TEMA 13

MÉTODOS INMUNOLÓGICOS EN MÉTODOS INMUNOLÓGICOS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Métodos inmunológicos

1.Detección de antígenos

Obtención de anticuerpos

Marcado de las inmunoglobulinas

Técnicas de detección

Aglutinación

Tema 13. Principios y métodos del

diagnóstico inmunológico

Aglutinación

Inmunofluorescencia

Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

2. Detección de anticuerpos

Muestras de suero

Pruebas serológicas

Aglutinación directa

Inmunofluorescencia

Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

- La reacción antígeno-anticuerpo se puede utilizar para detectar antígenos (si se dispone de anticuerpos específicos) o anticuerpos (si se dispone de antígeno purificados)

Métodos inmunológicos

- Estas dos afirmaciones constituyen la base de las pruebas inmunológicas para la detección de los antígenos microbianos y para la detección de anticuerpos sintetizados frente a ellos (diágnostico serológico)

- Las reacciones inmunológicas pueden realizarse en tubosconvencionales, membranas, portaobjetos o en micropocillos de placasde microtitulación

Métodos inmunológicos

Placas de microtitulación

-Algunas técnicas tienen valor diagnóstico, en algunos casos son confirmadas por otras, o incluso como técnicas de referencia por su elevada eficacia

-Muchas de estas técnicas son más rápidas, sencillas, económicas e

1. Detección de antígenos

Pretenden detectar el microorganismo utilizando anticuerpos

específicos marcados

-Muchas de estas técnicas son más rápidas, sencillas, económicas e incluso más sensibles que el cultivo, como en el caso de las clamidias o los virus

- Junto con la PCR, estas técnicas constituyen los métodos más utilizados en la actualidad en los laboratorios de virología

- Como se investiga un único microorganismo en cada prueba y al tratarse de pruebas caras y laboriosas, debe establecerse una cuidadosa evaluación clínica del paciente para solicitar la prueba adecuada

- Los anticuerpos utilizados pueden ser policlonales (obtenidos a partir de animales inmunizados con el antígeno) o monoclonales(producidos in vitro)

1.1. Obtención de anticuerpos

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos monoclonales

-Al fragmento Fc de una Ig pueden unirse químicamente diversas sustancias:

- Enzimas: al actuar sobre un sustrato lo transforman en un producto de diferente color

- β-galactosidasa

1.2. Marcado de las inmunoglobulinas

sustrato producto coloreado- β-galactosidasa

- fosfatasa alcalina

- peroxidasa de rábano

antígeno

anticuerpo

enzima

sustrato producto coloreado

- Sustancias fluorescentes: producen luz cuando son excitadas por una radiación incidente

- isotiocianato de fluoresceína

- rodamina

1.1.2. Marcado de las inmunoglobulinas

- umbeliferona

- lantánidos

- Sustancias lumínicas: producen luz por medio de una reacción química, generalmente una oxidación (quimioluminiscencia)

- luminol

- isoluminol

- ésteres de acridina

- adamantil dioxietano

- Partículas inertes: Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de

su fragmento Fc a la superficie de una membrana o de partículas

inertes (látex, gelatina, oro coloidal)

Las inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar tanto antígenos

como otros anticuerpos

- Si en una muestra clínica (LCR, orina, esputo) está presente un determinado microorganismo, al añadirle los anticuerpos marcados específicos contra él se fijarán al microorganismo y se producirá el efecto o la señal correspondiente:

- aglutinación- cambio de color de un sustrato

Técnicas de detección de antígenos

- cambio de color de un sustrato- fluorescencia- emisión de luz

- Por el contrario, si el microorganismo buscado no está presente en la muestra, los anticuerpos no podrán unirse a él y no se producirá la señal

- Se utilizan anticuerpos adheridos por su región Fc a partículas grandes de látex que facilitan la observación de la aglutinación al formarse grumos de gran tamaño

- Permiten la detección de antígenos

Aglutinación

- Permiten la detección de antígenos solubles (polisacárido); se pueden realizar sobre un portaobjetos y se llevan a cabo en tan sólo unos minutos

- Se utilizan anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes que se fijan a los microorganismos (inmunofluorescencia directa, IFD)

Inmunofluorescencia

- La visualización se realiza con un microscopio de fluorescencia observándose el microorganismo brillante (fluorescente) sobre un fondo oscuro

Inmunofluorescencia directa (IFD)

- Aunque los virus no pueden ser observados por su pequeño

tamaño en un microscopio óptico, se pueden detectar las proteínas

víricas que producen cuando se están multiplicando en una célula,

mediante anticuerpos específicos para esas proteínas

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

- Existe una técnica de inmunofluorescencia, denominada indirecta(IFI), que consiste en detectar los diferentes antígenos con suanticuerpo específico no marcado y a continuación revelarlo medianteun anticuerpo marcado dirigido contra el primer anticuerpo (anti-anticuerpo) (con un solo anticuerpo marcado se pueden revelar losdiferentes anticuerpos específicos no marcados)

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

- En la placa de microtitulación se fijan anticuerpos específicoscontra el antígeno que se quiere detectar

Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

1

2 -Se añade la muestra al pocillo y si el antígeno del microorganismo buscado está presente, los anticuerpos lo fijan (se unen a él)

3

4

5

- Se añade un anticuerpo dirigido contra el antígeno (igual al del pocillo, pero marcado con una enzima que se fija al antígeno)

- Se añade el sustrato (incoloro) sobre el que actúa la enzima

- Aparece un color (producto coloreado) cuya intensidad se puede medir en un colorímetro. Cuando en la muestra no existe el antígeno buscado, no se produce color

Lectura

Muestra

Unión MarcadoLavado

Sustratosin color

Productocoloreado

Anticuerposecundario

EnzimaAnticuerpo

Sitio deunión

1.1.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

coloreadosecundarioanti-anticuerpo

del paciente

Antígeno viral

- Las pruebas serológicas constituyen un método indirecto de diagnóstico al detectar en el suero del paciente los anticuerpos formados frente al microorganismo causante de la infección

- Necesitan que haya una buena respuesta de anticuerpos

- Sólo pueden utilizarse cuando una infección está plenamente instaurada

1.2. Detección de anticuerpos

(pruebas serológicas)

- Sólo pueden utilizarse cuando una infección está plenamente instaurada

- Las técnicas permiten calcular la cantidad de anticuerpos (título de anticuerpos)

- Deben extraerse entre 5 y 10 mL de sangre, dejar que coagule a temperatura ambiente (20 minutos) y separar el suero por centrifugación (1.000-1.200 g durante 10 minutos)

- Una vez separado el suero, puede mantenerse a 4-6ºC durante una semana, pero es preferible congelarlo a -20ºC (se conserva años si se evita la descongelación y congelación repetidas)

Muestras de suero

evita la descongelación y congelación repetidas)

Pruebas serológicas

- La reacción antígeno-anticuerpo puede evidenciarse por técnicas semejantes a las descritas para la detección de antígenos

-Las más utilizadas son: aglutinación directa, inmunofluorescencia yenzimoinmunoanálisis

- Puede realizarse sobre un portaobjetos, en tubos de ensayo o en placas de microtitulación

- Se prepara una suspensión del microorganismo (antígeno )

- Al enfrentar la suspensión al suero del paciente, si hay anticuerpos, las partículas microbianas aglutinan: sobrenadante transparente y la formación de muchos grumos cuando se resuspende el sedimento

Aglutinación

formación de muchos grumos cuando se resuspende el sedimento

Se hacen diluciones del suero

para ver la cantidad (el título)

de anticuerpos

- El título de anticuerpos es la dilución

más alta del suero en la que se

detecta aglutinación

Aglutinación

- En los pocillos el patrón es diferente: un sedimento amplio y granulado significa reacción positiva y un botón puntiforme central, reacción negativa

- Para cuantificar los anticuerpos en cada tubo o pocillo se realizan diluciones del suero

- El título de anticuerpos es la dilución más alta del suero en la que se detecta aglutinación

- En tres zonas de un portaobjetos se deposita una suspensión de unmicroorganismo (antígeno)

- Cada zona se baña con una dilucióndiferente de suero de un paciente (1/10,1/100 y 1/500)

- Lavado

Inmunofluorescencia

- Lavado

-Después de lavar el portaobjetos, seañade una solución de anticuerpos deconejo anti-Ig humana marcados conun producto fluorescente

- Se observa con el microscopio defluorescencia: en los lugares dondese ha producido una reacciónantígeno-anticuerpo, se observará señal

- El antígeno microbiano se fija en el fondo de un pocillo, se añade el suero de un paciente y se incuba

- Si el suero poseía anticuerpos contra ese antígeno, éstos se habrán fijado a él, arrastrándose mediante el lavado el resto de inmunoglobulinas presentes

Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

-A continuación se añaden anticuerpos dirigidos contra la Ig humana, obtenidos en conejos y marcados con una enzima

-Al añadir el sustrato incoloro, si se ha producido la reacción antígeno-anticuerpo, aparecerá color

Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Si falta este anticuerpo, es decir, si en el

suero del paciente no hay anticuerpos

no se detecta color al final