Métodos de determinação da estrutura de...
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Métodos de determinação da estrutura
de macromoléculas
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Cristalografia de raios X
•Purificação da proteína
•Obtenção de cristais de proteína
•Recolha de dados
•Determinação das fases
•Refinamento da estrutura
•Validação da estrutura
•Deposição e/ou publicação da estrutura
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Purificação
•Conhecimento da sequência
•Sistema de expressão ?
•Técnicas standard de purificação de proteína
•Obtenção de quantidades na ordem do
miligrama
•A proteína deve ter uma pureza superior a
97% para que a cristalização seja viável
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http://www.piercenet.com/
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Cristalização
•Dificuldade de cristalização:
as macromoléculas são objectos irregulares com superfícies de
contacto relativamente pequenas
•Crescimento lento:
os cristais podem dem
orar meses até
atingirem as dimensões
necessários (~0.5 mm)
•Depedendênciade múltiplos parâmetros:
pH, tem
peratura, concentração de proteína, solvente,
precipitantes, iões e outros ligandos. Por vezes usam-se robôs de
cristalização para varrer um conjunto vasto de combinações
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Cristal de lisozima
Cristal de cloretode sódio
•Os cristasde proteínacontêm
umaquantidade
elevadade água
•O empacotamento émuito menos denso que num cristal iónico
como o cloreto de sódio
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•Cristal vs solução
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Robô de cristalização
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Software de controlo
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Método da gota pendente
•Cerca
de 10 µ µµµL de umasoluçãode 10 mg/ml de proteína
écolocada
numaplacade vidro
•A placa éinvertida sobre um copo contendo ~ 1 mLde uma solução concentrada de
precipitante, por exp. sulfato de amónia
•O equilíbrio entre a gota e a solução éatingido lentamente por difusão de vapor, e a
concentração de proteína aumenta por perda de água para o reservatório, até
ser
atingido o limite de saturação, com a consequente precipitação da proteína e formação de
cristais (se as condições forem
propícias!)
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Cristais de proteína
Azurina
Flavodoxin
rubredoxin
miohemeritina
hemoglobin
bacterioclorofilaa
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Produção de raios X
Tubo de descarga de Crookes(cerca de 1900)
•A grandediferençade potencialentre cátodo
e ânodoproduz
descarga
de electrões
sobreo ânodo. A travagemdos electrõesno ânodo
éacompanhadade produçãode raios
X
(Bremsstrahlung
, radiação de travagem)
•O primeiro tipo de tubo de raios X, m
uito pouco eficiente. O
pera com um vácuo de cerca
de um 1 Torr
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Produção de raios X
Tubo de Coolidge
K -cátodo
A -ânodo
C -sistema de refrigeração
Win,Wout-água
X -raios X
•Os electrõeslibertam-se do cátodoporem
issãotermiónica, sendo
acelerados
atéao
ânodo
•O sobreaquecimento do ânodo éevitado através de um sistema de arrefecimento a água
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Produção de raios X
Tubo de Ânodo rotativo
C -cátodo
A -ânodo
C -sistema de refrigeração
W -janela
T -zona alvo
•O ânodo
roda
paraexpordiferentes
aofeixede raios
X e assim
dissiparcalornuma
área
maisextensa
•Éo design mais usado actualmente para fontes monocromáticas de raios X
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Radiação sincrotrónica
•RadiaçãoX produzida
pelaaceleração
de electrões
num aceleradorcircular (sincrotrão)
•Produz feixes extraordináriamente
intensos, que podem
ser monocromáticos ou
policromáticos
•Permite tempos de medição muito mais curtos
•Instalações geridas e partilhadas por consórcios de países, p.exp
o ES
RF (European
SynchrotronRadiationFacility) em Grenoble
Beamlines
magneto
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ESRF
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Recolha de dados -gonióm
etro
•O cristalémontado
numacabeça
móvel(goniómetro), quepermitea orientação
do
cristalde acordo
com osseus
eixosde simetria
Goniómetro
cristal
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Recolha de dados
goniómetro
detector
feixe de raios X
cristal
•O cristalroda
sobreo feixede raios, e osraiosdifractadossãorecolhidos
num
detector
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Difractóm
etro de raios X
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Dados de difracção
•Os raiosX difractados
pelocristalproduzemum padrãode pontosna
superfíciedo
detector.
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Lei de Bragg
2 d sinθ= n λ
d-distância entre dois planos
λ λλλ-comprimento de onda
θ θθθ-ângulo de incidência
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Cálculo da distância entre planos
•A lei de Bragg pode
ser usadaparacalculara distânciaentre doisplanos, se o ângulo
do raiodifractado
for conhecido, bem
comoo comprimentode ondada
radiação
X
usada.
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Espaço real versusespaço recíproco
•Os dados recolhidos
pelodetector podem
ser encaradoscomosendoumasecção
numarede
tridimensional de pontos
igualmente
espaçadas. A cadaconjuntode planos
no cristalcorrespondeum pontodo espaçorecíproco.
Espaço real
Espaço recíproco
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Espalhamento e periodicidade
1 átomna origem
2 átomsem -a/2 e +a/2
3 átomsem -a, 0 e +a
4 átomos em -(3/2)a, -
(1/2)a,+(1/2)a,+(3/2)a
Número infinito de átomos
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Espalhamento numa rede bi-dimensional
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Reconstrução da estrutura
O padrão produzido por um retículo periódico de moléculas éidêntico ao da mólecula
isolado, mas apenas mensurável num conjunto discreto de pontos:
A partir do padrão de espalhamento da molécula isolada seria possível reconstruir a
estrutura da molécula original:
periodicidade
Transformada de Fourier
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Reconstrução da estrutura
•Cadareflexão
(h,k,l) podeser descritaporum factor de estrutura
Fhkl
2(
)
1
jj
j
nihx
kylz
hkl
j
j
Ffe
π+
+
=
=∑
•A densidade
electrónicaρ(x,y,z) podeser calculadaa partirde
2(
)1
(,,)
ihxky
lz
hkl
hk
l
xyz
Fe
V
πρ
−+
+=∑∑∑
Note-se que os factores de estrutura Fhkltêm uma amplitudee uma fase
!
As intensidades medidas I são proporcionais àamplitude dos factores de estrutura:
2
hkl
IF
∝
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(h,k,l)
(0,0.0)
h
k
l
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Problema das fases
•Os factores de estrutura tem fase e
amplitude, mas a intensidade dos pontos dá
apenas a amplitude
•A maioria da informação estrutural estána
fase
•Formas de resolver as fases:
–Síntese de Patterson
–Substituição isomórfica
(metais pesados)
–Substituição molecular
–MAD (m
ultipleanomalousdispersion)
–Métodos directos
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Importância das fases
Síntese de Fourierusando apenas as
intensidades
Síntese de Fourierusando apenas as
fases
2(
)1
(,,)
ihxkylz
hkl
hk
l
xyz
Fe
V
πρ
−+
+=∑∑∑
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Substituição isom
órfica
•Um únicoátomode mercúrioécapazde produzirumadiferençamédiade 30%
entre
osfactores
de estruturada
moléculaoriginal (F
P) e a moléculasubstituída(F
PH) para
umaproteína
de 40000 d !
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Densidade electrónica
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Interpretar a densidade
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Modelar a estrutura na densidade electrónica
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Refinamento da estrutura
1.Medição de reflexões
2.Estimativa das fases
3.Obtenção de um modelo, com ajuda de informação
estereoquímica
4.Transformada de Fourier
inversa para obter as
intensidades e fases “teóricas”produzindo o modelo
5.Uso das novas fases teóricas junto com as
intensidades para criar um novo modelo
6.Voltar a 3
obs
calc
obs
R−
=∑∑F
F
F
R-factor
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Efeito da resolução