meteriales y metologias para el analisis de aminoacidos

7/21/2019 meteriales y metologias para el analisis de aminoacidos

1/22

50

CAPTULO 4. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Material vegetal

Se analizaron 25 variedades de maz de distintos colores proporcionadas por la

fundacin PRODUCE del estado de Puebla. Las muestras eran originarias de diferentes

regiones del estado de Puebla y fueron cultivadas durantes los ciclos agrcolas de

primavera-verano de 2002 y 2003 bajo diferentes modalidades de riego.

Tabla 4.1. Descripcin de las variedades analizadas

Muestra Municipio Comunida Modalida Varieda CicloAgrcola

1*a XochitlnTodos Santos

XochitlnTodos Santos

Riego Pioneer 32R21 Prim-Ver-03

2*a Tecamachalco Rancho SanIsidro





Riego Pioneer 32J55 Prim-Ver-03

5*a XochitlnTodos Santos

XochitlnTodos Santos


6a Mazapiltepec Rinconada Temporal Aspros AS-600(Amarillozanahoria)

Prim-Ver-02

7a Tlacotepec deBenito Jurez

Rancho Rojas Riego Pioneer 32R21 Prim-Ver-03

8a Mazapiltepec Rinconada Temporal CriolloAmarillo deMazapiltepec

Prim-Ver-02

9a Mazapiltepec Rinconada Temporal CriolloAmarillo deTlachichuca

Prim-Ver-02

10a Tepanco deLpez

San Cristbal Riego Hartz Seed Z-806

Prim-Ver-02

11a Tlacotepec deBenito Jurez

Rancho Rojas Riego Pioneer 3099 Prim-Ver-02

12a Tlacotepec de

Benito Jurez

Rancho Rojas Riego Pioneer 32J55 Prim-Ver-02


2/22

51

* Estas muestras llegaron frescas, se liofilizaron y se mantuvieron en refrigeracin para evitar la prdidade pigmentosaVariedades amarillas

b Variedades negras -azulescVariedades rojas

13a Mazapiltepec Rinconada Temporal CriolloAmarillo deOcotenco (Prod:Luz Alvarado)

Prim-Ver-03

14*a Oriental Oriental Temporal CriolloAmarillo deTlachichuca(donado porSDR)

Prim-Ver-03

15b Tecamachalco Xochimilco Riego Criollo Azul deXochimilco

Prim-Ver-03

16b Mazapiltepec Rinconada Temporal Criollo negro deMazapiltepec

Prim-Ver-03

17a Oriental Oriental Temporal CriolloAmarillo deOriental

Prim-Ver-03

18a Libres NuevoMxico

Temporal CriolloAmarillo deNuevo Mxico

Prim-Ver-03

19c San FelipeTeotlalzingo

San FelipeTeotlalzingo

Temporal Criollo Rojo deSan FelipeTeotlalzingo

Prim-Ver-03

20b San Felipe

Teotlalzingo

San Felipe

Teotlalzingo

Temporal Criollo Azul de

San FelipeTeotlalzingo(2)

Prim-Ver-03

21c Acatzingo San SebastinTeteles

Temporal Criollo rojo deSan SebastinTeteles(2)

Prim-Ver-03

22c Acatzingo San SebastinTeteles

Temporal Criollo rojo deSan SebastinTeteles (1)

Prim-Ver-03

23b San FelipeTeotlalzingo

San FelipeTeotlalzingo

Temporal Criollo Azul deSan FelipeTeotlalzingo (1)

Prim-Ver-03

24

b

Los Reyes deJurez Virreyes deJurez Temporal Criollo Azul deVirreyes deJurez

Prim-Ver-03

25b Acatzingo San SebastinTeteles

Temporal Criollo Azul deSan SebastinTeteles

Prim-Ver-03


3/22

52

4.2. Anlisis proximal

Todos los anlisis proximales se llevaron a cabo de acuerdo con la metodologa

descrita en las Normas Mexicanas vigentes para cada caso en el orden mostrado a

continuacin:

Figura 4.1. Anlsis proximal

4.2.1. Humedad

El contenido de humedad en las muestras de maz se determin siguiendo el

procedimiento reportado en la Norma NMX-F-83-1986. En dicha Norma, se entiende por

humedad la prdida en peso que sufre un alimento al someterlo a las condiciones de tiempo

y temperatura prescritos.

Reactivos, aparatos y equipo

-

Balanza analtica con sensibilidad de 0.1 mg- Crisoles de porcelana a peso constante

- Horno de secado con control de temperatura

- Desecador

- Pinzas para crisol

Humedad

Grasas Protenas

Fibra

Cenizas


4/22

53

Procedimiento

Se pesaron 10 g de muestra pulverizada en un crisol previamente tarado y secolocaron en el horno de secado a 100 C durante 24 horas. El crisol se transfiri a un

desecador, se dej enfriar a temperatura ambiente y se pes. Este procedimiento se repiti

hasta obtener peso constante.

Nota: A las muestras 1-5 y 14 no se les midi humedad ya que fueron liofilizadas

inmediatamente despus de que llegaron.

Clculos

El porcentaje de humedad se calcul de acuerdo a la frmula que se presenta a

continuacin:

100)(

humedadde%2

1

=

P

PP

Donde:

P = peso del recipiente con la muestra hmeda en gramos

P1= peso del recipiente con la muestra seca

P2= peso de la muestra en gramos

4.2.2. Cenizas

Las cenizas son el residuo inorgnico que queda despus de la incineracin de la

materia orgnica. Estos residuos estn compuestos de xidos y sales que contienen aniones,

tales como fosfatos, cloruros, sulfatos y cationes como sodio, potasio, calcio, magnesio,

hierro y manganeso. La metodologa que se sigui est descrita en la Norma NMX-F-066-

S-1978.


5/22

54


-

Crisoles de porcelana a peso constante- Pinzas para crisol

- Desecador

- Mufla

- Balanza analtica con sensibilidad de 0.1 mg

- cido ntrico concentrado

Procedimiento

En un crisol a peso constante se pusieron 20 g de muestra pulverizada. En vez de

colocar el crisol con muestra en una parrilla para quemar lentamente el material, el mtodo

se modific dejando toda la noche la muestra con 20 mL de cido ntrico. Al da siguiente

el crisol se llev a la mufla para calcinarla completamente a 600 C durante 24 horas,

despus de las que se dej enfriar en la mufla y se transfiri a un desecador para que se

enfriara completamente y as determinar la masa del crisol con cenizas.

Clculos

100M

p)-(Pcenizasde% =

Donde:

P = masa del crisol con las cenizas en gramos

p = masa del crisol vaco en gramos

M = masa de la muestra en gramos


6/22

55

4.2.3. Grasa cruda (extracto etreo)

Grasa cruda es el trmino que se emplea para referirse a la mezcla de materiales

liposolubles presentes en una muestra. stos pueden incluir mono, di y triglicridos,

fosfolpidos, esteroides, cidos grasos libres, vitaminas liposolubles, carotenos, clorofilas,

etc. Para la determinacin se sigui el procedimiento descrito en la Norma NMX-F089-S-

1978.


- ter etlico anhidro

- Extractor Soxhlet

- Cartuchos de extraccin de tamao adecuado para el extractor

- Reostato y manta de calentamiento

- Estufa (100-110C) con termostato y termmetro

- Balanza analtica con sensibilidad de 0.1 mg

- Matraz de fondo plano a peso constante

Procedimiento

Se pesaron 4g de muestra seca y pulverizada en un filtro Whatman no. 42, que se

dobla y se introduce en el cartucho de extraccin. El cartucho se coloc dentro del extractor

Soxhlet.


7/22

56

Se hizo pasar agua a 10C por el refrigerante. En la parte inferior se coloc un

matraz de fondo plano con 100 mL de ter etlico anhidro y se calent hasta obtener una

frecuencia de aproximadamente 2 gotas por segundo.

La extraccin se efectu por 6 horas, despus de las cuales se suspendi el

calentamiento, se evapor el ter del matraz y se sec a 100C hasta que alcanz un peso

constante.

Clculos

100p-P

crudagrasade% =

Donde:

P = Masa en gramos del matraz con grasa

p = Masa en gramos del matraz sin grasa

M = Masa en gramos de la muestra

4.2.4. Nitrgeno total (protenas totales)

La Norma que describe la determinacin de protenas en productos alimenticios esla NMX-F-068-S-1980. El procedimiento se basa en el mtodo de Kjeldahl, en el cual el

nitrgeno orgnico se convierte a sales de amonio, que se libera mediante la adicin de una

base no voltil. Despus de la destilacin, el amonio se determina por titulacin.

Para el anlisis de las muestras se hizo una modificacin de la norma citada

anteriormente utilizando un aparato de digestin Digesdhal para la digestin cida de la


8/22

57

muestra (micro Kjeldahl) y el mtodo de Nessler para la cuantificacin del nitrgeno en un

espectrmetro HACH DR/4000 como se describe a continuacin.


- Espectrofotmetro Hach DR/4000

- Aparato de digestin Digesdhal

- Matraces de digestin Digesdhal secos

- Columna de fraccionamiento conectada a una bomba aspiradora

- Acido sulfrico concentrado

- Perxido de hidrgeno al 30%

- Lentejas de hidrxido de sodio

- Probetas graduadas con tapn de 25 mL

- Indicador TKN

- Hidrxido de potasio 1 N

- Estabilizador mineral

- Alcohol polivinlico

-

Reactivo de Nessler

Digestin Hach

Se transfirieron 0.5 g de muestra seca y pulverizada en una matraz de digestin

Digesdhal. El aparato para digestin se ajust a una temperatura de 440 C y se encendi la

bomba aspiradora. Una vez que se tuvo la temperatura deseada, al matraz con la muestra se

le agregaron 4 mL de H2SO4concentrado y se coloc en el aparato seguido de la columnade fraccionamiento para dejarlo ebullir por 4 minutos. Pasado este tiempo se agregaron,

mediante un goteo lento, 15 mL de H2O2al 30%. Despus de la adicin se calent por un

minuto mas para eliminar el exceso de perxido, se sac del calentador y se dejo enfriar a

temperatura ambiente antes de remover la columna de fraccionamiento del digestor.


9/22

58

Una vez a temperatura ambiente, las muestras se aforaron a 25 mL con agua

desionizada y el pH se ajust a 2.5 usando lentejas de NaOH.

Se digiri una cantidad de agua igual a la de la muestra para utilizarla como blanco

para el anlisis.

Anlisis

La cuantificacin del nitrgeno total presente en las muestras se llevo a cabo en un

espectrofotmetro Hach DR/4000.

Se colocaron 1 mL de muestra y 1 mL del blanco en diferentes probetas graduadas.

A cada una se le adicion una gota de indicador TKN y posteriormente gotas de KOH 1N

hasta que apareci un color azul permanente. El volumen se ajust a 20 mL con agua

desionizada, se agregaron 3 gotas de estabilizador mineral a cada probeta y se mezclaron

varias veces por inversin. Posteriormente se adicionaron 3 gotas de alcohol polivinlico, se

mezclaron y se ajust el volumen a 25 mL. Finalmente, se agreg 1 mL del reactivo de

Nessler a cada pipeta y se esperaron 2 minutos antes de medir la absorbancia en el

espectrofotmetro a 460 nm, con el programa 2410 del Hach DR/4000 prediseado para

medir nitrgeno total.

Clculos

Para obtener la concentracin de nitrgeno (en partes por milln) a partir de la

lectura del espectrofotmetro en cada muestra se emplea la siguiente frmula:

CB

A75Ndeppm

=


10/22

59

Donde:

A= lectura del espectrofotmetro en mg/L

B= gramos de muestra utilizados para la digestin (0.5 g)

C= mililitros de la muestra digerida tomados para el anlisis (1 mL)

Para calcular el porcentaje de nitrgeno en cada muestra los resultados expresados

en partes por milln se multiplicaron por 1*10-4para expresarlos en trminos de gramos de

nitrgeno por cada 100 gramos de muestra.

El contenido de nitrgeno en diferentes protenas es aproximadamente de 16% por

lo que multiplicando el porcentaje de nitrgeno obtenido por un factor de 6.25 se obtiene la

cantidad de protenas presentes en los granos de maz.

4.2.5. Fibra cruda

Con este anlisis se determinan las sustancias orgnicas libres de grasa en insolubles

en medio cido y alcalino. La metodologa se encuentra descrita en la Norma NMX-Y-094-

SCFI-2001. En sta se define a la fibra cruda como la prdida por ignicin del residuo seco

remanente despus de la digestin de la muestra con solucin de cido sulfrico al 1.25% e

hidrxido de sodio al 1.25% bajo las condiciones especficas de la prueba.


- Solucin de cido sulfrico al 1.25%

- Solucin del hidrxido de sodio al 1.25%

- Agua hirviendo

- Matraces de bola de 500 mL


11/22

60

- Papel filtro Whatman no. 41

- Horno de secado con control de temperatura

-

Mufla- Desecador

- Refrigerante

- Restato y manta de calentamiento

- Embudo Buchner

- Matraz Kitasato

- Papel filtro Whatman no. 41

- Crisol de porcelana a peso constante

Procedimiento

Se pesaron 2 g de muestra pulverizada, seca y desengrasada, se colocaron en un

matraz de bola de 500 mL y se agregaron 100 mL de cido sulfrico al 1.25 % y perlas de

ebullicin. Esta mezcla se puso a ebullicin con reflujo durante media hora, despus de la

cual la solucin se filtr al vaco y se enjuag con agua hirviendo hasta que el agua de

lavado alcanz pH neutro. El residuo se transfiri al matraz de bola y se adicionaron 100

mL de hidrxido de sodio al 1.25% y se puso a ebullicin con reflujo durante media hora.

Nuevamente se filtr la solucin (a travs de un papel filtro pesado previamente) y se

enjuag con 10 mL de cido sulfrico al 1.25% y luego con agua hirviendo hasta que el

agua de lavado alcanz un pH neutro. Este residuo, junto con el papel filtro, se coloc en un

crisol a peso constante y se dej secar en la estufa a 130 C durante 2 horas. El crisol con la

muestra se dej enfriar en un desecador y se pes. Finalmente, se calcin en la mufladurante 30 minutos a 600 C, se dej enfriar y se pes.

Clculos

El porcentaje de fibra de la muestra se obtuvo con la siguiente frmula


12/22

61

100M

papeldelpesoMMFibrade% 21

=

Donde:

M = peso de la muestra en gramos

M1= peso de la muestra, el papel y el crisol despus del secado en la estufa en gramos

M2= peso del crisol con las cenizas en gramos


13/22

62

4.3. Anlisis de Xantofilas

4.3.1. Extraccin


- Metanol

- Hexano

- Hidroxitolueno butilado (BHT)

-

Papel filtro Whatman no. 41- Centrfuga

Procedimiento

El procedimiento de extraccin de xantofilas empleado es una modificacin del

mtodo descrito por Kurilich y Juvik (1999). Todos los anlisis se realizaron por duplicado.

El material se recubri de papel aluminio para mantener a las muestras en la oscuridad

durante todo el proceso y se agreg hidroxitolueno butilado (BHT) al 0.1% como

antioxidante a los disolventes utilizados.

Las muestras se pulverizaron hasta obtener partculas finas. Se tomaron 0.5 g de

cada muestras y se dejaron en 25 mL de metanol con 0.1% de BHT en la oscuridad y con

una agitacin ligera durante 48 horas. Despus de este tiempo las muestras se filtraron con

un embudo Buchner a travs de un papel filtro Whatman no. 41 y los pigmentos se

transfirieron a hexano como se describe a continuacin:

En tubos de centrfuga se virtieron 3 mL de hexano con 0.1% de BHT, se agregaron

3 mL del extracto metanlico y 1 mL de agua desionizada, se mezclaron con un vortex y se

centrifugaron durante 5 minutos. En la capa superior queda la fraccin con hexano y sta se

coloc en un vial por separado y la capa inferior se extrajo dos veces ms con hexano. Las


14/22

63

fracciones combinadas de hexano se concentraron en un rotavapor a 40 C y con presin

reducida para poder ser reconstituidas en la fase mvil.

4.3.2. Anlisis

Reactivos, Aparatos y Equipo

- Metanol grado HPLC

- Cloruro de metileno grado HPLC

-

Acetonitrilo grado HPLC- Tretilamina

- BHT

- Estndar de lutena

- Estndar de zeaxantina

- Cromatgrafo de lquidos

- Columna Waters Nova-Pak C18(5 m, 4.6 *250 mm)

- Guarda columna Waters Nova-Pak C18(4 m, 60 )

Procedimiento

Las muestras se reconstituyeron en 3 mL de acetonitrilo: metanol: cloruro de

metileno (75:20:5), 0.05% de trietilamina y 0.1% de BHT y se inyectaron por duplicado en

el cromatgrafo de lquidos. Las xantofilas cuantificadas fueron lutena y zeaxantina.

El anlisis de las muestras se llev a cabo en un Cromatgrafo de Lquidos

VARIAN que cuenta con una bomba ternaria modelo 9012; detector de longitud de onda

variable modelo 9050 y detector de fluorescencia ProStar. Se utiliz una columna Waters

Nova-Pak C18 (5 m, 4.6 *250 mm). La fase mvil estaba compuesta por acetonitrilo:

metanol: cloruro de metileno 75:20:5 (v/v/v). El flujo fue de 0.7 mL/min a 30 C. La

absorbancia se midi a 450 nm. Con estas condiciones el tiempo de retencin para la

lutena es de 7.503 min y para la zeaxantina de 7.932 min.


15/22

64

Para poder cuantificar los resultados se elaboraron curvas de calibracin con

estndares de lutena y zeaxantina proporcionadas por Roche Mxico S.A. Se manejaron 5concentraciones diferentes para cada uno, las cuales se presentan en la tabla 4.2:

Tabla 4.2. Concentraciones de lutena y zeaxantina para elaborar la curva de calibracin(g/mL)

Estndar Lutena Zeaxantina1 30.00 10.002 15.00 5.003 7.50 2.50

4 3.75 1.255 0.93 0.31

Anlisis estadstico

Se hizo un anlisis de varianza para determinar si haba diferencias significativas en

cuanto al contenido de cada pigmento en las diferentes variedades estudiadas utilizando el

procedimiento ANOVA del programa para anlisis estadstico SAS. Las concentraciones

de compuestos fueron consideradas diferentes significativamente entre cada muestra

cuando p < 0.05.

Con el mismo software se obtuvo la diferencia mnima significativa entre las medias

realizando una prueba de Tuckey, la cual sirve para saber entre qu muestras existen estas

diferencias.

Para averiguar la relacin entre el contenido de pigmento y el color del maz, lamodalidad de riego y el ciclo agrcola en el que fueron cultivadas las diferentes variedades

de maz se empleo el procedimiento GLM del mismo software y tambin se compararon las

medias con la prueba de Tukey.


16/22

65

4.4. Anlisis de Aminocidos

Se cuantificaron los aminocidos lisina, isoleucina, metionina y triptofano. Los

primeros 3 se extrajeron de acuerdo con el mtodo oficial 994.12 de la AOAC para el

anlisis de aminocidos en alimentos (hidrlisis cida y preoxidacin con cido perfrmico

antes de la hidrlisis). Mientras que para el triptofano (hidrlisis alcalina) se sigui la

metodologa reportada por Stocchi, et al. (1985).

4.4.1. Hidrlisis cida


- cido clorhdrico 6 N

- Citrato de sodio 0.2 N pH 2.2

- Nitrgeno de alta pureza

- Estndares de lisina, metionina, isoleucina y triptofano

- Refrigerantes

- Reostatos

- Rotavapor

Procedimiento

Se pesaron 300 mg de muestra pulverizada, desengrasada y seca, se colocaron en un

matraz de dos bocas de 500 mL y se agregaron 300 mL de HCl 6 N. El matraz se conect a

un refrigerante y se le hizo pasar una corriente de nitrgeno bajo la superficie del cido. Lamuestra se puso a reflujo durante 24 horas manteniendo el burbujeo de nitrgeno, despus

de las cuales se dej enfriar a temperatura ambiente y se filtro al vaco a travs de un papel

filtro Whatman no. 2. Posteriormente, el hidrolizado se evapor hasta sequedad en un

rotavapor a 40 C a presin reducida. El concentrado se lav con agua y se reevapor dos

veces para eliminar el cido, se disolvi en un buffer de citrato de sodio pH 2.2 y su

volumen se ajusto a 25 mL con el mismo buffer.


17/22

66

Por otro lado se hidroliz bajo las mismas condiciones un estndar que contena 3

mg de cada aminocido a analizar para poder calcular posteriormente su porcentaje derecuperacin.

Los hidrolizados disueltos en el buffer de citrato de sodio se mantuvieron a 4 C

hasta el momento de su anlisis.

4.4.2. Oxidacin con cido Perfrmico e Hidrlisis cida

Con este mtodo los aminocidos que contienen azufre son oxidados para poder ser

liberados de las protenas y as poder ser extrados eficientemente mediante la hidrlisis

cida. La cisteina es oxidada a cido cistico y la metionina a metionina sulfona.


- cido perfrmico (Se mezclan 72 mL de cido frmico al 100% con 1.5 mL de

metanol y 7.5 mL de perxido de hidrgeno al 30% y se deja reposar a temperatura

ambiente por dos horas)

- cido clorhdrico 6 N


- Estndares de lisina, isoleucina, metionina y triptofano


- Refrigerantes

-

Reostatos

- Rotavapor

Procedimiento

Se pesaron 300 mg de muestra pulverizada, desengrasada y seca y se colocaron en

un matraz de bola con unas gotas de cido perfrmico. La mezcla se enfri en hielo por 30


18/22

67

minutos y se agregaron otros 25 mL de cido perfrmico dejndola esta vez toda la noche a

4C.

Al da siguiente se agregaron 25 mL de agua y 2 mL de cido bromhdrico

mezclando bien. La mezcla se evapor a sequedad para eliminar el cido en un rotavapor.

Donde se recibe el cido se coloc un poco de NaOH para neutralizarlo. Una vez

concentrada la muestra se sigui la misma metodologa descrita anteriormente para la

hidrlisis cida.

A un estndar con 3 mg de cada uno de los aminocidos a cuantificar se le dio el

mismo tratamiento para evaluar su porcentaje de recuperacin.

4.4.3. Hidrlisis Alcalina

Como el triptofano se degrada durante la hidrlisis cida, se recomienda la hidrlisis

alcalina para extraerlo.

Reactivos, aparato y equipo

- Solucin de hidrxido de sodio 4.2 M (burbujeada con nitrgeno toda la noche)

- Octanol


- Bomba de vaco

- Centrfuga

- Viales de vidrio para sellar al vaco


- Hielo seco

- Acetona

- Estndar de triptofano


19/22

68

Procedimiento

Se pesaron 300 mg de muestra pulverizada, desengrasada y seca y se pusieron en unvial. Se agregaron 10 mL de hidrxido de sodio 4.2 M y 3 gotas de octanol. Esta mezcla se

congel en hielo seco, mientras que el vial se evacu y se sell. Posteriormente se coloc

en un recipiente con agua a temperatura ambiente hasta que se fundi la muestra. El vial se

meti al horno a 110 C durante 20 horas. Pasado este tiempo, se dej enfriar y se abri.

El hidrolizado se transfiri a un matraz lavando dos veces con 1 mL de citrato de

sodio pH 4.25 y el pH se ajusto a 4.25 con cido clorhdrico. El volumen se ajusto a 25 mL

con agua, la solucin se centrifug durante 30 minutos, se filtr con un embudo Buchner a

travs de un papel filtro Whatman no. 41 y se guardo a 4C hasta su anlisis.

A un estndar con 10 mg de triptofano se le dio el mismo tratamiento para evaluar

su porcentaje de recuperacin.

4.4.4. Anlisis

Todas las muestras, independientemente de su procedimiento de extraccin, se

derivatizaron con ortoftalaldehdo y se inyectaron para su cuantificacin en el cromatgrafo

de lquidos como se describe a continuacin.

Materiales, reactivos y aparatos

-

Solucin de o- ftalaldehdo (OPA) lista para su uso de Pierce

- Metanol grado HPLC

- Tetrahidrofurano grado HPLC

- Acetato de sodio

- Fosfato de sodio

- cido actico

- Estndar de lisina


20/22

69

- Estndar de isoleucina

- Estndar de metionina

-

Estndar de triptofano- Cromatgrafo de lquidos

- Columna XTerra RP18(5 m, 4.6*250 mm)

Procedimiento

Antes de su derivatizacin se hizo una dilucin 1:3 de los hidrolizados con buffer de

citrato de sodio. De sta se tomaron 2 L, se mezclaron con 200 L de la solucin de OPA

y se dej reaccionar por 1 minuto antes de inyectar al HPLC.

Los aminocidos derivatizados se separaron con una columna XTerra RP 18(5 m,

4.6*250 mm) y se detectaron por fluorescencia a una longitud de onda de excitacin de 250

nm y una de emisin de 480 nm.

La fase mvil estaba compuesta de 2 eluyentes:

- A: Metanol al 65%

- B: Acetato de sodio 50 mM, fosfato de sodio dibsico 50 mM, 25 mM de cido

actico, 0.25 M de tetrahidrofurano y 0.49 M de metanol; pH 7.5

La separacin se llev a cabo como se describe a continuacin:

Tabla 4.3. Programa de elusin para la separacin de aminocidos

Tiempo (min) % A Flujo0 20 0.85 28 0.835 58 0.840 75 0.856 95 0.8

56.1 95 1.060 96 1.061 100 1.068 100 1.0


21/22

70

Para poder evaluar el porcentaje de recuperacin y calcular la cantidad de

aminocidos se elaboraron curvas de calibracin para lisina, isoleucina, triptofano,metionina y metionina sulfona. Las concentraciones empleadas para elaborarlas se

presentan en la tabla 4.4.

Tabla 4.4. Concentracin de aminocidos para elaborar las curvas de calibracin (g/mL)

Estndar Metionina Triptofano Isoleucina Lisina Metioninasulfona

1 0.4000 0.4000 0.4000 0.8000 0.50002 0.2500 0.2500 0.2500 0.5000 0.2500

3 0.1250 0.1250 0.1250 0.2500 0.12504 0.0625 0.0625 0.0625 0.1250 0.0625

Clculos

El porcentaje de recuperacin para cada aminocido se calcula de la siguiente

manera:

100oshidrolizadaminocidodemg

HPLCelpordetectadosaminocidodemg

nrecuperacide% =

Para obtener la cantidad de aminocidos presente en cada muestra, el resultado

reportado en g/mL por el HPLC se multiplic por el factor de dilucin empleado (7575) y

por el porcentaje de recuperacin de cada aminocido.

Con estos clculos la cantidad de cada aminocido queda expresada en mg, pero

para poder analizarlos y evaluar la calidad de las protenas estos resultados tienen quedividirse entre la cantidad de nitrgeno proteico presente en cada muestra para obtener el

contenido de aminocidos en trminos de mg de aminocido/g de nitrgeno proteico.

Estos resultados pueden dividirse entre el contenido de cada aminocido en la

protena patrn de la FAO (ver tabla 3.2) para obtener su puntuacin qumica (chemical

score).


22/22

71

Anlisis estadstico

Se hizo un anlisis de varianza para determinar si haba diferencias significativas encuanto al contenido de cada aminocido en las diferentes variedades estudiadas utilizando

el procedimiento ANOVA del programa SAS. Las concentraciones de compuestos fueron

consideradas diferentes significativamente entre cada muestra cuando p < 0.05.

Con el mismo programa se calcul la diferencia mnima significativa entre las

medias realizando una prueba de Tuckey, la cual sirve para saber entre qu muestras

existen estas diferencias.

Para averiguar la relacin entre el contenido de aminocidos y el color del maz, la

modalidad de riego y el ciclo agrcola en el que fueron cultivadas las diferentes variedades

de maz se empleo el procedimiento GLM y tambin se compararon las medias con la

prueba de Tukey.

meteriales y metologias para el analisis de aminoacidos

Documents

Transcript of meteriales y metologias para el analisis de aminoacidos