METALLI PESANTI:

QUALI METODI ANALITICI?

MARINA CARINI Dipartimento di Scienze Farmaceutiche

Università degli Studi di Milano

Milano, 11 dicembre 2013

Metalli pesanti nei cosmetici

in alcuni casi LA PRESENZA DI TRACCE è un evento

inevitabile in quanto certi ingredienti come i

coloranti/pigmenti possono contenere naturalmente dei

residui di metalli pesanti

ciò che può essere considerato tecnicamente inevitabile

deve soddisfare i requisiti di sicurezza dei prodotti

stabilire parametri certi cui rapportare la sicurezza dei

prodotti in cui venisse riscontrata la presenza di sostanze

vietate valutazione del rischio

…. alcune considerazioni……

Metalli pesanti nei cosmetici

Non esistono limiti normativi !!! misure transitorie

La concentrazione sulla cute ???

La biodisponibilità a livello cutaneo ????

Il destino metabolico nella cute ??????

Reale esposizione (dose, durata e numero di applicazioni) ????

Obiettivo individuare il rischio concreto derivante della

presenza dei metalli nei cosmetici

Percorso di facile attuazione?????????

…. alcune considerazioni……

.... Linee guida

• Attualmente non disponibili, ma auspicabili

• Dovrebbero indicare dei limiti individuati non in quanto

valori assoluti, ma in quanto termini di riferimento ai quali

gli addetti ai lavori dovrebbero rapportarsi in una valutazione

presuntiva della sicurezza dei prodotti medesimi o della

inevitabilità tecnica delle tracce.

PROPOSTA LIMITI ISS

Antimonio 10 ppm Cromo (VI) 1 ppm

Arsenico inorganico 1 ppm Cromo (III) * 5 ppm

Arsenico organico 5 ppm Mercurio 1 ppm

Cadmio 5 ppm Nichel 10 ppm

Cobalto 1 ppm Piombo 20 ppm

* 0.0005% alcuni coloranti a base di Cr(III) sono permessi dalla normativa europea

senza indicazioni di quantitativo massimo è questa soglia tecnicamente raggiungibile?

Limiti fissati dalla

Farmacopea Europea 8.0

Pb: maximum 3.0 ppm

Cd: maximum 1.0 ppm

Hg: maximum 0.1 ppm

Metalli pesanti

HERBAL DRUGS

EP EXTRACTS

Metalli pesanti nei cosmetici

• Non esistono metodiche analitiche convalidate

(preparazione campione e analisi) e condivise per la

misurazione dei diversi metalli nei loro diversi gradi

di ossidazione (es. CrIII vs CrVI).

• In letteratura valori estremamente variabili circa

il contenuto totale dei metalli pesanti nei prodotti

cosmetici, a causa delle basse concentrazioni dei

predetti metalli e per le difficoltà nella loro

determinazione.

Discrepanze nel contenuto di metalli pesanti rilevate

nei prodotti cosmetici sono imputabili

a) all’uso di metodologie analitiche molto diverse

b) all’uso di metodiche di estrazione molto diverse

Metodolgie analitiche

confusione

• definizione dei contenuti totali e delle frazioni

“biodisponibili”

• speciazione degli elementi pesanti

Materiali certificati di riferimento (CRM - Certified Reference Materials)

permetterebbero di controllare i dati ottenuti da differenti

laboratori, di verificare gli standard, di calibrare gli

strumenti e di controllare le procedure di analisi

Sitox informa - Maggio 2013

Consensus document relativo a

Valutazione della sicurezza di residui inevitabili di

metalli presenti come impurezze nei cosmetici

lavoro di un gruppo di esperti in rappresentanza di

• diverse discipline scientifiche e mediche

(tossicologia, dermatologia, chimica analitica)

• diverse competenze (legali, formulative,

tecnologiche)

informazioni e dati necessari

per la valutazione della

sicurezza dei prodotti cosmetici

Metodologie analitiche

determinano il contenuto

totale di metalli pesanti nel

campione direttamente, senza

che l’analisi comporti

modifiche nelle proprietà e

nella sua composizione chimica

NON-DISTRUTTIVE

VANTAGGI SVANTAGGI

No pretrattamento

campione

Limiti di rilevabilità

Strumentazioni

complesse/costose

DISTRUTTIVE

implicano la totale

distruzione delle componenti

inorganiche fino ad ottenere

tutti gli elementi in soluzione

VANTAGGI SVANTAGGI

Pretrattamento

campione

Metodologie

ufficiali

Analisi quantitativa su

ioni in soluzione

• mineralizzazione

• solubilizzazione con acidi

• fusione con alcali forti

Metodologie analitiche

Molte si basano sulla misura dell’assorbimento o

emissione di energia radiante (spettrofotometri)

corrispondente alle transizioni elettroniche degli atomi

eccitati termicamente con una fiamma o attraverso

energia elettrica, o plasma

assorbimento atomico con atomizzazione a fiamma

(FAAS) tra i più diffusi ed utilizzati

assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS)

emissione atomica a plasma accoppiato

induttivamente (ICP-AES)

spettrometria di massa a plasma accoppiato

induttivamente (ICP-MS)

2.2.23. Atomic absorption spectrometry

3 types of sample atomisers:

– Flame technique

– Electrothermal atomisation technique

– Cold vapour (Hg) and hydride technique

(hydride-forming elements such as As, Sb, Bi, Se)

Metodologie Analitiche

EUROPEAN PHARMACOPOEIA 8.0

2.2.57. Inductively coupled plasma-atomic emission

spectrometry (ICP-AES)

2.2.58. Inductively coupled plasma-mass

spectrometry (ICP-MS)

AAS Atomic absorption spectroscopy

Si basa sull’esame dell’assorbimento

di una radiazione elettromagnetica

quando questa passa in un mezzo in

cui il campione sia presente come

atomi o ioni monoatomici

transizione elettronica.

Il sistema opera nel campo spettrale

degli spettrofotometri UV-vis

I livelli energetici atomici sono discreti l'assorbimento di una

radiazione elettromagnetica per eccitazione ad un livello

energetico superiore avviene ad una e una sola frequenza e

lunghezza d'onda.

Ogni atomo ha uno spettro di assorbimento caratteristico

misure quantitative applicando la legge di Lambert-Beer

AES Atomic emission spectroscopy

In base alla lunghezza d’onda emessa è possibile risalire

alla specie incognita e misurando l'intensità dell'emissione

si effettua anche l’analisi quantitativa.

Diverse varianti strumentali in relazione alla sorgente

utilizzata per produrre l'eccitazione degli atomi arco

elettrico, scintilla, fiamma, plasma (ICP)

Sfrutta la somministrazione di

ENERGIA relativamente elevata

per indurre dissociazione in atomi

e loro eccitazione l’energia in

eccesso viene restituita con

emissione di una nuova radiazione

Il sistema che si è rivelato più efficace è per eccitare l’analita consiste nel far ricorso al plasma, un gas formato da ioni ed elettroni, eccitato da un campo magnetico oscillante

Il plasma prodotto è in

grado di raggiungere

temperature comprese

tra 6.000 e 10.000 K

ICP Inductively coupled plasma

ICP-MS inductively coupled plasma

mass spectrometry

Sfrutta l'utilizzo di

• una torcia al plasma ICP per

indurre ionizzazione

• uno spettrometro di massa

per la separazione, rivelazione

e quantizzazione degli ioni prodotti

TECNICA MOLTO SENSIBILE determinazione di diversi

elementi inorganici metallici e nonmetallici presenti in

concentrazioni inferiori a una parte per miliardo (ppb)

TECNICA MOLTO SELETTIVA gli elementi vengono

identificati in base alla massa ionica, e non all’energia

di transizione dell’elettrone di legame

Happ NM et al., J. Cosmet Sci., 60:405-414; 2009

FDA (Center for Food Safety and Applied Nutrition)

Sviluppo e convalida di un metodo di determinazione del

piombo nei lipstick che prevede:

a) digestione acida del campione mediante microonde**

b) analisi ICP-MS

Risultati

a) LOD = 0.04 µg/g (ppm)

b) valore medio nei prodotti analizzati = 1.07 µg/g (ppm)

soddisfacente

** utilizzando solo HNO3 digestione incompleta, con conseguente

diminuzione dei livelli di Pb determinabili RISULTATI OTTIMALI per

addizione di HF (cui segue trattamento con acido borico in eccesso

per neutralizzare HF e solubilizzare i fluoruri insolubili

Concentrations and Potential Health Risks of Metals in Lip Products

Sa Li et al., Environ Health Perspect. 2013; 121(6): 705–710

Objectives: measure of lead and eight other metals in a convenience

sample of 32 lip products used by young Asian women in Oakland,

California, and assessed potential health risks related to estimated

intakes of these metals.

Methods:

a) Hot-block HNO3 digestion (130°C – 15 h)

b) ICP-AES the measurement did not distinguish Cr (VI) from

less toxic forms the percentage of Cr(VI) in the lip products

is therefore unknown

c) estimates of lip product usage rates to determine daily oral

intakes

Environmental Health Sciences Division, School of

Public Health, University of California, Berkeley

Results

Pb detected in 24 products (75%) average concentration of 0.36 ±

0.39 ppm, including one sample with 1.32 ppm

Approximately half (47%) of the samples contained Pb at concentrations higher

than the FDA-recommended maximum level of 0.1 ppm for Pb in candy likely

to be consumed frequently by small children

…. altri riferimenti bibliografici recenti

Al-Saleh I et al. Assessment of lead in cosmetic

products Regul Toxicol Pharmacol 2009;54:105–113

Method: GF-AAS after acid digestion

Pb levels: 0.27–3760 ppm (72 lipsticks)

0.944–1.854 ppm (8 eye shadow)

Gondal MA et al., Spectroscopic detection of health hazardous

contaminants in lipstick using Laser Induced Breakdown Spectroscopy

J Hazard Mater. 2010; 175(1-3):726-32

Pb, Cr, Cd, Zn in 4 different lipstick brands (Saudi Arabia)

Method: ICP-AES after HNO3 digestion

Pb levels: 5.7–9.4 ppm Cr levels: 10.2 – 40.8 ppm

Cd levels: 5.4-10.6 ppm Zn levels: 7.7 – 12.7 ppm

Al-Saleh I, et al., Trace metals in lipsticks. Toxicol Environ Chem.

2011;93:1149–1165 Data not available

…. altri riferimenti bibliografici recenti

Adepoju-Bello AA et al., Evaluation of the concentration of toxic metals

in cosmetic products in Nigeria. Afr J Biotechnol. 2012;11:16360–16364

Details of methods and data not available

Nourmoradi H et al. Assessment of lead and cadmium levels in frequently

used cosmetic products in Iran. J Environ Public Health. 2013 ID 962727.

Pb – Cd in 35 lipsticks and 15 eye shadow

Method: GF-AAS after HNO3 digestion (80°C)

Pb levels: 0.08-5.2  µg/g (lipsticks) – 0.85-6.90  µg/g (eye shadow)

Cd levels: 4.08-60.20  µg/g (lipsticks) - 1.54-55.59  µg/g (eye shadow)

Metodologie analitiche

I metodi ufficiali per la determinazione dei metalli

pesanti nel terreno (matrice sufficientemente

complessa) potrebbero essere presi come

riferimento anche per il settore cosmetico, non

esistendo a tutt’oggi metodi ufficiali in questo

specifico ambito ???

Metodi EPA

(Environmental Protection Agency)

PARAMETRO LOD (ppm) METODO EPA TECNICA ANALITICA

Antimonio 20 7040 FAAS

0.3 7041 GF-AAS

2.1 6010b-c ICP-AES

<0.002 6020 ICP-MS

Arsenico 0.1 7060 e 7062 GF-AAS

0.2 7061 assorbimento atomico e formazione di idruro

3.5 6010b-c ICP-AES

<0.002 6020 ICP-MS

Cadmio 0.5 7130 FAAS

0.01 7131a GF-AAS

0.23 6010b-c ICP-AES

<0.002 6020 ICP-MS

Cobalto 5 7200 FAAS

0.1 7201 GF-AAS

0.47 6010b-c ICP-AES

<0.002 6020 ICP-MS

Limiti di rivelabilità nel terreno valori espressi in mg/kg (ppm) di sostanza secca

PARAMETRO LOD (ppm) METODO EPA TECNICA ANALITICA

Mercurio 0.01

0.02

7472

7471A

Anodic Stripping Voltammetry (ASV) AA a vapori freddi

1.7 6010b-c ICP-AES

< 0.002 6020 ICP-MS

Nichel 4 7520 FAAS

0.1 7521 GF-AAS

1 6010b-c ICP-AES

< 0.002 6020 ICP-MS

Piombo 10 7420 FAAS

0.1 7421 GF-AAS

2.8 6010b-c ICP-AES

< 0.002 6020 ICP-MS

Limiti di rivelabilità nel terreno valori espressi in mg/kg (ppm) di sostanza secca

…il cromo 3 forme stabili

metallico, trivalente Cr(III) ed esavalente Cr(VI)

altamente tossico

cancerogeno (classe I)

… nutriente

essenziale…

non è in grado di

superare in quantità

significative le

membrane cellulari

è trasportato attivamente

all’interno delle cellule attraverso

i canali anionici non specifici,

prevalentemente come ione CrO42-

Meccanismi di tossicità del Cr VI

CrO42-

Cr3+

Cr6+

Cr4+

Cr5+ Ossidazione DNA

Addotti al DNA

CITOSOL NUCLEO

Stress ossidativo

Addotti proteine

Cr3+

Stress ossidativo

Addotti proteine

Ossidazione DNA

DNA-protein

cross links

GSH,

Asc,Cys

CROMO METODI EPA NEL TERRENO

determinazione del cromo totale e del Cromo (VI)

PARAMETRO LOD (ppm) METODO EPA TECNICA ANALITICA

Cromo totale 5 7190 FAAS

0.1 7191 GF-AAS

0.47 6010b-c ICP-AES

<0.002 6020 ICP-MS

Cromo (VI)

DIGESTIONE ALCALINA (EPA 3060a) 0,5 M NaOH / 0,28 M Na2CO3 (pH 11,5) a 90-95°C in presenza di tampone fosfato e Mg2+, per evitare l’ossidazione del Cr(III) a Cr(VI).

Cromo (VI) 20 7196 UV-Vis (complesso difenilcarbazide)

0.4 7198 Polarografia differenziale a impulsi

0.2 7195 Co-precipitazione con PbSO4 +

FAAS/GF-AAS/ICP-AES/ICP-MS

0.04 7197 Chelazione (pirrrolidinditiocarbammato)

+ estrazione + FAAS/ICP-AES/ICP-MS

0.016 7199 Cromatografia ionica

Determinazione CrVI criticità

1. la soluzione estraente deve solubilizzare tutte le

forme di CrVI

2. le condizioni di estrazione non devono indurre la

riduzione da CrVI a CrIII

3. le condizioni di estrazione non devono indurre

l’ossidazione da CrIII a CrVI

i punti 1 e 2 non sono soddisfatti da estrazioni

in ambiente acido e neutro

il punto 3 può essere critico nel caso di estrazione

in ambiente alcalino in assenza di ioni Mg2+

….non sono facilmente prevedibili e impostabili a priori

le condizioni ottimali da utilizzare per l’analisi dei

metalli pesanti in matrice cosmetica complessa.

…. senza considerare la diversa sensibilità strumentale

delle diverse tecniche analitiche attualmente

disponibili, che scandiscono il livello di rilevabilità di

tracce

…. risulta estremamente difficile standardizzare e

convalidare una metodologia di trattamento del

campione che possa essere universalmente applicabile

a tutte le tipologie di prodotti cosmetici

Conclusioni

…. quali metodi utilizza l’azienda per determinare i

livelli di metalli pesanti presenti nei prodotti finiti ???

… quali convalide, quale riproducibilità? Confronti aperti

sul problema? Condivisione di percorsi ?

L’azienda: come affronta il problema ?

Soluzioni adottate e da adottare ?????

… i livelli dei metalli pesanti potrebbero essere desunti

sulla base di un criterio di additività, applicato alle

materie prime utilizzate per la realizzazione di ogni

singolo prodotto finito ????

…. potrebbero essere utilizzati i livelli massimi dichiarati

dal produttore nelle specifiche di ogni singolo ingrediente

per ottenere un’indicazione del contenuto totale ???