Métodos Microbiológicos Rápidos Adriana Bugno Instituto Adolfo Lutz Encontro ABRASP 2011.

Métodos Métodos Microbiológicos Microbiológicos

RápidosRápidos

Adriana BugnoAdriana BugnoInstituto Adolfo Instituto Adolfo

LutzLutz

Encontro ABRASP 2011Encontro ABRASP 2011

Métodos microbiológicosMétodos microbiológicos

Não eram mentes investigativas conscientemente em busca Não eram mentes investigativas conscientemente em busca

de desenvolver novos métodos para um novo campo da de desenvolver novos métodos para um novo campo da

ciênciaciência

Exploradores guiados Exploradores guiados

pelo acaso ou pela curiosidade pelo acaso ou pela curiosidade

por problemas do dia-a-dia, para os quais não por problemas do dia-a-dia, para os quais não

se se

tinham respostastinham respostas

por imensa compaixão pelo sofrimento por imensa compaixão pelo sofrimento

humanohumano

A história da Microbiologia é uma estória de pessoas A história da Microbiologia é uma estória de pessoas

comuns e indivíduos peculiares, de zeladores, donas de comuns e indivíduos peculiares, de zeladores, donas de

casa, químicos, médicos, botânicos em buscas de casa, químicos, médicos, botânicos em buscas de

descobertas.descobertas.


É uma história de eventos e fenômenos para os quais não se É uma história de eventos e fenômenos para os quais não se

tinham explicação, seguidos de observações para as quais não se tinham explicação, seguidos de observações para as quais não se

tinham aplicações óbvias, de eventual associação de causa e tinham aplicações óbvias, de eventual associação de causa e

efeito, tudo em um vasto campo de investigação. efeito, tudo em um vasto campo de investigação.

Porém, não foi o sofrimento humano que inicialmente motivou os Porém, não foi o sofrimento humano que inicialmente motivou os

investigadores, mas os estudos básicos e aplicados dos processos investigadores, mas os estudos básicos e aplicados dos processos

industriais, os quais abriram caminho para as aplicações médicasindustriais, os quais abriram caminho para as aplicações médicas

As Eras da MicrobiologiaAs Eras da Microbiologia

Alguns pesquisadores dividem a história da Microbiologia em Eras:Alguns pesquisadores dividem a história da Microbiologia em Eras:

5000 a.C.5000 a.C.Sécu

lo 17

Século 17

Século

18

Século

18

Século

19

Século

19

Sécu

lo 2

0

Sécu

lo 2

0

Sécu

lo 2

1

Sécu

lo 2

1

Era d

a

Era d

a

Espec

ulação

Espec

ulação

Era d

o

Era d

o

Cultivo

CultivoEra

da

Era d

a

Observ

ação

Observ

ação

Era d

e Estu

dos

Era d

e Est

udos

Fisiol

ógico

s e

Fisiol

ógico

s e

Molecu

lares

Molecu

lares

Era dosEra dosMMRMMR

Era da EspeculaçãoEra da EspeculaçãoOs micro-organismos interagem com o homem e seu ambiente desde o início Os micro-organismos interagem com o homem e seu ambiente desde o início

da humanidade, de forma positiva ou negativa. da humanidade, de forma positiva ou negativa.

Eventos e fenômenos para os quais não se Eventos e fenômenos para os quais não se

tinham explicação ocorriamtinham explicação ocorriam

Se não adicionar porções de pão ou bebida fermentada no próximo lote de Se não adicionar porções de pão ou bebida fermentada no próximo lote de

produção, o pão não crescia e as uvas não fermentavam.produção, o pão não crescia e as uvas não fermentavam.

Pessoas ficavam Pessoas ficavam

doentes sem que doentes sem que

houvesse qualquer houvesse qualquer

pista sobre a pista sobre a

natureza ou a causa natureza ou a causa

de seus males de seus males

castigo dos deusescastigo dos deuses

542 d.C.: epidemia atingiu Constantinopla e se 542 d.C.: epidemia atingiu Constantinopla e se

espalhou pela Europa e Ásia.espalhou pela Europa e Ásia.

Século 14: a mais famosa das epidemias, a Peste Século 14: a mais famosa das epidemias, a Peste

Negra, causou a morte de 30-50% da população da Negra, causou a morte de 30-50% da população da

Europa e de ~ 40 milhões no mundo.Europa e de ~ 40 milhões no mundo.

Século 15: a Europa foi atingida por uma epidemia de Século 15: a Europa foi atingida por uma epidemia de

sífilis.sífilis.

Século 16: epidemia de sarampo causou a morte de Século 16: epidemia de sarampo causou a morte de

100 milhões de pessoas no mundo.100 milhões de pessoas no mundo.

Era da ObservaçãoEra da Observação

A humanidade compreendeu que um mundo desconhecido e A humanidade compreendeu que um mundo desconhecido e

invisível estava ao seu redor. A partir do século 17, tem início a invisível estava ao seu redor. A partir do século 17, tem início a

busca por enxergar este mundo e aprender a lidar com ele.busca por enxergar este mundo e aprender a lidar com ele.

Em meados do século 17, Anton van Leeuwenhoek preparou lentes muito Em meados do século 17, Anton van Leeuwenhoek preparou lentes muito

melhores que as de seu tempo, sem qualquer intenção de encontrar melhores que as de seu tempo, sem qualquer intenção de encontrar

fontes de vida, mas somente movido pela curiosidade de poder ver fontes de vida, mas somente movido pela curiosidade de poder ver

pequenas coisas: insetos, tecidos, poeiras. Até que, por algum motivo, pequenas coisas: insetos, tecidos, poeiras. Até que, por algum motivo,

resolveu ver a água da chuva e encontrou “pequenas criaturas”resolveu ver a água da chuva e encontrou “pequenas criaturas”

Esta foi a era dos avanços no campo da microscopiaEsta foi a era dos avanços no campo da microscopia

Lazzaro Spallanzani – conceito de autoclavação, Lazzaro Spallanzani – conceito de autoclavação,

anaerobioseanaerobiose

Giovanni Battista Amici – lentes objetivas acromáticasGiovanni Battista Amici – lentes objetivas acromáticas

Carl ZeissCarl Zeiss

Ernst Abbe – lentes de imersão em óleoErnst Abbe – lentes de imersão em óleo

Era do cultivoEra do cultivo

Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a

microbiologia emergiu do período da simples observação. microbiologia emergiu do período da simples observação.

Apesar das descobertas feitas até então, a causa das doenças infecciosas Apesar das descobertas feitas até então, a causa das doenças infecciosas

continuava sendo totalmente desconhecida. continuava sendo totalmente desconhecida.

Louis Pasteur: em 1857, interessa-se por desvendar as razões dos Louis Pasteur: em 1857, interessa-se por desvendar as razões dos

processos de fermentação que transformavam açúcar de beterraba em processos de fermentação que transformavam açúcar de beterraba em

álcool, mas algumas vezes em ácido. Somente após compreender o papel álcool, mas algumas vezes em ácido. Somente após compreender o papel

dos micro-organismos no processo de fermentação, sua atenção se volta dos micro-organismos no processo de fermentação, sua atenção se volta

ao estudo das doenças infecciosas. ao estudo das doenças infecciosas. Joseph Lister: iniciou as práticas de antissepsia para prevenir a Joseph Lister: iniciou as práticas de antissepsia para prevenir a

contaminação microbiana durante cirurgias e partos.contaminação microbiana durante cirurgias e partos.

Robert Koch: “detetive de micróbios” durante uma epidemia de cólera. Em Robert Koch: “detetive de micróbios” durante uma epidemia de cólera. Em

1873 começou os estudos com 1873 começou os estudos com anthraxanthrax e deduziu que os micro-organismos e deduziu que os micro-organismos

eram a causa da morte de animais. Também fez as primeiras eram a causa da morte de animais. Também fez as primeiras

fotomicrografias de bactériasfotomicrografias de bactérias

Era do cultivoEra do cultivo

Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a

microbiologia emergiu do período da simples observação. microbiologia emergiu do período da simples observação.

Desenvolvimento das técnicas de coloração:Desenvolvimento das técnicas de coloração:

Ferdinand Cohn: coloração de cortes histológicos com corantes Ferdinand Cohn: coloração de cortes histológicos com corantes

vegetaisvegetais

Robert Koch: técnica de fixação de bactérias e coloração com Robert Koch: técnica de fixação de bactérias e coloração com

azul de azul de metilenometileno

Erlich: técnica de diferenciação de bacilos da tuberculose por Erlich: técnica de diferenciação de bacilos da tuberculose por

coloraçãocoloração

Gram: técnica de diferenciação de bactériasGram: técnica de diferenciação de bactériasAvanços em imunologia, com a descoberta e produção de vacinasAvanços em imunologia, com a descoberta e produção de vacinas

Início dos estudos sobre insetos vetores e do desenvolvimento da Início dos estudos sobre insetos vetores e do desenvolvimento da

quimioterapiaquimioterapia

Era dos estudos fisiológicos e molecularesEra dos estudos fisiológicos e moleculares

O século 20 testemunhou grandes avanços: metabolismo microbiano, O século 20 testemunhou grandes avanços: metabolismo microbiano,

genética microbiana, biologia molecular, terapia antimicrobiana, genética microbiana, biologia molecular, terapia antimicrobiana,

desenvolvimento de meios de cultura seletivos e diferenciais, desenvolvimento de meios de cultura seletivos e diferenciais,

virologia, ...virologia, ...

Além dos conhecimentos básicos de bioquímica microbiana, os estudos do Além dos conhecimentos básicos de bioquímica microbiana, os estudos do

metabolismo microbiano tornaram possíveis o desenvolvimento de muitos metabolismo microbiano tornaram possíveis o desenvolvimento de muitos

métodos diagnósticos para selecionar ou diferenciar micro-organismos; métodos diagnósticos para selecionar ou diferenciar micro-organismos;

A taxonomia microbiana deixou de ser baseada puramente em A taxonomia microbiana deixou de ser baseada puramente em

características morfológicas e passou a considerar as características características morfológicas e passou a considerar as características

metabólicas;metabólicas;

Reclassificação de espécies e gêneros resultou do estudos de biologia Reclassificação de espécies e gêneros resultou do estudos de biologia

molecular;molecular;

O papel e a natureza do DNA nasceu de estudos para compreender a O papel e a natureza do DNA nasceu de estudos para compreender a

variação microbiana e a resistência a antibióticos - Em 1983, o DNA variação microbiana e a resistência a antibióticos - Em 1983, o DNA

transformou-se em ferramenta quando Karry Mullis desenvolveu a técnica transformou-se em ferramenta quando Karry Mullis desenvolveu a técnica

de PCR, que tornou possível a amplificação de DNAde PCR, que tornou possível a amplificação de DNA


Todo conhecimento adquirido é o fundamento dos métodos Todo conhecimento adquirido é o fundamento dos métodos

analíticos utilizados até hojeanalíticos utilizados até hoje

E....E....

Os Os métodos microbiológicos clássicos ou de referência métodos microbiológicos clássicos ou de referência são:são:

Amplamente acessíveis;Amplamente acessíveis;

Harmonizados;Harmonizados;

Aceitos por agências regulatórias;Aceitos por agências regulatórias;

DemandamDemandam grande quantidade de materiaisgrande quantidade de materiais

alta capacitação técnicaalta capacitação técnica

tempo longo tanto na execução analítica como tempo longo tanto na execução analítica como

para para obtenção dos resultadosobtenção dos resultados

Custos relativamente altosCustos relativamente altos

Exigem crescimento microbiano da ordem de 10Exigem crescimento microbiano da ordem de 1066 células para ser células para ser

macroscopicamente visívelmacroscopicamente visível


Ofereceu a base para o desenvolvimento de novas aplicações da Ofereceu a base para o desenvolvimento de novas aplicações da

ciência e de tecnologias inovadoras com potenciais vantagens ciência e de tecnologias inovadoras com potenciais vantagens

sobre os métodos clássicossobre os métodos clássicos

Os Os métodos microbiológicos rápidos métodos microbiológicos rápidos são desenvolvidos para:são desenvolvidos para:

Obter resultados analíticos confiáveis que assegurem de forma mais Obter resultados analíticos confiáveis que assegurem de forma mais

eficaz a eficaz a segurança do produto segurança do produto

Reduzir o tempo de detecçãoReduzir o tempo de detecção

Melhorar o isolamento, enumeração e caracterização de micro-Melhorar o isolamento, enumeração e caracterização de micro-

organismos, organismos, além de melhorar o fluxo para análise de múltiplas amostrasalém de melhorar o fluxo para análise de múltiplas amostras

Possibilitar automação, miniaturização e de intervenção durante o Possibilitar automação, miniaturização e de intervenção durante o

processo processo de fabricação – real timede fabricação – real time

Produtos estéreisProdutos estéreis

O controle de produtos estéreis visa assegurar a ausência de O controle de produtos estéreis visa assegurar a ausência de

Micro-organismos Micro-organismos viáveisviáveis

Toxinas microbianasToxinas microbianas

Substância pirogênicaSubstância pirogênica

PirogênioPirogênio

Endotoxina bacteriEndotoxina bacterianaana

Teste do PirogênioTeste do Pirogênio

Método Método in vivoin vivo

Alto custoAlto custo Manutenção de biotérioManutenção de biotério

Alta capacitação técnicaAlta capacitação técnica Analistas capacitados na técnica Analistas capacitados na técnica

analíticaanalítica

Habilidade para o manuseio de animaisHabilidade para o manuseio de animais

Demanda tempo excessivoDemanda tempo excessivo Preparação do testePreparação do teste

Obtenção de resultados (3 horas)Obtenção de resultados (3 horas)

Ensaio limiteEnsaio limite

Método clássico, oficializado em 1942 na USP XIIMétodo clássico, oficializado em 1942 na USP XII

Endotoxinas bacterianasEndotoxinas bacterianas

O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria

farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974)farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974)

Método Método in vitroin vitro

Menor custoMenor custo

Menor capacitação técnica dos analistasMenor capacitação técnica dos analistas

Demanda menor tempo para a preparação do teste e para obtenção Demanda menor tempo para a preparação do teste e para obtenção

de resultados (1 hora)de resultados (1 hora)

Maior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidãoMaior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidão

Ensaios: qualitativos (formação de gel) e quantitativos (cinético)Ensaios: qualitativos (formação de gel) e quantitativos (cinético)

Portable Test SystemPortable Test System

Nova tecnologia para quantificação de endotoxinas Nova tecnologia para quantificação de endotoxinas

bacterianas, baseada no teste cinético do LALbacterianas, baseada no teste cinético do LAL

Maior facilidade analíticaMaior facilidade analítica

Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de

resultados resultados

(15 minutos)(15 minutos)

Possibilidade de monitoramento durante processo produtivoPossibilidade de monitoramento durante processo produtivo

Fonte: www.criver.comFonte: www.criver.com

Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade

Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos

que tenham sido submetidos a algum processo esterilizante, que tenham sido submetidos a algum processo esterilizante,

pela inoculação em meio de cultura nutriente, que permite a pela inoculação em meio de cultura nutriente, que permite a

detecção de bactérias, bolores e leveduras, incubado por detecção de bactérias, bolores e leveduras, incubado por

temperatura e tempos adequadostemperatura e tempos adequados

Oficializado:Oficializado:

em 1932 na British em 1932 na British

Pharmacopeia e Pharmacopeia e em 1936 USP XIem 1936 USP XI


19361936

InoculaçãoInoculaçãodiretadireta

19381938

19401940

19421942

19441944

19461946

19481948

19501950

19601960

19701970

19801980

InoculaçãoInoculaçãoindiretaindireta

InoculaçãoInoculaçãoIndireta em Indireta em

sistema fechadosistema fechado

Fonte: www.millipore.comFonte: www.millipore.com


19361936


19381938

19401940

19421942

19441944

19461946

19481948

19501950

19601960

19701970

19801980




Caldo Caldo peptonadopeptonado

Caldo Caldo peptonado peptonado + gelatina + gelatina

+ solução de Litmus+ solução de Litmus

MeioMeioTioglicolatoTioglicolato

Caldo Caldo peptonado peptonado

+ mel+ mel

Caldo Caldo SabouraudSabouraud

Caldo Caldo Caseína Caseína de sojade soja


19361936


19381938

19401940

19421942

19441944

19461946

19481948

19501950

19601960

19701970

19801980




Caldo peptonadoCaldo peptonado Caldo peptonado Caldo peptonado + gelatina + gelatina

+ solução de Litmus+ solução de Litmus

Meio Meio TioglicolatoTioglicolato

Caldo peptonado + Caldo peptonado + melmel

Caldo Caldo SabouraudSabouraud

Caldo Caseína de Caldo Caseína de sojasoja

5 dias5 dias 07 dias07 dias14 dias14 dias

10 dias10 dias

A partir de 2000, 14 diasA partir de 2000, 14 dias

14 dias14 dias

Limitações do Teste de esterilidadeLimitações do Teste de esterilidade

Quanto aos aspectos analíticos, observa-se uma evolução na Quanto aos aspectos analíticos, observa-se uma evolução na

metodologia do Teste de Esterilidade, porém persistem algumas metodologia do Teste de Esterilidade, porém persistem algumas

limitações no que diz respeito à segurança de informaçõeslimitações no que diz respeito à segurança de informações

A falta de certeza absoluta quanto a esterilidade de todas as unidades do A falta de certeza absoluta quanto a esterilidade de todas as unidades do

lote, considerando que a análise é realizada em uma amostra lote, considerando que a análise é realizada em uma amostra

representativa (limitação estatística)representativa (limitação estatística)

Escopo limitado à detecção de bactérias e fungosEscopo limitado à detecção de bactérias e fungos – não adequado à – não adequado à

detecção de vírus, micobactérias, micoplasmas, micro-organismos detecção de vírus, micobactérias, micoplasmas, micro-organismos

psicrófilos ou termófilospsicrófilos ou termófilos

Além disso:Além disso:

DemandamDemandam quantidades expressivas de material e equipamentosquantidades expressivas de material e equipamentos

tempo longo para detecção (visual) do crescimento tempo longo para detecção (visual) do crescimento

microbianomicrobiano

capacitação técnicacapacitação técnica

Métodos microbiológicos rápidos aplicáveis aoMétodos microbiológicos rápidos aplicáveis aoTeste de esterilidadeTeste de esterilidade

Crescimento microbianoCrescimento microbiano

Correspondem:Correspondem: à automação de métodos existentes à automação de métodos existentes ou ou

estão baseados em tecnologias novasestão baseados em tecnologias novas

Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez, Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez,

exatidão, precisão e especificidadeexatidão, precisão e especificidade

Viabilidade microbianaViabilidade microbiana

RMM baseado no crescimento microbianoRMM baseado no crescimento microbiano

Medida de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que refletem Medida de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que refletem

o crescimento microbianoo crescimento microbiano

Fonte: www.biomerrieux.comFonte: www.biomerrieux.com

Fonte: www.celsis.comFonte: www.celsis.com

Bioluminescência do ATPBioluminescência do ATP

Detecção colorimétrica da produção de Detecção colorimétrica da produção de

COCO22

Bioluminescência do ATPBioluminescência do ATP

Fonte: www.celsis.comFonte: www.celsis.com

ATP é um conhecido marcador de viabilidade celular e o ATP é um conhecido marcador de viabilidade celular e o

potencial de seu uso para detecção de bactérias foi potencial de seu uso para detecção de bactérias foi

inicialmente descrito por Levin e Chapelle, em 1968inicialmente descrito por Levin e Chapelle, em 1968

O processo depende de reação enzimática aeróbica entre luciferina, O processo depende de reação enzimática aeróbica entre luciferina,

luciferase e ATP, que emite luz, entre outros produtos, a qual é medida por luciferase e ATP, que emite luz, entre outros produtos, a qual é medida por

um luminômetro ou por câmara com dispositivo de carga acoplada.um luminômetro ou por câmara com dispositivo de carga acoplada.

Detecção colorimétrica do CODetecção colorimétrica do CO22

Detecção do CODetecção do CO22 produzido pelo metabolismo ativo dos micro- produzido pelo metabolismo ativo dos micro-

organismosorganismos

Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico

de COde CO22, recoberto por uma membrana permeável , recoberto por uma membrana permeável

apenas ao COapenas ao CO22


COCO22 gerado atravessa a membrana e atinge o gerado atravessa a membrana e atinge o

sensor, que saturado com solução sensível ao pH, sensor, que saturado com solução sensível ao pH,

tem a cor alterada de verde para amarelo a tem a cor alterada de verde para amarelo a

medida que o nível de COmedida que o nível de CO2 2 aumenta. Os detectores aumenta. Os detectores

produzem sinal proporcional à intensidade de cor produzem sinal proporcional à intensidade de cor

e à concentração de COe à concentração de CO22 e os transdutores e os transdutores

eletrônicos mudem as mudanças de pressão eletrônicos mudem as mudanças de pressão

positivas ou negativas provocadas pela produção positivas ou negativas provocadas pela produção

ou consumo do gás durante o crescimento ou consumo do gás durante o crescimento

microbianomicrobiano


RMM baseado na viabilidade celularRMM baseado na viabilidade celular

Detecção microbiana através do uso de marcadores de Detecção microbiana através do uso de marcadores de

viabilidade (substrato de viabilidade)viabilidade (substrato de viabilidade)

Citometria de fase sólidaCitometria de fase sólida

Fonte: www.aeschemunex.comFonte: www.aeschemunex.com

Independe da proliferação microbianaIndepende da proliferação microbiana

Baseia-se no uso de corantes vitais dos componentes bioquímicos de Baseia-se no uso de corantes vitais dos componentes bioquímicos de

células microbianas viáveiscélulas microbianas viáveis

A amostra é escaneada por um detector laser e o número de células A amostra é escaneada por um detector laser e o número de células

marcadas (fluorescentes) é obtidomarcadas (fluorescentes) é obtido

Métodos microbiológicos rápidos na indústria Métodos microbiológicos rápidos na indústria farmacêuticafarmacêutica

Entre as vantagens dos MMRs podemos citar:Entre as vantagens dos MMRs podemos citar:

Confiabilidade e especificidadeConfiabilidade e especificidade

Rapidez e agilidade na liberação de resultadosRapidez e agilidade na liberação de resultados

Diminuição do número de etapas de trabalhoDiminuição do número de etapas de trabalho

Diminuição do erro analíticoDiminuição do erro analítico

Melhoria da qualidade dos processosMelhoria da qualidade dos processos

Redução de custosRedução de custos

A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na

aplicação de MMR em relação à indústria farmacêutica, aplicação de MMR em relação à indústria farmacêutica,

provavelmente por uma regulamentação mais restritiva que provavelmente por uma regulamentação mais restritiva que

exige demonstrar a equivalência aos métodos de referência exige demonstrar a equivalência aos métodos de referência

e o atendimento dos parâmetros de validação analíticae o atendimento dos parâmetros de validação analítica

Validação de MMRValidação de MMR

Pode ser realizada segundo procedimentos descritos na USP Pode ser realizada segundo procedimentos descritos na USP

(Capítulo <1223>) e demais compêndios farmacopeicos ou no (Capítulo <1223>) e demais compêndios farmacopeicos ou no

documento PDA documento PDA Technical ReportTechnical Report 33 33

Parâmetros de Parâmetros de validaçãovalidação

Teste Teste QualitativoQualitativo

Teste Teste QuantitativoQuantitativo

ExatidãoExatidão NãoNão SimSim

PrecisãoPrecisão NãoNão SimSim

EspecificidadeEspecificidade SimSim SimSim

Limite de detecçãoLimite de detecção SimSim SimSim

Limite de quantificaçãoLimite de quantificação NãoNão SimSim

LinearidadeLinearidade NãoNão SimSim

FaixaFaixa NãoNão SimSim

RepetibilidadeRepetibilidade SimSim SimSim

RobustezRobustez SimSim SimSim

EquivalênciaEquivalência SimSim SimSim

Validação de MMR para Teste de EsterilidadeValidação de MMR para Teste de Esterilidade

Gram +Gram +

Gram –Gram –

LeveduraLevedura

Fungo filamentosoFungo filamentoso

AnaeróbioAnaeróbio

EsporuladoEsporulado

PDA Technical Report 33, PDA Technical Report 33,

20102010

Micro-organismos Micro-organismos

testeteste

Nível de Nível de

contaminaçãocontaminação20 UFC/mL20 UFC/mL

2 UFC/mL2 UFC/mL

0,2 UFC/mL0,2 UFC/mL

0,02 UFC/mL0,02 UFC/mL

ReplicatasReplicatas

50 a 100 testes 50 a 100 testes

pelo pelo

método método

convencionalconvencional

50 a 100 testes 50 a 100 testes

pelo pelo

método alternativométodo alternativo

Validação de MMR aplicado ao Teste de Validação de MMR aplicado ao Teste de EsterilidadeEsterilidade

Nível de Nível de inóculoinóculo

Proporção esperada deProporção esperada de N resultados N resultados positivos em positivos em

N=100N=100negativosnegativos positivospositivos

2020 < 0,001< 0,001 >0,999>0,999 100100

22 0,1350,135 0,8650,865 8787

0,20,2 0,8190,819 0,1810,181 1818

0,020,02 0,9800,980 0,0200,020 22

Avaliação estatísticaAvaliação estatística

Os métodos são equivalentes quando a proporção Os métodos são equivalentes quando a proporção

de resultados positivos e negativos obtidos em de resultados positivos e negativos obtidos em

cada um deles não apresenta diferença cada um deles não apresenta diferença

estatisticamente significativaestatisticamente significativa

Dificuldades na implantação de MMRDificuldades na implantação de MMR

Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades

na utilização de MMR:na utilização de MMR:

Custo inicial de aquisição das tecnologiasCusto inicial de aquisição das tecnologias

Disponibilidade limitada de alguns insumos específicosDisponibilidade limitada de alguns insumos específicos

Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por

agências como agências como FDA, ANVISAFDA, ANVISA

TreinamentoTreinamento

Necessidade de recursos suficientes e Necessidade de recursos suficientes e expertiseexpertise tecnológica tecnológica

para para realização dos estudos de validação e equivalênciarealização dos estudos de validação e equivalência

Considerações finaisConsiderações finais

A utilização de MMR corresponde a novas oportunidades na A utilização de MMR corresponde a novas oportunidades na

garantia da qualidade e segurança de uso de produtos garantia da qualidade e segurança de uso de produtos

farmacêuticosfarmacêuticos

Uma variedade de novas possibilidades estão sendo disponibilizadas, com Uma variedade de novas possibilidades estão sendo disponibilizadas, com

vantagens e dificuldades que devem ser consideradas na escolha da vantagens e dificuldades que devem ser consideradas na escolha da

tecnologia mais adequada à finalidade pretendida.....tecnologia mais adequada à finalidade pretendida.....

..... facilidades, praticidade, ..... facilidades, praticidade,

rapidez....rapidez....

..... Porém nenhuma tecnologia será tão perfeita que irá prescindir da ..... Porém nenhuma tecnologia será tão perfeita que irá prescindir da

avaliação dos dados por um avaliação dos dados por um microbiologistamicrobiologista! !

Adriana BugnoCentro de Medicamentos, Cosméticos e

SaneantesInstituto Adolfo Lutz

Av. Dr. Arnaldo, 355 – Cerqueira Cesar São Paulo/SP

Tel/Fax: 11 [email protected]

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