FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUIMICAS

INFORME #7 DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

TEMA: EFECTO DE LOS ANTIBIOTICOS SOBRE LAS BACTERIAS PROFESOR: Dr. JACINTO HERVIAS, PEDRO

INTEGRANTES:---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

CURSO: Microbiologa CICLO: VIII SECCION: 2B GRUPO: I

LIMA PERU2015INTRODUCCINLos antibiticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos (antibiticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibiticos semisintticos), que a pequeas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostticos), tras ser administrados por va adecuada a un organismo receptor.La mayor parte de los antibiticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (actinomicetos,Bacillus, etc.) o eucariotas (hongos de los gneros Penicillium, Cephalosporium, etc.).Se conocen unos 5.000 antibiticos distintos, y cada ao se descubre unos 300 nuevos, pero en clnica solo se usa un 1% de los descubiertos. Su importancia econmica se pone de manifiesto al pensar en las 100.000 Tm. de antibiticos producidas al ao, por un valor equivalente a 3.000 millones de euros, lo cual representa una de las industrias biotecnolgicas ms importantes.

La mayor parte de los antibiticos comerciales se emplea para tratar enfermedades de etiologa bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad antitumoral.Desde el punto de vista qumico, se clasifican en grandes familias:antibiticos que contienen carbohidratos;

lactonas macrocclicas;

quinonas y compuestos relacionados;

antibiticos peptdicos y con aminocidos;

heterociclos del N;

heterociclos del O;

aromticos;

alifticos, etc.

MARCO TERICOLa accin de la penicilina, y en general de los -lactmicos, se desarrolla principalmente en la ltima fase de la sntesis de peptidoglicano de la pared celular, al unirse a una enzima transpeptidasa llamada protena fijadora de penicilina, responsable de producir una serie de enlaces cruzados entre las cadenas de los pptidos. La formacin de estos enlaces o puentes es la que confiere la mayor rigidez a la pared bacteriana. Por lo tanto, los -lactmicos como la penicilina, al inhibir la sntesis de peptidoglicano, interfieren en la formacin de la pared celular bacteriana. Las bacterias sin su pared celular estallan o son ms fcilmente fagocitadas por los granulocitos. Esta inhibicin produce una acumulacin de los precursores del peptidoglicano, los cuales producen una activacin de enzimas como las hidrolasas y autolisinas que digieren el remanente de peptidoglicano en la bacteria. Por otra parte, la penicilina favorece la lisis osmtica de la bacteria durante el proceso de multiplicacin.Las quinolonas son quimioterpicos de sntesis quebloquean la ADN-girasa bacteriana, unindose a la subunidad de tipo A. Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen superenrollamiento negativo en la doble hlice del ADN. La ADN-girasa est constituida por dos subunidades de tipo A y dos de tipo B (A2B2); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energa para la reaccin. El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que sta queda congelada en la fase en que el ADN est unido al enzima. Ello provoca la acumulacin de roturas de doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria.Lastetraciclinasson antibiticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gram-negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por distintas especies deStreptomyces. Se basan en el cudruple anillo del naftaceno. Actan comobacteriostticos, siempre y cuando las bacterias estn en crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son tiles incluso contra bacterias que viven como parsitos intracelulares (como las Rickettsias), debido a que sucarcter hidrofbico facilita su difusin a travs de membranas.Mecanismo de accin: provocanque la unin del aa-ARNt al sitio A del ribosoma sea inestable y est distorsionada, con lo cual se evita la elongacin de la cadena.In vitroactan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, por quin vivoslo inhiben a las bacterias? La explicacin est en el hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma suicida, cosa que no ocurre en eucariotas.Losaminoglucsidosconstituyen un grupo amplio y variado de antibiticosde amplio espectro, producidos por diversas especies deStreptomyces. Como se puede ver en las figuras, todos tienen en comn varios rasgos qumicos: son muy polares, policatinicos; presentan un anillo de aminociclitol (un ciclohexitol o inositol con grupo amino); uno o ms azcares, incluyendo al menos un aminoazcar (aparte del aminociclitol).Mecanismo de accin:se unen a lospoli ribosomas que estn traduciendo el ARNm,provocando errores en la lectura del ARNm, aldistorsionar la estructura del ribosoma. Por lo tanto, la bacteriacomienza a sintetizar protenas defectuosas; con un efecto final que es bactericida.MUELLER HINTON CALDOEste medio ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad de los antimicrobianos en medio lquido.FundamentoMedio nutritivo adecuado para facilitar el crecimiento de numerosos microorganismos. Al igual que su presentacin en forma de agar, el caldo Mueller Hinton muestra buena reproducibilidad de los resultados lote a lote, tiene un bajo contenido de inhibidores especialmente para sulfamidas, trimetoprima y tetraciclina. Puede ser suplementado para el crecimiento de bacterias exigentes y con ciertos cationes para el antibiograma de Pseudomonas frente a aminoglucsidosESCALA DE MC FARLANDLa utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solucin salina, en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma visual).La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin bacteriana. Creamos 10 estndares (en la tabla aparece la composicin de estos) y por espectrofotometra, creamos una recta patrn, de forma que vamos a poder detectar la concentracin de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamao de la bacteria, la formacin de agregados,...). La escala se basa en la capacidad de precipitacin del cloruro de bario en presencia de cido sulfrico

COMPETENCIASAplica mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana in vitro.Obtiene la concentracin mnima inhibitoria de antibiticos en estudio.MATERIALES Y EQUIPOS

Placas con agar Mueller Hilton Caldo con agar Mueller Hilton

Escala de Mc Farland 0.5 Hisopos

Tubos de ensayo Pipetas estriles

Cultivo de S. Aureus Cultivo de E. Coli

PROCEDIMIENTOMtodo de difusin en agarPreparar una dilucin de la bacteria en estudio equivalente a 0,5 de la escala de Mc Farland.

1.- Preparacin del inoculoPreparar suspensin bacteriana tomando una alcuota de la colonia representativa de la cepa proporcionada por el Laboratorio. Colocar el inoculo en el caldo nutritivo e incubar el tiempo necesario para alcanzar la turbidez requerida segn la escala Mac Farland.

El inoculo estandarizado, se puede preparar re suspendiendo colonias en solucin salina estril hasta alcanzar la turbidez de 0.5 de Mc Farland. Esta suspensin contiene 1-2x108UFC/ml.

TUBOCl2Ba1%SO4H21%u.f.c/ml

10,19,93,0x108

20,29,86,0x108

30,39,79,0x108

40,49,61,2x109

50,59,51,5x109

60,69,41,8x109

70,79,32,1x109

80,89,22,4x109

90,99,12.7x109

101,09,03,0x109

Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35C hasta que aparece una turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 hs). La turbidez se ajusta con suero fisiolgico estril o caldo para obtener una turbidez visualmente comparable a la de un estndar preparado previamente (llamado 0.5 de Mc Farland). Este estndar debe agitarse antes de usar y ser comparado en forma visual con el inculo preparado.

Para ello se miran ambos tubos al mismo tiempo contra un fondo blanco con una lnea negra como contraste Este mtodo es recomendado cuando el cultivo tiene ms de 24 hs de incubacin.

Siembra en una placa de agar Muller- Hilton con un hisopo el cultivo de E. Coli.Hisopado con E. Coliagar Muller- Hilton

Luego extender con el hisopo sobre la superficie del Agar Mller-Hilton, segn mtodo de diseminacin.

Agar divido en 4 para colocarle los discos de antibiticos

Colocar 4 Discos de antibiticos amoxicilina gentamicina ciproffloxacino y doxiciclina

Aplicar los discos con un aplicar los discos con una pinza estril cerca del mechero para conservar la esterilidad a pinza estril cerca del mechero para conservar la esterilidad

Durante 24 horas en una temperatura de 37c.

Siembra en una placa de agar Muller- Hilton con un hisopo el cultivo de s. aureusTomar un hisopo estril y sumergirlo en el caldo de estafilococos ureos

Por toda la placa Petri.Listo nuestra muestra

Colocar 4 Discos de antibiticos amoxicilina gentamicina ciproffloxacino y doxiciclina.

Durante 24 horas en una temperatura de 37c.

OBSERVACIONES Y RESULTADOSA las 24 horas medir los halos de inhibicin en mm e interpretar los resultados para clasificarlos como sensibles, intermedios o resistentes.

Se realiza la medida de la zona de inhibicin.Medicin de los halos. Despus de incubar las placas del antibiograma se procede a la lectura de este para ello se usa una regla y se mide el radio del halo de inhibicin partiendo desde donde est el disco del antibitico hasta donde se inhibi el crecimiento.La longitud obtenida despus se comparan con estndares que nos dirn si el medicamento ser el efectivo o no en el tratamiento

CATEGORAS DE INTERPRETACIN:

SENSIBLE: el microorganismo presenta un gran rea de inhibicin causada por el frmaco, 95% de xito.

INTERMADIO: se presenta un halo de inhibicin ms reducido el frmaco no es tan exitoso para el tratamiento.

RESISTENTE: presenta muy poco o casi nada de halo.

LECTURA E INTERPRETACIN DE LA CIM

La interpretacin de los resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en categoras clnicas: sensibles, intermedios o resistentes. C.I.M: concentracin mnima inhibitoria representa la mnima cantidad de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo. C.M.B: concentracin mnima bactericida concentracin mnima que mata el microorganismo. Luego se debe recurrir, teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa cepa, a las tablas para definir segn los valores de CIM que en ellas aparecen si las cepas en estudio son sensibles o resistentes a un determinado antibitico..

Amoxicilina

DOXICICLINA

CONCLUSIONES.

-El dimetro obtenido depender solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino tambin del espesor de la capa del agar, su pH y su composicin,

-Depender tambin de la capacidad de difusin de la droga en este medio, la temperatura, la velocidad de duplicacin bacteriana, y el tamao y fase de crecimiento.

-La importancia de adquirir confianza en las pruebas, obtener una informacin rpida y segura, lograr precisin de los resultados permite mejorar la calidad de los ensayos.

RECOMENDACIONES.

-los discos deben mantenerse en el freezer o en el refrigerador a 8c.paramantener la actividad del antibitico. Deben ser sacados una o dos horas antes de su uso.-Debemos fijarnos siempre en la fecha de vencimiento antes de usarlos.

-Los discos que pertenecen a la familia de los betalactamicos pierden su potencia al estar frente al calor.

-Antes de colocar los discos deben atemperarse y evitar su desecacin