UNIVERSITATEA OVIDIUS CONSTANTA FACULTATEA DE FARMACIE DISCIPLINA: CHIMIE FIZICA

INDRUMATORI: STUDENT: Prof. Univ. Dr. Ch. Farm. RODICA SRBU mirela

Gosu

1

Prep. Drd. IULIANA PSEGALINSCHI Grupa 2 Metode spectrale de analiza a medicamentelor

An II,

In caracterizarea, controlul si cercetarea medicamentelor sunt folosite metodele spectrale. Cele mai larg utilizate sunt metodele in UV-VIS, in IR, florimetria, spectroscopia atomica de absorbtie, spectroscopia de masa, spectroscopia de rezonanta magnetica nucleara sau analiza fluorescentei cu raze X. In determinarea stabilitatii medicamentelor este necesara cuplarea acestor metode cu alte metode de analiza, in scopul cresterii gradului lor de selectivitate. Dintre metodele optice, spectrofotometria permite un studiu analitic al reactiilor in solutie. pentru substantele medicamentoase. fiind utilizata atat pentru identificarea si determinarea structurilor, cat si pentru studii fundamentale ale echilibrelor in solutie. Metodele spectrofotometrice se bazeaza pe procese de absorbtie a radiatiilor luminoase de catre moleculele substantelor.Existenta unui spectru de absorbtie complex, caracteristic, constituie un mijloc pentru identificarea substantelor (in acest scop este exploatat in special domeniul infrarosu al spectrului). Pentru determinari cantitative se procedeaza la masurarea absorbantei radiatiilor luminoase de catre substante, utilizand mai ales radiatii ce apartin domeniului vizibil si ultraviolet al spectrului. Legea de baza a spectrofotometriei prezinta relatia dintre absorbtia unei radiatii a carei lungime de unda corespunde unei absorbtii maxime a substantei respective si produsul dintre grosimea traiectului absorbant si concentratie. A fost formulata de catre Bouguer-Lambert-Beer: T=It/I0=10-/C ; A=-logT=lC in care: T= transmitanta It= intensitatea radiatiei transmise I0= intensitatea radiatiei incidente A= absorbanta = coeficient molar de absorbanta(absorbtivitatea molara),mol-1cm2 l= grosimea stratului absorbant, in cm C= concentratia, in moll-1 Masurarea absorbantei cu un aparat, denumit spectrofotometru, constituie un mijloc pentru determinarea concentratiilor substantelor absorbante.

2

Metode de analiza spectrala in UV si VIS aplicate la medicamenteDomeniul spectral UV-VIS este format din trei zone spectrale si anume: Ultravioletul apropiat cuprins intre 185 si 400 nm; Vizibilul cuprins intre 400 si 700 nm; Infrarosu foarte apropiat cuprins intre 700 si 1100 nm. Determinarile spectrometrice din acest domeniu se bazeaza pe fenomenul de absorbtie a radiatiilor cuprinse in acest domeniu spectral, de catre speciile chimice analizate. Absorbtia specifica a cromoforilor din structura moleculei de determinat (fie produs activ, fie produs de degradare). poate sta la baza determinarii ei calitative sau cantitative. Un impediment serios in analizele spectrale ale medicamentelor il constituie prezenta unui numar mare de substante auxiliare, solventi, produsi de degradare, care face uneori chiar imposibila analiza, datorita aditivitatii absorbantilor la lungimea de unda data. Acest fapt impune separarea prealabila a componentilor. De multe ori pentru imbunatatirea selectivitatii si specificitatii metodei se realizeaza transformarea chimica prealabila a functiei intr-un derivat colorat care poate fi determinat in regiunea vizibila a spectrului sau prin cresterea conjugarii care permite masuratori in regiunea UV sau VIS. Se cunosc multe exemple si in continuare vom evidentia pe cele mai studiate: Determinarea stabilitatii acidului acetil salicilic in amestec cu polietileniglicoli, urmarindu-se in principal prin analize simultane in UV, formarea compusului de transesterificare in urma interactiei cu solventul; In cazul ampicilinei s-au realizat determinari cantitative pe baza formarii unui compus cu Ni(II) in dimetilsulfoxid, puternic absorbant in UV; Amestecurile de tetraciclina si 4-epitetraciclina s-au evidentiat pe baza diferentelor din curbele lor de dicroism circular si a pozitiei maximelor din regiunea UV; Prin metode spectrale s-au putut pune in evidenta alterarea rapida a solutiilor cu cortizon si prednison expuse la lumina (cand se produce substituirea gruparii CO-CH2-OH cu o grupare carboxil) cand dicroismul pozitiv al functiei cetonice din pozitia 20 a disparut. In concluzie, schimbarile importante pe care le sufera spectrul dicroic al unei molecule prin introducerea unui cromofor, eliminarea lui sau modificarea vecinatatii lui constituie baza controlului operativ al stabilitatii medicamentelor.

Spectrofotometria diferentiala are marele avantaj al citirii directe aabsobtiei substantei active fara a lua in considerare absorbtia produsilor de degradare sau a altor substante auxiliare care insotesc produsul pur. Metoda se aplica la toate substantele care pot suferi modificari spectrale reproductibile sub actiunea pH-ului sau a unor reactivi cum ar fi substante cu caracter acido-bazic sau oxido-reducator. De exemplu, se poate reliefa analiza spectrala a derivatilor fenotiazinici (prometazina, clorprometazina, trifluoperazina), care in timpul conservarii s epot degrada trecand in derivati de oxidare (sulfoxizi sau sulfone). Se foloseste spectrul diferenta al unei probe oxidate data de o proba de referinta, neoxidata, in aceeasi concentratie. In figura2 absorbtia observata in spectru la 337nm este proportionala cu concentratia in derivat fenotiazinic neoxidat si nu este afectat de prezenta excipientilor sau a produsilor de degradare, sau a altor substante active

3

asociate, cu conditia ca aceste componente sa nu sufere modificari spectrale sub actiunea reactivului de oxidare (acidul peroxoacetic).

Metodele spectrale in vizibil se bazeaza pe absorbtii in domeniul 350700nm. Metoda poate fi extinsa la un numar foarte mare de substante necolorate dar care prin complexare chimica dau coloratii stabile. Metoda se foloseste cu succes in stabilirea gradului de stabilitate a unui component studiat daca produsii de degradare sau celelalte componente nu dau coloratii caracterizate prin aceeasi parametri spectrofotometrici. Astfel, se pot evidentia urmatoarele exemple: Derivatii acidului carboxilic (anhidride, halogenuri, lactame si lactone, amide si esteri) pot fi transformati in acidul hiroxamic corespunzator, prin reactie cu hiroxilamina in mediu alcalin in prezenta de FeCl3 in solutie slab acida formeaza o coloratie rosie-violet de hidroxamat de fier (III). Aceasta reactie sta la baza determinarii amidelor in prezenta de compusi aminici si acizi, rezultati in urma degradarii lor hidroxilice. Asa s-a aplicat aceasta metoda la indicarea stabilitatii N-acetilsulfanilamidei si N-acetilsulfiloxazolului in prezenta produsilor lor de hidroliza sau a nucleului -lactamic din structura cefalosporinelor; Determinarea calorimetrica a hematropinei metilbromurata in prezenta produsului sau major de descompunere, metil bromura de tropina s-a bazat pe reactia dintre hematropina metil bromurata si reactivul Dragendorff. Pe baza reactiei cu fenilhidrazina a fost posibila determinarea acidului ascorbic si al acidului 2,3-dioxo-1-gluconic in mediu acid. In continuare sun prezentate cateva exemple de spectre in UV-VIS ale unor compusi farmaceutici cum ar fi amestecul de tetraciclina si epitetraciclina in acid sulfuric 0,1N (fig.7.2), spectrul UV al clozapinei in metanol ( fig.7.3), spectrul UV al fenoxicamului in etanol (fig.7.4) si spectrul UV al tiamfenicolului in apa (fig.7.5).

4

5

Spectre de absorbtie in ultraviolet si vizibilSpectrele de absorbtie in ultraviolet si vizibil se obtin grafic prin reprezentarea absorbantei sau a transmitantei in functie de lungimea de unda. Aplicabilitatea legii se limiteaza doar pentru concentratii mici si fara influente ale solventului asupra absorbantei luminii; cu aceste conditii legea se aplica la interpretarea structurii unei substante dizolvate, care formeaza o unitate cu moleculele solventului. In cazul concentratiilor mari, sub influenta electrolitilor straini au loc deformatii in straturile elctronice periferice ale ionilor, ceea ce atrage dupa sine o apropiere sau indepartare a moleculelor, respectiv a ionilor, care produc un spectru schimbat. Astfel, pentru toate sarurile care au un ion comun colorat, se va obtine acelasi spectru atat pentru cazul cand sarea este complet disociata intr-o solutie apoasa, cat si pentru cazul cand ionul este in stare hidratata. Daca prima sfera electronica a unui astfel de ion este ocupata cu alte molecule sau cu alti ioni in afara celor ai apei, spectrul nu va mai fi acelasi, apare un spectru cu aspecte deosebite. In cazul moleculelor organice, este foarte greu de observat coeziunea dintre moleculele substantei si cele ale solventului, adesea chiar diferitele grupari ale aceleasi molecule care se influenteaza foarte putin. De aici rezulta usurinta cu care se recunosc spectrele unor radicali, cum ar fi cel al grupei carbonil, fenil, nitro, acestia raspunzand doar anumitor energii electronice, vibratie si rotatie care sa afecteze intreaga molecula. Nu este exclusa totusi si eventuala influenta reciproca a unor grupari, tinand seama in alte cazuri de pozitia pe care o au in cadrul edificiului total al moleculei. Producerea spectrelor sub actiunea luminii vizibile sau ultraviolete sunt redate printr-o curba cu unul sau mai multe maxime, varful delimitat de extremele ce-l foreaza 6

numindu-se si banda de absorbtie. Banda de absorbtie se caracterizeaza prin pozitia maximului de absorbtie si intensitatea pe care o are in conditiile de lucru alese. Pozitia corespunde lungimii de unda a radiatiei a carei energie a produs tranzitia electronica, iar intensitatea ne arata probabilitatea interactiunii radiatie-sistem electronic si polaritatea starii excitate. Producerea tranzitiilor este legata de prezenta unor anumite grupe covalente de atomi nesaturati, numite grupe cromofore. Prin atasarea la un cromofor a unei grupe saturate de atomi(-NH21-OH fenolic, -COOH, -SO3H) se formeaza un auxocrom ce modifica lungimea de unda la care are loc absorbtia ( max) si intensitatea acesteia. La actiunea unei energii mici de excitatie, se obtine o deplasare a maximului de absorbtie spre lungimi de unda mai mari (rosu), ceea ce se numeste efect batocrom. Pentru energii mari de excitatie, maximul de absorbtie se deplaseaza spre lungimi de unda mai mici (violet) si se produce efectul hipsocrom. O marire a intensitatii produce efectul hipocrom, iar o micsorare a acestuia conduce la efectul hipocromic. Deplasarile batocrome, respectiv cele hipsocrome mai depind si de substituentii atasati cromoforilor, de posibilitatile de conjugare ale acestora, de polaritatea solventilor, etc.

7

Spectre electronice ( spectre in vizibil si ultraviolet)Energiile implicate in tranzitiile electronice sunt cu aproximativ un ordin de marime mai mare decat cele implicate in tranzitiile de vibratie. Din motive practice, domeniul spectral al tranzitiilor electronice se imparte in trei regiuni. Regiunea Vizibil Ultraviolet apropiat Ultraviolet indepartat Domeniul spectral al tranzitiilor electronice: () h (kcal*mol -1) 8000-4000 36-71 4000-1800 71-160 1800-1000 160-286

Absorbtia luminii in regiunea vizibila si ultravioleta a spectrului este datorata unei tranzitii intre nivelurile electronice diferite ale moleculei. Energiile necesare pentru excitarea electronica a moleculelor variaza intre 30-300 kcal*mol-1 si sunt deci mult mai mari decat cele ce determina excitarea nivelurilor de vibratie si de rotatie. Spectrele electronice cuprind lungimile de unda 8000-1000 . Ochiul omenesc percepe numai o parte din vibratiile electromagnetice determinate de tranzitiile electronice si anume pe acelea cu lungimile de unda cele mai mari (sau frecventele cele mai mici). Multe substante prezinta absorbtii caracteristice in IR, in timp ce in UV apropiat sunt transparente. Aceste spectre se datoresc tranzitiilor electronice ce apar la absorbtia unei cuante din domeniul vizibil si ultraviolet. Orbitalii legaturii simple pot fi de legatura ocupati cu electroni in stare fundamentala si orbitali de antilegatura * care sunt neocupati in stare fundamentaladar se pot ocupa in stare excitata. In mod analog se pot ocupa si orbitalii de legatura si de antilegatura *. In afara de aceste tipuri de orbitali exista si orbitali de nelegatura ,,n, localizati la un singur atom. Din figura constatam ca tranzitiile * necesita cea mai mare energie. Aceste tranzitii apar in regiuni de lungimi de unda mici (se manifesta spectral numai in ultravioletul indepartat). Tranzitiile n* si n* sunt caracteristice compusilor ce contin atomi cu electroni neparticipanti . In cazul moleculelor cu legaturi duble sunt caracteristice tranzitiile *.

8

Aceste tranzitii dau nastere la benzile de absorbtie ce prezinta anumite caracteristici (lungimea de unda la care are loc absorbtia maxima si coeficientul molar de extinctie). In functie de aceste caracteristici benzile de absorbtie au fost grupate in: Benzi R ce se datoresc unor tranzitii n* ale grupelor nesaturate simple. Aceste benzi au exticntii mici. Benzi K ce apar la moleculele nesaturate conjugate si se datoresc unor tranzitii *. Aceste benzi au extinctii mari. Benzi B ce apar la molecule aromatice si heterociclice. Aceste benzi au extinctii mici si apar la lungimi de unda mici si medii. Benzi E ce se datoresc tranzitiilor electronice in sistemul de trei legaturi etilenice incluse intr-un nucleu aromatic. Aceste benzi au extinctii mari si apar la lungimi de unda mici.

In interpretarea spectrelor electronice se utilizeaza termeni specifici, cum ar fi: cromofor = grupare de atomi capabila sa absoarba in UV; auxocrom = grupare de atomi capabila sa modifice lungimea de unda la care absoarbe cromoforul; efect batocrom = deplasarea absorbtiei spre lungimi de unda mai mari; efect hipsocrom = deplasarea absorbtiei spre lungimi de unda mai mici; efect hipocrom = scaderea intensitatii absorbtiei; efect hipercrom = cresterea intensitatii absorbtiei.

Aplicatii in domeniul medicamentului vizeaza atat aspectele teoretice cat si cele practice, metoda spectrometriei in UV-VIS este oficializata ca si cea din IR in diferitele 9

farmacopei care o impun la precizarea puritatii, a concentratiei si a urmarii stabilitatii multora dintre produsele sau preparatele farmaceutice de uz terapeutic. In tabelul ce urmeaza sunt indicate cateva dintre medicamentele frecvent identificate sau dozate prin spectrofotometria UV-VIS. Benzile caracteristice ale unor produsi medicamentosi: Denumirea max (nm) lg* Solvent compusului Acid acetilsalicilic 297.5 214 Etanol Aminofenazona 269 Metanol Ampicilina 268 5.50 Tampon pH 7 Benzilpenicilina (K) 263 Apa Codeina fosforica 285 37.5 Metanol Cofeina 273 Cloroform Chinina 250 Clorchina 255 HCl 0.1N Cloramfenicol drajeuri 278 298 Apa Furazolidona 367 746 Apa Fenilbutazona 264 630 NaOH 0.1N Fenacetina 250 840 Alcool Meticilina sodica 280 57.5 Apa Morfina 285 42 HCl 0.1N Reserpina comprimate 268 275 Alcool/Cloroform Tocoferol comprimate 285 44 Alcool absolut Tocoferol (sol.inject.) 298 71.5 Tetraciclina 269 400 HCl 0.01N

Spectrofotometrul

10

Spectrofotometrul de absorbtie in ultraviolet si vizibil se compune din urmatoarele parti principale: sursa de radiatii, monocromatorul, suportul pentru cave, detectorul, amplificatorul si inregistratorul. Sursa de radiatii este constituita, de obicei, dintr-un bec cu filament de wolfram, pentru domeniul vizibil, si dintr-o lampa de hidrogen sau deuteriu, pentru domeniul ultraviolet. Monocromatorul si cuvele sunt confectionate din sticla, pentru domeniul vizibil, si din cuart pentru domeniul ultraviolet. Pentru determinarile spectrofotometrice se folosesc doua cuve identice: o cuva in care se introduce solutia substantei de analizat (solutia proba) si o cuva in care se introduce lichidul de compensare constituit din solventul sau amestecul de solventi si reactici folositi la prepararea solutiei-proba. Concentratiile solutiilor se aleg astfel incat valorile absorbantelor sa fie cuprinse intre 0,30 si 0,70 cand se obtine o precizie satisfacatoare a determinarilor. Abaterea admisa fata de lungimea de unda prevazuta in monografia respectiva este de 2nm. Determinarile se efectueaza in cuve de 1cm si la temperatura de 200.5C, daca nu se prevede altfel. In monografiile respective se prevede concentratia solutiilor, natura solventului si, atunci cand este necesar, conditiile de pH in care se efectueaza deteminarile. Daca in monografia respectiva nu se prevede lichidul de compensare, determinarea se efectueaza folosind ca lichid de compensare solventul de la prepararea solutiei-proba. In monografia respectiva este prevazut lichidul de compensare cand la prepararea solutiei-proba se foloseste un amestec de solventi si reactivi.

11

Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina A din capsule gelatinoase

S-a dezvoltat o metod de dozare a vitaminei A n cloroform prin absorbie n UV la 330 nm, care este specific (excipentul nu interfer spectral cu analitul), este liniar n domeniul 1,8 72,3 g/mL (R=0,99991, p