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Metodi di analisi di OGM Roberta Onori Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari

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Metodi di analisi di OGM

Roberta Onori

Istituto Superiore di Sanità

Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per

i Rischi Alimentari

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Quadro

normativoAttivitàAttività

PrePre--marketingmarketing

metodi di analis imetodi di analis iIndaginiIndagini

s ullas ulla

es po s izionees po s izione

AttivitàAttività

PostPost--

marketingmarketingControlloControllo

ufficialeufficiale

AutocontrolloAutocontrollo

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Metodi di analisi degli OGM

Ditte produttrici

Per verificare le caratteristiche molecolari e la segregazione dell’OGM

Per monitorare la modificazione genetica mella produzione di ibridi

Idustrie alimentari, mangimistiche e sementiere

Per garantire la tracciabilità dei prodotti

Per garantire il rispetto delle normative vigenti

Autorità Competenti

Per l’attuazione del controllo ufficiale da parte deilaboratori competenti

Laboratori privati

Per fornire servizio analitico ai richiedenti

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Elementi che permettono di

individuare la presenza di OGM

Presenza del

“transgene”

Bt toxin crystals

Presenza della

proteina espressione

del transgene

inserito

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METODI ANALITICI

per la DIAGNOSTICA degli OGM

DNA PCR

PROTEINE TecnicheIMMUNOENZIMATICHE

(ELISA)

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Metodi ELISA per la determinazione delleproteine

proteine

Anticorpo di cattura

Signal

development

Recognition

Sites

(Epitopes)

Anticorpi

Enzima coniugato

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Metodi rapidi qualitativiMetodi rapidi qualitativi

Metodi quantitativiMetodi quantitativi

Soia RR e colza

Mais Event 176

Mais Bt 11

Applicazione di metodi immunologici agli

OGM

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Metodi rapidi

Reagent Flow

Labelled FilterCover

Result WindowReservoir Pad

Lateral Flow Device Schematic

Reagent Flow

Negative Result

Single band

Reagent Flow

Positive Result

Two bands

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Aliquota da analizzare

Estrazione delle

proteine

Dispensazione dell’estratto

nei pozzetti della piastra

Step 5.

Data analysis

Campione

Step

1.Step 2.

Step 3.

Step 4.

Metodi quantitativi ELISA

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Kit commerciali per l’analisi di OGM

BT Cry 1A(b)

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Metodi ELISA

• Materie prime o prodotti non

sottoposti a procedimenti tecnologici

in grado di denaturare le proteine

• Impossibilità di discriminare OGM

diversi che esprimono la stessa

proteina

• Non esiste perfetta correlazione fra

proteina espressa e % di materiale

OGM

•Bassi costi rispetto PCR

•Velocità del saggio

•Semplicità delle

operazioni (effettuabili anche

su campo TEST STRIP)

SVANTAGGI VANTAGGI

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mRNA

Proteina - enzima

metaboliti

mRNA

Proteina - enzima

metaboliti

WT

P E Gene T

Metodi basati sul DNA

mRNA

Proteina - enzima

metaboliti

mRNA

Proteina - enzima

metaboliti

mRNA

Proteina - enzima

metaboliti

P E Gene TOGM

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Metodi basate sul DNA

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Fasi analitiche di un metodo diagnostico basato sulla

PCR

Preparazione del campione

Estrazione del DNA

Valutazione quali-quantitativa del DNA

PCRPreparazione dei reattivi della PCR

Amplificato

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Preparazione CampionePreparazione Campione

“Laboratory Sample”Materie primeAlimenti processati

10.000 semi (CEN)

Estrazione DNAEstrazione DNA

“Test Portion”

2 pacchetti

2500 2500

Omogeneizzazione/Macinazione

Aliquota 1 Aliquota 2 Aliquota 3 Aliquota 4

Conservare a –20 C

1 merendina 1 merendina

Omogeneizzazione/Macinazione

Aliquota 1

200-300 mg 1-2 g

Omogeneità

Rappresentatività Aliquota 2 Aliquota 3 Aliquota 4

Conservare a –20 C

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Estrazione del DNA

Reagenti e materiali monouso

Provette tipo eppendorf da 2 e 1,5 mlRackReattivi per l’estrazione (prodotti per

biologia molecolare)Kit di purificazioneAcqua sterilePuntali sterili con filtroPipette automatiche dedicate

Strumentazione

Bagno termostatato

Vortex mixer

Centrifuga

(ambiente dedicato)

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La PCR Reazione a Catena della Polimerasi

DNA

Primers

dNTPs

PCR tampone + MgCl2

Taq DNA polymerase

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Steps in a PCR Cycle

Denaturation (90-95 º C)

Primer Annealing (40-70 º C)

Extension (72 º C)

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La PCR Reazione a Catena della Polimerasi

Curve di amplificazione

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Numero di

molecole di

DNA

Numero di cicli

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Metodi PCR per l’analisi di OGM

gene A gene BDNA della pianta DNA della pianta

PCR specificapianta

5

evento specifico

PCR discreening

2OGM

O non OGM

PCR specifica

della specie1

DNA

amplificabile

PCR specificadel gene

3gene

PCR specificaconstrutto

4costrutto

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Al DNA si aggiunge una soluzione

colorata contenente un addensante che ne

facilita il caricamento su un gel di agarosio.

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Analisi dell’amplificato

MWM 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c MWM

Zeina

(specifico

del mais)

Lectina

(specifico

della soia)

MWM = Marker Triplicati

1 = Mais 0% OGM 4 = Mais MON810 100% OGM

2 = Mais Bt-11 100% OGM 5 = Soia 0% OGM

3 = Mais Bt-176 100% OGM 6 = SoiaRR 100% GMO

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Analisi dell’amplificato

MWM 1 2 3 4 5 6 7 C MWM

437 bp (Bt-11)

194 bp (MON810)

120 bp (Bt-176)

MWM = Marker (Low Ladder 100 bp) C = No Template Control

1 = MON810 0.5% OGM 5 = MON810 + Bt-176 0.25% OGM

2 = Bt-176 0.5% OGM 6 = Bt-176 + Bt-11 0.25% OGM each

3 = Bt-11 0.5% OGM 7 = MON810 + Bt-11 + Bt-176 0.16% OGM each

4 = MON810 + Bt-11 0.25% OGM

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Labelling

requiredMore than 0.9%

Less than 0.9%No need for

labelling

Assay

individual

ingredients

Must be

Labelled ?

Yes/No

NegativePositive

GMO ?

Yes/No

Yes IllegalNo

Are they

Authorised ?

Yes/No

0.5% tolerance

0.9% threshold

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Metodi quantitativi per l’analisi di OGM

Analisi strumentale:REAL TIME PCR

Monitoraggio in TEMPO REALE dell’andamento della PCR

DNA

Raccomandazione EU 787/04 Percentuale di

DNA geneticamente modificato: percentuale

delle copie di DNA geneticamente modificato

rispetto alle copie di DNA specifico del taxon

bersaglio, calcolata in termini di genomi

aploidi

Proteine

Metodiimmunoenzimatici

ELISA

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Sonde di ibridizzazione

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SONDA ad IDROLISI TaqMan

5’

Reporter (FAM,VIC, TET)(Fluoresceina)

Quencher (TAMRA)(Rodamina)

Fam

Vic

Tet

Trasferimentodi energia

3’

Gruppo

Fosfato

Laser Excitation

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TaqMan™ Fluorogenic

Probe

Quencher (TAMRA)(Rodamina)

Reporter (FAM,VIC, TET)(Fluoresceina)

Gruppo

fosfato

3’5’

Fam

Vic

Tet

Distacco della sonda

Laser Excitation

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CHIMICA TaqMan

AnnealingDenaturazione

• Polimerizzazione•• PolimerizzazionePolimerizzazione

5’

5’

3’5’

3’

5’

forward

primer

RR

R = Reporter (FAM,VIC)

Q = Quencher (TAMRA)

QQQ

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Taqman PCR ChemistryTaqman PCR Chemistry

• Polymerization•• PolymerizationPolymerization

5’

5’

3’5’

3’

5’

forward

primer

RR

R = Reporter

Q = Quencher

Denaturation Annealing

QQQ

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Taqman PCR ChemistryTaqman PCR Chemistry

R = Reporter

Q = Quencher

5’

5’

3’5’

3’

5’

forward

primer

reverse

primer

QRR QQ

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Taqman PCR ChemistryTaqman PCR Chemistry

• Polymerization•• PolymerizationPolymerization

5’

5’

3’5’

3’

5’

forward

primer

RR

R = Reporter

Q = Quencher

Denaturation Annealing

QQQ

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5’

5’

3’5’

3’

5’

forward

primer

R = Reporter

Q = Quencher

. Taglio della sonda.. Taglio della sondaTaglio della sonda

RRQQQ

Emissione di fluorescenza

1

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

480 500 520 540 560 580 600 620 640 660

wave length (nm)

1st cycle

5th cycle

10th cycle

15th cycle

20th cycle

25th cycle

30th cycle

35th cycle

40th cycle

45th cycle

50th cycle

Campione

positivo

Controllo

negativo

Inte

ns

ità d

i

Flu

ore

sce

nza

EMISSIONE del

REPORTEREMISSIONE del

QUENCHER

Lunghezza d’onda

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REAL-TIME PCRPermette di seguire la cinetica della

PCR mentre è in atto: DURANTE LAFASE ESPONENZIALE

•viene rivelata da una CCD camera sotto il controllo del computer

FLUORESCENZA

•Campioni vengono irradiati da una sorgente luminosa

Fluorescenza

Cicli

Elimina manipolazioni successive all’amplificazione (minore possibilità di contaminazione tra campioni)

Elimina l’impiego di reagenti radioattivi o tossici(EtBr)

Riduzione dei tempi di esecuzione dell’analisi

VANTAGGI

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SISTEMA DI QUANTIFICAZIONE

Linea di base dellacurva

Non è ancora misurabile Rn

Linea soglia

Taglia la curva del campione in fase di crescita esponenziale

Ciclo soglia (Ct)

Ciclo in cui la curva di amplificazione del campione

in fase esponenziale taglia la linea soglia

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5%OGM

1%OGM

0.5% OGM

0.1%OGMLineathreschold

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Layout della piastra

S1 S1 S1 S2 S2 S2 S3 S3 S3 S4 S4 S4

A A A A

1:10

A

1:10

A

1:10

B B B B

1:10

B

1:10

B

1:10

C+ C+ C+ C- C- C- NTC NTC NTC

EN

DO

GE

NO

B

1:10

S4

NTCNTCNTCC1C1C1C+C+C+

B

1:10

B

1:10

BBBA

1:10

A

1:10

A

1:10

AAA

O

G

M

S4S4S3S3S3S2S2S2S1S1S1

C+ controllo positivo

C- controllo negativo

NTC Amplification reagent control

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ANALISI QUANTITATIVA OGM

QUANTIFICAZIONE RELATIVA

DNA SPECIE

VEGETALE (lectina, invertasi,

zeina, HMG)

DNA GM

(Soia RR, mais Bt 176-Bt 11 etc)

% OGM

DNA soia RR

X 100

DNA soia

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ANALISI QUANTITATIVA OGMCalcolata sull’

INGREDIENTE

Calcolata sull’

INGREDIENTEQuantificazione relativaQuantificazione relativa

DNA GM della Soia RR

(EPSPS)

DNA della SPECIE

VEGETALE SOIA (lectina)

%OGM =DNA specie

DNA GM

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CALCOLO DEL CONTENUTO IN OGM Curva di calibrazione costruita con

CRM (soia RR Fluka 0,1-0,5-1-2-5% RR)

1 Curva : mette in relazione la

differenza in cicli soglia tra target eriferimento in funzione del log %OGM

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1

Ct

Ct (OGM)-Ct(Lectina) = a log (% OGM) + b

log (% OGM)

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Metodo della “curva standard” copie genomiche

2 curve di calibrazione (transgene + gene di riferimento) basate sul

numero di copie genomiche

Copie genomiche soia RR

Copie genomiche soia

y = -3.4481x + 41.303

R2 = 0.9994

y = -3.3707x + 37.404

R2 = 0.9991

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

log (10) copie geno miche

Ct

x100

Raccomandazione EU 787/04

Percentuale di DNA geneticamente

modificato: percentuale delle copie di

DNA geneticamente modificato

rispetto alle copie di DNA specifico

del taxon bersaglio, calcolata in

termini di genomi aploidi

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•LOD valore al di sotto del quale il metodo non consente di determinare la presenza del parametro analizzato

•LOQ indica il limite al di sotto del quale il metodo non consente di determinare l’esatta concentrazione del parametro analizzato

%OGM0.01% (teorico)

0.1% (pratico)

%OGM0.001% (teorico)

0.01% (pratico)

1 copia

20 copie

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Principi di Base

Miniaturizzazione e automazione di saggi biologici

centinaia di migliaia di geni usati come sonde su una superficie di 2-3 cm

Le sonde vengono attaccate su un supporto solido

Con l’aiuto della “Robotica”

L’informatica è una componente centrale in tutti gli“step”

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Diagnosis : presence

of sequences specific

to the GMO

Food sample

Extraction of

DNA

Selective

amplification

(marker sequences)

and labelling

Activated glass

surface with fixed

specific capture

probes

Hybridisation of PCR

products

Tecniche Innovative

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Latest GMOchips design

Bt11

+ hy Ctl 3µM

Bt176 GA21 Mon810

T25,T45,Topas RRS Starlink a Starlink d

P35S test

Pat gene

Tnos test

nptII test CaMV test (a) CaMV test (b)

Mais Soybean Rapeseed

Tomato Sugar beet

+ hy Ctl 1.5µM + hy Ctl 750nM + hy Ctl 375nM

+ hy Ctl 187.5nM + hy Ctl 93.75nM + hy Ctl 46.875nM + hy Ctl 23.44nM

+ hy Ctl 11.72nM + hy Ctl 5.86nM - hy Ctl - hy Ctl

OXY235-1 OXY235-2

OXY235-3

EF Bt11 EF Bt176 EF GA21

EF T25 EF RRS EF Starlink

EF Mon810

Starlink e Starlink f

Fix Ctl 5nM

Fix Ctl 80nM

buffer

Fix Ctl 20nM

Fix Ctl 2.5nM

Fix Ctl 40nM

Fix Ctl 10nM

Fix Ctl 160nM

buffer

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GMOchips

T25 Mais

Pos Hyb CTL

Neg Hyb CTL

Specific capture probes for

Bt11

Pos Fix CTL

Specific capture probes for

T25

Specific capture probes for

Mon810

Specific capture probes for

Bt176

Specific capture probes for GA21

Specific capture probe for

RRS

Capture probe for Pat

gene

Capture probe for P35S