului.


39/251

39

Anumite medii de cultur sunt foarte bogate n sulf: DKW pentru nuc (Driver iKuniyuki, 1984), Litvay pentru conifere (Litvay i Johnson, 1981).

3.1.1.2. Microelementele

Microelementele folosite n culturilein vitro sunt n numr mai redus fa de celefolosite n soluiile nutritive complexe iar concentraiile uzuale sunt asemntoare pentrumajoritatea mediilor de cultur.

Dintre microelemente,fierul se administreaz n cantiti mai mari. Pentru a fi uorasimilabil se folosete chelatul de fier (NaFeEDTA) care se pregtete din sulfat feros(FeSO4 . 7H2O) i sare disodic a acidului etilen- diamino-tetraacetic (Na2EDTA . 2H2O).

Raportul dintre cei doi compui trebuie s fie de 1:2 adic, pentru 100M FeSO4 . 7H2O,

trebuie s se dizolve 200M de Na2EDTA.2H2O. Concentraia uzual a ionului Fe2+ este

n jur 100eq.Excesul de fier bivalent (Fe2+) determin oxidarea acestuia la fier trivalent (Fe3+) i

formarea de fosfat feric care precipit i crete turbiditatea mediului de cultur.Fierul este catalizatorul multor procese redox i are rol esenial n fotosintez, n

activitatea citocromilor respiratori i n sinteza proteic.Carena fierului se manifest prin clorozarea esuturilor verzi i blocarea

diviziunilor celulare n esuturile meristematice.Manganul particip la o serie de activiti enzimatice iar la conifere s-a dovedit c

poate nlocui ntr-o anumit proporie, magneziul (Clarkson i colab., 1980, citat de EnescuV. i colab. 1994). Are de asemenea un rol important n sinteza proteic.

Carena manganului determin blocarea sintezei ARN-ului n rdcinile de mazre.Zincul este implicat n sinteza auxinei, a ARN-polimerazei i a unor

dehidrogenaze. Lipsa acestuia determin dereglri n sinteza triptofanului (precursor alauxinei endogene), nglbenirea i necroza esuturilor tinere.

Aluminiul folosit numai n anumite medii de cultur (Heller) n cantiti foartemici are rol de catalizator al unor reacii biochimice.

Borul este utilizat sub form de acid boric (H3BO3) n concentraii relativ ridicate(1-10 mg/l). Rolul su preponderent se refer la reglarea proceselor de diviziune celular icretere.

Carena de bor se manifest prin brunificarea i necrozarea esuturilor.


40/251

40

Cuprul particip la multe reacii redox i este foarte important n embriogenez. Sefolosete sub form de sulfat de cupru (CuSO4 . 5 H2O) n concentraii de 0,025 mg/l (0,1mM).

Molibdenul se pare c are un rol important n activitatea nitrat-reductazei. Alturide iod intr n componena unor enzime i particip la procesele nutriionale aleexplantelor.

Cobaltul este folosit n concentraii foarte sczute sub form de clorur de cobalt(CoCl2 . 6H2O). Rolul su n metabolismul esuturilor vegetalein vitro este necunoscut, cade altfel cel al nichelului.

3.1.2. Constitueni organici3.1.2.1. CarbohidraiiCarbohidraii (zaharurile) sunt folosite n culturilein vitro ca surs de carbon i

energie, dat fiind faptul c explantele cultivate n astfel de condiii au o nutriie preponderent heterotrof.

Prin hidrolizarea carbohidrailor celulele vegetale i procur cantitatea de energienecesar desfurrii proceselor vitale. Trebuie spus c glucidele produse prin fotosintezin vitro de ctre esuturile verzi nu satisfac nici pe departe nevoile energetice globale aleacestora i nevoia de componeni structurali cum ar fi unele polizaharide (celuloza iamidonul).

Dintre zaharuri cel mai mult folosit estezaharoza n concentraie de 2-3%. Launele specii ( Malus robusta ) s-a folosit cu rezultate bune sorbitolul, n timp ce glucoza afost folosit tot la specii lemnoase n concentraie de 3%. n diferite experimente s-aufolosit i alte glucide cum ar fi: fructoza, maltoza, rafinoza sau chiar dextrina i amidonul.

n cantiti crescnde de la 1% la 3%, zaharoza a stimulat creterea explantelor demorcov (Gautheret, 1959), iar reducerea concentraiei la 2-3%, a determinat alungirealstarilor la pin, molid i larice (Aitken, J. i colab. 1981, citai de Enescu V. i colab.1994).

Trebuie precizat i rolul important pe care l au carbohidraii n echilibrarea presiunii osmotice a mediului de cultur. Creterea concentraiei de zaharoz peste anumitelimite are ca efect creterea presiunii osmotice i plasmolizarea celulelor explantelor.


41/251

41

O serie de cercettori au pus problema faptului c mediile de cultur artificiale princoncentraia ridicat de carbohidrai exercit o presiune osmotic "nenatural" asupraexplantelor. De aici necesitatea unor studii privind posibilitile de reducere a cantitilorde carbohidrai din mediile de cultur precum i gsirea altor substane cu rol similar(ESNA WG4, Buteni, 1996).

3.1.2.2. Aminoacizii Aminoacizii sunt folosii n mediile de cultur i ca surse suplimentare de azot

organic. Pe lng aceasta s-a dovedit c ei au rol n diferite procese inductive.Dintre aminoacizi, glicina este cel mai des folosit. nc din 1939, White a subliniat

c glicina stimuleaz creterea rdcinilor de tomate (Cachi, 1987).Gautheret (1959), de asemenea, subliniaz rolul aminoacizilor n formarea

calusului. Ali aminoacizi ca glutamina, arginina i prolina stimuleaz proliferareacalusului la pin (David H. i colab. 1984).

S-a constatat c n cazul folosirii aminoacizilor, izomerii levogiri (L) sunt maieficieni dect cei dextrogiri (D).

Dozele de folosire a aminoacizilor variaz de la 2 mg/l pentru glicin, la 10 mg/l

pentru L-arginin i cistein i pn la 100 mg/l pentru asparagin i L-tirozin.

3.1.2.3. Vitaminele

Vitaminele sunt substane organice cu rol catalitic indispensabile creterii idezvoltrii explantelorin vitro .

Termenul de vitamin - amin vital, a fost introdus pentru prima dat de ctreCasimir Funk n 1911 i ilustreaz plastic importana deosebit pe care acest grup de

substane o are pentru organismele vii.Spre deosebire de plantele din natur, esuturile i organele cultivatein vitro nu au

capacitatea de a-i sintetiza ntreaga gam de vitamine necesare desfurrii n bunecondiiuni a metabolismului.

La nceputurile culturilorin vitro s-a constat c prin adugarea n mediul de cultura unor substane naturale bogate n vitamine (lapte de cocos, sucuri de tomate i banane,extract de endosperm de cereale, lapte de porumb, extracte de drojdie)are loc stimularea

creterii explantelor.


42/251

42

Ulterior o serie de cercettori au realizat reete proprii de vitamine prin combinarean diferite proporii a vitaminelor cunoscute.

Trebuie precizat c majoritatea vitaminelor folosite sunt termosolubile iar prinautoclavare are loc descompunerea acestora. Uneori produii rezultai au la rndul lor unefect favorabil asupra culturilor (Hoza D., 1996).

Ideal ar fi ca amestecurile de vitamine s se poate aduga dup autoclavareamediului folosind filtrarea steril. Pentru mediile solide acest lucru este ns neaplicabil,fiind greu s se obin difuzia vitaminelor n masa mediului.

Principalele vitamine folosite la prepararea mediilor de cultur sunt folosite solitaresau, mai frecvent, n combinaii mai mult sau mai puin complexe.

Tiamina (vitamina B1, aneurina) este nelipsit din majoritatea reetelor de vitaminen concentraii care variaz de la 0,1 mg/l la amestecul de vitamine MS(Murashige&Skoog), la 0,4 mg/l la amestecul Walkey 1 i 2 pn la 5 mg/l la amesteculSH (Shenk i Hidelbrandt), respectiv 10 mg/l la amestecul B5 (Gamborg).

n toate cazurile, agentul solubilizant al tiaminei este acidul clorhidric.Aciunea fiziologic a tiaminei const n stimularea creterilor vegetative i deci

sporirea biomasei produsein vitro .

Piridoxina (vitamina B6) este de asemenea prezent n marea majoritate a mediilorde cultur. Concentraiile folosite variaz n general ntre 0,1-1 mg/l, folosindu-se i deaceast dat, ca agent de dizolvare acidul clorhidric. Se tie c piridoxina este precursorulunor coenzime importante cataliznd reacii de baz n metabolismul aminoacizilor.

Riboflavina (vitamina B2) este folosit doar n amestecurile de vitamine maicomplexe (ex. Jacquillot) n concentraii de 0,1-1,0 mg/l. Este rezistent la temperaturileridicate (se descompune la 280C) i la oxidani dar este sensibil la radiaiile U.V. Se

pare c acioneaz ca inhibitor al creterii rdcinilor i are rol important n metabolismulcelular.

Acidul pantotenic (vitamina B5) este mai puin utilizat ca atare. Gautheret (1945) precizeaz c acidul pantotenic stimuleaz creterea calusului la salcie. O serie decercettori au folosit ns cu succespantotenatul de calciu n concentraii de 0,5-2,5 mg/l.Acesta, este stabil termic pn la temperaturi de 200C i nu este fotolabil.


43/251

43

Cobalamina (vitamina B12) este mai rar folosit. n epoca de pionierat a culturilorin vitro Reinert i White (1956) citai de Gautheret (1959) au folosit-o cu bune rezultate lacreterea esuturilor tumorale. Vitamina B12 stimuleaz sinteza nucleoproteidelor.

Acidul nicotinic (vitamina B3, niacina) aproape nelipsit din mediile de cultur,este rezistent la temperaturi nalte (punct de topire 234-237C). Este solubil n ap i sefolosete n concentraii de 0,5-5,0 mg/l. Are rol esenial n metabolismul intermediar, nreaciile de oxido-reducere fiind component al dehidrogenazelor (NAD+ i NADP+).

Biotina (vitamina H) este folosit n concentraii reduse (0,1 mg/l). n soluii acidesau neutre este stabil dar se descompune prin nclzire. Are rol de coenzim intervenindn numeroase procese metabolice. Stimuleaz creterea esuturilor meristematice i

proliferarea celulelor.Acidul folic,folosit n concentraii mici (0,01 mg/l n amestecul Jacquiot) are efect

stimulator asupra creterii esuturilor la lumin. Acest lucru s-ar datora descompunerii salen acid para amino-benzoic. La ntuneric acidul folic are efect toxic.

Acidul para aminobenzoic, ntlnit n cteva amestecuri complexe de vitamine, sefolosete n concentraii de 1,0 mg/l. Este coenzima tirozinazei i stimuleaz biosintezaacidului pantotenic i a biotinei.

Acidul ascorbic (vitamina C) se folosete n concentraii ridicate (1,0-100,0mg/l) de regul ca agent antioxidant al polifenolilor eliminai de anumite specii la culturain vitro : stejar, mr, dafin (Stnic i colab. 1994), fistic, etc.

Prin autoclavare, vitamina C se distruge n bun parte. Rolul fiziologic al vitamineiC este complex, fiind un activator general al metabolismului celular.

Vitamina E (tocoferolul) favorizeaz reaciile de fosforilare i formare acompuilor macroergici, participnd la numeroase sinteze enzimatice. n culturilein vitro ,

vitamina E mrete sensibilitatea celulelor la auxine (Enescu V. i colab., 1994).Inozitolul (mio-inozitol, mezo-inozitol, m-inozitol, hexahidroxi-ciclohexan) este

un aditiv esenial al mediilor de cultur fiind considerat de unii autori, vitamin, iar dectre alii, glucid.

Se folosete de regul n concentraii de 100 mg/l dar se cunosc i situaii cnd afost folosit n concentraii de pn la 1000 mg/l.

Dei nu se cunoate prea bine rolul fiziologic al inozitolului, se pare c acesta ar

stimula diviziunea celular. Folosit n concentraii mari (250 mg/l) a stimulat creterea


44/251

44

calusului de Fraxinus pensylvanica (Wolter K.E. i Skoog F. 1966, citai de Enescu V icolab. 1994).

Aditivii naturali, folosii la nceput ca substane complexe stimulatoare n culturilein vitro (lapte de cocos, mal, extracte din fructe, drojdie, endosperm, etc.), au fostabandonai ntre timp. Acest lucru se datoreaz faptului c era imposibil de a se obine ocompoziie constant a produselor respective, care s permit repetabilitatea mediilor decultur.

Un alt aditiv natural estecazeina hidrolizat, care nu este altceva dect uncomplex de aminoacizi, putnd fi ncadrat n rndul substanelor folosite ca surs de azotorganic. Este folosit n concentraii de 250 mg/l.

3.2. Constitueni cu rol fitoregulatorHormonii vegetali, regulatorii de cretere, stimulatorii sau substanele de cretere

sunt compui organici, sintetizai de ctre plante n cantiti foarte mici. Aceti compuistimuleaz, inhib sau modific creterea i dezvoltarea unor organe.

La plantelein vitro fitohormonii endogeni produi de ctre explante sunt completaii complexai cu hormoni exogeni introdui n mediul de cultur.

n funcie de scopul urmrit se aleg tipurile de hormoni i concentraia optim i sedetermin astfel, sensul evoluiei explantului respectiv, ca rezultant a aciunii concertate aacestora.

Istoria descoperirii hormonilor de cretere este oarecum paralel cu cea a culturilorin vitro . Descoperirea hormonilor i studierea efectului lor asupra creterii i dezvoltrii plantelor a modificat radical evoluia cercetrilorin vitro .

Primul care a intuit faptul c n plante ar exista substane care s controleze

metabolismul acestora a fost Charles Darwin. Abia n anul 1931 Kgl i Haagen-Smit auizolat din urina uman o substan pe care au denumit-o auxina A. Aceeai cercettori ifolosind aceeai surs au purificat apoi (1934) o alt substan denumit hetero-auxina,

care s-a dovedit a fi de fapt acidul indolil acetic (AIA).Ulterior, la sfritul anilor 30, Gautheret, Nobecourt i White au studiat rolul pe

care l are auxina n creterea esuturilorin vitro .Prima citochinin izolat a fost chinetina (6 furfurilaminopurina) obinut din

sperm de heringi de ctre Miller i colab. (1955). Doi ani mai trziu, Skoog i Miller au


45/251

45

publicat date despre efectul raportului citochinin/auxin asupra proceselor deorganogenez.

Dup descoperirea i izolarea primilor hormoni de cretere s-a trecut la etapaurmtoare de sintez a noi compui cu structur i efect fiziologic asemntor.

n prezent, se cunosc cinci grupe mari de hormoni de cretere: auxine, citochinine,gibereline, acid abscisic i etilena.

3.2.1. AuxineleAuxinele sunt, n marea lor majoritate, compui naturali sintetizai de ctre plante i

acumulai n diferite organe, n concentraii reduse. Auxinele sunt prezente mai ales n

mugurii terminali, frunze tinere i vrfuri de lstari. Paralel cu izolarea compuilor auxinicinaturali s-au realizat compui de sintez cu aciune asemntoare ca derivai ai iodului,naftalenului, acidului fenoxiacetic i acidului benzoic.

Aciunea auxinelor este deosebit de complex:- intervin n procesele de diviziune i elongaie a celulelor, n concentraii mici

stimulnd diviziunea celular, iar n concentraii mari, alungirea;- modific permeabilitatea membranelor celulare modificndu-le n acelai timp,

alte caracteristici fizice i chimice;- influeneaz pozitiv sinteza proteic prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal;- controleaz procesele de dominan apical, determinnd inhibarea activitii

mugurilor axilari;- stimuleaz procesele de calusare i ulterior determin formarea rdcinilor.- n doze ridicate determin apariia de hipertrofii (simple deformri) sau

hiperplastii (tumori)

Principalele auxine folosite n culturilein vitro sunt prezentate n tabelul 3.2.1.Sunt prezentate de asemenea, substanele folosite pentru dizolvarea i diluarea acestora,temperaturile de pstrare i limitele concentraiilor uzuale.


46/251

46

Tabelul 3.2.1.Principalele auxine folosite n culturilein vitro

Specificaie Mas

molec.Solvent Diluant Pstrare

produs

Pstrare

soluie

Conc.

mg/lAIAAcid

indolilacetic175,2

etanol NaOH

1N ap0C 0C 0,01-3,0

AIA-L- Acidaspartic

290,3 NaOH0,5N

ap 0C 0C 0,01-5,0

AIA-L- Alanin 246,3 NaOH0,5N

ap 0C 0C 0,01-5,0

AIA-L- Fenil-alanin

322,4 NaOH0,5N

ap 0C 0C 0,01-5,0

AIA-L- Glicin 232,2 NaOH0,5N

ap 0C 0C 0,01-5,0

IBAAcid

indolilbutiric203,2

etanol NaOH

1Nap - -0C 0,1-10,0

K-IBAAcid indolil-

butiric, sare de K241,3 ap - 0-5C 0-5C 0,1-10,0

ANAAcid naftilacetic 186,2

NaOH1N ap temp.

cam.0-5C 0,1-10,0

4-CPAAcid 4 clor-fenoxiacetic

186,6 etanol ap temp.cam.

0-5C 0,1-10,0

Dicamba

Acid 2 metoxi-3,6-diclorbenzoic 221,0 etanol/ap ap 0-5C 0-5C 0,01-10,02,4-D

Acid 2,4 diclor-fenoxiacetic

221,0etanol

NaOH1N

ap temp.cam.

0-5C 0,01-5,0

2,4,5 TAcid 2,4,5 triclor-

fenoxiacetic255,5 etanol ap temp.

cam.0-5C 0,01-5,0

PicloramAcid 4-amino-3,5,6-tricloro-

picolinic

241,5 DMSO* ap temp.cam.

0-5C 0,01-10,0

* DMSO dimetilsulfoxid

Aa cum rezult din tabelul 3.2.1. solvenii folosii pentru dizolvarea auxinelor suntetanolul i hidroxidul de sodiu (NaOH) 0,5-1,0 N. Temperaturile de pstrare a substanelori respectiv a soluiilor stoc sunt prezentate n acelai tabel.

Stabilitatea auxinelor variaz destul de mult. Astfel, AIA i o bun parte din restulauxinelor, sunt fotolabile, n timp ce ANA i 2,4 D sunt mai stabile.


47/251

47

3.2.2. Citochininele Citochininele sunt substane deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de

cretere i dezvoltare la plante.Prima citochinin descoperit (Skoog, 1956) a fost izolat din sperm de heringi i

denumit chinetin (6-furfuril-amino-purin). Aproximativ n aceeai perioad s-adescoperit rolul stimulator al laptelui de cocos asupra formrii de noi plantulein vitro .Ulterior s-a constatat c acest lucru se datoreaz faptului c laptele de cocos era bogat ncitochinine naturale.

Efectele citochininelor asupra explantelor cultivatein vitro sunt multiple:- stimuleaz diviziunea celular;

- au rol esenial n formarea i creterea lstarilor;- au rol important n procesele de regenerare adventiv a lstarilor (organogenez

direct);- formarea rdcinilor este n general inhibat sub aciunea citochininelor;- stimuleaz de asemenea formarea lstarilor axilari i creterea ratei de

multiplicare;- ntrzie procesele de senescen i determin creterea coninutului de clorofil n

explante.Aciunea citochininelor se coreleaz cu cantitatea de auxine prezente n mediu.

Astfel spus, este esenial raportul auxine:citochinine n determinarea i reglarea unor procese vitale de cretere i dezvoltare a explantelor.

Principalele citochinine i substane cu efect similar folosite n culturilein vitro sunt prezentate n tabelul 3.2.2.

Dintre acestea BAP (6 benzil-amino-purin) sau BA (benziladenina) este cel mai

mult folosit.Zeatina, produs bioactiv izolat din porumb, are o activitate fitoregulatoare

important. La actinidia a stimulat formarea unui numr mare de lstari adventivi dinexplante de rdcin, internod, frunz (organogenez direct) i calus (organogenezindirect).

Efecte asemntoare are i 2 iP (2 izopentiladenina), DPU (difenil ureea),tidiazuronul (1 fenil-3-(1,2,3, tiadiazolpentil) uree), CPPU (N-2-cloro 4 piridil N-fenil-

urea), care la fel ca i zeatina sunt substane foarte costisitoare.


48/251

48

Toi aceti derivai ai fenil-ureei determin lstrirea adventiv puternic la diferitetipuri de explante i specii, efectul fiind mult mai puternic dect al citochininelor clasice,chiar la concentraii inferioare.

Datorit efectelor spectaculoase a devenit chiar o mod folosirea tidiazuronului ncercetri ct se poate de diverse.

Exist i autori (Horgan, 1986) citat de Pierik (1987) care susin c derivaii fenil-ureei (DPU) inhib de fapt activitatea citochinin oxidazei i n acest fel concentraiacitochininelor rmne ridicat iar activitatea este mai intens.

Adenina a fost folosit pentru prima dat de Skoog i Tsui n 1948, observndu-seefectul de stimulare a formrii lstarilor adventivi pe explante de tulpin de tutun.

Concentraia la care este folosit variaz destul de mult ntre 2-120 mg/l. Frecvent adeninaeste nlocuit cu hemisulfatul de adenin care este mult mai solubil n ap.

Sunt prezentate de asemenea, substanele folosite pentru dizolvarea i diluareaacestora, temperaturile de pstrare i limitele concentraiilor uzuale.

Tabelul 3.2.2.Principalele citochinine folosite n culturilein vitro

Specificaie Masmolec. Solvent DiluantPstrareprodus

Pstraresoluie

Conc.mg/l

Adenin 135,1 ap Na temp.cam.

0-5C 50-250

Adeninsulfat

184,2 ap Na temp.cam.

0-5C 50-250

BAP (BA)6-Benzil-

aminopurin(Benziladenin)

225,3 NaOH1N

ap temp.cam.

0-5C 0,1-5,0

BARBenzilamino-

purin ribozid357,4 NaOH

1Nap 0C 0C 0,01-5,0

BPA N-benzil-9-(2-tetrahidro-

piranil)-adenin

309,4 NaOH1N ap 0C 0C 0,1-5,0

Chinetin6 furfuril-

aminopurin215,2 NaOH

1Nap 0C 0C 0,1-5,0

KRChinetin ribozid

347,3 NaOH1N

ap 0-5C 0-5C 0,01-5,0

4 CPPU N-2-clor-4- piridil-N-feniluree

247,7 DMSO* ap 0-5C 0-5C 0,001-0,1

DPUDifeniluree

212,3 DMSO ap temp.cam.

0-5C 0,1-1,0


49/251

49

Tabelul 3.2.2. continuareSpecificaie Mas


produsPstraresoluie

Conc.mg/l

2 iP2 izopentil-adenin 203,2 NaOH1N ap 0C 0C 1,0-30,0

2 iPR2 izopentil-

adenin ribozid335,4 NaOH

1Nap 0C 0C 0,01-10,0

Specificaie Masmolec.

Solvent Diluant Pstrare produs

Pstraresoluie

Conc.mg/l

Tidiazuron1 fenil-3-(1,2,3-tidiazolpentil)

uree

220,2 DMSO ap temp.cam.

0-5C 0,001-0,05

Zeatin 219,2 NaOH

1N

ap 0C 0C 0,01-5,0

* DMSO dimetilsulfoxid

3.2.3. Giberelinele Giberelinele sunt substane hormonale mai puin folosite n culturilein vitro .Prima giberelin a fost descoperit n 1926 de ctre Kurosawa ca produs al

ciupercii Giberella fujikuroi . n prezent se cunosc un numr mare de gibereline(aproximativ 50) notate cu GA1.GAn.

Dintre acestea cel mai mult folosit este acidul giberelic GA3 (tabelul 3.2.3). Prinautoclavare, 90% din activitatea biologic a GA3 se pierde, motiv pentru care este nevoieca sterilizarea acestuia s se fac prin filtrare.

Rolul fiziologic al giberelinelor nu este pe deplin cunoscut. Se tie c ele au caefect:

- stimularea alungirii lstarilor, fiind recomandate n acest sens dup stabilizareaculturii de meristeme pentru formarea noilor lstari;

- nlturarea dormansului la semine i embrioni i stimularea germinrii;- reglarea formrii auxinelor endogene;- controlul proceselor de formare a florilor dar i a fructelor partenocarpice etc.;- inhibarea formrii lstarilor i rdcinilor adventive.


50/251

50

Tabelul 3.2.3.Gibereline i ali fitoregulatori folosii n culturilein vitro

Specificaie Mas


produs

Pstrare

soluie

Conc.

mg/lGA3 - Acidgiberelic

246,4 etanol ap temp.cam.

0-5C 0,01-5,0

ABA - Acidabscisic

264,3 NaOH1N

ap 0C 0C 0,1-10,0

Acid t-cinamic 148,2 etanol/aceton

ap temp.cam.

0-5C 0,1-10,0

Acid succinic 160,2 ap Na 0-5C 0-5C 0,1-10,0Floro-glucinol 126,1 ap Na temp.

cam.0-5C


51/251

51

cu inducia sau stimularea acestora. Astfel, se tie c dup divizarea calusului cantitatea deetilen produs este mai mare.

La calusul de tutun odat cu creterea concentraiei de etilen la lumin, a avut loci formarea de lstari adventivi (organogeneza indirect).

La explantele de bulbi de crin prin creterea concentraiei de etilen s-a stimulatdiferenierea de bulbi adventivi (organogeneza direct). De asemenea, prin mrireaconcentraiei de CO2 i etilen s-a constatat o cretere a numrului de lstari adventivi pecotiledoane de Pinus radiata .

Se pare c o anumit concentraie de etilen este necesar i pentru induciadiviziunii n suspensiile celulare la Acer . Se cunoate c etilena este implicat n

transportul auxinelor. Totodat, 2,4 D induce formarea etilenei n timp ce azotatul deargint, poate fi folosit pentru inhibarea sintezei de etilen.

Acidul 2 cloretilfosfonic (ACEP) se descompune n etilen i acid fosforic. nhorticultur este folosit sub denumirea comercial de Ethrel sau Ethephon cu 40%substan activ.

Cercetrile privind efectele ACEP asupra culturilorin vitro sunt numeroase(Cachi, 1987). n general aceast substan este folosit n mediul de cultur pentru rolul

de precursor de etilen pe care l are.Folosind ACEP n culturile de meristeme la garoafe n concentraii de 0,1 i 1,0

mg/l s-a observat formarea unui mare numr de muguri dintr-un singur meristem (Cahi,1987). Efecte stimulatoare au fost observate de ctre aceeai autoare la minibutaii decrizanteme, gerbera, cartof i protocormul de Cymbidium.

Floroglucinolul este un compus fenolic folosit de regul ca inhibitor al auxinoxidazei (AIA-oxidazei). Aplicat mpreun cu auxinele determin stimularea formrii

rdcinilor adventive datorit efectului sinergic care apare. n lipsa auxinelor,floroglucinolul stimuleaz formarea lstarilor adventivi.

Colchicina se folosete n special atunci cnd se urmrete mrirea gradului de ploidie prin dublarea numrului de cromozomi.

Amestecurile de substane de origine vegetal au fost folosite mai frecvent lanceputurile perioadei moderne a culturilorin vitro .

Amestecuri ca: laptele de cocos, sucul de tomate, portocale, ananas, seva de

mesteacn, piureul (praful) de banane, extractele de drojdie, de endosperm de cereale etc.,


52/251

52

au dovedit efecte stimulatoare asupra creterii i dezvoltrii explantelorin vitro datoritcompoziiei complexe pe care le au.

Principalul inconvenient pe care l prezint aceste amestecuri este compoziiavariabil de la caz la caz, fapt care face ca rezultatele obinute s nu fie repetabile n altecondiii.

Firmele productoare ofer astfel de amestecuri condiionate sub form de praf,suspensii sau soluii. De exemplu, pudra de banane poate fi folosit n concentraii de 40g/l, n timp ce laptele de cocos n concentraii de 5-20%.

Laptele de cocos poate fi obinut i n laborator printr-o pregtire sumar dupextragerea din nuci. Astfel, dup o prealabil filtrare se face sterilizarea acestuia prin

autoclavare timp de 15 minute la 121C. Se las apoi s se rceasc i a doua zi este dinnou filtrat i pstrat, pn n momentul folosirii, n congelator la 20C. Eventualele proteine care precipit sunt ndeprtate ulterior prin filtrare.

3.3. Constitueni cu rol stabilizator3.3.1. ApaApa este unul dintre componenii cei mai importani ai mediilor de cultur, ea

reprezentnd n jur de 95% din volumul acestora. Element vital, apa mediaz majoritatea proceselor metabolice care au loc n explantele cultivatein vitro .

n vasele de cultur, apa urmeaz un circuit relativ nchis, n sensul c este preluat de ctre explante, eliminat prin transpiraie n atmosfer, se condenseaz n bun parte pe pereii vaselor sau la suprafaa mediului i reintr n circuit.

Condensarea apei pe capace i pe pereii vaselor de cultur este mai accentuat ncamerele de cretere n care poliele rafturilor sunt nclzite de lmpile fluorescente aflate

dedesubt (n caz de izolare necorespunztoare).Pierderile de ap din vasele de cultur sunt ceva mai mari n camerele de cretere

neclimatizate i cu umiditatea aerului redus. n acest caz, se constat n timp odeshidratare a mediului vizibil prin scderea pronunat de volum i apariia de crpturin mediu.


53/251

53

Acest lucru este cu att mai periculos cu ct, n paralel, are loc creterea concentraiei n sruri i zaharuria mediului i deci creterea presiunii osmotice amediului.

Apa folosit pentru prepararea mediilor decultur trebuie s fie n mod obligatoriu distilat. Maimult, se recomand folosirea apei bidistilate care prezintun grad de puritate superior. Distilarea trebuie fcut ndistilatoare din sticl (tip Pyrex) ntru-ct distilatoarelemetalice pot elibera diferii ioni (Cu2+, Pb2+) n procesul

de distilare (foto 3.1.).Chiar distilatoarele din sticl trebuie splate

foarte bine cnd sunt noi i de regul, apa rezultat din primele 2-3 distilri nu se folosete.

n timpul exploatrii, periodic, se va proceda lasplarea cu acuratee a distilatorului cu ap deionizat.

Apa deionizat se obine cu ajutorul unor aparate speciale numite deionizatoare,

prevzute cu cartuuri filtrante speciale care rein ioni existeni n apa de robinet.Pentru o deionizare mai eficient debitul de ap lsat s treac prin deionizator

trebuie s fie ct mai mic posibil. Se impune, de asemenea, nlocuirea periodic a filtrelor.Trebuie spus c pe lng deionizare i distilare, exist i alte procedee de

purificare a apei, cum ar fi de exemplu, osmoza invers. Ideal este ns s se combine toatecele trei proceduri.

Atunci cnd se tie c apa de la reea este ncrcat cu ioni de tot felul (Pb2+, Ca2+,

Mg2+ etc.), chiar cu germeni, sau c ea provine din foraje i este bogat n sruri, serecomand ca la intrarea n laborator s se monteze o instalaie de filtrare. O astfel deinstalaie presupune montarea unei baterii de cartue filtrante alese n funcie decompoziia chimic a apei i coninutul acesteia n suspensii, germeni etc. Exist filtre pentru sruri de Ca, de Mg, filtre cu crbune pentru germeni, etc.

Pe lng faptul c intr n componena mediilor de cultur, apa mai este folosit n procesul de sterilizare a materialului vegetal nainte de inoculare.

n acest scop se folosete apa bidistilat care se autoclaveaz n prealabil i care sefolosete la cltirea materialului vegetal dup dezinfecia cu diferii ageni sterilizani.

Foto 3.1. Aparat din sticlpentru bidistilarea apei


54/251

54

De asemenea dup cltire, explantele rmn n recipiente cu ap distilat sub hot pn n momentul inoculrii.

Atunci cnd se lucreaz cu explante provenite de la specii care emit uor fenoli serecomand dizolvarea n ap distilat steril a unor substane antioxidante. Frecvent sefolosete polivinilpirolidona (PVP) n concentraie de 0,1%.

n ncheiere trebuie precizat c apa deioniozat i bidistilat produs n laboratortrebuie pstrat n recipiente din plastic etichetate i nchise. Sticla obinuit nu serecomand pentru c ea elimin ioni nedorii de plumb, sodiu, arsenic, etc.

3.3.2. Agenii de solidificare

Mediile de cultur folosite pentru creterea explantelorin vitro se pot realiza subform lichid sau solid (de fapt semisolid).

Mediile solide necesit adugarea unor ageni de solidificare care leag apa iabsorb celelalte componente ale mediului.

Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un bun agent de solidificare sunt:- s fie inert i s nu fie contaminat; s permit circulaia (difuzia) substanelor

minerale, apei, gazelor; s fie stabil dup autoclavare; s aib un punct de

solidificare sczut; s fie ieftin; eventual, s poat fi recuperat i refolosit.Dintre agenii de solidificare, agarul este cel mai larg folosit la culturilein vitro i

nu numai. Agarul este un polizaharid obinut din alga roieGelidium amansii care triete n

Oceanul Indian i Marea Chinei.Se prezint sub form unei pulberi galben murdar care se topete n ap la o

temperatur apropiat de 100C, soluia devenind translucid i se ntrete la o

temperatur de 32-35C. Se folosete n concentraie de 0,6-1,0%. Cel mai bun agar estecel produs de firma Difco Bacto (Noble agar). Exist i sortimente speciale cum ar fiagarul bacteriologic, agarul tip A, E, M, agarul purificat, agarul splat, folosite n lucrrispeciale de microbiologie, culturi de celule i protoplati.

n lipsa agarului pulvis se poate folosi i agarul sub form de solzi sau plci caretrebuie nmuiat n ap i splat repetat cu ap bidistilat, ntru-ct este mai puin pur.

Agaroza este format tot din coloizi marini, prezint un grad nalt de purificare i

este folosit pentru culturi de protoplati sau de celule. Gelific la mai puin de 30C (26-30C) fiind utilizat la prepararea mediilor cu compui termolabili.


55/251

55

Acidul alginic este un acid poliuronic (acidul anhidro-D-manuronic) care arecapacitatea de a se gelifica. Este ideal pentru culturi de protoplati i suspensii celulare dari pentru ncapsularea embrionilor somatici sau a explantelor de diferite feluri n vedereaobinerii seminelor artificiale. Soluiile apoase de acid alginic se gelific la temperaturacamerei n prezena unor cationi (n special a calciului). Lichefierea mediului gelificat se poate realiza prin adugarea unor ageni de chelatare (ex. citraii).

Formarea capsulelor de alginat pentru ncapsularea protoplatilor sau embrionilorsomatici se face prin adugarea n prealabil a acidului alginic (1,75-4,00%) ntr-o soluiecu concentraie sczut de calciu (2mM). Dup amestecare se face sterilizarea prin filtrare

(0,45m) sau autoclavarea.Odat obinut alginatul, se introduc explantele timp de 1-2 secunde, dup care una

cte una acestea sunt trecute ntr-o soluie de CaCl2 (50 mM) unde vor rmne timp de 45de minute pentru formarea capsulei.

Phytagelul (Gelrite) este un heteropolizaharid natural obinut prin purificare dintr-un substrat bacterian i format din acid glucuronic, ramnoz i glucoz. Este cunoscut isub numele de gum Gellan. Produce un gel dens, perfect limpede, la o concentraie dedoar 1,5-2,0%. Se gelific n soluie apoas la 27-31C. Uneori determin apariia

vitrificrii Agargelul este un amestec agar + phytagel care mbin calitile celor doi

componeni. n concentraie de 0,35-0,50% produce un gel semitransparent mult folosit pentru detectarea contaminrilor. n acelai timp este cunoscut pentru reducereavitrificrilor. Este mai ieftin ca agarul normal. Se gelific la 26-28C.

Transfergelul conine hidroxietilceluloz i se obine prin sintez. Este folosit nconcentraie de 2,5% pentru ncapsularea embrionilor somatici, a minibutailor i

apexurilor precum i n tehnicile de seed drilling (semnare n flux lichid). mpreun cusoluiile nutritive cu care se amestec formeaz un amestec vscos care se autoclaveaz.Prin autoclavare pH-ul soluiei scade cu 0,5-1 uniti. Pentru autoclavare trebuie folositerecipiente cu volum de 4 ori mai mare dect cel al soluiei care conine Trans

Microinmultirea plantelor

Documents

Transcript of Microinmultirea plantelor