METODOS PARA EVALUAR LA RESPUESTA INMUNE · haz de luz y emitiendo fluorescencia, estas señales...
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DRA. LUISA BARBOZADRA. LUISA BARBOZA
MÉTODOS PARA
EVALUAR LA
RESPUESTA
INMUNE
MMÉÉTODOS PARA TODOS PARA
EVALUAR LA EVALUAR LA
RESPUESTA RESPUESTA
INMUNEINMUNE
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RESPUESTA RESPUESTA INMUNEINMUNE
Poblaciones celulares
•Células T
•Células B
•Células fagocíticas
•Células citotóxicas
Diagnóstico
•Patologías inmunes
•Procesos infecciosos
Productos de la respuesta
•Citoquinas
•Inmunoglobulinas/anticuerpos
•Complemento
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TTTTéééécnicas basadas en interaccicnicas basadas en interaccicnicas basadas en interaccicnicas basadas en interacción antn antn antn antígenogenogenogeno----anticuerpoanticuerpoanticuerpoanticuerpo
• Inmunoensayos
• Western blot
• Inmunoprecipitación
• Inmunohistoquímica
• Inmunofluorescencia
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• RadioinmunoensayoRadioinmunoensayoRadioinmunoensayoRadioinmunoensayo (RIA): El (RIA): El (RIA): El (RIA): El marcador es un ismarcador es un ismarcador es un ismarcador es un isótopo radioactivo.topo radioactivo.topo radioactivo.topo radioactivo.
• AnAnAnAnálisis lisis lisis lisis inmunoenziminmunoenziminmunoenziminmunoenzimáticosticosticosticos (EIA): El (EIA): El (EIA): El (EIA): El marcador es una enzima.marcador es una enzima.marcador es una enzima.marcador es una enzima.
• FluoroinmunoanFluoroinmunoanFluoroinmunoanFluoroinmunoanálisislisislisislisis: El marcador es una : El marcador es una : El marcador es una : El marcador es una partpartpartpartícula fluorescente.cula fluorescente.cula fluorescente.cula fluorescente.
• Ensayos Ensayos Ensayos Ensayos inmunoquimioluminiscenteinmunoquimioluminiscenteinmunoquimioluminiscenteinmunoquimioluminiscente: La : La : La : La marca es una sustancia marca es una sustancia marca es una sustancia marca es una sustancia quimioluminiscentequimioluminiscentequimioluminiscentequimioluminiscente....
InmunoensayoInmunoensayoInmunoensayoInmunoensayo::::FormaciFormaciFormaciFormación de n de n de n de
inmunocomplejosinmunocomplejosinmunocomplejosinmunocomplejos(ant(ant(ant(antígeno/anticuerpo)geno/anticuerpo)geno/anticuerpo)geno/anticuerpo)
Marcados:Marcados:Marcados:Marcados:Conjugados a molConjugados a molConjugados a molConjugados a molééééculas culas culas culas
que emiten seque emiten seque emiten seque emiten señales ales ales ales detectablesdetectablesdetectablesdetectables
No marcados:No marcados:No marcados:No marcados:Son medidos por dispersiSon medidos por dispersiSon medidos por dispersiSon medidos por dispersión n n n
de luz o por visualizacide luz o por visualizacide luz o por visualizacide luz o por visualización n n n directadirectadirectadirecta
• PrecipitaciPrecipitaciPrecipitaciPrecipitaciónnnn
• AglutinaciAglutinaciAglutinaciAglutinaciónnnn
Tipos de Tipos de Tipos de Tipos de inmunoensayoinmunoensayoinmunoensayoinmunoensayo::::
J lmmunol Methods. 1992; 150: 5-21
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InmunoensayosInmunoensayosInmunoensayosInmunoensayos::::
�Comparación
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ELISA (ELISA (ELISA (ELISA (EnzymeEnzymeEnzymeEnzyme linkedlinkedlinkedlinked ImmunosorbentImmunosorbentImmunosorbentImmunosorbent AssayAssayAssayAssay):):):):
La detección se realiza colorimétricamente por la interacción de un sustrato cromogénico y
una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector La prueba de ELISA se basa
en la formación de inmunocomplejos, (reacción antígeno-anticuerpo, uno de los
cuales debe ser de reactividad conocida), para detectar la presencia de un analito de interés.
La detección se realiza colorimétricamente por la interacción de un sustrato cromogénico y
una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector.
En el ELISA, uno de los reactivos se conjuga con una enzima formando un complejo con
actividad inmunológica y enzimática.
Engvall y Perlman 1971
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ELISA. Pasos
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Tipos de ELISA:Tipos de ELISA:Tipos de ELISA:Tipos de ELISA:
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Evaluación de células BAnticuerpos / ELISA & CBA
Evaluación de células BAnticuerpos / ELISA & CBA
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Utilidad Utilidad Utilidad Utilidad
Clases y subclases de Clases y subclases de Clases y subclases de Clases y subclases de IgIgIgIg
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UtilidadUtilidadUtilidadUtilidadDetección de Ag y Ac
•Bacterias
•Parásitos
•Hongos
•Virus
Detección de complejos autoinmunes
•Anti- DNA (Antígenos nucleares extractables: SmSmSmSm ---- Ro Ro Ro Ro ---- La La La La ---- RNPRNPRNPRNP)
•Anti-Histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4)
LES
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UtilidadUtilidadUtilidadUtilidad
Detección de Acs contra antígenos de tejido
•Anti-tiroglobulina
•Anti-microsomal
•Anticuerpos Antifosfolípidos (CardiolipinaCardiolipinaCardiolipinaCardiolipina IgGIgGIgGIgG----MMMM)
Deteción de Ags asociados a tumores:
•Ag prostático
•Ag ovario (Ca125)
•ACE, alfafetoproteína
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ELISAELISAELISAELISAssss y Generaciones:y Generaciones:y Generaciones:y Generaciones:
1111rararara generacigeneracigeneracigeneraciónnnn
• Ag: lisado purificado de VIH
• Pocas sensibilidad y especificidad
2222dadadada generacigeneracigeneracigeneraciónnnn
• Ag: proteínas recombinantes de VIH. Detección de VIH-1 y VIH-2
• Poca sensibilidad, mejora la especificidad
3333rararara generacigeneracigeneracigeneraciónnnn
• Ag: proteínas recombinantes de VIH. Detección del grupo O del VIH. IgM e IgG
• Mejora la sensibilidad
4444tatatata generacigeneracigeneracigeneraciónnnn
• Capacidad para detectar al Ag p24 y anticuerpos
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Separación Celular
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TTTTéééécnicas basadas en fluorescenciacnicas basadas en fluorescenciacnicas basadas en fluorescenciacnicas basadas en fluorescencia
• Citometría de flujo
• Inmunofluorescia-Microscopia de fluorescencia
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FluorescenceFluorescenceFluorescenceFluorescence ActivatedActivatedActivatedActivated CellCellCellCell SortingSortingSortingSorting (FACS) (FACS) (FACS) (FACS) FluorescenceFluorescenceFluorescenceFluorescence ActivatedActivatedActivatedActivated CellCellCellCell SortingSortingSortingSorting (FACS) (FACS) (FACS) (FACS)
HidrodinámicaHidrodinámica
ElectrónicaElectrónica
Técnica que permite analizar partículas en suspensión que se hacen fluir a través de un rayo de luz, las partículas interactúan dispersando este haz de luz y emitiendo fluorescencia, estas señales ópticas son detectadas, transformadas y almacenadas electrónicamente.
Técnica que permite analizar partículas en suspensión que se hacen fluir a través de un rayo de luz, las partículas interactúan dispersando este haz de luz y emitiendo fluorescencia, estas señales ópticas son detectadas, transformadas y almacenadas electrónicamente.
ÓpticaÓptica
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ÓpticapticapticapticaÓpticapticapticaptica
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FluorocromosFluorocromosFluorocromosFluorocromosFluorocromosFluorocromosFluorocromosFluorocromos
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• CitometrCitometrCitometrCitometría de flujoa de flujoa de flujoa de flujo
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Utilidad: EvaluaciUtilidad: EvaluaciUtilidad: EvaluaciUtilidad: Evaluación de la funcin de la funcin de la funcin de la función hematopoyn hematopoyn hematopoyn hematopoyééééticaticaticaticaUtilidad: EvaluaciUtilidad: EvaluaciUtilidad: EvaluaciUtilidad: Evaluación de la funcin de la funcin de la funcin de la función hematopoyn hematopoyn hematopoyn hematopoyééééticaticaticatica
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Utilidad: Leucemias linfoblUtilidad: Leucemias linfoblUtilidad: Leucemias linfoblUtilidad: Leucemias linfoblásticassticassticassticasUtilidad: Leucemias linfoblUtilidad: Leucemias linfoblUtilidad: Leucemias linfoblUtilidad: Leucemias linfoblásticassticassticassticas
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EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluación de cn de cn de cn de céééélulas fagoclulas fagoclulas fagoclulas fagocíticasticasticasticas
FagocitosisFagocitosisFagocitosisFagocitosis
EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluación de cn de cn de cn de céééélulas fagoclulas fagoclulas fagoclulas fagocíticasticasticasticas
FagocitosisFagocitosisFagocitosisFagocitosis
• Látex
• Marcajes específicos
• Látex
• Marcajes específicos
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EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluación de cn de cn de cn de céééélulas fagoclulas fagoclulas fagoclulas fagocíticasticasticasticas
EstrEstrEstrEstréééés oxidativos oxidativos oxidativos oxidativo
EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluación de cn de cn de cn de céééélulas fagoclulas fagoclulas fagoclulas fagocíticasticasticasticas
EstrEstrEstrEstréééés oxidativos oxidativos oxidativos oxidativo
• DHR / DHE• DHR / DHE
• NBT• NBT
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Evaluación de células TProducción de citocinas/ marcadores intracelulares
Evaluación de células TProducción de citocinas/ marcadores intracelulares
• Ionomicina / Brefeldina A• Ionomicina / Brefeldina A
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EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluación de cn de cn de cn de céééélulas Tlulas Tlulas Tlulas TMarcadores varios / FACSMarcadores varios / FACSMarcadores varios / FACSMarcadores varios / FACS
EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluación de cn de cn de cn de céééélulas Tlulas Tlulas Tlulas TMarcadores varios / FACSMarcadores varios / FACSMarcadores varios / FACSMarcadores varios / FACS
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Evaluación de células BMarcadores varios / FACS
Evaluación de células BMarcadores varios / FACS
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InmunofluorescenciaInmunofluorescenciaInmunofluorescenciaInmunofluorescenciaInmunofluorescenciaInmunofluorescenciaInmunofluorescenciaInmunofluorescencia
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�Anticuerpos Antinucleares (IFI Hep-2)
�Anticuerpos Anti DNA
�Anticuerpos Antimitocondria
�Anticuerpos Antimúsculo Liso
�Anticuerpos contra PolimorfonuclearNeutrófilo (ANCAS)
�Anti-FTA
Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia
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Microscopía confocalMicroscopía confocal
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Microscopía confocalAplicaciones!!!
Microscopía confocalAplicaciones!!!
� FITC sódica
� Violeta de Cresilo
� Acriflavina HCL
� FITC sódica
� Violeta de Cresilo
� Acriflavina HCL
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ElectroforesisElectroforesisElectroforesisElectroforesis
de protede protede protede proteínasnasnasnas
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ELECTROFORESISELECTROFORESISELECTROFORESISELECTROFORESIS
Pasos bPasos bPasos bPasos básicossicossicossicos
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WESTERNWESTERNWESTERNWESTERN
BLOTTINGBLOTTINGBLOTTINGBLOTTING
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WESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGPasos bPasos bPasos bPasos básicossicossicossicos
•Difusión.
•Capilaridad (southern like).
•Electroforética.
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WESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTING
Luminol
• MMMMúltiples exposiciones ltiples exposiciones ltiples exposiciones ltiples exposiciones de la membrana hasta de la membrana hasta de la membrana hasta de la membrana hasta
conseguir la mejor conseguir la mejor conseguir la mejor conseguir la mejor imagen. imagen. imagen. imagen.
• Permite la detecciPermite la detecciPermite la detecciPermite la detección n n n cualitativa y cuantitativa cualitativa y cuantitativa cualitativa y cuantitativa cualitativa y cuantitativa
en un mayor rango de en un mayor rango de en un mayor rango de en un mayor rango de concentraciones concentraciones concentraciones concentraciones
• Los sustratos Los sustratos Los sustratos Los sustratos quimioluminiscentesquimioluminiscentesquimioluminiscentesquimioluminiscentes
proporcionan la mayor proporcionan la mayor proporcionan la mayor proporcionan la mayor sensibilidad.sensibilidad.sensibilidad.sensibilidad.
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WESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGWESTERN BLOTTINGEverybody knows western
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InmunohistoquímicaInmunohistoquímica
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InmunohistoquInmunohistoquíímicamica
Montaje de la muestra
� Fijado e inclusión en parafina� Cortado ultrafino� Montaje en laminas
Montaje de la muestra
� Fijado e inclusión en parafina� Cortado ultrafino� Montaje en laminas
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InmunohistoquímicaInmunohistoquímica
Pretratamiento del tejido
� Tratamientos proteolíticos o por calentamiento� Inhibición de actividades endógenas indebidas� Bloqueo
Pretratamiento del tejido
� Tratamientos proteolíticos o por calentamiento� Inhibición de actividades endógenas indebidas� Bloqueo
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InmunohistoquímicaAplicaciones!!!
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PCR (PCR (PCR (PCR (PolymerasePolymerasePolymerasePolymerase ChainChainChainChain ReactionReactionReactionReaction) ) ) )
Desarrollada en 1986 por Kary Mullis
Obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de una cantidad muy pequeña
Amplificar un fragmento de ADN o ARN (RT-PCR)
Identificación de:
�Microorganismos
�Personas (cadáveres)
Investigación
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Pasos de la PCR
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PCR en tiempo Real
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PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas PCR en tiempo Real. Ventajas �Mayor precisión, exactitud y sensibilidad
�Permite hacer detecciones múltiples
�No requiere procesamiento post-PCR.
�Evita la contaminación
�Mayor rapidez en la obtención de los resultados
�Cuantificación del contenido del material genético (ADN, ARN)
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PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad PCR en tiempo Real. Utilidad
�Ídentificación de microorganismos
�Cuantificación
�Monitoreo de resistencia a tto.
�Expresión de genes
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Microarray
http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm
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Analytica Chimica Acta. 2007, 601: 26
Utilidad: Utilidad: Utilidad: Utilidad: �Expresión de genes en diferentes patologías
�Valor pronóstico- Cáncer
�Susceptibilidad a enfermedad
�Infecciones
�Alergias