Microbiologia Degli Alimenti (Testo)

8/9/2019 Microbiologia Degli Alimenti (Testo)

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Prof. E.Neviani, Appunti di Microbiologia degli Alimenti

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Microrganismi e analisi dei microrganismi

IntroduzioneGli alimenti sono prodotti molto particolari caratterizzati dallessere, nel loro insieme,indispensabili alla vita e dallavere un impatto diretto sulla salute e sul benessere delluomo.

Nel 2003 lindustria alimentare italiana divenuta il secondo settore produttivo nazionale. Laproduzione di alimenti non , da tempo, pertanto un settore marginale di intervento ma coinvolgerisorse, lavoro e investimenti importanti che sono parte essenziale delleconomia nazionale. Inoltrelindustria alimentare coinvolge un numero di utenti enorme se comparato a quello di altri settori. Iltermine consumatori, in questo caso tende per numero a sovrapporsi a quello degli esseri viventi.Si pu scegliere la tipologia di alimento da consumare ma non di evitare in toto il consumo.In termini generali garantire la sicurezza degli alimenti e, quindi, la qualit della vita delconsumatore un compito prioritario di chi produce o comunque di tutti gli operatori chepartecipano alla filiera di produzione degli alimenti.La sicurezza deve essere considerata una conditio sine qua non della qualit di un alimento. Anzi parte integrante della qualit stessa, senza la quale, questultima non pu esistere. Allo stessotempo la necessit e la volont di sicurezza devono fare i conti con la possibile realizzazione

tecnologica. E ben noto che la pur auspicabile sicurezza assoluta (rischio zero) nella filiera diproduzione agro-alimentare , purtroppo, quasi sempre tecnicamente irrealizzabile; la presenza dipericoli di differente natura (presenza, sopravvivenza o contaminazione delle materie prime, deisemilavorati o dei prodotti finiti da parte di agenti biologici, chimici o fisici) ed il rischio chequesti si concretizzino riscontrabile sia alla produzione e trasformazione della materia prima, chenel corso della commercializzazione e conservazione del prodotto finito.Il rischio pu essere ridotto ai minimi termini, ma esiste sempre una probabilit, anche minima,che un evento negativo possa accadere. La frequenza con cui particolari eventi negativi, conconseguente rischio per la salute del consumatore, possono avvenire, varia da prodotto a prodotto,in relazione a molti fattori di ordine biologico e tecnologico che saranno pi approfonditamentediscussi in seguito.La certezza assoluta dellassenza di pericolo per alcuni prodotti potrebbe comportare limpiego ditrattamenti tecnologici di intensit tale da danneggiare e rendere inappetibile lalimento stesso; adesempio possibile impiegare trattamenti termici di intensit e durata che rendano impensabile lasopravvivenza di qualsiasi forma di contaminazione biologica ma, al contempo, gli stessitrattamenti indurrebbero modificazioni profonde delle caratteristiche nutrizionali ed organolettichedellalimento tali da renderlo non edibile.Nel determinare la realizzabilit, o meglio la possibilit di raggiungere, livelli di elevatissimasicurezza anche laspetto economico ha un rilievo essenziale; garantire la sicurezza comporta infattidei costi che devono essere proporzionati al valore intrinseco del prodotto. La sicurezza nondovrebbe pertanto diventare un valore aggiunto dellalimento, da tradurre in costo aggiuntivo comeper altri fattori di pregio, ma deve essere condizione preliminare alla commercializzazione delprodotto. Il prodotto sicuro non pu essere considerato una specialit per nicchie di consumo. La

salubrit deve essere garantita quindi per tutti i consumatori dai banchi delle migliori botteghespecializzate in prodotti di alta gamma agli scaffali degli hard discount. Ci nonostante lasicurezza, come detto, impone dei costi di produzione e questi costi devono essere compatibili, allostesso tempo, con la garanzia della salute del consumatore e con la sopravvivenza delle produzioni.Deve esistere un livello soglia di sicurezza, il pi elevato possibile, che deve essereobbligatoriamente raggiunto, al di sotto del quale la commercializzazione deve essere evitata ed ilconsumatore allertato.Sia nei paesi in via di sviluppo che in quelli industrializzati, anche se con differenti motivazioni ecause, le malattie indotte dalla presenza di microrganismi patogeni negli alimenti rimane una dellemaggiori cause di malattia per gli uomini. Secondo i dati forniti dalla World Health Organization


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(WHO) le morti conseguenti alle tossinfezioni alimentari, considerando anche quelle imputabili alconsumo di acqua non potabile, superano ampiamente i venti milioni lanno. Ovviamente, i casi dimalattie ad esito non letale indotte dal consumo di alimenti si possono misurare in un ordine difattori molto superiore.Conseguentemente tutto il comparto alimentare deve considerare la valutazione dei rischi diorigine microbiologica associati alla produzione, il loro monitoraggio e la loro costante riduzione,

uno dei settori di intervento prioritari.

Il mondo dei microrganismi

La cellula

Tutti gli esseri viventi sono costituiti da cellule. Si tratta di strutture biologiche che contengonolinformazione di quanto necessario alla sopravvivenza della cellula ed il sistema biochimico direalizzazione di questa informazione. La cellula di fatto un contenitore che trattieneselettivamente al suo interno il necessario per lo sviluppo, la moltiplicazione e leventualedifferenziazione. Questo particolare contenitore biologico attraverso una serie di differenti barriere

definisce il suo rapporto con lambiente esterno, sia che questo sia rappresentato da materiainanimata o, piuttosto, da altre cellule viventi ad esso correlate o estranee.Il numero di cellule che contribuisce alla morfologia ed al funzionamento degli organismiappartenenti al mondo vivente oscilla dalla singola cellula ai miliardi di unit. In particolare il regnoanimale e vegetale sono spesso caratterizzati da organismi costituiti da un numero di celluledifferenziate e specializzate che si organizzano in tessuti ed organi con differenti funzionifisiologiche, variabile da individuo a individuo ma, comunque, sempre molto elevato.I microrganismi, che sono una parte essenziale del mondo vivente, al contrario, sono per lo piunicellulari. In questo senso si tratta di strutture viventi singolari, se comparate alla complessit edallorganizzazione degli organismi superiori.I microrganismi sono infatti forme di vita microscopiche, anche molto differenti le une dalle altreper morfologia, fisiologia e metabolismo. Nel caso dei batteri le loro dimensioni possono variareda poche frazioni decimali di micron ad alcune unit, come nel caso dei bacilli; i lieviti presentanocellule pi grandi rispetto ai batteri con dimensioni di norma comprese tra i due e i dieci micron;le muffe, che invece presentano strutture pluricellulari ad ife, possono raggiungere dimensionimaggiori.Se confrontata con levoluzione delle conoscenze scientifiche in genere, la presa di conoscenza daparte delluomo di queste semplici forme di vita stata molto tardiva. La conferma dellesistenza diun mondo vivente invisibile, o troppo piccolo per essere notato ad occhio nudo, risale infatti al1600, quando fu scoperto il microscopio. Da quel momento i dubbi e le ipotesi si trasformarono inevidenze sperimentali e si svilupp la microbiologia. Negli anni successivi le ricerche dei primipionieri di questa scienza trovarono concrete connessioni tra la presenza dei microrganismi e la vitadelluomo: si compresero, ad esempio, i collegamenti tra alcuni microrganismi e la comparsa dimalattie o le cause della modificazione degradativa di differenti prodotti. La produzione di alimentifermentati come lo yogurt o il formaggio considerata fino a quel momento come magica trova inquesto modo una sua iniziale giustificazione scientifica.I microrganismi, allo stato attuale, sono compagni di viaggio, coinquilini del nostro mondo con iquali necessario trovare forme di coesistenza efficaci, sicure ed anzi possibilmente vantaggiose.Come anticipato, in genere col termine di microrganismi si definiscono gli esseri viventiunicellulari, come i batteri e i lieviti, oppure capaci di formare strutture pluricellulari, come nel casodelle ife del micelio delle muffe, caratterizzate da strutture pi articolate costituite tuttavia dacellule tutte simili tra loro.


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Si tratta comunque di organismi viventi molto semplici, se commensurati a forme di vita superiorecome quelle presenti nel regno vegetale ed animale, che al contrario comprendono forme di vitapluricellulari ed in particolare un elevato grado di differenziazione, organizzazione especializzazione.Le cellule degli eucarioti superiori, essendo solo parte di organismi pi complessi, pur contenendonel loro genoma tutte le informazioni necessarie allo sviluppo dellindividuo, grazie a complessi

sistemi di regolazione, ne esprimono solo la parte funzionale, in relazione ai compiti della cellula inquella parte dellorganismo ed alla fisiologia dellessere vivente.Nel mondo microbico, al contrario, lunit fondamentale della vita, la cellula, non differenziata econtiene ed esprime tutte le potenzialit fisiologiche e metaboliche che le permettono disopravvivere e moltiplicarsi anche singolarmente; cellula e organismo in questo caso sono entitche si sovrappongono e di fatto ogni cellula lorganismo stesso.In verit altre forme di vita ancora pi semplici, i virus, sono assimilabili al mondo microbico. Ivirus possiedono una struttura sub-cellulare, composta solo da un singolo o doppio filamento diDNA o RNA, e necessitano per moltiplicarsi di cellule ospiti rispetto alle quali si comportano comeveri parassiti.I principali componenti del mondo microbico noti fino ad oggi sono i batteri, i lieviti e le muffe;distinguibili in differenti famiglie, generi, specie e biotipi che meglio tratteremo in seguito.

I batteri sono singole cellule procariote, pi semplici rispetto alla cellula eucariote, che simoltiplicano per duplicazione binaria del singolo individuo (Figg. 1 e 2). I lieviti sono eucariotiunicellulari dotati di riproduzione sessuata o asessuata (Fig. 3). Le muffe sono invece eucariotipluricellulari e possono creare strutture ramificate in ife che le rendono visibili senza lausilio delmicroscopio; a differenza di quanto osservabile negli eucarioti superiori, tutte le singole cellulesono uguali e totipotenti ed ognuna di loro in grado di moltiplicarsi indipendentemente dalle altre.Alcuni batteri, gli sporigeni, sono in grado di dare origine a forme di resistenza, le spore, chelasciano la cellula in uno stato di letargo metabolico e le permettono di sopravvivere per lungotempo, in condizioni ostili ed in assenza di sostanze nutritive. In condizioni ottimali la sporagermina e d nuovamente origine alla cellula batterica vitale (Fig. 4).Nel caso delle muffe le spore sono delle forme cellulari utili alla moltiplicazione; si formano sullasuperficie delle ife del micelio e quindi trasportate nellambiente da vettori come aria, acqua, insettio altro, contaminano nuovi substrati e permettono a nuove ife di formarsi ed invadere il prodotto.La cellula microbica la pi piccola unit dotata di vita autonoma; i virus sono infatti strutture didimensioni minori ma incapaci di riprodursi in assenza di organismi ospiti che supportino lareplicazione della loro matrice costituita da sequenze di DNA o RNA.La dimensione e la forma della cellula sono definite dalla parete cellulare che rappresenta non solounimpalcatura che dona rigidit e resistenza meccanica al microrganismo, ma anche il suoconfine.La parete cellulare la barriera che separa linterno della cellula dallambiente, definisce lin e loutcellulare; anche il distretto cellulare, che essendo a diretto contatto con lesterno, agisce comeelemento sia di tutela e difesa della cellula che di comunicazione e rapporto con lhabitat e con lesue modificazioni.La struttura parietale impedisce lesplosione o limplosione della cellula in ragione del differenzialedi pressione rispetto lesterno e, pi in generale, permette che le sollecitazioni esterne e gli urticellulari non abbiano effetti drammatici per il microrganismo.La parete della cellula procariotica costituta principalmente da peptidoglicano, acidi teicoici,lipidi e proteine. Il peptidoglicano una struttura polimerica costituita da acido acetilmuramico eN-acetilglucosamina cui sono legate altre catene peptidiche che conferisce la rigidit alla cellula, .In base alla minore o maggiore presenza di lipidi nella parete, i batteri si differenzianorispettivamente in Gram + e Gram . La differente composizione, utilizzata a fini tassonomici,conferisce caratteristiche funzionali e di capacit di trasporto, di resistenza o sensibilit ad enzimi(muramidasi) e sostanze antibatteriche e pi in generale di interazione con lambiente.


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Nella parte esterna della parete possono essere presenti strutture flagellari, che facilitano la mobilitdella cellula e i fenomeni di chemiotassi, ed i pili e le fimbrie, che invece sembrano favorireladesione a differenti superfici. La parete pu essere ricoperta da capsule polisaccaridiche e dastrutture proteiche extraparietali, dette S-layer il cui ruolo ancora in discussione.La parete anche coinvolta nei fenomeni di aggregazione cellulare, adesione alle superfici,resistenza e/o recepimento di particelle virali ed in altre funzioni fisiologiche che travalicano la

semplice resistenza strutturale.La parete di alcuni microrganismi sede di enzimi necessari per lidrolisi di macromolecolepresenti nel substrato, le cui dimensioni sono incompatibili con lingresso nella cellula. Lattivitenzimatica favorisce la produzione di composti di minor taglia molecolare che possono penetrareallinterno del microrganismo, dove vengono utilizzati a fini plastici o per il metabolismoenergetico. Per esemplificare questo tipo di funzionamento si pu prendere ad esempio il sistemaproteolisi di alcuni batteri che dispongono di proteasi, peptidasi ed enzimi ad attivit degradativio di trasformazione degli aminoacidi. Si tratta di sistemi complessi differentemente collocati nellacellula il cui complesso di attivit permette una scissione delle macromolecole proteiche allesternodella cellula, lingresso e la completa demolizione ed il riutilizzo nel citoplasma.In contatto con la parete troviamo la membrana citoplasmatica; si tratta di un distretto cellulare acarattere lipofilo costituito in gran parte da una variet di molecole lipidiche complesse, in

particolare fosfolipidi, organizzate in modo da rivolgere verso lesterno le componenti idrofile. Lafunzione principale di questa struttura riconducibile a quella di un filtro che discrimina ci chepu entrare ed uscire dalla cellula. Trattiene il citoplasma e attraverso dei sistemi di trasporto, attivio passivi, seleziona lingresso dei nutriliti e lo smaltimento dei residui metabolici di scarto. Si trattadi unazione selettiva che per alcune molecole comporta una diffusione facilitata e per altre deisistemi di trasporto attivo che coinvolgono specifiche proteine di trasporto e carriers.In realt il confine tra parete e membrana non sempre semplice da definire, in particolare in alcunecellule procariote. Alcuni strutture di trasporto appartengono ad entrambi i distretti cellulari o sitrovano alla loro interfaccia. Alcune proteine ad attivit enzimatica appartengono alla parete per laloro parte idrofila mentre le zone idrofobiche della molecola penetrano nella membrana e siintrecciano con le sue componenti strutturali. Nei batteri Gram- i rapporti tra parete cellulare emembrana sono pi intrecciati: la membrana costituita da due strati, uno esterno ed uno interno,avvolge la parete cellulare. In alcuni enterobatteri nella membrana esterna si ritrovano componentilipopolisaccaridiche essenziali allattivit di specifiche endotossine.Alla membrana sono associate differenti attivit enzimatiche necessarie per lulteriore demolizionedi specifici substrati, nel trasporto selettivo di zuccheri, peptidi e sali minerali e nel mantenimentodelle condizioni chimico-fisiche ottimali del citoplasma. La membrana una barriera osmoticaselettiva, deputata a mantenere un ambiente intracellulare il pi favorevole possibile rispetto allecondizioni esterne. Il mantenimento di condizioni citoplasmatiche di acidit o di concentrazioneionica, compatibili con la corretta conformazione delle proteine citoplasmatiche e con lattivitenzimatica intracellulare, affidato a sistemi di trasporto attivo presenti nella membrana che creanoe mantengono un differenziale di concentrazione con lesterno di composti potenzialmente tossici ocomunque dannosi alla cellula. Queste attivit costano energia alla cellula e variano a seconda dellaspecie.Nel citoplasma della cellula avvengono i biochimismi essenziali alla vita del microrganismo. Ilcitoplasma contiene tutti gli elementi che permettono il funzionamento della cellula. Semplificando,il funzionamento del microrganismo dal punto di vista biochimico garantito dal flusso diinformazioni DNA-RNA-Proteine; il potenziale della cellula contenuto nel DNA, in relazione allafase di crescita cellulare e degli stimoli che provengono dallambiente, viene prima trascritto inRNA e quindi tradotto in proteine a differente funzionalit metabolica e fisiologica. Lespressionedel genotipo in fenotipo soggetta a regolazioni rigorose e flessibili, che da un lato non consentonola produzione di ci che non utile alla cellula e dallaltro garantiscono la capacit delmicrorganismo di rispondere, reagire, alle sollecitazioni dellambiente.


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Nel citoplasma oltre il cromosoma batterico possiamo trovare i plasmidi, ovvero filamenti di DNAextracromosomali dotati di autonoma capacit di replicazione. I plasmidi possono codificare perfenotipi di grande importanza per la cellula, come attivit enzimatiche determinanti per lafermentazione di alcuni zuccheri, la capacit di produrre alcune sostanze ad attivit antibiotica, laresistenza ad antibiotici, la sensibilit o la resistenza a batteriofagi, la produzione di enzimiproteolitici e di composti aromatici. I plasmidi possono integrarsi nel cromosoma batterico oppure

rimanere in forma libera nel citoplasma. Per loro natura i plasmidi non si replicano stabilmentecome il DNA cromosomale e i caratteri fenotipici codificati da plasmidi possono essere non stabili.La frequenza con cui possono essere persi i plasmidi nel corso della riproduzione cellulare variabile da specie a specie e rappresenta uno degli elementi che giustificano le modificazioni cheinsorgono nel potenziale del microrganismo. Alcune specie batteriche hanno un elevata capacitdi trasferire in altri microrganismi alcuni plasmidi, detti coniugativi. Questo fenomeno di granderilievo nellinsorgere di nuovi biotipi con differenti potenzialit metaboliche; nel caso dei germipatogeni lacquisizione di plasmidi che inducano vantaggi competitivi o resistenze ambientalimaggiori pu rappresentare un pericolo per linsorgenza di nuovi germi a maggiore efficaciapatogena.Nel citoplasma sono inoltre presenti i ribosomi, organelli che rappresentano il distretto cellularededicato alla traduzione del RNA messaggero ed alla sintesi delle proteine. Sempre nel citoplasma

dei procarioti possono essere presenti inclusioni di materiale nutritivo di riserva.Lattivit enzimatica oltre che dalla presenza di specifici substrati e dalla concentrazione deiprodotti condizionata da differenti parametri chimico-fisici quali lacidit, la disponibilit di acqualibera, la forza ionica e la temperatura. Come gi sottolineato, per il funzionamento della cellulamicrobica risulta essenziale mantenere il citoplasma nelle condizioni che garantiscano la stabilit edelle attivit enzimatiche essenziali alla vita cellulare (Tab.1.1).La capacit di adeguarsi a differenti condizioni di acidit, concentrazione salina e temperatura sonoparametri impiegati per il riconoscimento delle diverse specie microbiche ed hanno un evidentesignificato tecnologico in relazione della capacit della cellula di adattarsi al substrato ed allecondizioni di processo.Alcune specie bacillari Gram + sono caratterizzate dalla possibilit di formare endospore, forme diresistenza elaborate nel citoplasma la cui sintesi viene indotta in differenti momenti della vitacellulare. I fenomeni che determinano la sporificazione in determinati momenti non sono ancoracompletamente compresi anche se assodato che la sporificazione coinvolge le cellule in fase didifficolt metabolica conseguenti a carenza di nutriliti o a fenomeni ambientali ostili alla formavegetativa.Ogni cellula pu generare una sola spora. La formazione di endospore regolata da un numeromolto elevato di geni e da fattori sigma che in risposta a stimoli ambientali inducono la produzionedi profonde modificazione nella composizione, nella morfologia e nella fisiologia del batterio. Talimodificazioni iniziano con una introflessione della membrana citoplasmatica, che quindi ingloba ilcromosoma batterico e poi sviluppa un sistema articolato di membrane che circondano edefiniscono lendospora.La spora, di forma sferica od ovoidale, una forma di resistenza cellulare fortemente disidratata,ricca di dipicolinato di calcio (circa il 10% del peso della spora), una sostanza che favorisce laresistenza termica e alle sostanze chimiche, ed dotata di una complessa struttura di parete emembrane. Grazie a queste caratteristiche le spore batteriche possono sopravvivere a lungo incondizioni di quiescenza e possiedono capacit di resistenza incompatibili con la forma vegetativae superiori di numerosi ordini di fattori.Il fenomeno speculare alla sporificazione la germinazione, processo nel corso del quale a partiredalla spora si ricrea la forma vegetativa della cellula batterica (Fig. 4). Normalmente questofenomeno molto pi veloce rispetto alla sporificazione e viene favorito da trattamenti di stresssubletali, quali trattamenti termici a 70-80 C per alcuni minuti. La germinazione si articola indifferenti fasi che si comportano con lesione della tunica sporale e la formazione e lesocrescita


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della forma vegetativa. Sia la sporificazione che la germinazione comportano lattivazione di genispecifici, che inducono la profonda modificazione della cellula, e sono quindi soggetti a fattori diregolazione rigorosi.Gli eumiceti sono eucarioti, quindi microrganismi dotati di una struttura cellulare pi organizzata,che si differenziano dai batteri per le maggiori dimensioni e, come detto, per la struttura cellularepi complessa. Morfologicamente gli eumiceti si presentano sotto due forme: quella unicellulare,

tipica dei lieviti, che solo in rari casi si organizza in strutture pseudomiceliari, e quellamulticellulare con strutture filamentose, dette ife, tipica delle muffe. In questultimo caso linsiemedelle ife costituisce il micelio che pu raggiungere dimensioni anche molto grandi; si pudistinguere il micelio vegetativo che aderisce al substrato, assorbe i nutriliti e si propaga sullasuperficie, ed uno aereo, pi superficiale, dove si formano le spore. Queste spore hannoprincipalmente una funzione riproduttiva ma, essendo maggiormente resistenti agli stress ambientalirispetto alle cellule miceliari rappresentano anche una forma di resistenza per la muffa, sebbene taleresistenza sia sicuramente inferiore e non paragonabile a quella osservabile nelle spore batteriche.Le cellule dei miceti si differenziano dai batteri in quanto presentano un nucleo organizzato, checontiene il cromosoma, circondato da una membrana; esternamente le cellule sono dotate di unacapsula extra-parietale, una parete ed una membrana citoplasmatica. Nel citoplasma si riconosconoil reticolo endoplasmatico, i mitocondri ed i ribosomi.

Cellula procariota i batteriI batteri sono cellule microbiche procariote; tra i batteri numerose sono le specie utili nel settorealimentare, ma tra questi microrganismi troviamo anche la maggior parte delle specie direttamentepatogene per luomo. Le cellule procariote sono morfologicamente riconducibili fondamentalmentea 4 morfologie principali

1. Forma coccica o sferica (fig.1)2. Forma bacillare o a bastoncino (fig.2)3. Forma a vibrio o bastoncino ricurvo4. Forma a spirale

La parete della cellula procariote costituta principalmente da peptidoglicano, ovvero da unastruttura polimerica costituita da acido acetilmuramico e N-acetilglucosamina che conferisce larigidit alla cellula, cui sono legate altre catene peptidiche. In base alla minore o maggiore presenzadi lipidi nella parete, i batteri si differenziano rispettivamente in Gram + e Gram . La differentecomposizione non implica solo laspetto tassonomico, ma anche funzionale e di capacit ditrasporto, di resistenza o sensibilit ad enzimi (muramidasi), sostanze antibatteriche e pi ingenerale di interazione con lambiente.Nella parte esterna della parete possono essere presenti strutture flagellari, che facilitano la mobilitdella cellula facilitando i fenomeni di chemiotassi, i pili e le fimbrie, che sembrano favorireladesione a differenti superfici. La parete pu essere ricoperta da capsule polisaccaridiche e dastrutture proteiche extraparietali, dette S-layer il cui ruolo ancora in discussione. Si tratta distrutture i cui monomeri sono sintetizzati allinterno della cellula e quindi trasportati alla superficie.Nei batteri Gram+ a ridosso della parete, allinterno della cellula, si trova la membranacitoplasmatica nella quale sono presenti i mesosomi, caratteristiche invaginazioni che svolgono unruolo nellambito della replicazione cellulare.Nei batteri Gram- i distretti della parete cellulare e della membrana sono pi intrecciati. Lamembrana cellulare costituita da due strati , uno esterno ed uno interno, che avvolgono la paretecellulare. Nei batteri Gram - , di norma , lo strato di pepticoglicano che costituisce la parete moltopi sottile rispetto a quello caratteristico della cellula Gram +. Tra la sottile parete e la membranainterna si trova lo spazio periplasmico che un distretto cellulare dove si concentrano particolariattivit enzimatiche. La membrana esterna presenta dei canali di ingresso preferenziali e selettiviper alcune molecole, detti porine, che permettono la permeazione delle sostanze idrofile nellamatrice liofila. In alcuni batteri patogeni (enterobatteri) nella membrana esterna si ritrovanocomponenti liposaccaridiche essenziali allattivit di specifiche endotossine. Per esempio nella


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membrana esterna di Salmonella sono presenti unit polisaccaridiche, che costituiscono un sitoantigenico, utilizzato anche per la classificazione della specie.Come detto nel citoplasma troviamo il cromosoma batterico. Sempre nel citoplasma possiamotrovare i plasmidi; si tratta di filamenti di DNA extracromosomali dotati di autonoma capacit direplicazione. I plasmidi possono codificare per fenotipi di grande importanza per la cellula, comeattivit enzimatiche determinanti per la fermentazione di alcuni zuccheri, la capacit di produrre

alcune sostanze ad attivit antibiotica, la resistenza ad antibiotici, la sensibilit o la resistenza abatteriofagi, la produzione di enzimi proteolitici e di composti aromatici. I plasmidi possonointegrarsi nel cromosoma batterico oppure rimanere in forma libera, autonoma, nel citoplasma. Perloro natura i plasmidi non si replicano stabilmente come il DNA cromosomale e i caratterifenotipici portati da plasmidi possono essere instabili. La frequenza con cui possono essere persi iplasmidi nel corso della riproduzione cellulare variabile da specie a specie e rappresenta unodegli elementi che giustificano le modificazioni che insorgono nel potenziale del microrganismo.Alcune specie batteriche hanno una elevata capacit di trasferire in altri microrganismi alcuniplasmidi, detti coniugativi. Questo fenomeno di grande rilievo nellinsorgere di nuovi biotipi condifferenti potenzialit metaboliche; nel caso dei germi patogeni lacquisizione di plasmidi cheinducano vantaggi competitivi o resistenze ambientali maggiori pu rappresentare un pericolo perlinsorgenza di nuovi germi a maggiore efficacia patogena.

Nel citoplasma sono inoltre presenti i ribosomi, organelli che rappresentano il distretto cellularededicato alla traduzione del RNA messaggero ed alla sintesi delle proteine. Sempre nel citoplasmadei procarioti possono essere presente inclusioni di materiale nutritivo di riserva.Alcune specie bacillari Gram + sono caratterizzate dalla possibilit di formare endospore. Si trattadi forme di resistenza elaborate nel citoplasma la cui formazione viene indotta in differentimomenti della vita cellulare, solitamente collegati a fattori stress per la cellula. Si forma una solaspora che quindi si libera della forma vegetativa che si lisa. Questa capacit, che offre grandivantaggi per la sopravvivenza della specie batterica, regolata da un numero molto elevato di geni(alcune centinaia) e da fattori sigma che in risposta a stimoli ambientali inducono la produzione diprofonde modificazione nella composizione, nella morfologia e nella fisiologia del batterio. Talimodificazioni iniziano con una introflessione della membrana citoplasmatica, che quindi ingloba ilcromosoma batterico e poi sviluppa un sistema articolato di membrane che circondano edefiniscono lendospora.La spora, di forma sferica od ovoidale, una forma di resistenza cellulare fortemente disidratata,ricca di dipicolinato di calcio (circa il 10% del peso della spora), una sostanza che favorisce laresistenza termica e alle sostanze chimiche, ed dotata di una complessa struttura di parete emembrane. Grazie a queste caratteristiche le spore batteriche possono sopravvivere a lungo incondizioni di quiescenza e possiedono capacit di resistenza incompatibili con la forma vegetativae superiori di numerosi ordini di fattori.I fenomeni che determinano la sporificazione in determinati momenti non sono ancoracompletamente compresi anche se assodato che la sporificazione coinvolge le cellule in fase didifficolt metabolica conseguenti alla carenza di nutriliti o a fenomeni ambientali ostili alla formavegetativa.Il fenomeno speculare alla sporificazione la germinazione, processo nel corso del quale a partiredalla spora si ricrea la forma vegetativa della cellula batterica (fig 4). Normalmente questofenomeno molto pi veloce rispetto alla sporificazione e viene indotto da trattamenti di stresssubletali. Si articola in differenti fasi che si comportano con lesione della tunica sporale e laformazione e lesocrescita della forma vegetativa. Sia la sporificazione che la germinazionecomportano lattivazione di geni specifici, che inducono la profonda modificazione della cellula, esono quindi soggetti a fattori di regolazione rigorosi.


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Cellula Eucariote eumiceti

Gli eumiceti sono microrganismi dotati di cellula eucariota, quindi con una struttura cellulare piorganizzata. Si tratta di microrganismi largamente diffusi in natura che si differenziano dai batteriper le maggiori dimensioni e, come detto, per la struttura cellulare pi complessa.Morfologicamente gli eumiceti si presentano sotto due forme: quella unicellulare, tipica dei lieviti,che solo in rari casi si organizza in strutture pseudomiceliari, e quella multicellulare con strutture

filamentose, dette ife, tipica delle muffe. In questultimo caso linsieme delle ife costituisce ilmicelio che pu raggiungere dimensioni anche molto grandi; si pu distinguere il miceliovegetativo che aderisce al substrato,assorbe i nutriliti e si propaga sulla superficie, ed uno aereo, pisuperficiale, dove si formano le spore. Queste spore hanno principalmente una funzione riproduttivama, essendo maggiormente resistenti agli stress ambientali rispetto alle cellule miceliarirappresentano anche una forma di resistenza per la muffa, sebbene tale resistenza sia sicuramenteinferiore e non paragonabile a quella osservabile nelle spore batteriche.Gli eumiceti, oltre al meccanismo di fissione binaria mitotica, tipico dei batteri, possiedono siasistemi di riproduzione sessuata attraverso le spore che asessuata con formazione di conidi osporangiospore. Per la riproduzione sessuata necessario che due cellule specializzate, chiamategameti, si fondano assieme. Le spore sessuate possono essere prodotte entro aschi, cio conitori aforma di sacchi, o allesterno nei basidiomiceti.

Le cellule dei miceti si differenziano da quelle procariote dei batteri in quanto presentano un nucleoorganizzato, che contiene il cromosoma, circondato da una membrana cellulare; esternamente lecellule sono dotate di una capsula extra-parietale, una parete ed una membrana citoplasmatica. Nelcitoplasma si riconoscono il reticolo endoplasmatico, i mitocondri ed i ribosomi.

Metabolismo microbico

Le cellule microbiche, come ogni forma di vita, necessitano per crescere e moltiplicarsi di energiae di materiale per costruire o sostituire i componenti cellulari.Lenergia pu essere recuperata dalla luce, da parte degli organismi fotosintetici, o dallossidazionedi composti chimici, organici od inorganici, mentre il carbonio necessario per la costruzione delmateriale biologico della cellula pu essere recuperato alternativamente dalla materia organica(eterotrofi) o dalla CO2 (autotrofi). I principi della termodinamica definiscono che la materia evolvespontaneamente verso stati di massima entropia. La vita cellulare al contrario un sistemaorganizzato e regolato che funziona solo grazie allapporto di energia che contrasta la naturaletendenza della materia verso lentropia.In questo senso la vita della cellula corrisponde ad un flusso di energia e di elettroni creatoattraverso reazioni biochimiche specifiche. Questa energia viene creata attraverso reazioni diossidoriduzione.Il trasporto di energia avviene attraverso la sintesi di molecole che contengono legami ad elevatolivello energetico e che vengono accumulate e quindi rese disponibili per le reazioni di sintesi ocomunque per le trasformazioni energeticamente sfavorevoli. Si tratta di molecole molto reattive(AMP, ADP, ATP) costituite di adenosina mono- , di- o tri-fosforilate. Il flusso di energia nellacellula avviene grazie alla formazione o scissione di legami fosforilati con la materia organica e ledifferenti forme di adenosina fosforilata costituiscono sistemi di accumulo, riserva, trasporto ocessione di energia nei diversi processi metabolici.A fianco del flusso di energia si crea un parallelo flusso di elettroni che permette lalternarsi dellereazioni di ossido-riduzione coinvolte nei pathway metabolici della cellula. Il flusso di elettroni cheaccompagna i processi metabolici nella cellula garantito da altre molecole (NAD-NADH2,NADP-NADPH2) in grado di acquisire e cedere elettroni e quindi di trasferirli alle reazioni diossidoriduzione trasportandoli allinterno dei pathway metabolici della cellula.I processi di ossidazione che avvengono nella cellula microbica prevedono differenti biochimismiin relazione al sistema previsto per i processi di ossidoriduzione ed in particolare alla molecolautilizzata come accettore finale degli elettroni prodotti dallossidazione dei substrati:


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respirazione aerobia, con O2 come accettore finale di elettroni che viene ridotto ad acqua. respirazione anaerobia, con composti inorganici come accettori finali di elettroni fermentazione, con composti organici come accettori finali di elettroni

Nella gran parte dei casi i microrganismi di interesse alimentare sono eterotrofi e quindi richiedonoper il loro sviluppo la presenza di sostanza organica.Nei microrganismi aerobi la materia organica pu essere trasformata completamente ad acqua ed

anidride carbonica. Il rendimento energetico dellossidazione di un monosaccaride con 6 atomi dicarbonio porta alla formazione di 38 molecole di ATP. La respirazione comporta, comunque, in unprimo tempo la produzione di acido piruvico (fase nota come glicolisi) che poi viene trasformato ecompletamente ossidato attraverso il ciclo degli acidi tricarbossilici.I microrganismi anaerobi, che non dispongono di una completa catena enzimatica per il trasportodegli elettroni allossigeno, devono ridurre altre componenti che si generano nel corso del processodi fermentazione o che trovano nel substrato. In questo caso il rendimento energetico dellademolizione della sostanza organica molto inferiore rispetto alla respirazione aerobia; da unamolecola di glucosio si possono ottenere al massimo due molecole di ATP.In entrambi i casi si tratta di rendimenti teorici che come vedremo meglio in seguito risultanofortemente condizionati e modificati dalle condizioni di crescita e dalla tipologia di substrato.Lossidazione dei composti organici in acido piruvico comporta la contemporanea riduzione di un

altro composto. Nella cellula questo composto il NAD che viene ridotto a NADH2. In altre fasidel metabolismo, a sua volta, il NAD viene prodotto per ossidazione del NADH2 e contemporaneariduzione di altre molecole che funzionano da accettori di elettroni.Come detto i microrganismi aerobi attraverso una articolata catena di trasporto di elettroniutilizzano lossigeno come accettore terminale di elettroni. Altri composti come i solfuri e i nitritipossono fungere da accettori di elettroni nella respirazione anaerobia.Nel caso della fermentazione laccettore finale di elettroni spesso una molecola organica prodottanel corso della degradazione del carboidrato. Di norma lo stesso acido piruvico che pu essereridotto ad acido lattico (fermentazione lattica), alcool etilico (fermentazione alcolica) e/o in altrenumerose sostanze in relazione alla metabolismo della specie microbica (Tab. 1.2).Alri substrati di crescita per i microrganismi possono essere carboidrati a minor peso molecolarerispetto agli esomonosaccaridi, come zuccheri pentosi oppure acidi organici e alcoli. Anche altremolecole organiche, come ad esempio peptidi e amminoacidi, possono essere degradate daimicrorganismi con recupero di energia per la cellula.La capacit di utilizzare le diverse sostanze organiche presenti in natura come risorsa energetica oin funzione plastica ed il tipo di trasformazione-ossidazione delle stesse, con produzione di nuove epi semplici molecole, varia in funzione delle differenti specie microbiche e del potenzialeenzimatico e biochimico delle cellule di quella specie.Non tutti i microrganismi si adattano a tutti i substrati e le differenti famiglie microbiche presentanoesigenze nutrizionali molto varie e riconducibili alla minore o maggiore capacit della specie disintetizzare autonomamente o di recuperare dallambiente le sostanze essenziali per la crescita.Microrganismi poco esigenti necessitano di forme semplici di carbonio e azoto, mentre imicrorganismi pi esigenti per svilupparsi devono trovare nel substrato specifici carboidrati, forme

azotate pi complesse, vitamine e sali minerali.Lenergia quindi non di per s sufficiente alla crescita microbica e i differenti microrganismipresentano diverse esigenze nutrizionali in sostanze essenziali alla crescita ed al funzionamentodella cellula perch non sintetizzabili dai microrganismi.La presenza nel substrato di quantit sufficienti e nel corretto rapporto di composti essenziali risultadiscriminante nel permettere la crescita batterica delle differenti specie.Tra i componenti necessari alla crescita microbica alcuni amminoacidi risultano essenziali per lasintesi delle proteine cellulari e devono essere recuperati dal substrato di crescita. Le proteine e ipeptidi possono essere idrolizzati ad amminoacidi da complessi sistemi enzimatici presenti nelledifferenti specie microbiche. Si tratta di proteasi e peptidasi che idrolizzano con differente livello di


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specificit particolari legami peptidici, sia in relazione al tipo di aminoacido che alla sua posizionenella catena peptidica. Lattivit enzimatica pu riguardare legami allinterno della sequenzaproteica (endoproteasi) o essere limitata agli amminoacidi disponibili allN-terminale(aminopeptidasi) o al C-terminale della proteina (carbossipeptidasi). Sono poi note attivitspecifiche su di e tripeptidi. La sequenza di queste attivit enzimatiche permette la degradazionedelle proteine e dei peptidi di maggior taglia permettendo lingresso nella cellula di peptidi a basso

peso molecolare e, quindi, il recupero degli amminoacidi necessari alluptake cellulare. Gliamminoacidi possono a loro volta essere decarbossilati o deamminati ed ulteriormente trasformati(Tab. 1.3).La sostanza organica utilizzata e trasformata dalla cellula viene per la maggior parte, ad esclusionedelle componenti utili in senso plastico, riversata allesterno della cellula. Si tratta a tutti gli effettidi un sistema di gestione dei rifiuti metabolici; leconomia cellulare prevede lingresso di ci che utile, la trasformazione e la permanenza di ci che necessario, mentre i residui dannosi od inutilialla cellula, dopo eventuale trasformazione, vengono espulsi.Come detto il potenziale metabolico della cellula microbica pu essere anche molto differente daspecie a specie. La capacit di utilizzare differenti fonti energetiche e le esigenze nutrizionali sonodeterminate dalla presenza nel genoma cellulare di specifici segmenti di DNA in grado di codificarela trascrizione-traduzione di proteine ad attivit enzimatica essenziali allutilizzo dei differenti

substrati o alla sintesi di componenti cellulari specifiche.Lassenza o la presenza nel genoma di una cellula batterica di alcune di queste sequenze genichedetermina il potenziale metabolico della cellula e di conseguenza la capacit di utilizzare etrasformare differenti substrati e la necessit di procurarsi o meno dei precursori, non sintetizzabili,preformati dallambiente.Si deve inoltre ricordare che le attivit enzimatiche che esplicano questo potenziale metabolicosono fortemente regolate sia da fattori intriseci alla cellula che ambientali. Non tutto il messaggiopresente nel genoma cellulare viene necessariamente espresso dalla cellula e si traduce in attivitbiochimica. La cellula microbica nella sua semplicit ed essenzialit di funzionamento prevede deisistemi di regolazione che economizzano la sua attivit e allo stesso tempo ottimizzano il suorapporto con il mondo extra-cellulare.Solo il necessario alla sopravvivenza viene espresso. La definizione di questo necessarioderiva dal sovrapporsi delle esigenze metaboliche della cellula, dalla sua capacit di adattarsi allecondizioni ambientali (temperatura, disponibilit di acqua, acidit, disponibilit di ossigeno, etc.) e,quindi, dalla sua possibilit di trovare risorse energetiche idonee da dedicare al mantenimento di unambiente favorevole alla crescita.La regolazione dellespressione genica favorisce la capacit di adattamento di una forma di vitaunicellulare a differenti ambienti; resta il fatto che solo ci che presente nel DNA della cellula puessere espresso e, quindi, specie che possiedono genomi diversi possono adattarsi preferenzialmenteo selettivamente a nicchie ecologiche differenti.I microrganismi meno esigenti saranno i pi diffusi nellambiente, mentre i pi esigenti liritroveremo solo in specifiche matrici complesse. Alla variet di potenziale metabolico delle variespecie microbiche corrispondono specularmene differenti modificazioni del substrato; la sostanzaorganica trasformata in tappe successive in composti sempre pi semplici, in alcuni casi giungefino alla sua completa mineralizzazione.In conclusione fenomeni biochimici associati alla moltiplicazione dei microrganismi possonodifferire in modo significativo sia qualitativamente che quantitativamente in relazione al tipo dimicrorganismo, alle caratteristiche della matrici ed alle condizioni ambientali al contorno.La modificazione della sostanza organica che avviene nel corso dello sviluppo microbico puquindi indurre variazioni anche molto importanti nella composizione del substrato. La produzionedi acidi organici o di alcool etilico dovuta ai processi di fermentazione ha come conseguenzaimmediata linibizione, parziale o totale, di altri microrganismi, in particolare dei batteri putrefattivie di buona parte dei patogeni, favorendo lincrementata conservabilit degli alimenti. Anche la


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salubrit dellalimento entra in gioco come risultato del metabolismo cellulare nel caso diproduzione di cataboliti tossici per luomo.Ne consegue che la valutazione dellutilit o della pericolosit dei microrganismi viene definita daivantaggi che luomo pu ottenere dalle trasformazione che questi sono in grado di indurre in alcunematrici; questo il punto di vista delluomo, ma in realt, sempre semplificando, per la cellulabatterica si tratta semplicemente di ottenere energia per sopravvivere.

Versatilit e capacit di adattamento

In tutti gli ambienti dove luomo riesce a sopravvivere anche i microrganismi, essendo forme di vitapi semplice, possono trovare le condizioni per svilupparsi. La semplicit dellorganizzazione dellavita di questi organismi microscopici ne favorisce la proliferazione e la diffusione. I microrganismi,infatti essendo molto meno evoluti e complicati rispetto agli organismi superiori, risultano moltoresistenti ed in grado di popolare ambienti anche molto ostili. Ancora in anni recenti sono stateevidenziate delle famiglie di batteri estremofili rinvenuti sui bordi di vulcani o nelle solfatare equindi adattati a condizioni ritenute inconcepibili per ogni forma di vita superiore.Uno degli elementi chiave nella comprensione del mondo microbico la capacita della cellulamicrobica di replicarsi e riprodursi in tempi molto inferiori a quelli degli altri esseri viventi. Questareplicazione permette che a partire da una singola cellula si producano miliardi di microrganismi

copia del progenitore comune.Lelevato ritmo di riproduzione favorisce il fatto che qualora intervengano eventi, esterni ointrinseci alla cellula, che inducono mutazioni nelle sue caratteristiche, queste, se favorevoli allacellula stessa, prendano il sopravvento favorendo le cellule in grado di meglio adattarsiallambiente.Si tratta di modificazioni di popolazione che possono avvenire in tempi relativamente brevi rispettoa quanto avviene nel resto del mondo vivente e che, a volte, permettono alla cellula di sopravviveread eventi per essa drammatici come, ad esempio, la presenza di una sostanza ad azioneantibatterica, una temperatura elevata, un pH troppo acido. In questi casi, se anche una sola dellecellule batteriche della specie, tra le migliaia che possono essere presenti in un dato ambiente,presenta delle mutazioni occasionali del suo patrimonio genetico che le permettono di sopravvivereallevento ostile, questa che prender il sopravvento. In questo modo si selezioner unadiscendenza di cellule simili alla progenitrice caratterizzate da una specifica resistenza.Ovviamente, come in ogni altro aspetto del metabolismo e della vita della cellula microbica, laselezione e linsorgere di resistenza ed adattamento non sono solo fenomeni qualitativi ma anchelaspetto quantitativo rimane determinante per alcune espressioni.Unitamente alla naturale capacit di reagire alle sollecitazioni dellambiente la capacit di mutare edi adattarsi possono essere considerati i fenomeni di maggior importanza nel determinare lacapacit delle cellule microbiche di adattarsi e svilupparsi in ambienti estremi o in condizionisfavorevoli.Anche la presenza di organismi della stessa specie ma con caratteri metabolici e fisiologicidifferenti (biodiversit) pu essere ricondotta a fattori di selezione ed adattamento che hannofavorito lo sviluppo elettivo, in alcune specifiche nicchie ecologiche, di varianti microbicheportatrici di caratteri che nel contesto della nicchia li rendevano pi idonei a sopravvivere eprendere il sopravvento su altri biotipi. La biodiversit pu essere intesa in questo senso comemaggiore capacit di sopravvivere e adattarsi da parte di organismi di una specie.Rispetto alle condizioni ambientali le differenti specie microbiche presentano degli intervalli diresistenza/sensibilit o degli optimum di attivit caratteristici ma comunque variabili tra gliindividui della stessa specie.In questo contesto lo studio della biodiversit microbica, e quindi della capacit di un determinatomicrorganismo di crescere, colonizzare e modificare un dato prodotto, risulta fondamentale perinterpretare la funzione ecologica di popolazioni microbiche in ecosistemi complessi quali quelliagro-alimentari.


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La struttura microbica di una popolazione in continua evoluzione, risultando determinata sia dafattori esterni tecnologici e di modificazione dellecosistema che da fattori interni di naturabiologica. In questo senso la crescita, la sopravvivenza e lattivit di una data specie risultano, nellamaggior parte dei casi, definite dalla presenza di altre specie (microbiche, vegetali o animali).

Complessit del mondo microbico ed interazioni

Il mondo microbico estremamente variegato e la suddivisione in famiglie, generi, specie e biotipiattualmente in uso probabilmente non copre che una parte di una realt non ancora completamentenota.La microbiologia, e quindi la conoscenza dei microrganismi, in verit ancora una scienzagiovane, o comunque, ancora lontano dallaver compreso la complessit di tutti gli aspetti legati allecaratteristiche di queste forme di vita microscopica.Si ritiene che i primi batteri siano comparsi sul globo terrestre almeno 3 miliardi di anni fa, quindiun tempo enormemente precedente agli uomini. Tutto questo tempo ha favorito lo sviluppodiversificato di queste forme di vita che si sono adattate ad ambienti molto eterogenei.Ne consegue che, nonostante le loro dimensioni, il mondo dei microrganismi molto vasto sia invariet che famiglie, generi e biotipi.I primi studi sistematici che possono essere ritenuti gli inizi della scienza dei microrganismi

risalgono solo alla met del 800; gli studi di Pasteur, basandosi sulle osservazioni ed elaborandolopera di altri precedenti illustri studiosi e pionieri della materia, quali Spallanzani e VanLeeuwenhoek, hanno infatti dato il via alla comprensione del ruolo dei microrganismi nei processifermentativi ed alle basi della conservazione degli alimenti.In conseguenza si deve ritenere che, anche grazie allenorme sviluppo delle tecniche diagnosticheindotto in particolare dallevoluzione tecnologica e biotecnologica, nel prossimo futuro sarannoancora molte le scoperte e le innovazioni in grado di modificare radicalmente il modo diinterpretare questa complessa e variegata materia.La dimensione delle cellule microbiche le rende difficilmente individuabili e riconoscibili. I metodiper il loro studio sono per la maggior parte dei casi ancora basati sulla capacit di indurre la loroproliferazione e quindi ottenere un numero di cellule copia dello stesso microrganismo moltoelevato. In seguito alla moltiplicazione si formano delle colonie batteriche, costituite da un elavatonumero di copie della cellula progenitrice, che possono essere riconosciute ad occhio nudo e cheservono anche per lidentificazione. Questo fenomeno, in alcuni casi, pu risultare evidente anchenegli alimenti; si pensi alle muffe che si sviluppano in differenti prodotti od allintorbidamento dialcune bevande.Sono stati messi a punto negli anni differenti sistemi per coltivare i microrganismi e quindistudiarli: si tratta perlopi di supporti colturali liquidi o solidi i cui costituenti sono in grado di farcrescere con differenti livelli di selettivit le diverse forme microbiche.Gli sviluppi delle tecniche genetiche e biochimiche degli ultimi 50 anni hanno enormementemigliorato la capacit di riconoscere e studiare i microrganismi. Secondo alcuni studiosi,comunque, ancora oggi abbiamo probabilmente evidenziato solo una parte delle possibili forme divita microscopiche.Inoltre, a fini interpretativi, si inteso semplificare il mondo microbico nella sua dimensioneunicellulare studiando e trattando i differenti microrganismi singolarmente e quindi esasperandonele potenzialit individuali. In natura sono molto rari i sistemi monospecie o caratterizzati dallapresenza di poche specie. Nella grande maggioranza dei casi differenti microrganismi sono presentiin ecosistema ed interagiscono modificando anche profondamente le loro attitudini metaboliche edi crescita. Le relazioni inter e/o intraspecie divengono determinanti nel definire lo sviluppo di unmicrorganismo in un sistema biologico. La presenza e lo sviluppo simultaneo di altre speciemicrobiche possono esaltare lattivit di un microrganismo ma anche risultare fortemente inibitorieed in alcuni casi letali in conseguenza della produzione di metabolici tossici sia specifici che


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aspecifici. Tra i primi ricordiamo le batteriocine mentre tra i secondi possono trovarsi differentimolecole organiche come metaboliti secondari o acqua ossigenata.

Microrganismi e habitat

Essendo organismi unicellulari le interazioni della cellula microbica con lesterno sono determinantial fine della sopravvivenza della cellula stessa. La parete e la membrane cellulare divengono dei

filtri di informazione e dei sistemi di difesa attraverso i quali lorganismo comunica con lesterno (ilmondo); agli impulsi esterni la cellula risponde in base al suo potenziale cellulare. Tale potenzialecorrisponde allespressione di quanto compreso nel DNA della cellula batterica; la capacit di unmicrorganismo di modificarsi o adattarsi sotto la spinta della pressione ambientale infatti,generalmente, ampia ma rimane comunque compresa in limiti che la cellula non pu superare eche sono definiti da quanto racchiuso nel suo cromosoma.La gran parte dellenergia che la cellula ricava dal metabolismo e dalla trasformazione dei substratidi crescita viene devoluta alla moltiplicazione cellulare ed alla proliferazione nellambiente.Quando le condizioni esterne non sono ottimali, buona parte dellenergia che la cellula ricava dalmetabolismo viene invece dedicata alla difesa della cellula ed alla limitazione dei danni cheinterverrebbero sulla stessa struttura cellulare se non si tamponassero gli effetti di un ambiente che divenuto ostile. Questo fenomeno induce il depotenziamento di tutte le altre attivit cellulari che

richiedono energia; quando gli effetti indotti dallesterno sottraggono anche la quota di energia dadedicare ai metabolismi essenziali per la sopravvivenza la cellula collassa e smette di funzionare o,se pu sporifica.Le cellule microbiche interagiscono tra loro e con il resto delle forme viventi presenti nel loroecosistema, si adattano alle condizioni di sviluppo imposte dallambiente, non necessariamente aloro ottimali, e di conseguenza modificano i loro comportamenti.Lo stesso ecosistema viene modificato pi o meno profondamente dallattivit dei microrganismi e,a sua volta, induce nuovi comportamenti nel biota che si adatta. Il potenziale metabolico di unmicrorganismo in un dato ecosistema, e quindi anche in un alimento, pu essere interpretato soloconsiderando le interazioni metaboliche positive o negative che si instaurano con le altre forme divita presenti ed in particolare con gli altri microrganismi presenti e con il substrato.Gli alimenti fermentati, come ampliamente ricordato, sono ecosistemi complessi composti dallamatrice e dalla popolazione batterica che in essa risiede. Questo sistema inoltre caratterizzato dafattori chimico-fisici intrinsechi (pH, Aw, presenza di nutriliti) e esogeni al substrato ma dipendentidalla tecnologia di trasformazione e, quindi, in ultima analisi dalluomo (temperatura, presenza dibatteri aggiunti, trattamenti di bonifica microflora endogena, ambiente gassoso, presenza di O2).Sia i fattori estrinseci che intrinseci alla matrice inducono modificazioni dellattivit cellulare chene condizionano lomeostasi, la capacit di crescita ed il metabolismo.Lecologia microbica di un dato sistema comprende pertanto le interazioni che intercorrono tra lecaratteristiche strutturali della nicchia ecologica e la sua popolazione microbica; i fattori estrinsecialla nicchia possono essere manipolati dalluomo sia per favorire specifiche crescite microbiche cheal fine di inibire la moltiplicazione batterica.La complessit di questi fenomeni al momento non ancora facile da simulare se non ricorrendo amodelli predittivi, sempre necessariamente riduttivi e, per loro natura, estremamente semplificati.La modellazione matematica di sistemi complessi, come gli alimenti, una disciplina che si pone ilcompito di prevedere il comportamento dei microrganismi in relazione a variazioni dellecondizioni ambientali e, per ottenere questo scopo, devere ricorrere a semplificazioni che purmantenendo il potenziale descrittivo siano di facile gestione.Come discusso in precedenza, i rapporti e gli equilibri tra microrganismi di differente genere especie appartenenti ad un dato ecosistema, e quindi anche un alimento non sterilizzato, sonoinfluenzati da molteplici fattori abiotici o biotici; il numero e le caratteristiche del microrganismo,la presenza di altri microrganismi e la loro interazione, le caratteristiche del substrato, le condizioniambientali e, nel caso di prodotti trasformati, i parametri di processo.


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I trattamenti tecnologici possono concretizzarsi rispetto ai microrganismi in effetti di rimozionedalla matrice (centrifugazione, microfiltrazione), uccisione (trattamenti termici o disinfettanti),inibizione o attivazione della crescita in relazione alle caratteristiche del microrganismo ed allentitdel parametro di processo. La tecnologia di trasformazione pu, inoltre, indurre selezione e/oelezione di particolari specie e/o biotipi.Di fatto si crea uninterazione tra parametri di processo (es: temperatura/tempi trattamento,

aggiunta coadiuvanti e/o additivi, umidit ambienti), le caratteristiche del substrato di crescita (es:concentrazione differenti nutriliti, acidit, disponibilit di ossigeno, attivit dellacqua) elecosistema microbico (presenza differenti generi, specie e biotipi). Queste interazionideterminano il sopravvento di alcuni microrganismi rispetto ad altri ed allo stesso tempo lemodificazioni di composizione e struttura del substrato. Luomo attraverso i trattamentitecnologici indirizza gli eventi metabolici che derivano dalla selezione.Le variazioni di habitat (substrato/parametri tecnologici) modificano sia le caratteristiche dellasingola cellula che le sue capacit di interagire con altre cellule, della stessa o di differente specie,presenti nel sistema (Tabb. 1.1., 1.4).Indipendentemente dalla difficolt di riprodurre in laboratorio le condizioni ottimali per interpretarele interazioni tra microrganismi in sistemi naturali, come in precedenza anticipato, negli ultimi annisono sempre frequenti gli studi che utilizzando metodi di indagine molecolari hanno evidenziato la

presenza di cellule vitali ma non coltivabili. Cellule microbiche quindi in grado di interagire con ilsubstrato ma che allo stato attuale delle conoscenze non sono isolabili dal substrato e quindistudiabili. In alcuni casi si tratta di biotipi di specie altrimenti coltivabili con metodi classici.Tutto ci lascia supporre non solo che alcuni microrganismi siano in grado di crescere in un solospecifico ecosistema ma, anche, la possibilit che in alcuni casi la loro capacit di moltiplicarsi siastimolata dalla presenza di altri microrganismi in grado di supplire a carenze metaboliche coninterazioni positive. Alternativamente la non coltivabilit pu essere il risultato di modificazionidella potenzialit metabolica della cellula conseguenti a trattamenti che inducano stress nelmicrorganismo; questo fenomeno stato osservato, ad esempio, dopo pastorizzazione del latte.Queste evidenze ci inducono a credere che molto ci sia ancora da comprendere in merito allafisiologia ed alla biochimica cellulare dei microrganismi e come sia possibile che queste materiedi studio presentino aspetti del tutto inattesi.A questi fenomeni si aggiunga che in particolari ecosistemi sono state evidenziate forme diorganizzazione complesse, che oltrepassano laspetto unicellulare, della popolazione microbica chepare organizzarsi in forme differenziate, anche se molto primitive rispetto alle cellule degli eucariotisuperiori, come i bio-film. In queste strutture particolari, si sono distinte cellule pi propensealladesione alla superficie ed altre, pi esterne, pi propense a rapportarsi con lesterno. Questeforme di organizzazione modificano il metabolismo della singola cellula ed instaurano una sorta didifferenziazione nei compiti dei componenti di una popolazione microbica introducendo,probabilmente come conseguenza delladattamento a condizioni differenti, elementi diorganizzazione sopracellulari non compatibili con lunicellularit nota per queste forme di vita.Ogni approccio al mondo dei microrganismi deve pertanto prevedere la certezza delle grandiconoscenze acquisite dalluomo in questo settore ma anche la consapevolezza che siamo ancoralontani dalla piena comprensione di questa forma di vita.

Metodi per lanalisi della presenza dei microrganismi e la loro caratterizzazione

Lanalisi microbiologica

Disporre di metodi per valutare la salubrit dei cibi diviene un problema sempre pi sentito fin dallaseconda met dellottocento. Se la microbiologia nasce come scienza studiabile nel momento incui si concretizza la possibilit di osservare i microrganismi al microscopio, lanalisi microbiologica


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degli alimenti si sviluppa con lintento di comprendere le origini della putrefazione e deldeterioramento delle derrate alimentari e degli effetti sulla salute pubblica collegati al loroconsumo. Da allora con lo sviluppo di differenti terreni colturali e la messa a punto di metodi dicrescita ed identificazione sempre pi selettivi diviene possibile una valutazione maggiormenteapprofondita della presenza di differenti gruppi microbici e del loro significato.Lanalisi microbiologica di un alimento si pu porre differenti scopi ed assume un differente

significato in relazione al campione da analizzare. Per i test di sterilit pu, ad esempio, esseresufficiente la valutazione dellassenza (non crescita) di microrganismi in una data aliquota dicampione e dopo incubazione per un tempo determinato in condizioni definite. In altri casi si devequantificare la presenza delle cellule microbiche; alternativamente si ricercano solo microrganismicon determinate caratteristiche (psicrofili, termofili) o appartenenti ad un genere o ad una specie.Nel caso di alcuni patogeni pu essere sufficiente valutarne la presenza o lassenza, mentre per ibatteri alterativi o per la microflora lattica caratteristica sono di maggiore interesse le valutazionidella presenza numerica. La ricerca di specifici biotipi pu assumere un rilievo di naturatecnologica o di legame con lisolamento da particolari prodotti. Allo stesso tempo leproblematiche coinvolte nellanalisi di un latte sterile, dove i microrganismi devono essere assenti,e quella di uno yogurt dove deve essere presente unabbondante microflora lattica sono moltodifferenti.

In tutti i casi il primo momento dellanalisi la preparazione del campione. Solitamente il prelievodeve essere rappresentativo di tutto il prodotto da analizzare, in alternativa, se lanalisi si indirizzaad una sua specifica parte (es. la crosta), questa deve essere rappresentativa della porzione che siintende indagare.Tutte le operazioni di prelievo e preparazione del campione allanalisi devono essere eseguitepreservandolo dalla contaminazione da parte di microflora esogena. Lanalisi di crescita in terreni diconta comporta la necessit di diluire il campione, in particolare quando esso non liquido.La tipologia di prodotto e la flora microbica che si intende individuare (lo scopo dellanalisi)indirizzano le modalit di analisi.In pratica, cos come differisce il significato della presenza di diversi microrganismi in differentiprodotti, anche lorganizzazione dellanalisi microbiologica pu e deve essere modificata inrelazione al campione in analisi.Lesigenza di poter confrontare i risultati ottenuti nellanalisi microbiologica dai differenti operatoridel settore ha indotto a formare commissioni ed enti preposti a normare le procedure di analisi e avalidare i nuovi metodi proposti. In tabella 1.5 riportiamo la lista delle analisi per il settorelattierocaseario riconosciute dalla FIL-IDF (Fdration Internationale de Laiterie - InternationalDairy Federation, www.fil-idf.org).La complessit della risoluzione analitica delle problematiche di ordine microbiologico edigienico, in particolare nel settore alimentare, rimane tuttora elevata. La riuscita dellanalisimicrobiologica di un alimento, in particolare per quello che concerne la ricerca dei germi patogeni,deve infatti confrontarsi con differenti fattori sfavorevoli tra i quali:

leterogeneit fisico-chimica della matrice costituita da sostanze che possono interferire con

la crescita batterica o la selettivit dei terreni colturali,

la distribuzione non uniforme dei batteri nelle differenti parti o porzioni del campione equindi la necessit di un prelievo sufficiente e rappresentativo, la presenza contemporanea di altri microrganismi nel campione che, ad esempio nel caso dei

batteri patogeni, possono essere in numero enormemente superiore alla specie da ricercareed interferire con la riuscita dellanalisi,

la presenza cellule danneggiate dai processi tecnologici di produzione ma ancora in grado di

sopravvivere (injured o stressed cell; cellule vitali ma non coltivabili).Alcuni di questi fenomeni risultano sfavorire la sensibilit dellanalisi microbiologica e segeneralmente questa evidenza tollerata e considerata intrinseca allanalisi stessa, assume unrilievo preoccupante nel caso della ricerca di patogeni caratterizzati da un livello di infettivit


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elevata. Lo sviluppo di terreni di arricchimento sempre maggiormente efficaci ha favorito ilrecupero e lo sviluppo selettivo della maggior parte dei batteri, ma il problema rimane ancora apertoSi consideri, inoltre, che oggi la produzione di alimenti sempre meno facilmente conciliabile coni tempi necessari allindagine microbiologica tradizionale; i protocolli HACCP necessitano dirisposte veloci in modo da poter intervenire in caso di eventi negativi per correggere i parametri diprocesso possibilmente on-line e non molte ore dopo il prelievo per lanalisi e quindi quando

levento negativo non pi correggibile ed ha gi avuto la possibilit di mettere a rischio la salutedel consumatore.

Metodiche tradizionali o classiche

Con questo termine non corretto si intende definire i metodi di indagine in uso nei laboratori dimicrobiologia fino almeno al decennio a cavallo degli anni 80. Si tratta di metodiche diidentificazione e conta dei microrganismi che rimangono la base dellanalisi microbiologica e,quindi, con il termine tradizionale non si deve intendere superate o desuete. Lo sviluppo di nuovetecniche di indagine caratterizzate da maggiore sensibilit e, a volte, facilit di impiego rimanepiuttosto un complemento alle indagini microbiologiche tradizionali, che ne permetteunapprofondimento analitico ed unapproccio pi sistematico.

Analisi al Microscopio

Gli esordi dellanalisi microbiologica si possono sovrapporre in un certo senso con limpiego delmicroscopio. Ancora oggi il microscopio rappresenta uno strumento fondamentale per il lavoro deimicrobiologi alimentari in quanto permette lo studio della morfologia delle cellule batterichepresenti in un campione e, dopo diluizione se solido o torbido, anche una valutazione numericatramite conta visiva delle cellule presenti in volumi definiti e determinati dallo spessore e dallareadi particolari vetrini con griglie di volume noto (camere di conta).Il primo limite dellanalisi quantitativa consiste nella necessit di avere concentrazioni microbicheelevate nel preparato in osservazione; ad esempio la misurazione con camera di Thoma richiede lapresenza di almeno un milione di cellule per millitro. Ulteriore limite dellanalisi risiede nel fattoche, ovviamente, al di l di una pur importante preliminare classificazione morfologica (forma,mobilit, reazione alla colorazione di gram, presenza di spore, formazione di catene o strutture apalizzata, etc.), losservazione al microscopio dice poco in relazione alla presenza di batteriappartenenti a specie differenti, alla vitalit delle cellule osservabili ed alle loro caratteristiche. Adesclusione dei controlli di purezza di alcune colture di laboratorio o di equilibrio in starter costituitida colture miste di lattobacilli e streptococchi, anche agli occhi dei microbiologi pi espertilanalisi visiva del preparato al microscopio non risulta risolutiva, ma solo di indirizzo e diintroduzione allanalisi in terreni colturali.

La metodica tradizionale: identificazione e conta dopo crescita in terreni nutritivi

Nel 1881 Koch nel suo testo "Agar-based method for isolating bacteria" pone le basi dello sviluppodei metodi di conta in piastra in terreni agarizzati, successivamente elaborate dal suo assistentePetri. A partire da queste osservazioni sono stati messi a punto la gran parte dei sistemi di conta,selezione, isolamento ed identificazione dei microrganismi.Tra la fine del 1800 e linizio del secolo scorso cominciano a formarsi i primi comitati per lavalutazione della salubrit degli alimenti e dellacqua, prima attraverso la definizione della loroanalisi chimica e quindi anche batteriologica. The American Pubblic Health Association nel 1905pubblic la prima edizione di Standard Methods of Water Analysis. Sempre, nello stesso annoPrescott del Massachusetts Institute of Technology propose di impiegare terreni colturali differenti econdizioni di incubazioni specifiche nellanalisi del latte; la commissione che si form in seguito


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alla proposta produsse la prima versione degli Standard Methods for Examination of DairyProducts, successivamente si svilupparono organizzazioni ad hoc per sviluppare, confrontare estandardizzare le metodiche di analisi.La metodica di Koch e Petri, che si basa sulla capacit dei microrganismi di moltiplicarsi e formarecolonie una volta incubati in condizioni e per tempi definiti in appositi substrati, ha permesso,attraverso lo sviluppo di terreni selettivi e di arricchimento, di poter indagare praticamente sulla

presenza di tutte le specie microbiche oggi note.La tassonomia microbica stessa, si sviluppata attraverso la crescita preliminare in opportuniterreni colturali. Lisolamento delle colonie da classificare, limpiego di test di crescita inparticolari condizioni o di specifiche attivit metaboliche, per molti delle quali il segnale dipositivit rimaneva la crescita microbica stessa, lanalisi al microscopio delle colture purepermettevano quindi, nellinsieme, di assegnare il microrganismo ad una specie.Per quanto riguarda lanalisi di presenza o assenza di determinate specie microbiche, dopoopportuno prelievo e preparazione del campione (Tab. 1.5) possibile ricorrere a terreni diarricchimento con la principale funzione di recupero di tutte le cellule batteriche presenti (ancheparte di quelle maggiormente stressate). Si procede quindi alla deposizione del campione interreni di crescita, liquidi o agarizzati, caratterizzati da specifica selettivit. Lintorbidamento delterreno liquido o la comparsa di colonie batteriche nel terreno agarizzato indicano positivit della

presenza.La metodica della conta in piastra, che divenuta metodo ufficiale e di riferimento per tutte leanalisi microbiologiche, rimane basata sulla corretta preparazione e diluizione del campione esulla successiva deposizione, per spatolamento od inclusione, in opportuni terreni di crescitaagarizzati caratterizzati da differenti livelli di selettivit. La crescita in terreni agarizzati offre ilvantaggio di discriminare i batteri vivi da quelli che non sono pi in grado di moltiplicarsi (ilnumero viene infatti espresso come unit formanti colonia = ufc). In particolare nel caso delleanalisi ufficiali sono previste ripetizioni delle prove di analisi e limpiego di procedure specificherelative a tutte le operazioni di analisi (dal campionamento alla lettura del dato analitico). Anchelelaborazione del valore numerico del risultato deve seguire idonee procedure normate e codificate(Tab. 1.5)Ricorrendo alla tecnica del MPN (Most Probable Number) invece possibile utilizzare terreniliquidi per la conta di microrganismi. Si tratta di preparare diluizioni successive del campione edeporle in ripetizioni di brodi di crescita selettivi o elettivi. Il valore numerico della presenzamicrobica viene valutato in base al numero di ripetizioni della diluizione alla quale si evidenziaintorbidimento e quindi crescita batterica. Alternativamente la positivit di crescita pu essereevidenziata dalla manifestazione di un particolare carattere metabolico, quale ad esempio laproduzione di CO2 che induce il galleggiamento nel terreno colturale di campanelle di vetro. Siutilizzano opportune tabelle numeriche elaborate, in base alla probabilit statistica, in modo datradurre in un numero le differenti possibilit di combinazioni di ripetizioni positive alle diversediluizioni. In questo caso i risultati di analisi sono costituiti da valori discreti e non coprono tuttolinsieme numerico continuo come nel caso della conta in piastra.Il livello di selettivit dellanalisi in terreni liquidi o agarizzati completato dalladozione dispecifici tempi e condizioni di incubazione che risultano determinanti nel discriminare la crescitadi alcune specie. Le condizioni di incubazione sono parte integrante delle differenti procedureanalitiche.Tra i limiti maggiori della metodiche di conta tradizionale in primo luogo si devono sottolineare ilunghi tempi di attesa per disporre del risultato; a seconda del tipo di microrganismo ricercato itempi di incubazione variano infatti dalle 24 ore alla settimana. Inoltre riconosciuta una nonsempre soddisfacente precisione di analisi. Limprecisione insita nel metodo aggravata dalladifficile ripetibilit della componente manuale dell'operatore. Quando si confrontano risultatiottenuti in laboratori differenti, il cui livello di professionalit sia accertato, non raro osservaredifferenze dei risultati analitici anche importanti. Infine la metodica non offre alcuna indicazione


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sullo stato fisiologico e metabolico dei microrganismi, si evidenziano infatti solo le cellule vive, ocoltivabili, ma non si ottiene alcuna informazione sul loro stato di attivit.

Metodiche innovative

Unitamente allo sviluppo dellindustria alimentare, in particolare in relazione allampliamento edalla globalizzazione delle reti di distribuzione e commercializzazione, si imposta la necessit di

disporre di tecniche di valutazione della qualit microbiologica degli alimenti, sempre pi sensibili,veloci, automatizzate ed economiche.Mentre grandi progressi sono stati fatti nella messa a punto di terreni e condizioni di incubazioniselettivi, i limiti nella precisione e la necessit di tempi di incubazione prolungati sonosostanzialmente rimasti inalterati fin dai tempi della messa a punto della metodica di conta inpiastra e, allo stato attuale delle conoscenze, non pare possibile modificare significativamente leprocedure delle tecniche tradizionali.In questo senso lo sviluppo scientifico, sia biologico che di altri settori della scienza, ha favorito lamessa a punto di nuove tecniche di indagine; in particolare, lavvento delle biotecnologie hapermesso lo sviluppo di metodi sempre maggiormente conoscitivi e discriminanti. In questocontesto levoluzione delle tecniche basate sullindagine di porzioni del genoma batterico hannorappresentato una vera rivoluzione nel campo dellanalisi microbiologica degli alimenti.

La sensibilit delle metodiche basate sul riconoscimento di sequenze geniche o di epitopi antigenicida parte di specifici anticorpi, attualmente a disposizione del microbiologo alimentare, non eranoimmaginabili nei decenni scorsi. In particolare, lincremento di sensibilit offerto da questemetodiche nella ricerca dei batteri patogeni negli alimenti ha permesso di identificare e monitorarenuove problematiche relative alla qualit della materia prima e/o alleffetto dei parametri diprocesso sulla sopravvivenza batterica e sulla conservabilit del prodotto.Levoluzione dei sistemi di identificazione che derivano dallo sviluppo di queste tecniche talmente veloce al punto da renderne molto difficile una rassegna esaustiva.Allo stesso tempo l'avvento dell'automazione e dellinformatizzazione che ha coinvolto numerosearee della scienza e della tecnologia ha indotto ripercussioni anche nel campo delle disciplinemicrobiologiche. Il settore della microbiologia stato sicuramente uno degli ultimi a sentirne glieffetti e questo ritardo rispetto ad altri settori, quali quello chimico e quello fisico, ha differentiragioni. La principale insita nella natura stessa della microbiologia, una scienza che lavora conorganismi viventi dalla natura articolata e complessa, soggetta a mutazioni comportamentalicoerenti al sistema di crescita o, a volte, intrinseche al microrganismo stesso; tale variabilit difficilmente assimilabile a sistemi di indagine semplificati che, come previsto dalle metodicheanalitiche automatizzate, monitorizzano poche singole variabili di natura chimica o fisica. Ladifficolt di validare con le metodiche ufficiali di conta microbica in terreni agarizzati i risultatiottenuti con metodiche alternative ha rappresentato e continua a rappresentare unulterioreproblema: poich i metodi di conta in piastra prevedono livelli di ripetibilit e riproducibilit chepoco si addicono alla correlazione con le precise rilevazioni, almeno nel contesto della specificavariabile considerata, determinate dalle metodiche innovative. In particolare, quando non siconsiderino solo i microrganismi patogeni, la valutazione della qualit microbiologica di unalimento prevede la necessit di esprimere una valutazione quantitativa della carica microbica,generica o differenziata in specie, e non solo la presenza o assenza di specifiche microflore; questoaspetto, vista la difficolt di tradurre il risultato strumentale in un valore numerico assimilabile alleufc previste dai metodi tradizionali e riconosciuti, ha complicato la possibilit di impiego dimetodiche alternative. Infine, anche se non di minore importanza, la naturale recalcitranza da partedei microbiologi ad abbandonare od innovare le metodiche consolidate non ha favoritolavvento di nuovi sistemi di indagine. In merito a questa discussione Sharpe ha avuto modo disottolineare come i microbiologi siano ossessionati dalla capacit dei batteri di moltiplicarsi neiterreni agarizzati e come questo fatto, conseguenza dell'abitudine a prendere come riferimento la


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metodica tradizionale, abbia sicuramente ritardato lo sviluppo di metodiche alternative divalutazione della contaminazione batterica.In questi ultimi decenni l'automazione concernente l'analisi microbiologica andata comunquesempre pi affermandosi sotto la spinta del continuo perfezionamento delle tecniche di misurachimico-fisiche e, come detto, della sempre pi pressante esigenza di disporre di tecniche versatili,in modo da poter analizzare un numero elevato di campioni e di meglio ammortizzare i costi di

investimento, e possibilmente strutturate in modo da permettere l'elaborazione ed il controllocomputerizzato dei risultati.Si deve sottolineare come lautomazione delle analisi, mentre quasi sempre coincide con unamaggiore potenzialit riferita al numero di campioni da analizzare, non necessariamente comportimaggiore sensibilit e velocit di ottenimento del risultato. Peraltro la definizione di metodi rapidiin microbiologia appare ancora indefinita. La rapidit infatti interpretabile in modo soggettivo inrelazione alle specifiche esigenze; si potrebbe considerare rapido un metodo che offre una rispostaistantanea e, in questo senso, il metodo ideale non esiste ancora. Per rapido quindi si usa intendereun metodo semplice che abbrevia i tempi e le procedure di analisi caratteristiche dei metoditradizionali.Volendo sintetizzare in commercio si possono ritrovare metodi rapidi basati sostanzialmente sualcune tipologie di organizzazione dellanalisi:

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test biochimici di identificazione miniaturizzati2. test di derivazione dei metodi colturali classici modificati3. test immunologici4. test a DNA o RNA5. test basati sullimpiego di marcatori fluorescenti

Tutti questi tipi di test possono essere differentemente organizzati, automatizzati, gestiti edarchiviati da specifici software e possono risultare utili alla detezione ed identificazione didifferenti microrganismi.Anche la disponibilit e lutilit nel settore della microbiologia degli alimenti di questi metodi sideve confrontare con le problematiche poste dagli scopi dellanalisi (identificazione o conta) e ledifficolt imposte dal substrato (effetto matrice e presenza di altri batteri) caratteristici dellemetodiche tradizionali.I problemi rimangono simili a quelli osservati per le metodiche tradizionali ma la necessit dirapidit incrementa le difficolt di mantenere sensibilit e precisione.Sotto la spinta dellevoluzione della biologia e della tecnologia differenti livelli di innovazione e diautomazione sono andati, comunque, col tempo affermandosi nei laboratori di analisimicrobiologica.Allo stato attuale sono disponibili test di riconoscimento per la maggior parte dei patogenirinvenibili negli alimenti; buona parte sono ancora basati sulla metodica di conta ed isolamentotradizionale, altri su nuove tecniche che in alcuni casi risultano pi veloci, specifiche e pisensibili. Si pu sostenere che i livelli di innovazione dellanalisi microbiologica che si sonoaffermati in questi utimi due-tre decenni, nel loro insieme, hanno profondamente cambiatolapproccio allanalisi microbiologica di un alimento offrendo al microbiologo nuove soluzioni perstudiare la popolazione batterica di un campione e comprenderne il significato.

Nuovi metodi di identificazione dei microrganismi

Messa a punto di nuovi terreni selettivi e kit diagnostici

Il primo aspetto coinvolto nellevoluzione delle metodologie di analisi di identificazione deimicrorganismi stata la messa a punto di nuovi terreni di crescita selettivi e/o substrati chepermettessero di discriminare le cellule batteriche in grado di esprimere attivit metabolichedefinite.


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In particolare sono stati prodotti differenti sistemi miniaturizzati per evidenziare specifiche attivitenzimatiche utili allidentificazione dei ceppi. La miniaturizzazione dei kit biochimici per ladiagnostica e la classificazione dei microrganismi ha favorito lo sviluppo di strumentazioni condifferente livello di automazione e di rilevazione oggettiva dei risultati in modo da sottrarre lavalutazione del risultato alla soggettivit dellocchio umano. Linterfaccia con computer elimpiego di software elaborati ad hocha permesso di ridurre limprecisione dovuta allanalista e di

aumentare la ripetibilit e la riproducibilit dei risultati, nonch la loro archiviazione. In questosettore sistemi come il Vitek o il Biolog Identification System hanno trovato una importantediffusione per lidentificazione di microrganismi isolati da campioni alimentari.Da considerare innovativi sono stati i sistemi Petri-Film; si tratta di film agarizzati che in realtriproducono completamente il sistema di conta in piastra ma che essendo gi pronti all'uso e didimensioni molto ridotte facilitano l'analisi di un numero elevato di campioni, eliminando lapreparazione del terreno colturale e la sua distribuzione in piastra, riducendo gli spazi necessari perla preparazione, incubazione e valutazione delle piastre ed, in particolare, limitando i costi del lorosmaltimento.Anche lintroduzione di substrati fluorogenici e cromogeni ha facilitato lo sviluppo di terrenicolturali selettivi e specifici per alcune specie batteriche ed in particolare per microrganismipatogeni.

In questi ultimi due casi si tratta di sistemi non solo utili allidentificazione microbica ma anche allanumerazione selettiva di alcune specie microbiche.

Metodi immuno-enzimatici

Per il riconoscimento selettivo di particolari microrganismi negli ultimi anni si sono notevolmentesviluppati kit diagnostici basati su metodi immunoenzimatici.Lo sviluppo delle tecniche immunologiche ha favorito la produzione di anticorpi di epitopiantigenici caratteristici di metaboliti o componenti cellulari specifici di differenti microrganismi.Questo si rivelato di grande utilit in particolare per il riconoscimento di alcune specie patogenepresenti in differenti substrati. Lelevata sensibilit della reazione antigene-anticorpo e la facilit diadattare il sistema a differenti supporti e a differenti sistemi di rilevazione ha favorito lo svilippo dimolteplici test caratterizzati dal differente design. I sistemi proposti sono sempre basati sullaspecificit di riconoscimento antigene-anticorpo, ma nel tempo si sono sviluppati sistemi pisofisticati e sensibili. Si tratta di test estremamente specifici caratterizzati dalla semplicit diimpiego. Alcuni di questi metodi permettono anche una valutazione semi- quantitativa del numerodi microrganismi presenti ma, in genere, trovano impiego in analisi di riconoscimento qualitativospecifico. Sono stati proposti test di agglutinazione con gli anticorpi legati a piccole sfere di lattice(lattex-agglutination test, LA); la presenza dellantigene induce lagglutinazione in seguito allaformazione di una rete di legami ponte antigene-anticorpo-lattice. Il test LA molto semplice eveloce ma poco sensibile e quindi pi adatto per la conferma tassonomica o serologica dopoisolamento dei ceppi dallalimento e coltura o arricchimento. Per Salmonella sono stati proposti testdi immunodiffusione organizzati in modo da comprendere una parte di arricchimento allinterno delkit di reazione. I test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) che sono probabilmente i piutilizzati per la rilevazione di batteri patogeni negli alimenti sono basati sullaccoppiamento di

unattivit enzimatica alla reazione anticorpale. Solitamente i test ELISA prevedono limpiego dipi anticorpi: il primo legato ad un supporto cattura lantigene quindi, il secondo, che di norma collegato ad una attivit enzimatica, viene aggiunto in successione e si lega, a sua volta, conlantigene catturato dal primo. In base alla rilevazione dellattivit enzimatica possibile stabilire lapositivit della prova. I sistemi di rilevazione sono solitamente molto semplici e quasi sempre legatia reazioni colorimetriche di facile detezione. I metodi ELISA disponibili si sono differenziati inragione dei molteplici supporti proposti e dellorganizzazione della tempistica di successione deidifferenti eventi coinvolti nel riconoscimento dellantigene; la loro sensibilit solitamente oscilla trale diecimila e le centomila ufc/ml e nellordine delle unit di ng/ml per le proteine e/o le tossinebatteriche. Per la ricerca dei batteri patogeni sono quindi solitamente previste colture di


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arricchimento preventive per raggiungere le soglie di sensibilit necess

Microbiologia Degli Alimenti (Testo)

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