Métodos para detecção de antígenos e anticorpos e aplicações no diagnóstico imunológico...
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Métodos para detecção de antígenos e
anticorpos e aplicações no diagnóstico
imunológico
Prof.Esp. Marcos Valério Zschornack
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INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico
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RESPOSTA DE ANTICORPOS• EspecificidadeHabilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.• QuantidadeN° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.• IsotipoDetermina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.• AfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.• Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
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Avidez x Afinidade
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INTERAÇÕES Reações reversíveis.
Ligações não covalentes:- Pontes de hidrogênio- Interações hidrofóbicas- Interações de Van der Waals- Ligações iônicas
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MÉTODOS
1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blotting
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MÉTODOS
• PRECIPITAÇÃO- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese• AGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs• IMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting
APLICAÇÕES
- Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia
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PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO• Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.
• Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
• As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.
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REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO• Interação entre Ac e Ag solúvel • Ac precisa ser bivalente• Ag precisa ser bi ou polivalente• A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que
cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA
PRECIPITADO
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É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo:
Zona de excesso de anticorpo
Zona de equivalência
Zona de excesso de antígeno
+ - -+- -
Anticorpo livre
Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado
Quantidade de antígeno adicionado
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TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:
Imunodifusão Dupla:
• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:
Ac
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IMUNODIFUSÃO DUPLA
Ac
Ag Ag
Ac
Ag Ag
12
Ac
Ag Ag
Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose
• As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:
• Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
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• Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.
• O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Poços onde são colocados padrões e amostras a serem
dosados Agarose contendo anticorposanti-IgG humana
Halo de precipitação IgG – anti-IgG
Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.
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• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.
• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.
• Ag e Ac formam arcos de precipitação.
IMUNOELETROFORESE
+ -
Ag
Ag
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna
canaleta
2- Anti-soro na canaleta
canaleta
3- Difusão e precipitação
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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO• Ac + Ag multivalente particulado • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-
quantitativo)• Pó-zona: excesso de Ac• Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica
(repulsão)• Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex
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2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
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3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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5) Leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
negativo positivo
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi
(ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.
• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.
• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.Aglutinação Positiva
Negativa
Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
+Soro anti - hCGUrina
São incubados e colocados numa placa
Adicionam-se Partículas revestidas com hCG
Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial
Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.
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TESTE DE COOMBS• Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);• DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;• Não aglutinam os eritrócitos;• Direto: Ac ligados aos eritrócitos
fetais;• Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes
no soro materno. • Permite detectar incompatibilidades
Rh, prevenindo contra DHRN.
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IMUNOENSAIOS• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos,
isótopos)• Tipos:- RIA- ELISA- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO- WESTERN BLOTTING
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IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Princípio da técnica: • Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a
uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.
• Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.
• A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).
• Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
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Microscópio de fluorescência com epiluminação
luz UV atinge o ma- terial examinado
fluorescência emitida chega ao observador
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TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
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IFA direta:• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina,
nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
IFA indireta:• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como
a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
• É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade
(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
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IMAGENS
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CITOMETRIA DE FLUXO • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais
passando em uma corrente através de um feixe de Laser.• Separa as células por fluorescência ativada.• Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo
diferente.• É um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAÇÕES• Tipo de linfócitos;• Quantidade, tamanho, granulosidade;• Isolamento de populações celulares;• HIV
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Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
• O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).
• A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro.
• Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.
Fosfatase alcalinaPeroxidase
B-galactosidase
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TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
DIRETO OU SANDUÍCHE
INDIRETO PLACA UTILIZADA
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ELISA Indireto
ELISA Direto ou Sanduíche
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Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo
ELISA Competitivo
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RADIOIMUNOENSAIO – RIE Marcações:
I125: emite raios gama H3: raios beta
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
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WESTERN BLOTTING• Eletroforese de
proteínas.• Identifica
antígenos ou anticorpos.
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WESTERN BLOTTING
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WESTERN BLOTTING
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FIM