Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 6. RAPD, ISSR apod.
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR
description
Transcript of Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR
![Page 1: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/1.jpg)
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin
4. PCR
Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013
Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických
oborů PřF JU
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
![Page 2: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/2.jpg)
Historie
Co bylo před PCR?
k dispozici pouze DNA, kterou se podařilo vyizolovat
fragmenty DNA bylo možné namnožit klonováním (zač. 70. let)
(zapojením do plazmidu a vnesením do bakt. buněk)
sekvenování NK (od konce 70. let)
RFLP
![Page 3: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/3.jpg)
RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) variabilita generována restrikčními enzymy z
bakterií - rozpoznávají krátkou specifickou sekvenci dsDNA
vyizolovaná genomová DNA naštěpena jedním nebo více enzymy
fragmenty separovány ELFO, vizualizace obarvením, nebo přenesením na membránu a hybridizací se značenou DNA sondou (Southern-blot)
sondy:
• specifické pro určitý lokus (např. rDNA; další využití – restrikční mapování
genomu, určování pořadí genů pomocí genově specifických sond)
• multilokusové (např. hypervariabilní repetitivní sekvence: mini- a mikrosatelity)
![Page 4: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/4.jpg)
RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Lokusově specifická sonda: variabilita RFLP patternů 11 izolátů Candida albicans
(A - celková genomická DNA po naštěpení enzymem EcoRI)
B - Southern blot hybridizace se sondou pro oblast 28S, 18S a 5S rDNA
![Page 5: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/5.jpg)
RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Multilokusová sonda:
variabilita patternů generovaných pomocí 2 mikrosatelitových sond (r. Candida)
![Page 6: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/6.jpg)
PCR
PCR:
Polymerase Chain Reaction
in vitro namnožení určité části DNA
*1983, ale první (zapomenuté) pokusy už v r. 1971; Nobelova cena za chemii (1993)
![Page 7: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/7.jpg)
Princip PCRPrincip PCR
vždy musíme mít k dispozici primery: levý-forward a pravý-reverse
elongace produktu 5´→3´!
první nasynt. vlákna jsou o něco delší než cílový produkt, cyklováním ale téměř absolutně převládne cílový produkt
teoreticky by měla stačit 1 molekula, v reálu je potřeba o něco víc (aspoň 10?)
(DNA polymeráza)
PCR cycling
1)
2)
3) Elongace
Templát. DNA
![Page 8: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/8.jpg)
Princip PCRPrincip PCR
enzymatická syntéza DNA: prodlužování vlákna vždy ve směru 5´→3´(nezapomenout na to ani při designu primerů!)
![Page 9: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/9.jpg)
Princip PCRPrincip PCR
počet kopií narůstá exponenciálně, postupně ale pokles - opotřebování polymerázy, inhibice narůstajícím množstvím nově nasynt. DNA (nastává obvykle po 30-35 cyklech)
![Page 10: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/10.jpg)
Princip PCR
PCR cyklus:
1) denaturace – rozpletení dvouvlákna templátové DNA, obvykle stačí 94-95°C, 30-60 s
(záleží na CG obsahu, lze ovlivnit přidáním aditiv)
![Page 11: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/11.jpg)
Princip PCR
PCR cyklus:
2) annealing (nasedání) primerů
obvykle v rozmezí ca 48-62°C, 30-60 s specifické pro každý primerový pár, nutné optimalizovat,
příp. odhadnout podle sekvence primerů přibližně o 3-5°C pod metling temperature (Tm) primerů:
Tm = 64.9°C + 41°C x (počet G + C – 16.4) / délka primeru [bp] – pro primery >14bp
(Tm = 4°C x ( počet G + C) + 2°C x (počet A + T) – pro primery <14bp, Wallace rule)
http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
![Page 12: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/12.jpg)
Princip PCR
PCR cyklus:
3) elongace – syntéza komplement. vlákna DNA polymerázou
teplota podle typu polymerázy, obvykle 72°C (ale ~10% aktivity v 37°C)
délka podle aktivity polymerázy a délky amplifikovaného úseku Taq: 1000 bp/min
Taq polymerázy před odpadnutím z vlákna DNA dávají na jeho konec jeden A (terminal transferase activity; využití při AT klonování)
![Page 13: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/13.jpg)
Princip PCR
Složení PCR reakce:
primery: 0.1-1 µM každého primeru reakční pufr (Tris-HCl):
• MgCl2 příp. MgSO4: 1-4 mM (Mg2+ je kofaktor polymeráz)
• KCl: 50 mM deoxynukleotidy (dNTP): 40-200 µM každého typu dNTP polymeráza: 0.5-2U / 25 µl reakce
templát: 1-1000 ng / 25 µl reakce (pro genomovou DNA)
s PCR chemikáliemi pracovat na ledu, skladovat v -20°C (hlavně polymeráza!)
ideálně alikvoty (dNTP jsou senzitivní na opakované zamražování; výhodné i proti kontaminacím)
PCR produkt naopak snese hodně…
![Page 14: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/14.jpg)
Princip PCR
Vlastní příprava PCR:
objem 1 reakce může být libovolně v rozmezí 5-100 µl namíchat mix pro požadovaný počet vzorků, vždy používat
negativní kontrolu (PCR směs bez DNA → kontrola reakčních komponent, zda nejsou kontaminované DNA)
komerčně dodávané premixy – obsahují všechny složky reakce kromě primerů a templátu
před přesunem do cykleru držet vzorky na ledu
Příklad PCR cyklování: 95°C – 3 min počáteční denaturace DNA
35x: 95°C – 3 min denaturace
Ta – 1 min nasedání primerů
72°C – 1 min elongace
72°C – 10 min závěrečná elongace (dosynt. případná neúplná vlákna)
5°C hold temp. drží teplotu dokud nevyzvedneme vzorky z cykleru
![Page 15: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/15.jpg)
Princip PCR
ELFO produktu PCR:
amplifikace 1 lokusu (za předpokladu, že se alely neliší délkou):
cílový PCR produktnespecifický PCR produkt
dimery primerů
neg. kontrola
(bez templátu)
![Page 16: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/16.jpg)
Princip PCR
PCR polymerázy:
nejdříve se musely měnit po každém PCR cyklu (zničení tepelnou denaturací; Klenowův fragment)
průlomem izolace termostabilní Taq polymerázy *1965
(bakterie Thermus aquaticus)
různé typy PCR polymeráz se liší:
• procesivitou - počet nasynt. bp/min
• chybovostí - inkorporace nesprávného nukleotidu
• reakčními podmínkami - složení reakčního pufru, elongační teplota, kolik musíme dát enzymu atd.
![Page 17: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/17.jpg)
Princip PCR
nejčastěji používané PCR polymerázy:
Taq (Thermus aquaticus; 1965)
1 kb/min (<5 kb), 72°C, frekvence chyb 1x10-4 – 2x10-5 , tvoří polyA-konce; nejlevnější
Pfu (Pyrococcus furiosus; 1991)
0.5-1 kb/min, 72°C, frekvence chyb ~2x10-6 (proof-reading = 3´to 5´ exonuclease activity, high fidelity), ale netvoří polyA-konce; MgSO4 jako zroj Mg2+
modifikace Taq a její směsi s proof-readingovými enzymy
(např. Ex Taq apod.): tvoří polyA-konce, chybovost ~mezi Taq a Pfu
![Page 18: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/18.jpg)
Princip PCR
amplifikace dlouhých úseků, genomových fragmentů:
◄ fúze dvou proteinů:
modrá jednotka váže dsDNA
zelená jednotka (~Pyrococcus) syntetizuje
Phusion polymerase (<20 kb)
rychlá - 1 kb/15-30s; 6x míň chyb než Pfu (proof-reading)
LA polymerase (<30-40 kb; Long and Accurate)
1kb/min; Taq polymeráza + proof-reading jednotka
![Page 19: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/19.jpg)
Optimalizace PCR
1. Odstranění nespecifických produktů:
příčina: nespecifická vazba primerů
teplota annealingu – zkusit různé Ta, nebo gradient (např. po 2-3°C)
• touch-down PCR: první cykly PCR jsou zásadní pro specifitu → pokud primery nenasedají specificky, tak se případný mismatch zafixuje; začít s vyšší Ta, a postupně ji snižovat (např.: 1. cyklus – 60°C, 2. cyklus 59°C, ...)
zkrácení času annealingu snížit koncentraci primerů, polymerázy
koncentrace MgCl2 (např. po 0.5 mM) - spíše snižovat
koncentrace KCl (ovlivňuje denaturaci DNA, kratší fragmenty preferenčně denaturují za vyšší koncentrace KCl)
• krátké nespecif. produkty: ↓ KCl
• dlouhé nespecif. produkty: ↑ KCl (> 50 mM může inhibovat Taq)
![Page 20: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/20.jpg)
Optimalizace PCR
1. Odstranění nespecifických produktů:
příčina: nespecifická vazba primerů
dlouhé nespecif. produkty může redukovat zkrácení elongace Cold-start: vzorky před umístěním do cykleru držet na ledu! (omezení
aktivity polymerázy)
Hot-start polymerázy: blokovány navázanou protilátkou, aktivovány až počáteční denaturací → nevznikají nespecifické PCR produkty způsobené sníženou aktivitou polymerázy před umístěním vzorků do cykleru
ředění DNA templátu (1:10, 1:100...)
snižování počtu PCR cyklů
![Page 21: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/21.jpg)
Optimalizace PCR
1. Odstranění nespecifických produktů:
příčina: krátké, zdánlivé nespecif. produkty mohou být
nedosyntetizovaná vlákna cílového úseku
podpořit činnost polymerázy
• prodloužením času elongace
• zvýšením koncentrace polymerázy
• koncentrace MgCl2• aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein)
prodloužit čas denaturace, nebo přidat aditiva usnadňující denaturaci templátu (10% DMSO, 5% formamid)
![Page 22: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/22.jpg)
Optimalizace PCR
extrakce - vyřezávání cílových bandů z agarózy po ELFO (vhodné např. pro sekvenaci, klonování)
asi nejefektivnější postup pro odstranění dimerů primerů
1. Odstranění nespecifických produktů:
• celý vzorek nanést na 1-1.5% agarozový gel, nechat rozjet v ELFO
• ideálně Sybr Green + modré světlo (UV fragmentuje DNA, proto minimalizovat dobu expozice / odstínit např. skleněnou petriskou)
• vyřízlý kousek agarózy s cílovým bandem purifikovat běžně dostupnými kity (lyze agarózy, purifikace DNA na membráně)
• může být ztrátové → dělat větší PCR reakce (např. 30 a víc µl)
![Page 23: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/23.jpg)
Optimalizace PCR
2. Slabá nebo žádná amplifikace
chyba při míchání PCR, nesprávný program apod. – odhalí se pomocí pozitivní kontroly (= vzorek templátu, u kterého máme ověřené, že amplifikuje)
teplota annealingu – pomůže především snižování zvýšit počet cyklů PCR (max. ca 45)
• pokud je málo cílové DNA, pozor na kontaminace! zvýšit koncentraci templátu nebo naopak templát ředit (1:10 – 1:1000) – pokud obsahuje inhibitory
• spike control: pozitivní kontrola + vzorek, který nefunguje → pokud nedá produkt, je to inhibitory ve vzorku
zvýšit koncentraci primerů, polymerázy
gradient koncentrace MgCl2 aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein), nebo
usnadňující denaturaci templátu (DMSO, komerční PCR enhancery)
![Page 24: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/24.jpg)
Optimalizace PCR
použití více PCR: více cyklů PCR, méně opotřebované polymerázy
a) reamplifikace
• vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za ± stejných reakčních podmínek
• někdy nefunguje (dané typem použitých primerů???)
b) nested PCR
• vzorek PCR reakce se použije jako templát pro novou PCR za použití vnitřních primerů (příp. se použije jeden vnitřní primer + jeden z primerů původní PCR = semi-nested PCR)
• obvykle funguje lépe
• umožňuje větší specifitu
(selektují až 4 primery!)
• x musíme mít vnitřní primery...
2. Slabá nebo žádná amplifikace
![Page 25: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/25.jpg)
Optimalizace PCR
zkontrolovat primery: zda sedí na naši cílovou sekvenci - kritický je mismatch na 3´ konci, kde nasedá polymeráza
2. Slabá nebo žádná amplifikace
pokud nesedí, pokusit se o design nových primerů:
• shromáždit co nejvíc cílových sekvencí, vytipovat vhodná místa
- co nejvíce konzervované mezi cílovými sekvencemi
• někdy jsou sekvence tak variabilní, je nutné použít tzv. degenerované báze (IUPAC kód - např. M značí A nebo C)
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ - program na design primerů, umožňuje mj. zvolit oblast kam chceme v sekvenci umístit primery, testuje jejich parametry
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx - pokročilejší testování parametrů primerů
![Page 26: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062519/56815414550346895dc21062/html5/thumbnails/26.jpg)
Optimalizace PCR
◄ stabilní dimer primerů (Delta G<6 kcal/mol),
který je při PCR elongován (5´- 3´!)
pro důslednou eliminaci dimerů nastavit např. v Primer3:Max Self Complementarity: 3Max Self Complementarity: 1
• neměly by tvořit smyčky, které nedenaturují za annealingové teploty
• pozor na dimery primerů:
někdy i ideální primery nefungují a naopak teoreticky špatné fungují bez problémů...
Obecná pravidla pro design primerů:
• 15-28 bp dlouhé, GC obsah 40-60%
• pro optimální specifitu by 3´ konec měl být bohatší na GC, ale ne víc jako 3 GC v posledních 5 bázích (zvyšuje riziko nespecif. nasedání)
• oba primery by se neměly příliš lišit v teplotě nasedání (max. ~3°C)