Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Polymorphismus ... · Abstract Hummel Thomas...

Aus derNeurologischen Klinik des St. Josef-Hospital

- Universitätsklinik -der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. H. Przuntek____________________________________________

Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Polymorphismus,Hyperhomocysteinämie und Morbus Parkinson

Inaugural-Dissertationzur

Erlangung des Doktorgrades der Medizineiner

Hohen Medizinischen Fakultätder Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt vonThomas Hummel

aus Berlin2001

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. Dr. W. Kuhn

Koreferent: Prof. Dr. med. Malin

Tag der mündlichen Prüfung: Dienstag, 17.07.2001

Für meine Eltern

Abstract

Hummel

Thomas

Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Polymorphismus, Homocystein und MorbusParkinson

Homocystein ist eine schwefelhaltige, aliphatische Aminosäure, welche Ausgangsstoff

der Remethylierung des Methionin ist und auf verschiedene andere Stoffwechselwege

Einfluß nimmt. Homocystein kann auf verschiedene Arten pathogen auf den

menschlichen Organismus wirken. Es induziert oxidativen Streß durch seine zweifache

Wirkung am NMDA-Rezeptor (exzessiver Kalzium-Ionen-Einstrom und reaktive

Oxygenierung) und durch eine Erhöhung des Homocystein Thiolacton-Spiegels,

wodurch es zu einer vermehrten Bildung freier Radikale kommt. Des weiteren wirkt

Homocystein prothrombogen und induziert Arteriosklerose mit daraus resultierendem

erhöhten Schlaganfall- und Herzinfarktrisiko als anerkannter, unabhängiger

Arterioskleroserisikofaktor.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde bei 79 Parkinsonpatienten im Vergleich zu

Kontrollen eine signifikante Erhöhung der Homocysteinkonzentration gefunden. Hierbei

zeigte sich eine signifikante Abhängigkeit der Homocysteinkonzentration vom

heterozygoten und homozygoten MTHFR C677T Genotyp.

Homocystein könnte somit ein wichtiger ätiologischer oder prognostischer Faktor des

Morbus Parkinson sein. Eine Hyperhomocysteinämie kann neben anderen Auslösern

auch durch eine L-Dopa-Therapie bedingt sein. Die MTHFR C677T Punktmutation mit

ihrem heterozygoten und homozygoten Genotyp ist mit einer Prävalenz von ca. 50% in

der Bevölkerung weit verbreitet als ein möglicher Auslöser einer

Hyperhomocysteinämie und der damit verbundenen Risiken.

Falls die Ergebnisse dieser Arbeit in weiteren Studien bestätigt werden können, müßte

vor der Einleitung einer L-Dopa-Therapie eine Bestimmung der Homocysteinkonzen-

tration im Serum erfolgen und im Falle einer Erhöhung eine Genotypisierung der

MTHFR durchgeführt werden. Bei einem heterozygoten oder homozygoten Genotyp

müßte eine kontinuierliche Kontrolle der Homocysteinkonzentration im Serum der

Parkinsonpatienten erfolgen, und im Falle einer Erhöhung eine Homocystein-senkende

Therapie durchgeführt werden, um schwerwiegende Komplikationen zu vermeiden.

Inhalt

1. Einleitung 1

1.1. Morbus Parkinson 1

1.1.1. Allgemeines 1

1.1.2. Pathologisch-anatomische Grundlagen 1

1.1.3. Klinik und Diagnosestellung 2

1.1.4. Ätiologie 3

1.1.5. Therapie 4

1.2. Homocystein 6

1.3. Hyperhomocysteinämie 11

1.4. 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase 12

1.5. Fragestellung 13

1.5.1. Hyperhomocysteinämie und Morbus Parkinson 13

2. Material und Methoden 16

2.1. Materialien 16

2.1.1. Geräte 16

2.1.2. Verbrauchsmaterialien 16

2.2. Patienten 16

2.2.1. Ausschlußkriterien 16

2.2.2. Einschlußkriterien 17

2.2.3. Patientendaten 17

2.3. Verlaufsprotokoll 17

2.3.1. Motorikerfassung 17

2.4. Verarbeitung der Proben 18

2.4.1. Vitamin B12 und Folsäure 18

2.4.2. Vitamin B6 19

2.4.3. Homocystein 20

2.4.4. Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase 20

2.4.5. Cholesterin und Triglyceride 23

2.5. Statistische Auswertungskriterien 23

2.6. Ethische Kriterien 23

3. Ergebnisse 24

3.1. Charakterisierung der untersuchten Probanden 24

3.1.1. Patienten 24

3.1.2. Kontrollgruppe 26

3.1.3. Zusatzuntersuchungen der Patienten 27

3.2. Statistik und Auswertung 29

3.2.1. Vergleich der Homocysteinkonzentration der 29

Parkinsonpatienten und Kontrollen

3.2.2. Kontrollgruppe im Vergleich zu Patienten mit 31

Unterschiedlicher Genetik

3.2.3. Vergleich der Patienten mit unterschiedlicher 33

Genetik

4. Diskussion 35

4.1. Schlußfolgerung 38

5. Literaturverzeichnis 43

6. Danksagung 63

7. Lebenslauf 64

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: L-Dopa-Metabolismus 7

Abb. 2: Homocystein-Metabolismus 9

Abb. 3: Folat-Stoffwechsel 10

Abb. 4: Normaler, heterozygoter, homozygoter Genotyp 22

Abb. 5: Homocysteinkonzentration der Patienten mit heterozygoter (I), 32

homozygoter (II), normaler (III) Genetik und Kontrollgruppe

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Die Klassifizierung nach Hoehn und Yahr 18

Tab. 2: Patientenkollektiv 25

Tab. 3: Kontrollgruppe 26

Tab. 4: Zusatzparameter des Patientenkollektivs 28

Tab. 5: Varianzanalyse bezüglich der Homocysteinkonz. der 30

Parkinsonpatienten und der Kontrollen

Tab. 6: Post hoc Test: 1 = Parkinsonpatienten; 2 = Kontrollen 30

Tab. 7: Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, 30

Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure) der Patienten

und Kontrollen

Tab. 8: Mittelwerte des Homocysteins und der Covarianten 31

(0=Kontrollen; 1=heterozygot; 2=homozygot; 3=normal)

Tab. 9: Standardabweichung des Homocysteins und der Covarianten 31

(0=Kontrollen; 1=heterozygot; 2=homozygot; 3=normal)

Tab. 10: Post hoc Test: {1}=Kontrollen; {2}=heterozygot; 32

{3}=homozygot; {4}=normal

Tab. 11: Varianzanalyse: Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, 32

Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure) der Kontrollen und Patienten

mit heterozygotem, homozygotem, normalem Genotyp

Tab. 12: ANOVA: Mittelwerte mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 33

3=normalem Genotyp der Parkinsonpatienten

Tab. 13: Standardabweichungen mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 33

3=normalem Genotyp der Parkinsonpatienten

Tab. 14: Post hoc Test der Mittelwerte der Homocysteinkonzentrationen 34

(1=heterozygoter, 2=homozygoter, 3=normaler Genotyp der

Parkinsonpatienten)

Tab. 15: Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, 34

Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure, Cholesterin, Triglyceride,

L-Dopa-Dosis, Dauer der Erkrankung, Krankheitsausprägung

(Hoehn-Yahr-Skala)) innerhalb der verschiedenen

Mutationsformen

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AMP Adenosin-5´-Monophosphat

ANOVA Analysis of Variance

ATP Adenosin-Triphosphat

CH3 Methylgruppe

CMP Cytidin-Monophosphat

CO2 Kohlendioxid

COMT Catechol-O-Methyl-Transferase

Cu++ Kupfer

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

Et al. et alii (und andere)

FADH2 Reduzierte Form des Flavin-Adenin-Dinucleotid

g Gramm

GMP Guanosin-Monophophat

GTP Guanosin-Triphosphat

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

HCHO Formaldehyd

Het. Heterozygot

Hinfl Restriktionsendonuklease

Hom. Homozygot

HPLC High Performance Liquid Chromatographie

ITP Inosin-Triphosphat

K+ Kalium

Kontr. Kontrolle

l Liter

LDL Low Density Lipoprotein

L-Dopa L-Dihydroxy-Phenylalanin

m männlich oder milli (10-3)

M Molar

MAO-B Monoaminooxidase B

Mg++ Magnesium

MPP+ 1-Methyl-4-Phenylpyridinium

MPTP 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin

MTHFR Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase

MTHFR C677T Punktmutation am Nukleotid 677 der MTHFR,

an der Cytosin gegen Thymin substituiert wird

µ Mikro (10-6)

NAD+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid

NADH+H+ Reduzierte Form des NAD+

NADP+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat

NADPH+H+ Reduzierte Form des NADP+

Neg. negativ

NH3 Ammoniak

Norm. Normal

O2 Sauerstoff

Pat. Patient

PCR Polymerase Chain Reaction

Pi Phosphat

Pos. Positiv

PPi zwei Phosphate

SAH S-Adenosyl-Homocystein

SAM S-Adenosyl-Methionin

SBD-F Thio-spezifisches Reagenz

Tab. Tabelle

UMP Uridin-Monophosphat

w weiblich

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Morbus Parkinson

1.1.1. Allgemeines

James Parkinson beschrieb erstmalig ein hypokinetisch-hypertones Krankheitsbild in

seiner Abhandlung „An essay on the shaking palsy“ (Parkinson 1817), welches später

als Morbus Parkinson in der Neurologie ihren Eingang fand. M. Hall beschrieb dieses

Phänomen 1841 als „Paralysis Agitans“. Im Volksmund nennt sich die Krankheit

„Schüttellähmung“.

Der Morbus Parkinson gehört zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen

(Kessler 1978) deren Prävalenzrate von 0,1-0,2% im Alter stark zu nimmt (über 55-

jährig: 1,4%) (De Rijk et al. 1995). 80% der Fälle sind Patienten, die älter als 65 Jahre

sind (Kurtzke et Kurland 1977). Bisher wurden keine signifikanten

geschlechtsspezifischen Unterschiede der Prävalenzrate gefunden (Sutcliff et al. 1985).

Die Inzidenzrate liegt bei der schwarzen Weltbevölkerung signifikant niedriger als bei

der weißen Bevölkerung (Zhang et Román 1993). Insgesamt wird die Zahl der

Parkinson-Kranken in Deutschland auf etwa 150.000 - 200.000 geschätzt (Schneider

1991).

1.1.2. Pathologisch-anatomische Grundlage

Der Morbus Parkinson ist eine Erkrankung, die neuropathologisch durch eine

Degeneration dopaminerger Neurone in den vorwiegend ventro-lateralen Anteilen der

Substantia nigra pars compacta und des Locus coeruleus gekennzeichnet ist (Gibb et

Lees, Tertiakoff 1919). Diese nigrale Degeneration geht in 80% der Fälle mit der

Bildung sogenannter Lewy-Körper einher. Sie stellen intraneuronale eosinophile

Einschlußkörper dar, welche aus Neurofilamenthaufen und dem Streßprotein Ubiquitin

bestehen (Riede et Schäfer 1993). Man nimmt an, daß diese Einschlußkörper den

neurogenen „Streß“ widerspiegeln (Langston 1996). Diese lassen sich aber auch bei

anderen degenerativen Erkrankungen nachweisen (Rossor 1996). Lewy-Körper fanden

Einleitung

2

sich bei Parkinson-Patienten auch in extranigralen Strukturen des limbischen Systems

(tiefe Schichten der entorhinalen Region, Hippocampusformation, Amygdala), in diffus

zur Hirnrinde projizierenden Kerngebieten und in Zentren zur Regulation autonomer

Funktionen (Braak et al. 1996). Erst bei einem nigralen Zellverlust von 60-70% wird die

Erkrankung klinisch manifest (Schneider 1997). Biochemisch ist der Morbus Parkinson

durch einen verminderten Dopamin-Gehalt des Corpus Striatum gekennzeichnet, der

durch eine herabgesetzte Bildung in der Substantia nigra und durch eine erhöhte

Aktivität der Monoaminooxidase-B im nigrostriatalen System resultiert (Poewe et

Oertel 1992; Riederer 1995). Die klinischen Kardinalsymptome Rigor, Tremor,

Bradykinese resultieren aus diesem Dopamin-Mangel im nigrostriatalen System und aus

anderen abhängigen Transmittersystemen in nicht nigralen Strukturen (Poewe et al.

1996; Deutschl 1996).

1.1.3. Klinik und Diagnosestellung

Die Klinik des idiopathischen Morbus Parkinson ist in drei Subtypen unterteilt. Es

werden der Tremor-Dominanztyp, der Rigor-Akinese-Dominanztyp und der

Äquivalenztyp unterschieden (Poewe et al. 1983). Wenn systemübergreifende

Beschwerden wie Hirnatrophie, zerebelläre Ataxie oder Blickparesen hinzukommen

wird dies als „Parkinson-Plus“ bezeichnet (Schneider 1997). Motorische Symptome des

Morbus Parkinson sind Akinese/Bradykinese (Amimie, Mikrographie, Einschränkung

der Feinmotorik), Rigor mit Zahnradphänomen und Tremor (niederfrequenter

Ruhetremor von 3-5/s unterschiedlicher Amplitude bei 90% der Patienten im Laufe der

Erkrankung) (Dengler 1995; Przuntek 1992; Fischer 1995; Schneider 1997; Deutschl

1996). Vegetative Symptome sind vermehrter Speichelfluß und Talgproduktion

(Salbengesicht), Obstipation (Jurow 1998; Jost et Schimrigk 1992), Harnverhalt,

Impotenz und Blutdruckregulationsstörungen mit Hypotonie (Jörg 1993; Jost 1995).

Psychische Symptome bestehen nicht selten aus einer depressiven Stimmungslage (10%

schwerwiegend, 45% leichtgradig), die häufig (ca. 20%) mit einem kognitiven Defizit

assoziiert ist (Bader et Hell 1998; Ebert et Lammers 1997; Lang 1994). Desweiteren

können psychotische Episoden nach jahrelangem Therapieverlauf auftreten (Fassauer

1998). Angststörungen zeigen etwa 40% aller Parkinson-Patienten (Poewe et al. 1996).

Einleitung

3

Gerade die beschriebene Symptomatik der Parkinson-Erkrankung ist von entscheidender

Bedeutung bei der Diagnosestellung, da diese bis heute klinisch zu stellen ist. Es

existieren keine spezifischen genetischen, biochemischen oder breit anwendbare

neuroradiologische Parameter (Brooks 1997). Krankheitsverlauf, das Ansprechen auf L-

Dopa und das Fehlen von unvereinbaren Befunden sind ebenfalls von Bedeutung zur

Diagnosestellung (Oertel et al. 1996; Poewe et al. 1996). Die nicht seltenen

Fehldiagnosen zeigen bei der Vielzahl der Differentialdiagnosen wie schwierig die

Diagnosestellung mitunter für den Kliniker sein kann (Quinn 1995).

1.1.4. Ätiologie

Die Ursache der Parkinson-Erkrankung ist heute immer noch nicht abschließend geklärt.

Genetische Faktoren scheinen, wie epidemiologische Studien zu Erkrankungsfällen

unter Familienangehörigen zeigen, eine pathogenetische Rolle zu spielen (Payami et al.

1994; Vieregge et Heberlein 1995). Das Erkrankungsrisiko für Angehörige gegenüber

der Normalbevölkerung ist erhöht (Bonifati et al. 1995; Vieregge et Heberlein 1995). In

einigen Familienuntersuchungen zeigte sich ein autosomal dominanter Erbgang (Waters

et Miller 1994; Wszolek et al. 1994), wohingegen einige Zwillingsuntersuchungen

gegen eine genetische Ätiologie sprechen (Duvoisin et al. 1981; Marsden 1987). Es

zeigte sich jedoch in einer weiteren Studie, daß bei einigen der zur Zeit

asymptomatischen Zwillingsgeschwister mit Hilfe der Positronen-Emissions-

Tomographie (PET)-Technik nigrostriäre Veränderungen nachzuweisen waren (Burn et

al. 1992; Holthoff et Vieregge 1994). Ob eine multifaktorielle Genese der Erkrankung

anzunehmen ist, wird zur Zeit diskutiert (Langston 1996), wobei Mutationen

verschiedener Gene als Risikofaktoren angesehen werden. Diese sind: Cytochrom P450

2D6 (Armstrong et Daly 1992; Smith et al. 1992; Langston 1996), Glutathion S-

transferase M1 (Langston 1996), Polymorphismus in den Genkodierungen der

Monoaminooxidase B (Kurth et al. 1993) und der Monoaminooxidase A (Hotamisligil

et al. 1994). Bei dem Abbau von Dopamin entstehen aus dem Zwischenprodukt

Wasserstoffperoxid chemisch reaktive Hydroxylradikale. Bei dieser Reaktion wird,

unter Beteiligung von Melanin, zweiwertiges in dreiwertiges Eisen umgewandelt. Die

Dopamin-Zelle ist also einem hohen „oxidativen Streß“ ausgesetzt, welcher zur

Einleitung

4

Degeneration der Zelle führen könnte (Lange et al. 1992). In Post-Mortem-

Untersuchungen wurden bei Parkinson-Patienten freie Sauerstoffradikale und eine

reduzierte Aktivität der Glutathion-Peroxidase, die protektiv wirkt, in den Basalganglien

gefunden (Poewe 1994). Ursache könnte ein Komplex-I-Defekt der mitochondrialen

Atmungskette sein (Reichmann et al. 1993). Die Theorie des „oxidativen Stresses“

unterstrich die Entdeckung der Substanz 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin

(MPTP), welche ein akutes und anhaltendes Parkinson-Syndrom auslösen kann

(Hellenbrand 1993; Ballard et al. 1985). MPTP wird in 1-Methyl-4-Phenylpyridinium

(MPP+) umgewandelt, welches über spezielle Dopamintransporter in die Zelle gelangt

und somit hochselektiv für das dopaminerge System ist (Hellenbrand 1993; Jenner et

Olanow 1996). Durch den elektrochemischen Gradienten konzentriert sich MPP+ in den

Mitochondrien und hemmt dort den Komplex-I der Atmungskette (Hellenbrand 1993;

Jenner 1996; Reichmann et al. 1993; Lange et al. 1992). Die klinischen Auswirkungen

unterscheiden sich nicht von denen des Morbus Parkinson, es fehlt jedoch die

Progredienz, und es lassen sich keine Lewy-Körperchen finden. Die Ähnlichkeit vieler

Pestizide zu MPTP werfen die Frage nach ätiologisch relevanten Umweltfaktoren auf

(Lange et al. 1992; Kuhn et Müller 1996). Es gibt Fallbeschreibungen eines Parkinson-

Syndroms nach 15-jährigem Kontakt mit Paraquat (Sanchez-Ramos et al. 1987). Unter

dem Begriff der multifaktoriellen Genese werden des weiteren auch noch Ernährungs-

einflüsse und sekundäre Ursachen (Traumen, Infekte, Medikamente etc.) diskutiert.

Auch wird die Apoptose als ein möglicher ätiologischer Faktor der Neurodegeneration

angesehen (Przuntek et al. 1996; Mochizuki et al. 1997).

1.1.5. Therapie

Das therapeutische Spektrum des Morbus Parkinson ist aufgrund der erforschten

neurochemischen, neurophysiologischen, neuroanatomischen, histochemischen und

pathophysiologischen Grundlagen des bestehenden Dopamindefizites vorangetrieben

worden. Birkmayer und Hornykiewicz setzten 1961 erstmalig aufgrund der

Entdeckungen von Carlsson et al. 1958 im Tierversuch 3,4-Dihydroxyphenyl-L-Alanin,

genannt L-Dopa, zur Behandlung von Patienten mit Morbus Parkinson ein. L-Dopa ist

die direkte metabolische Vorstufe des Dopamins und kann die Blut-Hirn-Schranke

passieren. Mit der Einführung der Kombination des L-Dopa mit peripheren

Einleitung

5

Decarboxylasehemmern (Benserazid und Carbidopa) ließen sich mehrfach höhere

Konzentrationen im zentralen Nervensystem mit einer Verminderung der peripheren

Nebenwirkungen erreichen (Birkmayer et Birkmayer 1989; Calne et al. 1971;

Lieberman et al. 1975). Zentrale Nebenwirkungen wie Hyperkinesien, Angstzustände,

Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Alpträume, Verwirrtheitszustände („Dopa-

Psychose“) traten damit mehr in den Vordergrund (Birkmayer et Birkmayer 1989). Die

Langzeittherapie mit L-Dopa wird dafür verantwortlich gemacht, daß es zu einer

Akzeleration der Neuronendegeneration und zur Progredienz zentraler Nebenwirkungen

kommt (Cohen 1984; Nakamura 1997). Nach Therapiedauer von 3-5 Jahren ist mit

einem Wirkverlust des L-Dopa zu rechnen (Lees 1994), so daß heute versucht wird die

L-Dopatherapie soweit wie möglich hinauszuzögern und zunächst eine Kombination mit

anderen Antiparkinson-Mitteln anzustreben ist. Eine kausale Therapie ist bis zum

heutigen Tage nicht möglich, aufgrund der noch nicht endgültig geklärten Ätiologie. Die

medikamentöse Therapie kann somit nur symptomatisch und substituierend sein (Kuhn

et Müller 1997).

Aufgrund der ausgeprägten Nebenwirkungen der L-Dopa Therapie wurden alternative

Therapiemöglichkeiten zur Verbesserung der dopaminergen Transmission entwickelt.

Großen Stellenwert nehmen hierbei die Dopaminagonisten ein (z. B. Bromocriptin,

Lisurid, Pergolid, Alpha-Dihydro-Ergocryptin, Cabergolin und Apomorphin), welche

zur direkten, selektiven Stimulation postsynaptischer, dopaminerger D1- und D2-

Rezeptoren führen (Kuhn et Müller 1997; Jörg 1997). Dopaminagonisten zeigten im

Tierversuch einen MPTP-antagonistischen Effekt und könnten somit neuroprotektiv

wirken (Cohen 1984; Lange et al. 1994; Przuntek 1994). Die Dopaminkonzentration im

synaptischen Spalt wird durch die Hemmung der Monoaminooxidase B (MAO-B)

(Selegilin) oder der Catechol-0-Methyl-Transferase (COMT) (Tolcapone und

Entacapone) erhöht und somit eine Verbesserung der Symptomatik erzielt. Das zentral

und peripher wirksame Tolcapone wurde im November 1998 wegen seltenen, akut

verlaufenden, hepatotoxischen Nebenwirkungen vom deutschen Markt genommen. In

vorherigen Studien wurde bereits auf eine mögliche neurotoxische Wirkung und

potentielle Risiken zentral wirksamer COMT-Hemmer hingewiesen (Kuhn 1998). Des

weiteren können Anticholinergika und Glutamatrezeptorantagonisten (Amantadin,

Dimethylamantadin) als adjuvante Therapiemöglichkeit verwendet werden.

Einleitung

6

Anticholinergika sind vor allem bei vegetativen Nebenwirkungen und Tremor-

symptomatik indiziert. Glutamatrezeptorantagonisten haben sich besonders bei akine-

tischen Krisen, Rigor und Tremor auch als Monotherapie bewährt und erfahren zur Zeit

aufgrund ihrer außerdopaminergen Wirkung eine Renaissance (Kuhn et Müller 1997).

Die neurochirurgische Therapie hat durch die Probleme der medikamentösen

Langzeittherapie, durch neuere Erkenntnisse über Pathomechanismen und Topographie

des Morbus Parkinson sowie weiterentwickelte Operationstechniken wieder an

Bedeutung gewonnen (Müller 1996). Zur Anwendung kommen als stereotaktische

Therapieansätze die Thalamo- und Subthalamotomie, besonders bei Rigor und Tremor

(Müller 1994, Moringlaine 1996, Kupsch et Oertel 1996, Oertel 1991, Ostertag et al.

1997). Durch eine gezielte Läsion des posteroventralen Globus pallidus internus

(Pallidotomie) kann es zu einer dramatischen Verbesserung sowohl von Rigor, Tremor

und Akinese kommen (Müller 1994, Laitinen et al. 1992, Iacano et al. 1994, Kupsch et

Oertel 1996). Neuerdings werden Transplantationsverfahren sowohl mit homologem

ventralen Mittelhirngewebe von menschlichen Feten als auch autologem

Nebennierenmark des Parkinson-Patienten verwendet (Kuhn et Müller 1997, Kupsch et

Oertel 1996, Glaß et Vogel 1991, Vogel 1991). Desweiteren findet die chronische

Stimulation des Nucleus ventralis intermedius thalami und des Nucleus subthalamicus

besonders bei der Tremor-Problematik ihre therapeutische Bedeutung (Kuhn et Müller

1997, Diederich et Alesch 1997, Obeso et al. 1997, Bülau 1998, Kupsch et Oertel 1996).

Ob sich diese Verfahren der konventionellen Thermokoagulation als überlegen

erweisen, kann heute noch nicht mit Sicherheit gesagt werden (Kuhn et Müller 1997,

Kupsch et Oertel 1996).

Eine unterstützende Rolle in der Parkinson-Therapie ist die regelmäßige

Krankengymnastik sowie die logopädische und ergotherapeutische Betreuung (Ulm

1998). Zur psychischen Stabilisierung ist die längerfristige familiäre Betreuung wichtig.

1.2. Homocystein

Homocystein ist eine schwefelhaltige, aliphatische α-Aminosäure, welche

Ausgangsstoff der Remethylierung des Methionin ist und zusammen mit Serin Einklang

Einleitung

7

in der Synthese von 2-Ketobutyrat und Cystein findet (Stryer 1991; Lehninger et al.

1994). Die Synthese des Homocysteins ist abhängig von verschiedenen

Stoffwechselwegen (siehe Abb. 2). Homocystein entsteht aus S-Adenosyl-L-

Homocystein, welches durch die Adenosyl-Homocysteinase unter H2O-Verbrauch zu

Adenosin und Homocystein gespalten wird. S-Adenosyl-L-Homocystein entsteht durch

eine Demethylierung von S-Adenosyl-L-Methionin. S-Adenosyl-L-Methionin ist einer

der wichtigsten Methylgruppendonatoren und wirkt an zahlreichen biosynthetischen

Methylierungen mit. S-Adenosyl-L-Methionin entsteht durch den Transfer einer

Adenosylgruppe von ATP auf das Schwefelatom des L-Methionin. Ein wichtiges

Enzym, welches S-Adenosin-L-Methionin als Methylgruppendonator benötigt, ist die

Catechol-O-Methyltransferase (COMT). Sie läßt sich beim Menschen in fast allen

Geweben nachweisen, insbesondere jedoch im Gehirn, Leber und Intestinum (Kuhn

1998). Die COMT ist wichtig zur Eliminierung biologisch aktiver (z.B. L-Dopa) und

toxischer Katecholamine. Eine typische Reaktion mit Beteiligung der COMT ist die

Metabolisierung von L-Dopa (siehe Abb. 1).

COMT

pos. neg. Ecdysone AMP,GMP,UMP,CMP, Dopa Decarboxylase α-Methyldopa Coenzym: Pyridoxalphosphat CO2

COMT

Disulfiram Ascorbate, O2

Dopamine Hydroxylase Coenzym: Cu++

Dehydroascorbate, H2O

S-Adenosyl-L-Methionine

Phenyl-Ethanol-Amine- N-Methyltransferase S-Adenosyl-L-Homocysteine

Abb. 1: L-Dopa-Metabolismus

L-Dopa

Dopamin

L-Norepinephrine

L-Epinephrine

3-O-Methyldopa

3-O-Methoxytyramin

Einleitung

8

In Gegenwart von S-Adenosyl-L-Methionin entsteht dabei S-Adenosyl-L-Homocystein

und 3-O-Methyldopa. Daraus folgt, daß bei einem Überschuß von L-Dopa vermehrt S-

Adenosyl-L-Homocystein gebildet wird, was dann vermehrt zu Homocystein

umgewandelt wird (Kuhn 1998). S-Adenosyl-L-Methionin kann ebenfalls bei der

Umwandlung von L-Norepinephrin zu L-Epinephrin über die Phenyl-Ethanol-Amin-N-

Methyltransferase als Methylgruppendonor dienen und somit ebenfalls zu einer

Erhöhung des Homocysteins führen. Ursprung dieser Reaktion wäre ein Abbau des L-

Dopa durch die Dopa Decarboxylase (Stryer 1991; Lehninger et al. 1994; Michal 1982).

Diese Reaktion spielt aber seit Einführung der peripheren Decarboxylase-Hemmer eher

eine untergeordnete Rolle.

Homocystein reagiert mit Serin, katalysiert durch die Cystathionin-β-Synthetase, zu

Cystathionin (Abb. 2). Des weiteren wird das Cystathionin durch die Cystathionin-γ-

Lyase in Cystein und α-Ketobutyrat unter Freisetzung von NH3 gespalten. Die Enzyme,

die diese Reaktionen katalysieren, haben Pyridoxalphosphat als Coenzym, welches aus

Vitamin B6 gebildet wird.

Methionin wird durch die Übertragung einer Methylgruppe auf Homocystein

regeneriert. Methylgruppendonor dieser Reaktion ist 5-Methyl-Tetrahydrofolate. Diese

Reaktion katalysiert die 5-Methyl-Tetrahydrofolate-Homocysteine-Methyltransferase.

Coenzyme, die diese Methylierung vermitteln, sind das vom Vitamin B12 abgeleitete

Methylcobamid sowie S-Adenosyl-Methionin, FADH2 und Mg++. Methionin hemmt

diese Reaktion. Alternative Methylgruppendonoren sind Betain und Dimethylthetin.

Einleitung

9

Abb. 2: Homocystein-Metabolismus

Einleitung

10

5-Methyl-Tetrahydrofolat entsteht aus 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat katalysiert durch

die 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase. Cofaktor dieser Reaktion ist NADH+H+,

welches zu NAD+ reduziert wird. 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat wird aus 5,6,7,8-

Tetrahydrofolat über verschiedene Methylierungsreaktionen gebildet, die teilweise

Pyridoxalphosphat als Coenzym benötigen. Grundsubstanz dieser Reaktionen ist die

Folsäure (Stryer 1991; Lehninger et al. 1994; Michal 1982).

NADPH+H+

Dihydrofolatdehydrogenase

NADP+

neg. Folatantagon. (Methotrexat), Purines NADPH+H+

Tetrahydrofolate-Dehydrogenase NADP+

HCHO NAD+, Glycine L-Serine

Coenzym: Serine-Hydroxy- Coenzym: Pyridoxalphosphat Methyltransferase Pyridoxalphos.

H2O CO2, NH3, Glycine, NADH+H+ H2O

pos. wenig Methionin

NADH+H+

5,10 Methylene Tetrahydrofolatereduktase

neg. NAD+

ATP, GTP, ITP, Guanosin, Inosin, viel Methionin

Abb. 3: Folat-Stoffwechsel

Folate

7,8-Dihydrofolate

5,6,7,8-Tetrahydrofolate

5,10 Methylene Tetrahydrofolate

5-Methyl Tetrahydrofolate

Einleitung

11

1.3. Hyperhomocysteinämie

Schon seit längerer Zeit ist bekannt, daß Homocystein ein unabhängiger Risikofaktor für

die Atherosklerose und die Atherothrombose ist und somit das Risiko eines

Schlaganfalls, einer koronaren Herzerkrankung und einer arteriellen

Verschlußerkrankung des peripheren Gefäßsystems signifikant erhöht ist (Clarke et al.

1991; Nygard et al. 1997; Alfthan et al. 1997). In letzter Zeit wird die

Hyperhomocysteinämie ebenfalls als ein Risikofaktor für eine tiefe

Beinvenenthrombose diskutiert (Den Heijer et al. 1995; Den Haeijer et al. 1996).

Homocystein wirkt sowohl endothel- als auch gewebetoxisch (Kuhn 1998). Es wird

angenommen, daß die atherogene Potenz des Homocystein durch eine Anhäufung von

Homocystein Thiolacton bedingt wird. Homocystein Thiolacton führt nun zu einer von

Eisen-Ionen katalysierten Thiolation freier Aminogruppen von Low Density

Lipoproteinen (LDL), was eine vermehrte zelluläre Aufnahme von LDL bedingt. Das

durch diese vermehrte LDL Aufnahme in die Zelle gelangte Homocysteine Thiolacton

kann nun seinerseits ebenfalls zu einer Intima-Schädigung führen (McCully 1993,

Hirano et al. 1994). Homocystein liegt zu 20-30% in freier Form und zu 70-80% in

proteingebundener Form vor (Malinow 1994). Bei einem gesunden Menschen liegt der

Homocystein-Spiegel zwischen 5,0 und 15,9 µmol/l Plasma (Ueland et al. 1993). Bei

der Hyperhomocysteinämie wird die mäßig ausgeprägte (16-30 µmol/l), die mittelgradig

ausgeprägte (31-100 µmol/l) und die ausgeprägte (>100 µmol/l) Form unterschieden

(Kang et al. 1992). Als Ursachen einer Hyperhomocysteinämie kommen hereditäre und

erworbene Ursachen in Betracht. Eine hereditäre Ursache ist Cystathionin-β-

Synthetase-Mangel (Boers et al. 1985; Lehninger et al. 1994). Die Genlokalisation

dieses Defektes befindet sich beim Menschen auf dem Chromosom 21. Die homozygote

Form hat eine Inzidenz von 1 zu 332000 (Malinow 1994) und führt zu einer

ausgeprägten Hyperhomocysteinämie mit dem klassischen Bild einer Homocysteinurie.

Die heterozygote Form (Prävalenz 0,5%-1,5% (Boers et al. 1985)) kann eine

mäßiggradig ausgeprägte Hyperhomocysteinämie aufweisen, bei etwa 40% liegen die

Werte aber im Normbereich (Kang et al. 1992; Murphy-Chutorian et al. 1985). Des

weiteren führt ebenfalls ein 5, 10 Methyl-Tetrahydrofolat-Reduktase-Mangel in seiner

homozygoten Form zu einer ausgeprägten Hyperhomocysteinämie (Kang et al. 1992).

Neun seltene Mutationen können zu einem ausgeprägtem Mangel an Methylen-

Einleitung

12

Tetrahydrofolat-Reduktase führen, wobei alle diese Mutationen Einzelbasen-

Substitutionen sind (Rozen 1996).

Des weiteren kann eine Hyperhomozysteinämie durch erworbene Ursachen bedingt sein.

Hierzu zählen ein Betain-Mangel durch cholinarme Kost, Cobalamin- (Vitamin B12)

Mangel, Folsäure-Mangelzustände und ein Mangel an Pyridoxalphosphat (Vitamin B6)

(Kang et al. 1992; Kang et al. 1987). Außerdem kann eine Hyperhomocysteinämie

medikamentös induziert sein. Diese Form der Hyperhomocysteinämie ist unter

Chemotherapeutika- (Methotrexat) und Antikonvulsiva-Therapie (in erster Linie

Phenytoin) nachgewiesen (Refsum et al. 1991; Dastur et Dave 1987).

1.4. 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase

Verschiedene epidemiologische Studien zeigten, daß die milde Form der

Hyperhomocysteinämie ebenfalls ein unabhängiger Risikofaktor für eine Atherosklerose

der Koronararterien, des cerebralen und peripheren Gefäßsystems ist (Van den Berg et

al. 1995; Kluijtman et Van den Heuvel 1996). Die milde Form der

Hyperhomocysteinämie wird mit einem thermolabilen Polymorphismus des Gens,

welches die Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase kodiert, in Verbindung gebracht

(Frosst et al. 1995; Kang et al. 1991; Kluijtmans et al. 1996). Es handelt sich hierbei um

eine Punktmutation am Nukleotid 677, bei der Cytosin gegen Thymin substituiert wird.

Diese Punktmutation führt dazu, daß ein Alanin-Codon (GCC) in ein Valin-Codon

(GTC) umgewandelt wird. Diese Substitution resultiert in eine thermolabile Form der

Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase. Die Prävalenz dieser Mutation zeigte sich in einer

Untersuchung von 57 Kanadiern in der heterozygoten Form bei 50% und der

homozygoten Form bei 12% als weit verbreitet (Frosst et al. 1995). Des weiteren fand

sich in 15-17% Nord-Amerikanischer und Niederländischer Patienten, die an einer

koronaren Herzkrankheit erkrankt waren, und in jeweils 5% der Kontrollgruppen diese

thermolabile Variante der Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (Kang et al. 1991;

Kluijtmans et al. 1996). Es wird davon ausgegangen, daß etwa 5% der Normal-

Bevölkerung homozygot für diese Mutation sind (Welch et Loscalzo 1998).

Homozygote Individuen zeigen eine 50%ige Reduktion der Aktivität des Enzyms und

tendieren zu mäßig ausgeprägter Hyperhomozysteinämie (Kang et al. 1992; Rees et

Einleitung

13

Rodgers 1993). Es zeigte sich eine um 24% höhere Homocysteinkonzentration als bei

normalem Genotyp bei einer Folatkonzentration < 15,4 nmol/l. Es zeigten sich

allerdings keine signifikanten Unterschiede in der Homozysteinkonzentration bei einer

Folatkonzentration > 15,4 nmol/l (Jacques et al. 1996). Somit scheint diese Mutation

prädispositionierend für eine Hyperhomozysteinämie zu sein, wenn sie mit einer

niedrigen bis normalen Folatkonzentration einhergeht. In Lymphozytenextrakten zeigte

sich eine signifikant geringere Enzymaktivität. Die homozygote Mutation zeigte eine

verbliebene Aktivität von 30%, heterozygote von 65% im Vergleich zur

Kontrollgruppen-Enzymaktivität. Werden diese Extrakte bei 46°C für 5 Minuten erhitzt

war die verbliebene Enzymaktivität bei homozygotem Normaltyp auf 67%, bei

heterozygoter Mutation auf 56% und bei homozygoter Mutation auf 22% abgesunken

(Frosst et al. 1995). Obwohl der thermolabile Effekt dieser Mutation als gesichert gilt ist

der exakte Mechanismus noch nicht bekannt. Diese Form der Mutation wird in letzter

Zeit auch mit der multifaktoriellen Genese der Neuralrohr-Defekte, wie der Spina

Bifida, in Zusammenhang gebracht (Van der Punt et al. 1995).

1.5. Fragestellung

1.5.1. Hyperhomocysteinämie und Morbus Parkinson

Es ist nachgewiesen, daß die Homocystein-Plasmakonzentration bei Parkinson Patienten

im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant erhöht ist (Kuhn et al. 1998; Allain et al.

1995; Kuhn et al. 1997). Homocystein induziert oxidativen Streß und könnte somit

neben der Gefäßendothelschädigung ebenfalls eine Rolle bei neurodegenerativen

Prozessen spielen (Schlüssel et al. 1995; McCully 1994). Dies unterstreicht die

zweifache Wirkung von Homocystein am N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor. Homocystein

wirkt an der glutamatbindenden Seite des Rezeptors als Agonist, aber ebenso als

partieller Antagonist an der Seite des Rezeptors, welche Glycin als Coagonist hat. Unter

pathologischen Bedingungen, wie Schlaganfall oder Kopftrauma, ist die

Glycinkonzentration erhöht und Homocystein wirkt nun vermehrt als Agonist am N-

Methyl-D-Aspartat Rezeptor. Es kommt somit zu einem exzessiven Kalzium-Ionen

Einstrom und einer reaktiven Oxygenierung. Über diesen Mechanismus wäre eine

neurotoxische Wirkung des Homocystein zu erklären (Lipton et al. 1997, Olney et al.

Einleitung

14

1987; Do et al. 1986). Ein weiterer Anhalt hierfür ist die Erhöhung freier oxidativer

Radikale durch Homocystein Thiolacton (McCully 1994). Ebenfalls wird schon seit

längerer Zeit eine mögliche vaskuläre Genese des Morbus Parkinson diskutiert. Horner

et al. konnten bei 27% der untersuchten Parkinson Patienten ein erhöhtes vaskuläres

Risiko nachweisen (Horner et al. 1997). Bei der Todesursachenerforschung von 220

Parkinson Patienten im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von 421 Personen zeigte sich

eine signifikante Erhöhung von ischämischen Herzerkrankungen und cerebrovaskulären

Erkrankungen in der Gruppe der Parkinson Patienten (Ben-Schlomo et Marmot 1995).

Andere Studien zeigten hingegen eine geringe Inzidenzrate von Schlaganfällen bei

Parkinson Patienten auf (Struck et al. 1990). Ein Fallbericht schildert ein 2 jährig

verstorbenes Mädchen, welches einen 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase

Mangel hatte und dabei das klinische Bild eines Morbus Parkinson, einer

Leukoencephalopathie und einer kombinierten Degeneration des Herzens aufwies. Es

zeigten sich jedoch keine Veränderungen der Basalganglien (Clayton et al. 1986).

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob es einen möglichen

Zusammenhang zwischen den verschiedenen Genotypen der thermolabilen Variante der

5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase und einem signifikant erhöhten Homocystein

Plasmaspiegel bei Morbus Parkinson Patienten gibt.

Im einzelnen wurde untersucht:

1. die Häufigkeit des homozygoten, heterozygoten und normalen Genotyps der

Punktmutation am Nukleotid 677 des Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Gens

bei Parkinson Patienten.

2. die Homocysteinkonzentration in Korrelation zu dieser thermolabilen Mutation.

3. die Homocysteinkonzentration in Korrelation zu der täglichen L-Dopa-Dosis,

Krankheitsausprägung (Hoehn- u. Yahr Klassifikation), Dauer der Erkrankung in

Jahren sowie Cholesterin- und Triglyceridkonzentrationen der Parkinson

Patienten

4. die Homocysteinkonzentration in Korrelation zu Geschlecht, Vitamin B6,

Vitamin B12 sowie Folsäure Konzentrationen und Alter der Patienten und

Kontrollen.

Einleitung

15

Ursachen für eine Anhäufung von Homocystein kann ein vermehrter Aufbau oder ein

verminderter Abbau des Homocysteins sein. So kann ein vermehrtes Angebot von S-

Adenosyl-L-Homocystein zu einer Hyperhomocysteinämie führen. Ursache hierfür

könnte ein erhöhter Methionin-Spiegel oder eine L-Dopa-Therapie sein. Des weiteren

könnte eine Genmutation der Cystathionin-β-Synthetase oder der 5-Methyl-

Tetrahydrofolat-Homocystein-Methyltranferase zu einer Hyperhomocysteinämie führen.

Material und Methoden

16

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

2.1.1. Geräte

! Kühlzentrifuge (J2-21, Fa. Beckmann)

! Eppendorfpipetten verschiedener Größe

2.1.2. Verbrauchsmaterialien

! Eppendorf-Caps

! Polypropylenröhrchen

! EDTA-Monovetten

! Serum-Monovetten

! Venenpunktionsbesteck (Venofix® S Luer Lock, Fa. Braun)

2.2. Patienten

2.2.1. Ausschlußkriterien

! Patienten mit Diabetes mellitus, arteriellem Hypertonus oder anderen

metabolischen Erkrankungen, welche mit einem erniedrigtem Level an Vitamin

B6, B12 und/oder Folsäure einhergehen

! Erniedrigte Werte des Vitamin B6, B12 und/oder Folsäure

! Andere neurologische Erkrankungen außer Morbus Parkinson

! Demenz oder andere neurologisch/psychiatrische Erkrankungen, welche die

Evaluation des Patienten behindern könnten

! Medikamentöses Parkinsonoid

! Jede akute Erkrankung oder schwerwiegende instabile oder nicht kompensierte

Erkrankung von Lunge, Herz, Niere, Leber oder Gastrointestinaltrakt

! Krebsleiden oder bekannte HIV-Infektion

! Positive Suchtanamnese


17

! Schwangerschaft oder Stillzeit

! Vaskuläre oder kardiale Vorerkrankungen

! Teilnahme an anderen klinischen Studien innerhalb der letzten 30 Tage vor

Studienbeginn

! Fehlende Zustimmung des Patienten

2.2.2. Einschlußkriterien

! Alter mindestens 40 Jahre

! Gesichertes idiopathisches Parkinson-Syndrom

! Zustimmung zur Teilnahme an der Studie

2.2.3. Patientendaten

Siehe Ergebnisteil 3.1.

2.3. Verlaufsprotokoll

Nachdem unter Berücksichtigung der Ein- und Ausschlußkriterien sowie durch die

Zustimmung des Patienten die Teilnahme an der Studie gesichert war, erfolgte vor der

morgendlichen Medikamenteneinnahme und nach einer Fastenzeit von mindestens 10

Stunden zwischen 6.00 und 7.30 Uhr morgens die Blutentnahme. Es wurden eine 10 ml

EDTA-Monovette, eine 1 ml EDTA-Monovette sowie eine 10 ml Serum-Monovette mit

Blut aus einer peripheren Unterarmvene gefüllt. Die Blutprobe aus der 10 ml EDTA-

Monovette wurde jeweils direkt nach der Entnahme 10 Minuten in der Kühlzentrifuge

(4°C) bei 3000 G zentrifugiert, danach das Plasma abpipettiert und bei – 80 °C bis zur

weiteren Verarbeitung eingefroren.

2.3.1. Motorikerfassung

Die klinische Begutachtung hinsichtlich der Motorikerfassung des Patienten wurde vor

Studienbeginn mittels der Hoehn- und Yahr-Klassifikation vorgenommen (Hoehn et


18

Yahr 1967, siehe Tab. 1). Des weiteren wurde die Dauer der Erkrankung, Medikation,

Alter, Geschlecht und ggf. Zusatzerkrankungen des Patienten schriftlich fixiert.

Tab. 1: Die Klassifizierung nach Hoehn und Yahr

Stadium Klinische Symptomatik

0 Keine

I Unilaterale Manifestation

II Bilaterale Manifestation ohne Störung der Balance

III Leichte bis mäßige bilaterale Erkrankung,

Erste klinische Zeichen gestörter Haltereflexe,

Anamnestisch Gleichgewichtsstörung, Hinstürzen,

Patient ist physisch noch unabhängig

IV Schwere Beeinträchtigung, vollständig ausgebildete Symptomatik,

Patient kann noch ohne Hilfe laufen und stehen

V Bettlägeriger oder rollstuhlpflichtiger Patient

2.4. Verarbeitung der Proben

Die Blutprobe aus der 10 ml Serum-Monovette wurde in das hauseigene Labor zur

Bestimmung der Cholesterin- und Triglycerid-Werte gebracht.

Das gewonnene Plasma wurde umgehend zusammen mit der 3 ml EDTA-Blutprobe zur

weiteren Verarbeitung in das Labor Dr. Eberhard & Partner eingeschickt. Die

Plasmaprobe diente dabei jeweils zur Bestimmung der Homocystein-, Vitamin B12- und

Folsäurekonzentration. Aus der Blutprobe wurde hingegen die Vitamin B6-Konzen-

tration bestimmt und die molekulargenetische Mutationsuntersuchung durchgeführt.

2.4.1. Vitamin B12 und Folsäure

Die Vitamin B12- und Folsäure-Bestimmung basiert auf dem Prinzip der kompetitiven

Liganden-Assays. Liganden-Bindungsassays wenden spezifische Rezeptoren oder

Liganden an, um den Analyten zu binden. Der Analyt konkurriert hierbei mit einem

markierten Liganden um einen in niedriger Konzentration vorliegenden spezifischen

Rezeptor. Die Verdrängung des markierten Liganden vom Rezeptor ist umgekehrt-


19

proportional der Konzentration des Analyten in der Probe. Die quantitative Bestimmung

des markierten Liganden nach Ablauf der Bindungsreaktion erfolgt nach Trennung des

gebundenen markierten Liganden vom ungebundenen. Die ungebundene Form wird

anschließend quantitativ gemessen (heterogener Assay). Je nach Markierung werden

Radio-, Enzym-, Fluoreszenz- und Lumineszenz-Ligandenassays unterschieden

(Thomas 1998).

Das Vitamin B12 in der Patientenprobe konkurriert mit einem acridiniumester-

markierten Vitamin B12 um eine begrenzte Menge an gereinigtem Intrinsic-Faktor,

nachdem es von den Bindungsproteinen des Serums mittels eines Releasing Agens

(Natriumhydroxid) und DTT extrahiert wurde. Zugesetztes Cobinamid verhindert eine

Rückbindung. Hierbei handelt es sich um ein Lumineszenz-Ligandenassay (Chiron

Diagnostics Corporation 1996).

Dieses Prinzip gilt auch bei der Bestimmung der Folsäure. Nach Extrahierung der

Folsäure von ihren endogenen Bindungsproteinen konkurriert die freie Folsäure dann

mit einer markierten Folsäure (5-Methyltetrahydrofolat) um eine begrenzte Menge

hinzugegebenes β-Lactoglobulin. Dieses wird aus dem Reaktionsansatz entfernt und die

ungebundene Menge markierter Folsäure bestimmt, welche sich invers zur

Folsäurekonzentration der Probe verhält (Thomas 1998).

2.4.2. Vitamin B6

Die Bestimmung des Vitamin B6 sowie des Homocysteins erfolgte mittels HPLC. Die

HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) ist eine Methode zur Analyse

fester, flüssiger und löslicher Substanzgemische. Die zu analysierende Probe wird dabei

in einer mobilen Phase (Eluens) gelöst und mit dieser durch eine Säule transportiert, die

die stationäre Phase enthält. Die Affinitätsunterschiede der Probenbestandteile zur

stationären Phase führen dann zu einer Auftrennung des Substanzgemisches entlang der

Säule. Mittels verschiedener Meßverfahren ist anschließend eine quantitative

Bestimmung der in der Probe enthaltenden Substanzen möglich. Dabei wird im

Detektor der austretende Konzentrationspeak in ein elektrisches Signal übertragen. Bei

entsprechenden Potentialdifferenzen zwischen Eluens und Probe wird dabei die

Redoxreaktion der Probe ausgenutzt, und man erhält ein Meßpotential (Bussemas et

Harhoff 1990).


20

2.4.3. Homocystein

Vor der Bestimmung wird das gesamte Homocystein (freies und an Proteine

gebundenes) mit einem Thio-spezifischen Reagenz (Kurzname: SBD-F) derivatisiert.

Das Derivat kann dann aufgrund seiner Fluoreszenz mittels HPLC detektiert und

quantifiziert werden. Von dem gewonnenem Plasma werden 0,3 ml in einem schmalen

Reagenzglas mit 30 µl einer 10 %igen Tri-n-butylphosphin-Lösung in reinstem

Dimethylformamid versetzt und geschüttelt. Man läßt die Mischung 30 Minuten bei 4°C

stehen, um die Reduktion des Homocysteins und der Disulfidbrücken bzw. die

Freisetzung des proteingebundenen Homocysteins zu bewirken. Dann werden 0,3 ml

einer 10 %igen Trichloressigsäure (enthält 1 mmol/l EDTA) zugesetzt. Hierdurch

werden die Proteine gefällt, das freigesetzte Homocystein bleibt in Lösung. Nach

Zentrifugation werden 100 µl der überstehenden Lösung zu einer vorbereiteten

Mischung von 20 µl einer 1,55 M Natriumhydroxid-Lösung, 250 µl eines 0,125 M

Boratpuffers (pH 9,5; mit 4 mmol EDTA) sowie 100 µl der SBD-F-Lösung (1 mg/ml

Boratpuffer) pipettiert. Der Ansatz reagiert daraufhin 1 h bei 60 °C im Wasserbad. Die

Proben verfärben sich je nach Homocysteingehalt gelblich bis tiefgelb. 20 µl werden im

HPLC analysiert (Te Poele-Pothoff et al 1995; Ubbink et al.1991; M. Mansoor et al.;

Araki et Sako 1987).

2.4.4. Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase

Die Analyse von Nukleinsäuren erfordert zunächst ihre Isolierung aus

unterschiedlichem Probenmaterial. Die Lyse des gewonnenem EDTA-Blutes erfolgte

durch Inkubation in einem speziellen Puffer in der Gegenwart von Proteinasen.

Anschließend werden die Nukleinsäuren spezifisch in Gegenwart eines chaotropen

Salzes an Glasfaser- oder Silica-Oberflächen gebunden (Vogelstein et Gillespie 1979).

Die Bindungsreaktion findet innerhalb von wenigen Sekunden statt und wird durch die

Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung mit

den gelösten Nukleinsäuren verursacht. Somit wird die Absorption an das Glasfaservlies

gefördert. Da nur Nukleinsäuren spezifisch gebunden werden, kann die DNA nach der

Durchführung eines einfachen Waschvorgangs frei von Begleitsubstanzen isoliert

werden (Miller et al. 1988). Zur genetischen Untersuchung ist die Menge der DNA-


21

Zielsequenz oft nicht ausreichend und muß daher zur Steigerung der

Nachweisempfindlichkeit spezifisch vervielfältigt werden.

Hierfür wird die Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction (PCR)),

welche im folgenden beschrieben wird, als effektivste Methode benutzt. Durch

Erhöhung der Temperatur über 90°C wird die Nukleinsäure reversibel in die

Einzelstränge geteilt. Bei anschließendem Abkühlung auf etwa 50°C können die im

Überschuß vorhandenen Primer schneller an ihre komplementären Sequenzen binden als

sich der DNA-Doppelstrang renaturieren kann (Annealing). Die in der Reaktionslösung

vorhandene Polymerase verlängert daraufhin bei etwa 70°C die Primer mit freien

Nukleotiden komplementär zur Basensequenz der DNA-Stränge (Extension). Die neu

synthetisierten Stücke dienen bei folgenden Zyklen als weiteres Ausgangsmaterial.

Durch die so erzielte enorme Vermehrung des gewünschten Fragments sind

anschließende Arbeitsschritte wesentlich vereinfacht.

Nach der PCR erfolgt die Restriktionsanalyse mittels einer spezifischen

Restriktionsendonuklease, welche die doppelsträngige DNA-Nukleotidsequenz

spezifisch in Bruchstücke (Restriktionsfragmente) schneidet. Für die Untersuchung der

spezifischen Mutation des Gens, welches die Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase

kodiert, wird das HinfI-Restriktionsenzym (Firma: Fermentas Ltd.) verwendet, welches

die Nukleotid-Basensequenz zwischen Guanin und Adenosin erkennt und die kovalente

Bindung einer DNA dort spaltet, wo diese Sequenz auftritt, also genau komplementär

zur eigentlichen Punktmutation.

Der Nachweis des Mutationsstatus wurde nun mittels Elektrophorese auf einem

2,5%igem Agarosegel durchgeführt. Je nach Anreicherung kann hier auch zwischen

einer heterozygoten oder homozygoten Mutation unterschieden werden (Thomas 1998,

Kluijtmans et al. 1996).


22

Abbildung 4: Normaler, heterozygoter und homozygoter Genotyp


23

2.4.5. Cholesterin und Triglyceride

Die Bestimmung des Cholesterins und der Triglyceride erfolgte durch das hauseigene

Labor mittels standardisierter automatisierter Methoden.

Das Prinzip der Cholesterinbestimmung basiert auf einer vollenzymatischen Reaktion,

wobei Cholesterin-Ester durch eine Esterase in freies Cholesterin und Fettsäuren

gespalten werden. Mittels einer Cholesterin-Oxidase wird danach unter

Sauerstoffverbrauch das freie Cholesterin oxidiert, wobei H2O2 entsteht, dessen Menge

proportional zur Menge des Cholesterins ist (Thomas 1998).

Die Bestimmung der Triglyceride erfolgt nach hydrolytischer Spaltung derselben. Die

Menge des nun freien Glycerins ist proportional zur Menge der Triglyceride (Thomas

1998).

2.5. Statistische Auswertungskriterien

Da die Werte normal verteilt waren, wurden parametrische Tests angewandt, wobei das

übliche 0,05 Signifikanzniveau angenommen wurde.

Die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA (Analysis of Variance), dem

Tukey honest difference Test als post hoc Test sowie Regressionsanalysen.

2.6. Ethische Kriterien

Die Studie ist von der unabhängigen Ethik-Kommission der Ruhr-Universität Bochum

geprüft und genehmigt. Die Studienteilnehmer wurden vor Studienbeginn über Art,

Umfang, Ablauf, Ziel und Freiwilligkeit der Untersuchung aufgeklärt und stimmten

einer Blutentnahme zu.

Ergebnisse

24

3. Ergebnisse

3.1. Charakterisierung der untersuchten Probanden

Es wurden 123 Probanden untersucht, die sich in 79 Parkinsonpatienten und 44

Kontrollen aufteilten. 47 Patienten und 24 Kontrollen waren männlichen, 32 Patienten

und 20 Kontrollen weiblichen Geschlechts. Das mittlere Alter der Patienten betrug

63,494 Jahre (+ 11,236), das der Kontrollen 58,136 Jahre (+ 12,422), der Unterschied

zwischen beiden Gruppen 5,358 Jahre. Die mittlere Homocysteinkonzentration der

Patienten betrug 16,343 µmol/l (+ 7,259), die der Kontrollen 13,009 µmol/l (+ 5,492).

Die statistische Signifikanz dieses Unterschiedes wurde unter Berücksichtigung der

einflußnehmenden Größen der verschiedenen Gruppen weiter untersucht.

3.1.1. Patienten

Das Patientenkollektiv bestand aus 35 Patienten (44,3 %) mit normalem Methylen-

Tetrahydrofolat-Reduktase-Genotyp, 36 Patienten (45,57 %) mit heterozygoter

Mutationsform und 8 Patienten (10,13 %) mit homozygoter Mutationsform. Die mittlere

Homocysteinkonzentration der Patienten mit normaler Genetik betrug 13,520 µmol/l (+

5,237), mit heterozygoter Genetik 17,719 µmol/l (+ 7,134) und mit homozygoter

Genetik 22,500 µmol/l (+ 10,323). Im weiteren Verlauf wurde die statistische

Signifikanz dieser Unterschiede unter Berücksichtigung von Dauer der Erkrankung,

Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure, Cholesterin, Triglyceride sowie

L-Dopa-Medikation und Krankheitsstadium (Hoehn-Yahr-Skala) als Covarianten in die

Auswertung mit einbezogen. Die Mittelwerte sowie Standardabweichungen werden

später noch ausführlich dargestellt.

Die Referenzbereich des Vitamin B6 liegt zwischen 7,0 und 30 ng/ml, des Vitamin B12

zwischen 200 und 1000 pg/ml sowie der Folsäure zwischen 3,0 und 20,0 ng/ml. Der

Normwertbereich für das Homocystein liegt bis 15 µmol/l. Ein Ausschlußkriterium für

diese Studie waren erniedrigte Werte für Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure.

Ergebnisse

25

Tabelle 2: Patientenkollektiv

Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein Mutation(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)

Pat. 1 m 82 15 200 13 20 hetPat. 2 m 71 18,5 276 8,6 14,5 hetPat. 3 m 54 19 203 13,5 15 hetPat. 4 m 63 24 509 5,9 9,4 hetPat. 5 m 70 22 308 3,4 21,5 hetPat. 6 w 81 32,5 296 3,3 42,5 hetPat. 7 m 51 16 265 3,8 22,5 hetPat. 8 w 69 32,5 264 5,8 17,5 hetPat. 9 w 77 14,5 310 4,1 15,5 hetPat. 10 w 80 14,5 224 4,6 33 hetPat. 11 m 54 21 565 8,3 19 hetPat. 12 w 48 13 306 4,7 12,5 hetPat. 13 m 56 23 263 5,6 34 hetPat. 14 w 60 3700 303 5,5 15,5 hetPat. 15 w 77 14 388 8,1 9,3 hetPat. 16 w 77 16 234 7,4 21 hetPat. 17 m 73 12,5 202 8 26 hetPat. 18 m 78 15 341 4,8 17 hetPat. 19 m 66 20,5 336 5,4 13,5 hetPat. 20 m 53 7,3 456 4,5 13 hetPat. 21 w 71 15,5 280 4,1 23,5 hetPat. 22 m 57 17,5 277 5,8 14 hetPat. 23 m 63 23,5 293 4 16 hetPat. 24 m 82 15,5 1011 3,5 17 hetPat. 25 w 58 27,5 793 5 18,5 hetPat. 26 w 69 16 669 5,8 8,4 hetPat. 27 m 53 8 357 8 8,8 hetPat. 28 w 63 18,5 380 10,3 16,5 hetPat. 29 m 76 17 687 5 13,5 hetPat. 30 w 64 17 1611 4,2 15,5 hetPat. 31 m 38 30 316 10,3 13 hetPat. 32 w 68 140 394 16,6 11,5 hetPat. 33 m 53 13,5 275 4,8 17,5 hetPat. 34 m 49 10,5 701 6,5 15,5 hetPat. 35 w 76 13 417 7,8 19 hetPat. 36 m 59 12,5 303 7,1 17,5 hetPat. 37 m 41 13,5 266 3,4 38,5 homPat. 38 m 57 22,5 347 6 18,5 homPat. 39 m 77 16 693 3,9 19,5 homPat. 40 m 64 18,5 494 12,6 16,5 homPat. 41 w 80 18 355 7,5 23 homPat. 42 m 70 15,5 401 4,6 15 homPat. 43 m 68 33,5 675 7,2 11 homPat. 44 m 60 19,5 300 4 38 homPat. 45 w 58 27,5 264 3,6 22 normPat. 46 w 57 29 239 4,3 13 normPat. 47 w 50 12 349 7,6 11 normPat. 48 w 75 23,5 224 3,5 23 normPat. 49 m 64 22 254 5,1 12,5 normPat. 50 w 72 17,5 570 6,5 11,5 normPat. 51 w 79 17,5 426 11,7 16 norm

Ergebnisse

26

Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein Mutation(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)

Pat. 52 w 56 18 241 9,4 9,5 normPat. 53 m 56 16,5 241 10,2 8 normPat. 54 m 55 19,5 515 12,9 4,9 normPat. 55 m 57 37 699 >21 10 normPat. 56 m 60 20,5 306 7,7 11,5 normPat. 57 m 60 21 384 6,8 15 normPat. 58 w 59 18 301 6,4 12 normPat. 59 m 49 50 1387 14,2 11,5 normPat. 60 w 66 16,5 308 4,4 25 normPat. 61 m 59 24 511 13,1 7,5 normPat. 62 w 88 39,5 300 6,5 16,5 normPat. 63 w 56 24,5 353 17,1 10 normPat. 64 m 55 31,5 291 8,6 9,7 normPat. 65 m 57 15,5 428 4,1 9,8 normPat. 66 m 59 17,5 307 3,6 10 normPat. 67 m 77 21 269 3,3 18,5 normPat. 68 w 62 13,5 279 5,1 10,5 normPat. 69 w 29 24 428 12,4 6,3 normPat. 70 m 54 14,5 333 5,3 14 normPat. 71 m 65 13 226 6,3 24,5 normPat. 72 w 52 26 383 6,6 6 normPat. 73 w 73 13,5 266 12,9 12 normPat. 74 m 61 34 269 7,4 15 normPat. 75 m 76 1900 >2100 3,9 19,5 normPat. 76 m 64 17 228 6,7 18,5 normPat. 77 m 48 22 308 5,5 17,5 normPat. 78 w 68 19,5 234 5,9 19 normPat. 79 m 55 22 280 7,5 12 norm

3.1.2. Kontrollgruppe

Das Kontrollgruppenkollektiv bestand aus 44 Kontrollen, wobei die mittlere

Homocysteinkonzentration bei 13,009 µmol/l (+ 5,492), das mittlere Alter bei 58,136

Jahre (+ 12,422), die mittlere Folsäurekonzentration bei 6,482 ng/ml (+ 2,862) lag. Es

zeigte sich ein Mittelwert von 21,693 ng/ml (+ 17,453) des Vitamin B6 und 417,864

pg/ml (+ 232,952) des Vitamin B12.

Tabelle 3: Kontrollgruppe

Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)

Kontr. 1 m 62 16,5 309 4,6 14,5Kontr. 2 w 74 19 326 7,7 10,5Kontr. 3 w 69 15,5 303 10,1 12,5Kontr. 4 m 65 21,5 242 8,4 9Kontr. 5 m 67 16,5 251 5,2 7,5Kontr. 6 w 55 18,5 235 5 10,5

Ergebnisse

27

Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)

Kontr. 7 w 66 18 687 8,3 10,5Kontr. 8 m 53 16,5 526 6,4 6Kontr. 9 m 51 23 521 7,6 17,5Kontr. 10 w 24 23,5 305 4 15Kontr. 11 m 51 14,5 366 3,6 19Kontr. 12 w 50 15,5 544 3,6 14Kontr. 13 m 27 23,5 427 6,2 9Kontr. 14 m 77 12,5 261 5,1 7,5Kontr. 15 w 59 120 767 8,3 6,4Kontr. 16 w 43 23 290 10,3 15,5Kontr. 17 m 61 10 376 3,3 23,5Kontr. 18 w 42 15 585 7,2 5,8Kontr. 19 m 57 15,5 488 3,5 9Kontr. 20 w 68 10,5 460 3 30Kontr. 21 m 58 13 452 5,4 11Kontr. 22 m 67 20,5 378 6,8 10Kontr. 23 w 59 15 215 5,9 7,5Kontr. 24 m 46 30,5 296 7,9 12Kontr. 25 m 80 18,5 276 15,7 12,5Kontr. 26 w 56 20,5 1161 5 9,3Kontr. 27 m 58 36,5 433 9,2 10,5Kontr. 28 w 65 18,5 360 3,3 24,5Kontr. 29 m 75 21 261 6,8 5,6Kontr. 30 w 63 11 438 5,2 8,1Kontr. 31 m 60 14,5 239 4,5 14Kontr. 32 m 71 20 664 5,3 8,2Kontr. 33 w 53 17 220 3,2 20,5Kontr. 34 m 67 19,5 1389 9,1 17,5Kontr. 35 m 53 15,5 442 3,7 9,5Kontr. 36 w 57 27 405 5,2 17Kontr. 37 m 66 10 314 4,7 13,5Kontr. 38 m 46 22,5 263 7,9 23,5Kontr. 39 m 43 15,5 348 6,9 14,5Kontr. 40 m 40 11 233 4,6 16,5Kontr. 41 w 73 24,5 479 15,4 11Kontr. 42 w 63 20,5 385 5 17,5Kontr. 43 w 45 20 238 6,8 13,5Kontr. 44 w 73 63,5 228 10,3 11,5

3.1.3. Zusatzuntersuchungen der Patienten

Weiter wurde bei den Parkinsonpatienten zusätzlich noch die Cholesterin, Triglyceride,

L-Dopa-Tagesdosis sowie die Dauer der Erkrankung und die Krankheitsausprägung

Ergebnisse

28

mittels der Hoehn-Yahr-Klassifikation bestimmt. Die hierbei errechneten Mittelwerte

sowie Standardabweichungen werden später noch ausführlich dargestellt.

Tabelle 4: Zusatzparameter des Patientenkollektiv

Geschl. Cholesterin Triglyceride L-Dopa - Dauer der Hoehn - Yahr(mg/dl) (mg/dl) Dosis (mg) Erkr. ( J ) Klassifikation

Pat. 1 m 197 180 400 2 3Pat. 2 m 213 162 300 2 2Pat. 3 m 182 104 650 11 4Pat. 4 m 186 120 400 4 4Pat. 5 m 198 56 500 5 3Pat. 6 w 273 204 700 6 4Pat. 7 m 230 148 275 15 4Pat. 8 w 251 153 700 15 4Pat. 9 w 260 287 600 0 3Pat. 10 w 249 99 500 4 3Pat. 11 m 244 64 500 3 2Pat. 12 w 326 324 0 0 2Pat. 13 m 223 129 0 0 2Pat. 14 w 179 155 500 4 2Pat. 15 w 172 144 200 0 2Pat. 16 w 272 114 400 2 3Pat. 17 m 276 134 900 15 3Pat. 18 m 170 188 400 5 4Pat. 19 m 273 122 600 12 3Pat. 20 m 316 404 600 4 2Pat. 21 w 226 142 775 20 3Pat. 22 m 205 305 500 2 3Pat. 23 m 174 44 800 9 3Pat. 24 m 139 94 200 0 4Pat. 25 w 256 114 475 11 3Pat. 26 w 185 75 0 5 1Pat. 27 m 245 85 800 13 2Pat. 28 w 286 133 150 13 3Pat. 29 m 165 174 200 3 4Pat. 30 w 240 213 300 1 3Pat. 31 m 255 206 500 1 1Pat. 32 w 314 151 300 1 2Pat. 33 m 251 189 600 7 4Pat. 34 m 248 167 225 8 2Pat. 35 w 152 69 600 1 3Pat. 36 m 237 290 175 3 1Pat. 37 m 277 109 400 6 1Pat. 38 m 278 132 500 5 2Pat. 39 m 164 119 500 15 4Pat. 40 m 222 101 700 9 2Pat. 41 w 164 157 600 1 2Pat. 42 m 233 127 400 10 3Pat. 43 m 214 104 900 10 4Pat. 44 m 160 108 400 1 2Pat. 45 w 294 217 950 12 2Pat. 46 w 271 203 450 20 3

Ergebnisse

29

Geschl. Cholesterin Triglyceride L-Dopa - Dauer der Hoehn - Yahr(mg/dl) (mg/dl) Dosis (mg) Erkr. ( J ) Klassifikation

Pat. 47 w 134 52 1075 5 4Pat. 48 w 149 88 450 0 5Pat. 49 m 219 142 600 14 4Pat. 50 w 261 56 400 8 3Pat. 51 w 205 124 800 17 3Pat. 52 w 166 97 600 12 3Pat. 53 m 209 77 300 4 2Pat. 54 m 245 119 200 0 3Pat. 55 m 259 99 37,5 0 1Pat. 56 m 210 106 400 1 2Pat. 57 m 242 187 0 0 2Pat. 58 w 251 175 500 3 3Pat. 59 m 237 121 0 4 4Pat. 60 w 256 500 700 4 2Pat. 61 m 221 194 0 0 2Pat. 62 w 231 72 600 22 3Pat. 63 w 161 160 250 3 3Pat. 64 m 192 31 600 8 2Pat. 65 m 259 71 600 4 2Pat. 66 m 237 207 300 7 4Pat. 67 m 235 148 400 1 3Pat. 68 w 160 97 350 17 3Pat. 69 w 299 141 0 2 1Pat. 70 m 302 81 0 4 2Pat. 71 m 287 171 0 0 1Pat. 72 w 269 167 400 10 1Pat. 73 w 267 131 600 6 3Pat. 74 m 243 106 600 12 4Pat. 75 m 223 73 500 12 4Pat. 76 m 196 92 200 7 2Pat. 77 m 209 128 450 6 2Pat. 78 w 294 189 300 3 4Pat. 79 m 235 257 200 2 3

3.2. Statistik und Auswertung

3.2.1. Vergleich der Homocysteinkonzentration der Parkinsonpatienten und

Kontrollen

Zunächst wurde eine Varianzanalyse zum Vergleich zwischen Parkinson Patienten und

Kontrollen durchgeführt, wobei als Covarianten Folsäure, Vitamin B6, Vitamin B12

sowie Alter und Geschlecht eingesetzt wurden. Diese Varianzanalyse testete die

Nullhypothese, daß die Homocysteinkonzentrationen der Parkinson Patienten und der

Kontrollgruppe gleich groß sind.

Ergebnisse

30

Es zeigt sich jedoch, daß sich die Homocysteinkonzentrationen der Patienten signifikant

(F(dF 1, 116) = 5.916, p = 0,017) von denen der Kontrollgruppe unterscheiden.

Tab. 5:Varianzanalyse bezüglich der Homocysteinkonz. der Parkinsonpatienten und der Kontrollen

df MS df MSEffect Effect Error Error F p-level

1 252.368 116 42.661 5.916 0.017

Der post hoc Test (Tukey honest difference Test für ungleiche Gruppen) zeigt ebenfalls

signifikante Unterschiede (p = 0,018) zwischen Parkinsonpatienten und Kontrollen

hinsichtlich des Mittelwertes der Homocysteinkonzentration der gesamten Gruppen.

Tab. 6:Post hoc Test: 1 = Parkinsonpatienten; 2 = Kontrollen

{1} {2}{1} 0.018{2} 0.018

Die Varianzanlyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin

B12, Folsäure) ergab im Vergleich hinsichtlich der Parkinsonpatienten und Kontrollen

keinen signifikanten Einfluß (F(dF 5, 116) = 2.148, p = 0,065).

Tab. 7: Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12,Folsäure) der Patienten und Kontrollen

Sum of MeanSquares df Square F p-level

Effect 458.151 5 91.63 2.148 0.065Error 4948.679 116 42.661

Ergebnisse

31

3.2.2. Kontrollgruppe im Vergleich zu Patienten mit unterschiedlicher Genetik

Da bei Parkinsonpatienten, wie oben beschrieben, eine signifikante

Homocysteinerhöhung nachgewiesen werden konnte, soll jetzt die Abhängigkeit zum

Polymorphismus diesbezüglich untersucht werden. Deswegen wurden die

Parkinsonpatienten in (1) heterozygote, (2) homozygote Mutation sowie (3) normale

Form des Methylen-Tetra-hydrofolat-Reduktase-Gens unterteilt und mittels ANOVA

gegen die Kontrollgruppe (0) verglichen.

Da bei den Kontrollen die Subtypisierung nicht vorgenommen wurde, wurden sie als

gesamte Gruppe (0) angesehen. Als Covarianten wurden Geschlecht, Alter, Vitamin B6,

Vitamin B12 und Folsäure berücksichtigt.

Es zeigten sich hier signifikante Unterschiede (F(dF: 3,114) = 7.49, p < 0.0001) hinsichtlich

der Homocysteinkonzentration zwischen den einzelnen Gruppen.

Tab. 8: Mittelwerte des Homocysteins und der Covarianten (0=Kontrollen; 1=heterozygot; 2=homo-zygot; 3=normal)

Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homocystein Geschlecht Alter Vitamin B6 Vitamin B12 Folsäure

0 13.009 1.455 58.136 21.693 417.864 6.4821 17.719 1.417 64.972 123.508 417.028 6.5862 22.500 1.125 64.625 19.625 441.375 6.1503 13.520 1.457 60.886 75.957 357.171 10.174

Tab. 9: Standardabweichung des Homocysteins und der Covarianten (0=Kontrollen; 1=heterozygot;2=homozygot; 3=normal)

Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homocystein Geschlecht Alter Vitamin B6 Vitamin B12 Folsäure

0 5.492 0.504 12.422 17.453 232.952 2.8621 7.134 0.500 11.360 613.480 275.049 3.0452 10.323 0.354 12.351 6.238 164.493 3.0283 5.237 0.505 10.772 317.493 212.686 16.019

Im post hoc Test (Tukey honest difference Test für ungleiche Gruppen) zeigten sich

signifikante Unterschiede der Homocysteinkonzentration zwischen der Kontrollgruppe

und der heterozygoten Mutationsform (p = 0.009) sowie zwischen der Kontrollgruppe

Ergebnisse

32

und der homozygoten Mutationsform (p = 0.014). Es zeigte sich jedoch kein

signifikanter Unterschied der Homocysteinkonzentration zwischen den Patienten ohne

Mutation, also mit einer normalen Genetik, und der Kontrollgruppe (p = 0.986).

Tab. 10: Post hoc Test: {1}=Kontrollen; {2}=heterozygot; {3}=homozygot; {4}=normal

{2} {3} {4}{1} 0.009 0.014 0.986

Abbildung 5: Homocysteinkonzentration der Patienten mit heterozygoter (I), homozygoter (II),normaler Genetik und Kontrollgruppe

Die Summe aller Covarianten (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure)

ergab hinsichtlich der Parkinson Patienten mit normaler, heterozygoter, homozygoter

Genetik und Kontrollen keinen signifikanten Einfluß (F(dF: 5,114) = 2.161, p = 0,063).

Tab. 11:Varianzanalyse: Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure)der Kontrollen und Patienten mit heterozygotem, homozygotem, normalem Genotyp


Effect 411.838 5 82.368 2.161 0.063Error 4344.591 114 38.110

��

��

��

ho

mo

cyst

ein

eµ µµµ M

ol(m

ean

+/-

SD

)

I II III controls0

10

20

30

40I

��

II��

III

��

controls

Ergebnisse

33

3.2.3. Vergleich der Patienten mit unterschiedlicher Genetik

Bei den Parkinsonpatienten wurden die Dauer der Erkrankung, das Geschlecht, das

Alter, die Vitamin B6-, Vitamin B12-, Folsäure-, Cholesterin-, Triglyceridkonzentration

sowie die L-Dopa-Medikation und das Krankheitsstadium (Hoehn-Yahr-Skala) als

Covarianten in die Auswertung mit einbezogen.

Die durchgeführte ANOVA testet die Nullhypothese, daß die Homocystein-

konzentrationen der verschiedenen Formen des Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-

Gens (1 = heterozygote; 2 = homozygote Mutation; 3 = normal) gleichgroß sind.

Das Ergebnis (F(dF: 2,66) = 6,05, p<0,004) zeigt, daß sich die Homocysteinkonzen-

trationen signifikant voneinander unterscheiden.

Tab. 12:ANOVA: Mittelwerte mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 3=normalem Genotyp derParkinsonpatienten

Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homoc. Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Cholest

erinTriglyc

erideL-Dopa Erkrank

ungsdauer

HY-Skala

1 17.719 1.4167 64.972 123.508 417.028 6.586 229.667 159.500 436.806 5.750 2.8062 22.500 1.125 64.625 19.625 441.375 6.150 214.000 119.625 550.000 7.125 2.5003 13.520 1.457 60.886 75.957 357.171 10.174 232.229 139.400 394.643 6.571 2.714

Tab. 13:Standardabweichungen mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 3=normalem Genotyp derParkinsonpatienten

Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homoc. Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Cholest

erinTriglyc

erideL-Dopa Erkrank

ungsdauer

HY-Skala

1 7.134 0.500 11.360 613.480 275.049 3.045 47.619 80.350 236.604 5.411 0.9202 10.323 0.354 12.351 6.238 164.493 3.028 48.412 18.685 177.281 4.824 1.0693 5.237 0.505 10.772 317.493 212.686 16.019 43.563 82.348 275.522 6.094 1.017

Die daraufhin durchgeführte post hoc Analyse mittels Tukey Test zeigte einen

signifikanten Unterschied der Homocysteinkonzentrationen zwischen dem normalen

Genotyp und der heterozygoten Mutationsform (p = 0,025) sowie zwischen dem

normalen Genotyp und der homozygoten Mutation (p = 0,022).

Ergebnisse

34

Tab. 14: Post hoc Test der Mittelwerte der Homocysteinkonzentrationen(1=heterozygoter, 2=homozygoter, 3=normaler Genotyp der Parkinsonpatienten)

{1} {2} {3}{1} 0.319 0.025{2} 0.319 0.022{3} 0.025 0.022

Die Varianzanalyse der Summe der Covarianten (Geschlecht, Alter, Vitamin B6,

Vitamin B12, Folsäure, Cholesterin, Triglyceride, L-Dopa-Medikation, Dauer der

Erkrankung, Krankheitsausprägung (Hoehn-Yahr-Skala)) der Parkinsonpatienten ergab

im Vergleich der einzelnen Mutationsformen (heterozygot, homozygot, normal) keinen

signifikanten Einfluß (F(dF: 10,69) = 1.470, p = 0.170).

Tab. 15:Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12,Folsäure, Cholesterin, Triglyceride, L-Dopa-Dosis, Dauer der Erkrankung, Krankheitsausprägung(Hoehn-Yahr-Skala)) innerhalb der verschiedenen Mutationsformen


Effect 607.560 10 60.756 1.470 0.170Error 2851.972 69 41.333

Diskussion

35

4. Diskussion

Wie in der Einleitung schon ausgeführt kann Homocystein auf verschiedene Weisen

pathogen auf den menschlichen Organismus einwirken. Homocystein induziert

oxidativen Streß durch seine zweifache Wirkung am N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor

(dadurch bedingter exzessiver Kalzium-Ionen Einstrom und reaktive Oxygenierung) und

durch eine Erhöhung des Homocystein Thiolacton-Spiegels, wodurch es zu einer

vermehrten Bildung freier Radikale kommt. Des weiteren wirkt Homocystein

prothrombogen und induziert Arteriosklerose mit daraus resultierendem erhöhtem

Schlaganfall- und Herzinfarktrisiko als anerkannter, unabhängiger Arteriosklerose-

risikofaktor.

Die Ätiologie des Morbus Parkinson ist bis zum jetzigen Zeitpunkt ungeklärt. Diskutiert

werden neben multifaktoriellen Ursachen sowohl eine neurodegenerative als auch eine

vaskuläre Genese. Eine wichtige Rolle könnte hierbei das Homocystein einnehmen, da

es bei Parkinson Patienten im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht ist (Kuhn et al.

1998; Allain et al. 1995; Kuhn et al. 1997). Die Ergebnisse unserer Studie bestätigen

dies.

Erklärbar wäre hierdurch auch eine mögliche Ursache der noch unklaren Progredienz

des Morbus Parkinson, welcher trotz zur Zeit gut wirksamer Medikamente keinen

ätiologischen Ansatz in der Therapie aufweist und einen progredienten, protrahierten

Verlauf, auch durch medikamentöse Nebenwirkungen mitbedingt, nimmt. Eine zentrale

Rolle spielt hierbei der derzeit bestehende Goldstandard der medikamentösen Therapie

mit L-Dopa, welcher ebenfalls zu einem erhöhten Homocystein-Spiegel führen kann

durch Abbau über die COMT. Dieser Mechanismus konnte bislang nur im Tiermodell

an L-Dopa-behandelten Ratten nachgewiesen werden (Miller et al. 1997).

Eine Erhöhung der Homocysteinvorstufe S-Adenosyl-Homocystein (SAH) fand sich bei

L-Dopa-behandelten Mäusen (Liu et al. 2000). Durch L-Dopa wird eine Vermehrung

der Methylierungsreaktionen mittels SAM induziert, was zu einer konsekutiven

Erhöhung des SAH führt (Surtees et Hyland 1990). Vitamin B12- oder

Folsäurestoffwechsel-störungen können ebenfalls zu einer Erhöhung von SAH im

Tiermodell führen (Scott et al. 1994). Methylierungsreaktionen sind wie der Morbus

Diskussion

36

Parkinson altersabhängig vermehrt. Nach Injektion von SAM in den lateralen Ventrikel

von Ratten fanden sich Rigor, Tremor und Hypokinese bei den so behandelten

Versuchstieren, was sich in Form einer neuronalen Degeneration als morphologisches

Korrelat belegen ließ (Charlton et Mack 1994). Diese ebenfalls beim Morbus Parkinson

als Kardinalsymptome bekannten Erscheinungsformen lassen auf eine Vermehrung der

SAM abhängigen Erhöhung von Methylierungsreaktionen schließen und somit im

Zusammenhang die L-Dopa-Therapie in einem neuem Licht erscheinen (Fahn 1996).

Andere Ursachen einer Hyperhomocysteinämie wurden bereits in der Einleitung

aufgeführt (Vitamin, Folsäure oder medikamentös induziert).

In mehreren Studien konnte bereits jeweils im Vergleich zu Kontrollgruppen eine

Hyperhomocysteinämie bei Parkinson Patienten nachgewiesen werden (Müller et al.

1999; Yasui et al. 1999; Kuhn et al. 1997; Kuhn et al. 1998; Allain et al. 1995). Im

Rahmen unserer Studie fand sich ebenfalls ein signifikanter Unterschied der

Homocysteinkonzentrationen bei Parkinson Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Unseres Wissens nach wurde bisher nur in einer Studie ein Vergleich L-Dopa-

behandelter Patienten mit unbehandelten Patienten durchgeführt. Es zeigte sich hierbei

ein signifikanter Unterschied der Homocysteinkonzentrationen zwischen den

unterschiedlich therapierten Patientengruppen, jedoch nicht zwischen unbehandelter

Patientengruppe und der Kontrollgruppe (Müller et al. 1999). Dies könnte für eine L-

Dopa induzierte Hyperhomocysteinämie im menschlichen Organismus sprechen.

Entsprechende Studien stehen noch aus.

Eine mögliche Ursache für eine Erhöhung der Homocysteinkonzentration ist eine

Punktmutation am Nukleotid 677 des Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR)

kodierenden Gens (siehe Einleitung). Im Zusammenhang mit dem Morbus Parkinson

fanden Harmon et al. 1997 zunächst beim Vergleich von 188 Parkinson Patienten mit

184 Kontrollen keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der heterozygoten,

homozygoten und normalen Form des MTHFR-Gens, ohne dabei die Homocystein-

konzentration zu berücksichtigen. Es zeigte sich hierbei eine Prävalenz der

homozygoten Form von 7,1% (Kontrollen) und 9,6% (Patienten) sowie der

heterozygoten Form von 47,3% (Kontrollen) und 42,5% (Patienten).

Diskussion

37

Im Gegensatz dazu konnten Kowa et al. 1999 eine signifikante Erhöhung der

homozygoten Form des MTHFR-Gens bei 169 Parkinson Patienten (15,4 %) im

Vergleich zu 187 Kontrollen (8,6 %) nachweisen. Generell wird von einer Prävalenz der

homozygoten Form in der Normalbevölkerung von 5-10% ausgegangen und der

heterozygoten Form von über 40% (Rozen 1996; Kang et al. 1988; Kang et al. 1991

siehe Einleitung;Welch et Loscalzo 1998 siehe Einleitung; Gussekloo et al. 1999).

Eine im August 2000 veröffentlichte japanische Studie von Yasui et al. zeigte einen

signifikanten Unterschied der Homocysteinkonzentrationen von 90 Parkinson Patienten

im Vergleich zu 50 Kontrollen auf. Jedoch fand sich kein signifikanter Unterschied

innerhalb der Patientengruppe mit unterschiedlichem Genotyp (homozygot, heterozygot

und normal). Im Kontrast dazu stehen die Ergebnisse unserer Studie, wobei ein

signifikanter Unterschied der Homocysteinkonzentration zwischen dem normalen

Genotyp und der heterozygoten Mutationsform (p = 0,025) sowie zwischen dem

normalen und dem homozygoten Genotyp (p = 0,022) innerhalb des Patientenkollektivs

beweisbar war. Des weiteren fällt bei der Studie von Yasui et al. eine auffallend hohe

Prävalenz der homozygoten Mutationsform von 23,33% beim Patientenkollektiv und

von 20,75% in der Kontrollgruppe auf. Dies könnte in einer Fehlschichtung des in die

Studie eingeschlossenen Kollektivs begründet sein, zumal andere Studien eine

Prävalenz des homozygoten Genotyps in der japanischen Bevölkerung zwischen 10,6 %

und 11 % aufzeigen (Nishio et al. 1996; Nakai et al. 2000).

Die Ergebnisse hinsichtlich der Homocysteinkonzentration der unterschiedlichen

Genotypen innerhalb der Parkinson Patientengruppe sowie im Vergleich der

heterozygoten und homozygoten Mutationsform zur Kontrollgruppe scheinen für eine

Abhängigkeit der Homocysteinkonzentration vom Genotyp zu sprechen. Des weiteren

fand sich insbesondere kein signifikanter Einfluß durch die tägliche L-Dopa Dosis,

Folsäure-, Vitamin B6-, oder Vitamin B12-Konzentration, welche auf den Homocystein-

Stoffwechsel Einfluß nehmen können.

Bereits 1997 konnten Markus et al. eine Abhängigkeit der Homocysteinkonzentration

zum homozygoten MTHFR-Genotyp in Interaktion mit der Folsäurekonzentration

Diskussion

38

finden. Es zeigte sich jedoch keine Assoziation zwischen cerebrovaskulären

Erkrankungen und dem Genotyp.

Jedoch konnte die homozygote Mutationsform mit einem erhöhten Risiko für eine

vaskulär bedingte Demenz in Einklang gebracht werden (Yoo, Choi et Kang 2000). Im

Gegensatz zu einer Studie von Spence et al. 1999, in der Homocystein und nicht der

MTHFR-Genotyp signifikant mit einer Carotisarteriosklerose assoziiert war, konnte

Bova et al. 1999 die hochgradige Arteria Carotisstenose mit dem MTHFR C677T Allel

in Verbindung bringen.

Eine rein vaskuläre Genese des Morbus Parkinson scheint eine Rarität zu sein. In groß

angelegten Studien konnte ein reines vaskuläres Parkinson Syndrom zwischen 0,9 und

1,6 % der Fälle festgestellt werden. Jedoch zeigten sich bei 20 bis 27 % der Fälle

zusätzliche zerebrovaskuläre Erkrankungen (Jellinger 1998; Horner 1997; Scigliano et

al. 1996). Des weiteren fand sich bei Parkinson Patienten in der

Todesursachenforschung im Vergleich zur Normalbevölkerung eine signifikante

Erhöhung von ischämischen Herzerkrankungen und cerebrovaskulären Erkrankungen

(Ben-Schlomo et Marmot 1995). Im Gegensatz dazu steht eine Studie von Struck et al.

1990, die weniger Schlaganfälle bei Parkinson Patienten aufzeigen konnte.

4.1. Schlußfolgerung

Aufgrund der hier aufgeführten Studien scheint sich ein erhöhtes cerebrovaskuläres

Risiko bei Patienten mit Morbus Parkinson aufgrund verschiedenster Mechanismen

abzuzeichnen, welches durchaus auch Niederschlag in der Krankheitsprognose findet.

Ursächlich hierfür scheint eine Hyperhomocysteinämie zu sein, welche ebenfalls durch

die Ergebnisse unserer Untersuchung gestützt mit dem Morbus Parkinson assoziiert zu

sein scheint. Diese erhöhte Homocysteinkonzentration kann neben nicht hereditären

Ursachen (z. B. Vitaminmangelerscheinungen, medikamenteninduziert), wobei hier

gerade beim Morbus Parkinson der L-Dopa-Therapie ein besonderer Stellenwert zuteil

wird, durch hereditäre Ursachen (z. B. Cystathionin-β-Synthetase-Mangel; 5, 10

Methyl-Tetrahydrofolat-Reduktase-Mangel) bedingt sein. Eine in der Bevölkerung mit

Diskussion

39

bis zu 50% weit verbreitete Punktmutation am Nukleotid 677 des MTHF codierenden

Gens scheint bei Morbus Parkinson Patienten gehäuft aufzutreten.

Unsere Ergebnisse zeigen eine signifikante Assoziation der erhöhten Homo-

cysteinkonzentration sowohl am homozygoten, als auch am heterozygoten Genotyp bei

Parkinson Patienten im Vergleich zu Patienten mit normalem Genotyp und zur

Kontrollgruppe. Dies läßt auf einen direkten Zusammenhang der

Hyperhomocysteinämie bei Parkinson Patienten mit dem Auftreten des heterozygoten

und homozygoten MTHFR-Genotyps schließen. Weitere Studien diesbezüglich stehen

noch aus.

Aufgrund der im Tierversuch nachgewiesenen Erhöhung der Homocysteinkonzentration

durch eine L-Dopa-Medikation und der in unserer Arbeit signifikant nachgewiesenen

Hyperhomocysteinämie bei hetero- und homozygotem Genotyp des MTHFR

kodierenden Gens bei Parkinson Patienten ist ein additiver Effekt bei L-Dopa

behandelten Parkinson Patienten nachvollziehenbar und könnte das erhöhte

cardiovaskuläre Risiko bei Parkinson Patienten erklären. Interessant wären hierbei

Untersuchungen hinsichtlich der Homocysteinkonzentration vor und nach Beginn einer

L-Dopa-Therapie.

Auf der anderen Seite können sowohl L-Dopa, als auch Homocystein neurodegenerativ

wirken und so zu einer Progredienz der Erkrankung beitragen.

Welche Rolle Homocystein bei der Ätiologie des Morbus Parkinson einnimmt bleibt

unklar und müßte in weiteren Studien noch näher untersucht werden.

Falls die Ergebnisse dieser Studie durch weitere, nachfolgende Untersuchungen

bestätigt werden können, müßte vor Einleitung einer L-Dopa Medikation eine

Bestimmung der Homocysteinkonzentration im Serum erfolgen, um mögliche

cardiovaskuläre und neurodegenerative Komplikationen einer durch L-Dopa induzierten

Hyperhomocysteinämie vorzubeugen und eine eventuell vorbestehende Erhöhung der

Homocysteinkonzentration auszuschließen.

Falls eine Erhöhung der Homocysteinkonzentration besteht sollte dann eine

Genotypisierung der MTHFR durchgeführt werden, aufgrund der weiten Verbreitung

Diskussion

40

der heterozygoten und homozygoten Frequenz der MTHFR C677T-Mutation von über

50 % in der Bevölkerung. Dies sollte in Kombination mit einer Bestimmung der

Vitamine B6, B12 und Folsäure erfolgen, um ein mögliches Vitaminmangelsyndrom als

Ursache für eine Hyperhomocysteinämie auszuschließen.

Falls sich hier erniedrigte Werte ergeben, sollte zunächst eine Vitaminsubstitution mit

anschließender erneuter Homocysteinbestimmung durchgeführt werden, bevor eine L-

Dopa-Therapie anschließt.

In dem Falle einer homozygoten oder heterozygoten Mutation sollte die

Homocysteinkonzentration kontinuierlich, nach klinischer Applikation von L-Dopa,

kontrolliert werden, um einer chronischen Toxizität durch erhöhte Homocysteinwerte

durch synergistische Effekte der L-Dopa-Medikation und der homozygoten und

heterozygoten Mutation vorzubeugen.

Falls im Krankheitsverlauf eine L-Dopa-Therapie unumgänglich ist und weiterhin

erhöhte Plasmakonzentrationen des Homocysteins zu erwarten sind muß dies auch

therapeutische Konsequenzen nach sich ziehen.

Eine Erniedrigung der Homocysteinkonzentration könnte aufgrund der

Stoffwechselwege durch eine Erhöhung der Substratkonzentration oder vermehrte

Rekrutierung alternativer Stoffwechselwege und Verminderung der

Homocysteinsynthese erreicht werden (Kang 1996).

Die Effizienz einer Homocystein-senkenden Therapie konnte bereits am Beispiel des

angeborenen Neuralrohrdefektes bewiesen werden (Copp 1998; Wald et al. 1998;

Schorah 1998). Hierbei konnte eine tägliche Medikation mit 4 mg Folat eine Reduktion

der Neuralrohrdefekte um 70 % erreichen. 30 % zeigten sich nicht sensibel auf die

Folsäuretherapie. Eine tägliche Einnahme von 437 µg Folat resultierte in eine 21%igen

Reduktion der Homocysteinkonzentration (Riddell et al. 2000). Eine sichere Prävention

der Neuralrohrdefekte wird bei einer täglichen Einnahme von 400 µg angenommen

(Wald et al. 1998; Schorah 1998). Wie eine amerikanische Studie mit einer

folsäureangereicherten Müslipräparation gezeigt hat, bringt die tägliche Zufuhr von 600

Diskussion

41

µg nicht mehr als die Einnahme von 400 µg. Jedoch scheint die Einnahme von 200 µg

nicht ausreichend zur adäquaten Homocysteinsenkung zu sein (Malinow et al. 1998).

Durch eine konsequente Einnahme von 400 µg Folsäure und 1 mg Vitamin B12 kann ein

erhöhter Homocysteinspiegel normalisiert werden (Berlit 2000). Bei Einnahme von 500

µg Folsäure und 50 µg Vitamin B12 ließ sich der Homocysteinspiegel um 3-6 µmol/l

senken, was mit einer Risikoreduktion für eine koronare Herzerkrankung um 25 %

einhergeht (Sander 2000).

In einer Doppelblindstudie, die 285 älteren Personen einschloß, zeigte sich nach

8maliger Applikation von 1 mg Vitamin B12, 5 mg Vitamin B6 und 1,1 mg Folsäure

intramuskulär innerhalb von 3 Wochen bei 92% der behandelten Gruppe eine völlige

Normalisierung des Homocysteinwertes (in der Placebogruppe 20% normwertig)

(Naurath et al. 1995).

Bei einem genetischen Mangel von MTHFR zeigte sich jedoch die Therapie mittels

Folsäure, Vitamin B12 und Vitamin B6 nicht signifikant erfolgreich. Aufgrund dessen

wurde bereits seit 1972 erfolgreich in solchen Fällen Betain eingesetzt (Kishi et al.

1994). Betain ist ein alternativer Methylgruppendonor für die Umwandlung von

Homocystein zu Methionin über die Betain-Homocystein-Methyltransferase, welche

weder Folat noch Methylcobalamin als Coenzym benötigt.

In mehreren Einzelfallstudien konnte gezeigt werden, daß Betain eine Kompensation der

durch die MTHFR-Genmutation bedingten Hyperhomocysteinämie erbringen konnte.

Die SAM-Konzentration konnte dabei gesteigert, und die SAH-Konzentration gesenkt

werden und somit bessere Konditionen für Methylierungsreaktionen geschaffen werden.

Eine durch L-Dopa bedingte Verminderung von SAM und Erhöhung von SAH könnte

so eventuell kompensiert werden. Benötigt wurden hierbei Betaindosen zwischen 5 bis

20 g täglich. Bei keiner der Fallstudien zeigten sich irgendwelche Nebenwirkungen der

Betainmedikation (Hyland et al. 1988; Kishi et al. 1994; Bottiglieri et Hyland 1994).

Studien mit groß angelegten Patientenkollektiven fehlen zum jetzigen Zeitpunkt noch.

Diskussion

42

Der Abbau von L-Dopa über die Catechol-O-Methyltransferase (COMT), bei dem SAM

zu SAH umgewandelt wird und so ebenfalls eine Erhöhung des Homocysteins bewirken

kann, könnte über COMT-Hemmer abgefangen werden (Kuhn et Müller 1997). In vitro

konnte eine Verminderung der Toxizität von L-Dopa durch COMT-Hemmer

nachgewiesen werden (Storch et al. 2000).

Jedoch werden COMT-Hemmer zur Zeit noch relativ kontrovers diskutiert aufgrund

möglicher toxischer Nebenwirkungen (Kuhn 1998; Müller et al. 1993) und finden

deshalb erst bei Patienten in späten Krankheitsstadien hauptsächlich Anwendung.

Grundlage dieser möglichen therapeutischen Schritte einer Hyperhomocysteinämie

mittels Folsäure, Vitamin B6, Vitamin B12, Betain oder COMT-Hemmern ist, daß vor

Beginn einer L-Dopa-Therapie alle weiteren therapeutischen Optionen ausgeschöpft

werden, um die L-Dopa-Therapie so lange wie möglich vermeiden zu können.

Neuere Therapieoptionen könnten die Wirkung von L-Dopa verstärken, so daß eine

Dosis-Reduktion möglich oder zumindest eine weitere Erhöhung der L-Dopa-Dosis

vermeidbar wäre. In erster Linie wäre hier eine zusätzliche Medikation mit potentiellen

NMDA-Antagonisten wie z. B. Budipin und Amantadin zu überdenken (Kuhn et Müller

1997; Luginger et al. 2000).

Falls sich jedoch trotz Ausschöpfung aller therapeutischen Möglichkeiten einer

homocysteinsenkenden Therapie im Verlauf eine persistierende Hyperhomocysteinämie

zeigt, ist unter Abwägung des Benefits der L-Dopa-Therapie auf das Parkinsonsyndrom

gegen mögliche schwerwiegende Nebenwirkungen einer Hyperhomocysteinämie

gegebenenfalls auf eine L-Dopa-Therapie zu verzichten.

Literaturverzeichnis

43

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Danksagung

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6. Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. Kuhn für die Überlassung des Themas und die exzellente

Betreuung.

Herrn Priv.-Doz. Dr. Thomas Müller für die Unterstützung in organisatorischen Fragen

und statistischen Problemen.

Den vielen Parkinsonpatienten, die durch ihre Bereitschaft zur Teilnahme an der Studie

diese Arbeit erst ermöglicht haben.

Den Mitarbeitern des Labor Eberhard. Maria, Helga, Ferdinand und Dragica Hummel.

Angelika Basu

Lebenslauf

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7. Lebenslauf

28.01.1974 Geburt als drittes Kind des Ehepaars

Dragica und Ferdinand Hummel in Berlin

1980-1984 Grundschule an der Josefinenstr. in Bochum

1984-1993 Gymnasium am Ostring in Bochum

Mai 1993 allgemeine Hochschulreife

Oktober 1993 Beginn des Medizinstudiums an der Ruhr-Universität-

Bochum

September 1995 Physikum

September 1996 1. Staatsexamen

September 1998 2. Staatsexamen

Oktober 1998 Beginn des Praktischen Jahres im St. Josef-Hospital

(Universitätsklinik der Ruhr-Universität-Bochum)

November 1999 3. Staatsexamen

Seit 15. November 1999 Tätigkeit als Arzt im Praktikum in der chirurgischen

Klinik des St. Josef-Hospitals (Universitätsklinik der

Ruhr-Universität-Bochum) unter der Leitung von Prof. Dr.

med. V. Zumtobel

Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Polymorphismus ... · Abstract Hummel Thomas...

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