Protocolo de monitoreo para evaluar la captura y el efecto ...
METODOLOGíA Hongos Anaerobios Ruminales Nativos N. 1981 .... 2005 Parte3.pdf · DNS (Miller,...
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27 rumen mediante la evaluación de secuencias diagnósticas y varios protocolos de extracción de DNA. METODOLOGíA Hongos Anaerobios Ruminales Nativos Se aislaron colonias de hongos anaerobios a partir del líquido ruminal de un toro de 2 años de la raza criolla Blanco Orejinegro (BON), alimentado ad libitum. El líquido ruminal se colectó mediante el método de extracción por cánula bajo condiciones anaeróbicas, se diluyó hasta 10 -4 Y cada dilución se inoculó en medios de cultivo sólido los cuales se incubaron a 39°C (Joblin K. N. 1981; Hungate R.E. 1966). Los medios de cultivo sólido y líquido se prepararon a partir de las metodologías descritas por Hungate, 1966, Holdeman L. V. et al, 1977 y modificaciones propuestas por Bauchop et al. ,en 1979 con algunas adaptaciones realizadas en el Laboratorio de Biotecnología Ruminal para el cultivo de microorganismos anaerobios. Los medios líquidos contenían una mezcla de Sales I (16 mi), Sales II (16.5 mi), Fluido Ruminal (17 mi), Extracto de Levadura (0.10 g), Bicarbonato (0.50 g), L-Cisteina Hidrochloride (0.02 g), Resarzurin (0.0001 mi), Hemina (0.0002 mi), una solución de vitaminas y antibióticos (1 .212 p/v, benzilpenicilina, 0.265% p/v sulfato de estreptomicina y 0.060% p/v Cloranfenicol) y Agua destilada (50 mi). Los medios se ajustaron a pH = 7.0 +/- 0.2 C, con un buffer de NaHC0 3 - CO 2 bajo condiciones anaeróbicas con gas carbónico (C0 2 ). Los medios sólidos presentaron una composición similar, excepto porque en este caso, se agregó agar al medio.
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27
rumen mediante la evaluacioacuten de secuencias diagnoacutesticas y varios protocolos
de extraccioacuten de DNA
METODOLOGiacuteA
Hongos Anaerobios Ruminales Nativos
Se aislaron colonias de hongos anaerobios a partir del liacutequido ruminal de un
toro de 2 antildeos de la raza criolla Blanco Orejinegro (BON) alimentado ad
libitum El liacutequido ruminal se colectoacute mediante el meacutetodo de extraccioacuten por
caacutenula bajo condiciones anaeroacutebicas se diluyoacute hasta 10 -4 Y cada dilucioacuten se
inoculoacute en medios de cultivo soacutelido los cuales se incubaron a 39degC (Joblin K
N 1981 Hungate RE 1966)
Los medios de cultivo soacutelido y liacutequido se prepararon a partir de las
metodologiacuteas descritas por Hungate 1966 Holdeman L V et al 1977 y
modificaciones propuestas por Bauchop et al en 1979 con algunas
adaptaciones realizadas en el Laboratorio de Biotecnologiacutea Ruminal para el
cultivo de microorganismos anaerobios Los medios liacutequidos conteniacutean una
mezcla de Sales I (16 mi) Sales II (165 mi) Fluido Ruminal (17 mi) Extracto
de Levadura (010 g) Bicarbonato (050 g) L-Cisteina Hidrochloride (002
g) Resarzurin (00001 mi) Hemina (00002 mi) una solucioacuten de vitaminas y
antibioacuteticos (1 212 pv benzilpenicilina 0265 pv sulfato de estreptomicina
y 0060 pv Cloranfenicol) y Agua destilada (50 mi) Los medios se
ajustaron a pH = 70 +- 02 C con un buffer de NaHC03 - CO2 bajo
condiciones anaeroacutebicas con gas carboacutenico (C02) Los medios soacutelidos
presentaron una composicioacuten similar excepto porque en este caso se
agregoacute agar al medio
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Las cepas crecieron bajo un ambiente de anaerobiosis de C02 a un pH de
66 a 69 y a una temperatura de 39degC El crecimiento y las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas macroscoacutepicas de las colonias fuacutengicas se observoacute al
estereoscopio a intervalos de 6 horas durante las primeras 48 horas La
purificacioacuten de las colonias se realizoacute mediante repiques sucesivos de
colonias individuales cada 4-5 diacuteas entre medio soacutelido y medio liacutequido En
los casos en los que se obtuvo zoosporogeacutenesis se hicieron diluciones de
soluciones de zoosporas para garantizar la obtencioacuten de cultivos
monozoospoacutericos La pureza de los cultivos se constatoacute por comparacioacuten de
la morfologiacutea macroscoacutepica y microscoacutepica de las colonias En esta etapa no
se adicionaron antibioacuteticos dado que los aislados estaban ausentes de
bacterias lo cual se corroboroacute por tincioacuten de Gram
Para el repique de medio soacutelido a medio liacutequido se tomaron porciones de 3
mm de diaacutemetro de la periferia de las colonias seleccionadas utilizando una
pipeta pasteur cuyo extremo se habiacutea modificado en forma de ventosa y
habiacutea sido previamente gasificada con CO2 Los cultivos en medio liacutequido se
incubaron a 39degC y cada 12 horas se agitaron fuertemente con vortex
durante 30 segundos con el fin de estimular el crecimiento y obtener
fragmentacioacuten miceliar faacutecilmente transferible cada vez que se repicaron los
aislados Para los inoacuteculos tomados de medio liacutequido se tomoacute un mililitro de
cultivo previamente agitado con vortex con una jeringa gasificada con C02
Las colonias de hongos fueron adaptadas a medio de cultivo suplementado
con paja de arroz antes de realizar los ensayos de crecimiento y actividad
enzimaacutetica en los sustratos complejos analizados
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Residuos de cosecha evaluados como sustratos
Se evaluaron los siguientes residuos de cosecha en concentraciones de
00045 gmi espiga de la paja de arroz bagazo de cantildea lavado y cascarilla
de cafeacute bajo las condiciones de la despulpadora Como control se utilizoacute
celulosa cristalina Sigmareg tipo 101
Todos los sustratos complejos fueron triturados con un molino de aspas para
obtener un tamantildeo de partiacutecula 05 mm fueron esterilizados en autoclave a
121degC 15 lbs de presioacuten por 15 minutos se secaron hasta peso constante y
se almacenaron en envases esteacuteriles bien tapados
No se adicionaron azucares solubles en ninguno de los materiales
preparados y en el caso del bagazo de cantildea se realizaron lavados con agua
destilada a 50 oC agitacioacuten magneacutetica durante 30 minutos y filtracioacuten entre
cada lavada antes (una vez) y despueacutes (cinco veces) de moler el material
para minimizar el efecto de los azuacutecares solubles propios del sustrato
Evaluacioacuten de la induccioacuten de esporangiogeacutenesis y zoosporogeacutenesis en
medios de cultivo
Se tomaron 15 mi de los medios de cultivo suplementados con glucosa o
paja de arroz incubados durante 4 5 Y 6 diacuteas los cuales conteniacutean
fragmentos de micelio y se inocularon en 90 mi de cada uno de los
siguientes medios de cultivo Glucosa (03Pv) Celobiosa (03 PN) Paja
de arroz (044 PN) Bagazo de Cantildea (044 PN) Y una mezcla de
Glucosa y Celobiosa (0303 PN) Cada ensayo se realizoacute por triplicado
Los cultivos fueron agitados diariamente para promover la liberacioacuten de
zoosporas y se observaron cada 24 horas durante 5 diacuteas en un microscopio
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invertido marca Nikom modelo TMS-F para monitorear la
esporangiogeacutenesis y la zoosporogeacutenesis Se registraron fotos de esporangios
y micelio utilizando una caacutemara digital marca Olympus modelo C35BX que
se adaptoacute al microscopio invertido
Preparacioacuten de los inoacuteculos
Para garantizar homogeneidad entre los inoacuteculos se colectaron soluciones
de zoosporas a partir de los sobrenadantes de 8 cultivos del hongo E1
incubados durante 65 horas en medio suplementado con paja de arroz y se
utilizoacute un mililitro de esta solucioacuten para cada uno de los tratamientos
analizados Para estimar la variacioacuten entre los inoacuteculos despueacutes de la
siembra de 5 tubos se cultivoacute un mililitro en medio soacutelido seguacuten la
metodologiacutea previamente descrita se incubaron a 39degC por 48 horas y se
contaron las Unidades Formadoras de Talo (UFT) con la ayuda de un
estereomicroscopio La concentracioacuten promedio del inoacuteculo estuvo en un
rango de 57 +- 846 Y64 +- 1103 zoosporas
Para la evaluacioacuten de las diferentes actividades enzimaacuteticas se obtuvieron
filtrados de cultivos del hongo incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno
de los medios suplementados con residuos de cosecha Para la evaluacioacuten
de la estabilidad enzimaacutetica los filtrados se obtuvieron de cultivos del hongo
en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a 39degC
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Evaluacioacuten de la cineacutetica de crecimiento de HARBR-E1
Para escoger el meacutetodo de cuantificacioacuten de crecimiento maacutes apropiado se
evaluoacute preliminarmente la cineacutetica proliferativa del hongo cultivado en
medios suplementados con glucosa y celobiosa por tres meacutetodos
1) Cuantificacioacuten del volumen desalojado por el gas total acumulado como
producto metaboacutelico (Theodorou M K 1995) Despueacutes de una hora de
incubacioacuten del cultivo se equilibroacute la presioacuten interna en el tubo de cultivo
mediante la salida o inyeccioacuten de CO2 con una jeringa previamente
desgasificada El volumen de la fase gaseosa producida por el metabolismo
del hongo se relacionoacute con el crecimiento fuacutengico y se midioacute por el
desplazamiento del embolo en la jeringa introducida en los cultivos
evaluados
(2) Determinacioacuten del peso de la masa fuacutengica El cultivo se filtroacute a traveacutes
de un embudo gooch de tamantildeo de poro medio o un papel de fibra de vidrio
Whatman tipo C con ayuda de vacio los cuales habiacutean sido previamente
secados y pesados Luego de vaciar el contenido y guardar los filtrados para
otros ensayos se completoacute el traspaso con agua destilada y se incubaron a
80degC hasta lograr peso constante La masa fuacutengica se pesoacute en una balaza
analiacutetica marca OHAUS Explorer
(3) Deteccioacuten espectrofotomeacutetrica de la cantidad de formiato liberado al
medio (Lowe S E 1987 NY Sleat1984) Un volumen de 05 mi de los
filtrados obtenidos por el procedimiento anterior se centrifugaron a 11600 g
durante 15 minutos y se mezclaron con 1 mi de solucioacuten derivatizante que
conteniacutea 05 g de aacutecido citrico monohidratado (Cario Erbareg) 10 g de
acetamida (Merckreg)100 mi de isopropanol (J T Bakerreg) 005 mi de una
solucioacuten al 30 (pv) de acetato de sodio (Merckreg) y 35 mi de anhiacutedrido
aceacutetico (Merckreg) Las mezclas se agitaron en vortex durante 15 segundos
se dejaron en reposo 145 horas y posteriormente se les midioacute la
absorbancia a 520 nm en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 Genesys Los
valores de formiato se interpolaron a partir de una curva de calibracioacuten que
se construyoacute con soluciones de formiato de concentraciones conocidas (05
306090 12 Y 15 mM) las cuales se prepararon en medio de cultivo sin
inoculo El blanco reactivo se preparoacute de manera similar soacutelo que en lugar
de solucioacuten estaacutendar de formiato se utilizaron 05 mi de medio de cultivo
recieacuten preparado y previamente centrifugado a 11 600 g durante 15 minutos
Los ensayos se hicieron en tres reacuteplicas en la que las muestras se tomaron
por duplicado cada 24 horas durante 10 diacuteas excepto en el caso de la masa
fuacutengica la cual se midioacute cada 48 horas La cuantificacioacuten
espectrofotomeacutetrica de formiato se utilizoacute para evaluar el crecimiento del
hongo HARE1 en medios suplementados con los residuos de cosecha
Preparacioacuten de los filtrados fuacutengicos
La actividades enzimaacuteticas se evaluaron en filtrados obtenidos de cultivos
fuacutengicos incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno de los medios
suplementados con residuos de cosecha El efecto de diferentes valores de
pH (40 50 60 65 70 80 oacute 90) sobre las actividades enzimaacuteticas
analizadas se evaluoacute a 40degC y el efecto de las temperaturas de 20 30 40
50 60 oacute 70 oC se evaluoacute a pH 65 valor encontrado en el fluido ruminal en
el momento del muestreo Los ensayos se realizaron en tres reacuteplicas con
dos repeticiones
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
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aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
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internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
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reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
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RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
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Las cepas crecieron bajo un ambiente de anaerobiosis de C02 a un pH de
66 a 69 y a una temperatura de 39degC El crecimiento y las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas macroscoacutepicas de las colonias fuacutengicas se observoacute al
estereoscopio a intervalos de 6 horas durante las primeras 48 horas La
purificacioacuten de las colonias se realizoacute mediante repiques sucesivos de
colonias individuales cada 4-5 diacuteas entre medio soacutelido y medio liacutequido En
los casos en los que se obtuvo zoosporogeacutenesis se hicieron diluciones de
soluciones de zoosporas para garantizar la obtencioacuten de cultivos
monozoospoacutericos La pureza de los cultivos se constatoacute por comparacioacuten de
la morfologiacutea macroscoacutepica y microscoacutepica de las colonias En esta etapa no
se adicionaron antibioacuteticos dado que los aislados estaban ausentes de
bacterias lo cual se corroboroacute por tincioacuten de Gram
Para el repique de medio soacutelido a medio liacutequido se tomaron porciones de 3
mm de diaacutemetro de la periferia de las colonias seleccionadas utilizando una
pipeta pasteur cuyo extremo se habiacutea modificado en forma de ventosa y
habiacutea sido previamente gasificada con CO2 Los cultivos en medio liacutequido se
incubaron a 39degC y cada 12 horas se agitaron fuertemente con vortex
durante 30 segundos con el fin de estimular el crecimiento y obtener
fragmentacioacuten miceliar faacutecilmente transferible cada vez que se repicaron los
aislados Para los inoacuteculos tomados de medio liacutequido se tomoacute un mililitro de
cultivo previamente agitado con vortex con una jeringa gasificada con C02
Las colonias de hongos fueron adaptadas a medio de cultivo suplementado
con paja de arroz antes de realizar los ensayos de crecimiento y actividad
enzimaacutetica en los sustratos complejos analizados
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Residuos de cosecha evaluados como sustratos
Se evaluaron los siguientes residuos de cosecha en concentraciones de
00045 gmi espiga de la paja de arroz bagazo de cantildea lavado y cascarilla
de cafeacute bajo las condiciones de la despulpadora Como control se utilizoacute
celulosa cristalina Sigmareg tipo 101
Todos los sustratos complejos fueron triturados con un molino de aspas para
obtener un tamantildeo de partiacutecula 05 mm fueron esterilizados en autoclave a
121degC 15 lbs de presioacuten por 15 minutos se secaron hasta peso constante y
se almacenaron en envases esteacuteriles bien tapados
No se adicionaron azucares solubles en ninguno de los materiales
preparados y en el caso del bagazo de cantildea se realizaron lavados con agua
destilada a 50 oC agitacioacuten magneacutetica durante 30 minutos y filtracioacuten entre
cada lavada antes (una vez) y despueacutes (cinco veces) de moler el material
para minimizar el efecto de los azuacutecares solubles propios del sustrato
Evaluacioacuten de la induccioacuten de esporangiogeacutenesis y zoosporogeacutenesis en
medios de cultivo
Se tomaron 15 mi de los medios de cultivo suplementados con glucosa o
paja de arroz incubados durante 4 5 Y 6 diacuteas los cuales conteniacutean
fragmentos de micelio y se inocularon en 90 mi de cada uno de los
siguientes medios de cultivo Glucosa (03Pv) Celobiosa (03 PN) Paja
de arroz (044 PN) Bagazo de Cantildea (044 PN) Y una mezcla de
Glucosa y Celobiosa (0303 PN) Cada ensayo se realizoacute por triplicado
Los cultivos fueron agitados diariamente para promover la liberacioacuten de
zoosporas y se observaron cada 24 horas durante 5 diacuteas en un microscopio
30
invertido marca Nikom modelo TMS-F para monitorear la
esporangiogeacutenesis y la zoosporogeacutenesis Se registraron fotos de esporangios
y micelio utilizando una caacutemara digital marca Olympus modelo C35BX que
se adaptoacute al microscopio invertido
Preparacioacuten de los inoacuteculos
Para garantizar homogeneidad entre los inoacuteculos se colectaron soluciones
de zoosporas a partir de los sobrenadantes de 8 cultivos del hongo E1
incubados durante 65 horas en medio suplementado con paja de arroz y se
utilizoacute un mililitro de esta solucioacuten para cada uno de los tratamientos
analizados Para estimar la variacioacuten entre los inoacuteculos despueacutes de la
siembra de 5 tubos se cultivoacute un mililitro en medio soacutelido seguacuten la
metodologiacutea previamente descrita se incubaron a 39degC por 48 horas y se
contaron las Unidades Formadoras de Talo (UFT) con la ayuda de un
estereomicroscopio La concentracioacuten promedio del inoacuteculo estuvo en un
rango de 57 +- 846 Y64 +- 1103 zoosporas
Para la evaluacioacuten de las diferentes actividades enzimaacuteticas se obtuvieron
filtrados de cultivos del hongo incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno
de los medios suplementados con residuos de cosecha Para la evaluacioacuten
de la estabilidad enzimaacutetica los filtrados se obtuvieron de cultivos del hongo
en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a 39degC
31
Evaluacioacuten de la cineacutetica de crecimiento de HARBR-E1
Para escoger el meacutetodo de cuantificacioacuten de crecimiento maacutes apropiado se
evaluoacute preliminarmente la cineacutetica proliferativa del hongo cultivado en
medios suplementados con glucosa y celobiosa por tres meacutetodos
1) Cuantificacioacuten del volumen desalojado por el gas total acumulado como
producto metaboacutelico (Theodorou M K 1995) Despueacutes de una hora de
incubacioacuten del cultivo se equilibroacute la presioacuten interna en el tubo de cultivo
mediante la salida o inyeccioacuten de CO2 con una jeringa previamente
desgasificada El volumen de la fase gaseosa producida por el metabolismo
del hongo se relacionoacute con el crecimiento fuacutengico y se midioacute por el
desplazamiento del embolo en la jeringa introducida en los cultivos
evaluados
(2) Determinacioacuten del peso de la masa fuacutengica El cultivo se filtroacute a traveacutes
de un embudo gooch de tamantildeo de poro medio o un papel de fibra de vidrio
Whatman tipo C con ayuda de vacio los cuales habiacutean sido previamente
secados y pesados Luego de vaciar el contenido y guardar los filtrados para
otros ensayos se completoacute el traspaso con agua destilada y se incubaron a
80degC hasta lograr peso constante La masa fuacutengica se pesoacute en una balaza
analiacutetica marca OHAUS Explorer
(3) Deteccioacuten espectrofotomeacutetrica de la cantidad de formiato liberado al
medio (Lowe S E 1987 NY Sleat1984) Un volumen de 05 mi de los
filtrados obtenidos por el procedimiento anterior se centrifugaron a 11600 g
durante 15 minutos y se mezclaron con 1 mi de solucioacuten derivatizante que
conteniacutea 05 g de aacutecido citrico monohidratado (Cario Erbareg) 10 g de
acetamida (Merckreg)100 mi de isopropanol (J T Bakerreg) 005 mi de una
solucioacuten al 30 (pv) de acetato de sodio (Merckreg) y 35 mi de anhiacutedrido
aceacutetico (Merckreg) Las mezclas se agitaron en vortex durante 15 segundos
se dejaron en reposo 145 horas y posteriormente se les midioacute la
absorbancia a 520 nm en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 Genesys Los
valores de formiato se interpolaron a partir de una curva de calibracioacuten que
se construyoacute con soluciones de formiato de concentraciones conocidas (05
306090 12 Y 15 mM) las cuales se prepararon en medio de cultivo sin
inoculo El blanco reactivo se preparoacute de manera similar soacutelo que en lugar
de solucioacuten estaacutendar de formiato se utilizaron 05 mi de medio de cultivo
recieacuten preparado y previamente centrifugado a 11 600 g durante 15 minutos
Los ensayos se hicieron en tres reacuteplicas en la que las muestras se tomaron
por duplicado cada 24 horas durante 10 diacuteas excepto en el caso de la masa
fuacutengica la cual se midioacute cada 48 horas La cuantificacioacuten
espectrofotomeacutetrica de formiato se utilizoacute para evaluar el crecimiento del
hongo HARE1 en medios suplementados con los residuos de cosecha
Preparacioacuten de los filtrados fuacutengicos
La actividades enzimaacuteticas se evaluaron en filtrados obtenidos de cultivos
fuacutengicos incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno de los medios
suplementados con residuos de cosecha El efecto de diferentes valores de
pH (40 50 60 65 70 80 oacute 90) sobre las actividades enzimaacuteticas
analizadas se evaluoacute a 40degC y el efecto de las temperaturas de 20 30 40
50 60 oacute 70 oC se evaluoacute a pH 65 valor encontrado en el fluido ruminal en
el momento del muestreo Los ensayos se realizaron en tres reacuteplicas con
dos repeticiones
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
33
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
37
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
38
39
Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
29
Residuos de cosecha evaluados como sustratos
Se evaluaron los siguientes residuos de cosecha en concentraciones de
00045 gmi espiga de la paja de arroz bagazo de cantildea lavado y cascarilla
de cafeacute bajo las condiciones de la despulpadora Como control se utilizoacute
celulosa cristalina Sigmareg tipo 101
Todos los sustratos complejos fueron triturados con un molino de aspas para
obtener un tamantildeo de partiacutecula 05 mm fueron esterilizados en autoclave a
121degC 15 lbs de presioacuten por 15 minutos se secaron hasta peso constante y
se almacenaron en envases esteacuteriles bien tapados
No se adicionaron azucares solubles en ninguno de los materiales
preparados y en el caso del bagazo de cantildea se realizaron lavados con agua
destilada a 50 oC agitacioacuten magneacutetica durante 30 minutos y filtracioacuten entre
cada lavada antes (una vez) y despueacutes (cinco veces) de moler el material
para minimizar el efecto de los azuacutecares solubles propios del sustrato
Evaluacioacuten de la induccioacuten de esporangiogeacutenesis y zoosporogeacutenesis en
medios de cultivo
Se tomaron 15 mi de los medios de cultivo suplementados con glucosa o
paja de arroz incubados durante 4 5 Y 6 diacuteas los cuales conteniacutean
fragmentos de micelio y se inocularon en 90 mi de cada uno de los
siguientes medios de cultivo Glucosa (03Pv) Celobiosa (03 PN) Paja
de arroz (044 PN) Bagazo de Cantildea (044 PN) Y una mezcla de
Glucosa y Celobiosa (0303 PN) Cada ensayo se realizoacute por triplicado
Los cultivos fueron agitados diariamente para promover la liberacioacuten de
zoosporas y se observaron cada 24 horas durante 5 diacuteas en un microscopio
30
invertido marca Nikom modelo TMS-F para monitorear la
esporangiogeacutenesis y la zoosporogeacutenesis Se registraron fotos de esporangios
y micelio utilizando una caacutemara digital marca Olympus modelo C35BX que
se adaptoacute al microscopio invertido
Preparacioacuten de los inoacuteculos
Para garantizar homogeneidad entre los inoacuteculos se colectaron soluciones
de zoosporas a partir de los sobrenadantes de 8 cultivos del hongo E1
incubados durante 65 horas en medio suplementado con paja de arroz y se
utilizoacute un mililitro de esta solucioacuten para cada uno de los tratamientos
analizados Para estimar la variacioacuten entre los inoacuteculos despueacutes de la
siembra de 5 tubos se cultivoacute un mililitro en medio soacutelido seguacuten la
metodologiacutea previamente descrita se incubaron a 39degC por 48 horas y se
contaron las Unidades Formadoras de Talo (UFT) con la ayuda de un
estereomicroscopio La concentracioacuten promedio del inoacuteculo estuvo en un
rango de 57 +- 846 Y64 +- 1103 zoosporas
Para la evaluacioacuten de las diferentes actividades enzimaacuteticas se obtuvieron
filtrados de cultivos del hongo incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno
de los medios suplementados con residuos de cosecha Para la evaluacioacuten
de la estabilidad enzimaacutetica los filtrados se obtuvieron de cultivos del hongo
en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a 39degC
31
Evaluacioacuten de la cineacutetica de crecimiento de HARBR-E1
Para escoger el meacutetodo de cuantificacioacuten de crecimiento maacutes apropiado se
evaluoacute preliminarmente la cineacutetica proliferativa del hongo cultivado en
medios suplementados con glucosa y celobiosa por tres meacutetodos
1) Cuantificacioacuten del volumen desalojado por el gas total acumulado como
producto metaboacutelico (Theodorou M K 1995) Despueacutes de una hora de
incubacioacuten del cultivo se equilibroacute la presioacuten interna en el tubo de cultivo
mediante la salida o inyeccioacuten de CO2 con una jeringa previamente
desgasificada El volumen de la fase gaseosa producida por el metabolismo
del hongo se relacionoacute con el crecimiento fuacutengico y se midioacute por el
desplazamiento del embolo en la jeringa introducida en los cultivos
evaluados
(2) Determinacioacuten del peso de la masa fuacutengica El cultivo se filtroacute a traveacutes
de un embudo gooch de tamantildeo de poro medio o un papel de fibra de vidrio
Whatman tipo C con ayuda de vacio los cuales habiacutean sido previamente
secados y pesados Luego de vaciar el contenido y guardar los filtrados para
otros ensayos se completoacute el traspaso con agua destilada y se incubaron a
80degC hasta lograr peso constante La masa fuacutengica se pesoacute en una balaza
analiacutetica marca OHAUS Explorer
(3) Deteccioacuten espectrofotomeacutetrica de la cantidad de formiato liberado al
medio (Lowe S E 1987 NY Sleat1984) Un volumen de 05 mi de los
filtrados obtenidos por el procedimiento anterior se centrifugaron a 11600 g
durante 15 minutos y se mezclaron con 1 mi de solucioacuten derivatizante que
conteniacutea 05 g de aacutecido citrico monohidratado (Cario Erbareg) 10 g de
acetamida (Merckreg)100 mi de isopropanol (J T Bakerreg) 005 mi de una
solucioacuten al 30 (pv) de acetato de sodio (Merckreg) y 35 mi de anhiacutedrido
aceacutetico (Merckreg) Las mezclas se agitaron en vortex durante 15 segundos
se dejaron en reposo 145 horas y posteriormente se les midioacute la
absorbancia a 520 nm en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 Genesys Los
valores de formiato se interpolaron a partir de una curva de calibracioacuten que
se construyoacute con soluciones de formiato de concentraciones conocidas (05
306090 12 Y 15 mM) las cuales se prepararon en medio de cultivo sin
inoculo El blanco reactivo se preparoacute de manera similar soacutelo que en lugar
de solucioacuten estaacutendar de formiato se utilizaron 05 mi de medio de cultivo
recieacuten preparado y previamente centrifugado a 11 600 g durante 15 minutos
Los ensayos se hicieron en tres reacuteplicas en la que las muestras se tomaron
por duplicado cada 24 horas durante 10 diacuteas excepto en el caso de la masa
fuacutengica la cual se midioacute cada 48 horas La cuantificacioacuten
espectrofotomeacutetrica de formiato se utilizoacute para evaluar el crecimiento del
hongo HARE1 en medios suplementados con los residuos de cosecha
Preparacioacuten de los filtrados fuacutengicos
La actividades enzimaacuteticas se evaluaron en filtrados obtenidos de cultivos
fuacutengicos incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno de los medios
suplementados con residuos de cosecha El efecto de diferentes valores de
pH (40 50 60 65 70 80 oacute 90) sobre las actividades enzimaacuteticas
analizadas se evaluoacute a 40degC y el efecto de las temperaturas de 20 30 40
50 60 oacute 70 oC se evaluoacute a pH 65 valor encontrado en el fluido ruminal en
el momento del muestreo Los ensayos se realizaron en tres reacuteplicas con
dos repeticiones
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
33
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
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RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
30
invertido marca Nikom modelo TMS-F para monitorear la
esporangiogeacutenesis y la zoosporogeacutenesis Se registraron fotos de esporangios
y micelio utilizando una caacutemara digital marca Olympus modelo C35BX que
se adaptoacute al microscopio invertido
Preparacioacuten de los inoacuteculos
Para garantizar homogeneidad entre los inoacuteculos se colectaron soluciones
de zoosporas a partir de los sobrenadantes de 8 cultivos del hongo E1
incubados durante 65 horas en medio suplementado con paja de arroz y se
utilizoacute un mililitro de esta solucioacuten para cada uno de los tratamientos
analizados Para estimar la variacioacuten entre los inoacuteculos despueacutes de la
siembra de 5 tubos se cultivoacute un mililitro en medio soacutelido seguacuten la
metodologiacutea previamente descrita se incubaron a 39degC por 48 horas y se
contaron las Unidades Formadoras de Talo (UFT) con la ayuda de un
estereomicroscopio La concentracioacuten promedio del inoacuteculo estuvo en un
rango de 57 +- 846 Y64 +- 1103 zoosporas
Para la evaluacioacuten de las diferentes actividades enzimaacuteticas se obtuvieron
filtrados de cultivos del hongo incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno
de los medios suplementados con residuos de cosecha Para la evaluacioacuten
de la estabilidad enzimaacutetica los filtrados se obtuvieron de cultivos del hongo
en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a 39degC
31
Evaluacioacuten de la cineacutetica de crecimiento de HARBR-E1
Para escoger el meacutetodo de cuantificacioacuten de crecimiento maacutes apropiado se
evaluoacute preliminarmente la cineacutetica proliferativa del hongo cultivado en
medios suplementados con glucosa y celobiosa por tres meacutetodos
1) Cuantificacioacuten del volumen desalojado por el gas total acumulado como
producto metaboacutelico (Theodorou M K 1995) Despueacutes de una hora de
incubacioacuten del cultivo se equilibroacute la presioacuten interna en el tubo de cultivo
mediante la salida o inyeccioacuten de CO2 con una jeringa previamente
desgasificada El volumen de la fase gaseosa producida por el metabolismo
del hongo se relacionoacute con el crecimiento fuacutengico y se midioacute por el
desplazamiento del embolo en la jeringa introducida en los cultivos
evaluados
(2) Determinacioacuten del peso de la masa fuacutengica El cultivo se filtroacute a traveacutes
de un embudo gooch de tamantildeo de poro medio o un papel de fibra de vidrio
Whatman tipo C con ayuda de vacio los cuales habiacutean sido previamente
secados y pesados Luego de vaciar el contenido y guardar los filtrados para
otros ensayos se completoacute el traspaso con agua destilada y se incubaron a
80degC hasta lograr peso constante La masa fuacutengica se pesoacute en una balaza
analiacutetica marca OHAUS Explorer
(3) Deteccioacuten espectrofotomeacutetrica de la cantidad de formiato liberado al
medio (Lowe S E 1987 NY Sleat1984) Un volumen de 05 mi de los
filtrados obtenidos por el procedimiento anterior se centrifugaron a 11600 g
durante 15 minutos y se mezclaron con 1 mi de solucioacuten derivatizante que
conteniacutea 05 g de aacutecido citrico monohidratado (Cario Erbareg) 10 g de
acetamida (Merckreg)100 mi de isopropanol (J T Bakerreg) 005 mi de una
solucioacuten al 30 (pv) de acetato de sodio (Merckreg) y 35 mi de anhiacutedrido
aceacutetico (Merckreg) Las mezclas se agitaron en vortex durante 15 segundos
se dejaron en reposo 145 horas y posteriormente se les midioacute la
absorbancia a 520 nm en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 Genesys Los
valores de formiato se interpolaron a partir de una curva de calibracioacuten que
se construyoacute con soluciones de formiato de concentraciones conocidas (05
306090 12 Y 15 mM) las cuales se prepararon en medio de cultivo sin
inoculo El blanco reactivo se preparoacute de manera similar soacutelo que en lugar
de solucioacuten estaacutendar de formiato se utilizaron 05 mi de medio de cultivo
recieacuten preparado y previamente centrifugado a 11 600 g durante 15 minutos
Los ensayos se hicieron en tres reacuteplicas en la que las muestras se tomaron
por duplicado cada 24 horas durante 10 diacuteas excepto en el caso de la masa
fuacutengica la cual se midioacute cada 48 horas La cuantificacioacuten
espectrofotomeacutetrica de formiato se utilizoacute para evaluar el crecimiento del
hongo HARE1 en medios suplementados con los residuos de cosecha
Preparacioacuten de los filtrados fuacutengicos
La actividades enzimaacuteticas se evaluaron en filtrados obtenidos de cultivos
fuacutengicos incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno de los medios
suplementados con residuos de cosecha El efecto de diferentes valores de
pH (40 50 60 65 70 80 oacute 90) sobre las actividades enzimaacuteticas
analizadas se evaluoacute a 40degC y el efecto de las temperaturas de 20 30 40
50 60 oacute 70 oC se evaluoacute a pH 65 valor encontrado en el fluido ruminal en
el momento del muestreo Los ensayos se realizaron en tres reacuteplicas con
dos repeticiones
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
33
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
37
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
38
39
Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
31
Evaluacioacuten de la cineacutetica de crecimiento de HARBR-E1
Para escoger el meacutetodo de cuantificacioacuten de crecimiento maacutes apropiado se
evaluoacute preliminarmente la cineacutetica proliferativa del hongo cultivado en
medios suplementados con glucosa y celobiosa por tres meacutetodos
1) Cuantificacioacuten del volumen desalojado por el gas total acumulado como
producto metaboacutelico (Theodorou M K 1995) Despueacutes de una hora de
incubacioacuten del cultivo se equilibroacute la presioacuten interna en el tubo de cultivo
mediante la salida o inyeccioacuten de CO2 con una jeringa previamente
desgasificada El volumen de la fase gaseosa producida por el metabolismo
del hongo se relacionoacute con el crecimiento fuacutengico y se midioacute por el
desplazamiento del embolo en la jeringa introducida en los cultivos
evaluados
(2) Determinacioacuten del peso de la masa fuacutengica El cultivo se filtroacute a traveacutes
de un embudo gooch de tamantildeo de poro medio o un papel de fibra de vidrio
Whatman tipo C con ayuda de vacio los cuales habiacutean sido previamente
secados y pesados Luego de vaciar el contenido y guardar los filtrados para
otros ensayos se completoacute el traspaso con agua destilada y se incubaron a
80degC hasta lograr peso constante La masa fuacutengica se pesoacute en una balaza
analiacutetica marca OHAUS Explorer
(3) Deteccioacuten espectrofotomeacutetrica de la cantidad de formiato liberado al
medio (Lowe S E 1987 NY Sleat1984) Un volumen de 05 mi de los
filtrados obtenidos por el procedimiento anterior se centrifugaron a 11600 g
durante 15 minutos y se mezclaron con 1 mi de solucioacuten derivatizante que
conteniacutea 05 g de aacutecido citrico monohidratado (Cario Erbareg) 10 g de
acetamida (Merckreg)100 mi de isopropanol (J T Bakerreg) 005 mi de una
solucioacuten al 30 (pv) de acetato de sodio (Merckreg) y 35 mi de anhiacutedrido
aceacutetico (Merckreg) Las mezclas se agitaron en vortex durante 15 segundos
se dejaron en reposo 145 horas y posteriormente se les midioacute la
absorbancia a 520 nm en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 Genesys Los
valores de formiato se interpolaron a partir de una curva de calibracioacuten que
se construyoacute con soluciones de formiato de concentraciones conocidas (05
306090 12 Y 15 mM) las cuales se prepararon en medio de cultivo sin
inoculo El blanco reactivo se preparoacute de manera similar soacutelo que en lugar
de solucioacuten estaacutendar de formiato se utilizaron 05 mi de medio de cultivo
recieacuten preparado y previamente centrifugado a 11 600 g durante 15 minutos
Los ensayos se hicieron en tres reacuteplicas en la que las muestras se tomaron
por duplicado cada 24 horas durante 10 diacuteas excepto en el caso de la masa
fuacutengica la cual se midioacute cada 48 horas La cuantificacioacuten
espectrofotomeacutetrica de formiato se utilizoacute para evaluar el crecimiento del
hongo HARE1 en medios suplementados con los residuos de cosecha
Preparacioacuten de los filtrados fuacutengicos
La actividades enzimaacuteticas se evaluaron en filtrados obtenidos de cultivos
fuacutengicos incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno de los medios
suplementados con residuos de cosecha El efecto de diferentes valores de
pH (40 50 60 65 70 80 oacute 90) sobre las actividades enzimaacuteticas
analizadas se evaluoacute a 40degC y el efecto de las temperaturas de 20 30 40
50 60 oacute 70 oC se evaluoacute a pH 65 valor encontrado en el fluido ruminal en
el momento del muestreo Los ensayos se realizaron en tres reacuteplicas con
dos repeticiones
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
33
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
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reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
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RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
aceacutetico (Merckreg) Las mezclas se agitaron en vortex durante 15 segundos
se dejaron en reposo 145 horas y posteriormente se les midioacute la
absorbancia a 520 nm en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 Genesys Los
valores de formiato se interpolaron a partir de una curva de calibracioacuten que
se construyoacute con soluciones de formiato de concentraciones conocidas (05
306090 12 Y 15 mM) las cuales se prepararon en medio de cultivo sin
inoculo El blanco reactivo se preparoacute de manera similar soacutelo que en lugar
de solucioacuten estaacutendar de formiato se utilizaron 05 mi de medio de cultivo
recieacuten preparado y previamente centrifugado a 11 600 g durante 15 minutos
Los ensayos se hicieron en tres reacuteplicas en la que las muestras se tomaron
por duplicado cada 24 horas durante 10 diacuteas excepto en el caso de la masa
fuacutengica la cual se midioacute cada 48 horas La cuantificacioacuten
espectrofotomeacutetrica de formiato se utilizoacute para evaluar el crecimiento del
hongo HARE1 en medios suplementados con los residuos de cosecha
Preparacioacuten de los filtrados fuacutengicos
La actividades enzimaacuteticas se evaluaron en filtrados obtenidos de cultivos
fuacutengicos incubados a 39degC durante 7 diacuteas en cada uno de los medios
suplementados con residuos de cosecha El efecto de diferentes valores de
pH (40 50 60 65 70 80 oacute 90) sobre las actividades enzimaacuteticas
analizadas se evaluoacute a 40degC y el efecto de las temperaturas de 20 30 40
50 60 oacute 70 oC se evaluoacute a pH 65 valor encontrado en el fluido ruminal en
el momento del muestreo Los ensayos se realizaron en tres reacuteplicas con
dos repeticiones
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
33
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
37
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
38
39
Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
Aislamiento de DNA y evaluacioacuten de cebadores
Para el aislamiento de ONA se ensayaron varios protocolos con
modificaciones Se utilizoacute el kit comercial Wizardreg Genomic ONA purification
Kit A1120 (Promega Madison USA) seguacuten las recomendaciones del
fabricante y otras metodologiacuteas para romper la pared celular de los hongos
anaerobios del rumen las cuales incluyeron maceracioacuten de micelio fresco y
liofilizado en presencia de nitroacutegeno liacutequido arenilla de cuarzo y otras
adaptaciones descritas en el anexo 2 Un protocolo adicional se ensayoacute en
soluciones de zoosporas
El disentildeo y evaluacioacuten teoacuterica de la especificidad de los cebadores para
hongos se realizoacute con la ayuda de los programas computacionales Bioedit
(Hall 1999) Primer3 (Rozen y Skaletsky 2000 httpwwwshy
genomewi mitedu) y Blast (Stephen 1997
httpwwwncbi nlmnihgovBLAST) mediante anaacutelisis de alineamiento
muacuteltiple de las secuencias de ONAr 18S e ITS pertenecientes a los geacuteneros
de hongos Neocallimastix Piromyces Orpinomyces y Anaeromyces
publicadas en el GenBank (httpwwwncbi nlmnihgov)
Perfil eectroforeacutetico del contenido proteico del filtrado fuacutengico
mediante SDS-PAGE La SOS-PAGE se realizoacute en geles de poliacrilamida
al 10 (pv) en presencia de SOS (01 pv) (Laemmli 1970) Las
muestras de enzima se desnaturalizaron en SOS al 5 (pv) por incubacioacuten
durante 5 minutos a 100 oC La electroforesis se corrioacute a 15 oC y una
corriente constante de 40 mV Las bandas de proteiacutena se detectaron por
tentildeido con Azul Brillante Coomassie G-250 La cantidad de cada proteiacutena
33
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
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RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
34
aplicada al gel fue de 5-50 IJg de acuerdo a la metodologiacutea descrita por Xue
G-P et al 1992
Evaluacioacuten de la actividad Exo-P-14-glucanasa (EC 32191) o Avicelasa en
los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) Para evaluar el efecto del pH un volumen de 03 mi del
filtrado del hongo se incuboacute durante 40 horas a una temperatura de 40 oC
con una solucioacuten que conteniacutea 00200 g de celulosa cristalina (Sigmacell
101) Y 15 mi de solucioacuten buffer de citrato - fosfato 01 M a pH bajo estudio
Un procedimiento similar se utilizoacute para evaluar el efecto de la temperatura
de incubacioacuten excepto porque en este caso el pH se fijoacute a 65
Despueacutes de la incubacioacuten de los filtrados con celulosa cristalina se
adicionaron a la mezcla 30 mi del reactivo de DNS se taparon y agitaron
con vortex se sometieron a ebullicioacuten durante 15 minutos se enfriaron con
agua a temperatura ambiente y se centrifugaron a 7500 rpm durante 10
minutos
Un mililitro del sobrenadante se diluyoacute con 30 mi de agua destilada se agitoacute
con vortex se leyoacute la absorbancia a 540 nm (IUPAC) contra un blanco
reactivo y el valor obtenido se interpoloacute de una curva de calibracioacuten
construida con 20 mi de soluciones estaacutendar de glucosa de 100 300 500
700 Y 900 ppm las cuales se trataron de manera similar a los extractos y el
blanco reactivo
Los tubos blanco se prepararon similar a las muestras excepto porque no se
adicionoacute filtrado fuacutengico La actividad exoglucanasa se expresoacute en unidades
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
37
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
38
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
35
internacionales UIml considerando una unidad como la cantidad de enzima
que libera un micromol de glucosa por minuto
Evaluacioacuten de la actividad endo-fJ-14-Glucanasa (EC 3214) o
carboximetilcelulasa en los filtrados fuacutengicos
La actividad enzimaacutetica se determinoacute por el meacutetodo de azuacutecares reductores
DNS (Miller 1959) En estos ensayos 02 mi del filtrado del hongo se
incubaron durante 30 minutos a 40degC con una solucioacuten que conteniacutea 00100
g de carboximetilcelulosa grado comercial de alta viscosidad y alto grado de
sustitucioacuten Geycel F1-2000reg (Quiacutemica Amtex) y 18 mi de solucioacuten buffer
de citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio
La curva de calibracioacuten en este caso se construyoacute a partir de soluciones
estaacutendares de 500625750 125 Y 175 ppm La actividad de CMCasa se
expresoacute como la cantidad de azucares reductores liberados como glucosa
por minuto por mililitro de extracto enzimaacutetico
Evaluacioacuten de la actividad fJ-14-glucosidasa (EC 32121) o Celobiasa
en los filtrados fuacutengicos
En este caso la actividad se determinoacute por el Meacutetodo enzimaacutetico Glucosa
Oxidasa - usando un Kit comercial de Biosystems siguiendo las
recomendaciones del fabricante
Brevemente 05 mi del filtrado del hongo se mezclaron con una solucioacuten que
conteniacutea 00020 g de celobiosa (JT Bakerreg) y 05 mi de solucioacuten buffer de
citrato - fosfato 01 M con uno de los valores de pH bajo estudio se
agitaron con vortex se incubaron a 40degC durante 30 minutos y se sometieron
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
36
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
37
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
38
39
Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
a ebullicioacuten durante 8 minutos con el fin de desnaturalizar el extracto
enzimaacutetico
Despueacutes de enfriarse a temperatura ambiente y centrifugarse a 7500 rpm
durante 10 minutos 05 mi del sobrenadante se mezclaron con 1 mi del
reactivo A (GO) se agitaron con vortex se dejaron en reposo durante 20
minutos y se leyeron en un espectrofotoacutemetro Spectronic 20 genesys a 500
nm contra un blanco reactivo
Los valores de absorbancia obtenidos se interpolaron en una curva de
calibracioacuten de glucosa como estaacutendar la cual se construyoacute con 05 mi de
soluciones estaacutendar de glucosa de 15 45 75 Y 105 ppm respectivamente
Las soluciones estaacutendar y el blanco reactivo se prepararon de manera
similar a los extractos excepto porque en el caso del blanco reactivo se
utilizaron 05 mi de agua destilada en lugar del medio de cultivo La actividad
p - glucosidasa se expresoacute como la cantidad de glucosa liberada por minuto
por mililitro de extracto enzimaacutetico
Estabilidad del extracto enzimaacutetico
La estabilidad del extracto ezimaacutetico se evaluoacute en filtrados del hongo
cultivado en celulosa cristalina durante 7 diacuteas a las temperaturas y pH en los
que se encontroacute mayor actividad para cada una de las enzimas Para tal fin
se incubaron por separado 30 mi del filtrado del hongo a 50degC 40degC Y 0shy
5degC en un bantildeo termostatizado Despueacutes de 12 horas de incubacioacuten se
determinaron las actividades enzimaacuteticas celulasa CMCasa y p-glucosidasa
utilizando para cada caso los pH y temperaturas en las cuales se obtuvo
mayor actividad enzimaacutetica y las metodologiacuteas descritas en la seccioacuten
anterior Los datos se tomaron por duplicado a partir de ensayos de tres
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reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
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RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
reacuteplicas (Lowe S E 1987 Hebraud M 1988)Para el ensayo de 0-5 oC la
determinacioacuten se realizoacute cada 24 horas durante 4 diacuteas mientras que para
los ensayos de 40 y 50degC el muestreo se realizoacute cada 12 horas
Anaacutelisis Estadiacutestico
Los datos obtenidos de las actividades enzimaacuteticas se graficaron como
promedios para obtener una curva de actividad con respecto al pH o a la
temperatura Para cada una de las actividades enzimaacuteticas se construyoacute un
graacutefico box plot con los datos obtenidos en los puntos con mayor actividad
Con la ayuda del paquete estadiacutestico SAS se evaluoacute si los datos en estos
puntos teniacutean una distribucioacuten normal utilizando la prueba Shapiro-Wilk Para
los resultados que presentaron una distribucioacuten normal se usoacute la Prueba T
para comparar las diferencias entre las actividades enzimaacuteticas promedio en
los sustratos de intereacutes y en el caso contrario se utilizoacute como prueba no
parameacutetrica el Test de Wilcoxon
37
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
RESULTADOS
Aislamiento purificacioacuten y mantenimiento de hongos ruminales
Despueacutes de 48 horas de incubacioacuten bajos las condiciones antes descritas se observoacute
crecimiento de colonias fuacutengicas de diversas morfologiacuteas (figura 1) en inoacuteculos de liacutequido
ruminal diluidos hasta 10 -4 auacuten cuando en esta uacuteltima dilucioacuten se observaron solo cinco
colonias
Entre el tercero y el seacuteptimo diacutea se obtuvieron cultivos axeacutenicos con colonias que
presentaron actividad proliferativa en los repiques despueacutes de este periacuteodo las colonias
presentaron dificultades para crecer en los nuevos medios repicados Para los anaacutelisis
los repiques se realizaron cada 5 a 6 diacuteas
La mejor actividad proliferativa se observoacute en inoacuteculos tomados de la porcioacuten perifeacuterica
de las colonias en comparacioacuten con los tomados de la porcioacuten central de la colonia y en
tubos agitados vigorosamente con vortex 3 veces cada diacutea durante 30 segundos En las
etapas preliminares se observoacute crecimiento de las colonias en todos los sustratos
complejos bajo estudio auacuten cuando la inspeccioacuten visual de los cultivos hizo evidente que
la velocidad de crecimiento variaba entre sustratos siendo menor en cascarilla de cafeacute
Los microorganismos aislados en medio suplementado con glucosa y celobiosa
tuvieron la habilidad de crecer directamente en medios con sustratos complejos
sin necesidad de una etapa previa de adaptacioacuten Para los anaacutelisis de
zoosporogeacutenesis se tomaron cinco colonias las cuales fueron denominadas
como 5V2 62CV 8182 91D2 Y 9383
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
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Flgura 1 Colonias fuacutengicas con diversas morfologiacuteas
