METODO DE SALTING-OUT

• Técnica de tipo inorgánica• Utiliza reactivos bajos en

toxicidad• Permite visualizar la malla del

ADN.

Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra.

Protocolo:1.- Colocar 6 ml de sangre periférica en tubos de centrifuga de plástico de 15 ml. Agregar el Buffer lisis frío hasta completar los 15 ml. Dejar en congeladora por 15 minutos agitándolo de vez en cuando. ( 3-5 veces)

2.- Centrifugar a 5,000 rpm por 20 minutos. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante.

3.- Resuspender el pellet (golpeándolo con la mano) y añadir 15 ml de Buffer lisis frío. Mezclar 30 segundos por inversión. Centrifugar a 5,000 rpm por 20 minutos.

4.- Repetir el paso 2 y 3 varias veces (3 a 4) para lavar el pellet. (hasta que el líquido sobrenadante quede transparente).

5.- Resuspender el pellet con 3 ml del Buffer lisis caliente. Disgregar el pellet golpeando suavemente el fondo del tubo con los dedos.

6.- Agregar SDS 10% 0.5 ml utilizando una jeringa de tuberculina. Mezclar suavemente por rotación.

7.- Agregar 0.1 ml de Proteinasa K (20 mgr/ml), utilizando una jeringa de Tuberculina. Colocar los tubos en Baño María a 50ºC por 17 a 24 horas.

8.- Agregar al contenido 2 ml de Cloruro de Sodio 6M. Mezclar por inversión por 2 minutos.

9.- Centrifugar a 5000 rpm por 20 minutos a otro tubo nuevo de centrífuga de 15 ml.10.- Repetir el paso 8 y 9 una vez más si fuera necesario.11.- Al sobrenadante obtenido se le agrega igual volumen de Alcohol Isopropílico ó Etanol Absoluto helado.

12.- Mezclar suavemente por inversión y observar la formación de la medusa de ADN (hebra de ADN genómico). Si es necesario dejar en congelación por 30 minutos para una mejorprecipitación.

13.- Utilizando una pipeta pasteur coger la hebra de ADN y colocarla rápidamente en un tubo eppendorf de 2 ml. Dejar secar en estufa.

14.- Agregar 1 ml de TE 1X. y disolver el ADN mezclando por inversión. Guardar el ADN extraído a Tº. de refrigeración hasta su cuantificación.