Mesure de la diffusion dans les biofilms bactériens grâce à la technique de FRAP

en microscopie confocale

Alexis Canette, MIMA2, INRA – Jouy-en-JosasFrançois Waharte, PICT-IBiSA, Institut Curie - Paris

- attached to a surface

(biotic or abiotic)

- extracellular organic gel

matrix (water,

polysaccharides, proteins,

lipids, and nucleic acids)

with frame made of

appendages (flagella and

pili)

- 3D architecture

(differents gradients of

metabolites, genes

expression and

subpopulations)

New properties:

- strong attachment and cohesion

against mechanical stress and

predators (bacteriophages, protists,

phagocytes)

- cell-cell interactions (Quorum

sensing), regulated cell

differenciation, collective

coordinated behaviour, horizontal

inter-cellular genetic exchange

- heterogeneity of cell physiology,

low metabolism, emergence of

persister subpopulations (resistance)

-diffusion reaction limitation against

antimicrobials (tolerance)

ADHESION (planctonic bacteria)

BIOFILM (community of micro-organism)

DISPERSION (planctonic bacteria)

Architecture of B. subtilis

communities

(Bridier et al. PLoS One , 2012)

(Sanchez-Visuete et al. AEM , 2015)

50 µm

GFP

GFP

Congo Red, 72h24h

72h Syto9, 24h

50 µm

µM µM nMFluorophore

concentration

FCS4D

time µss msh

FRAP

min

“Spatial resolution” ≥x100 µm ≥ x10 µm ≥ x100 nm

d

µM+

Diffusion verticale

Diffusion/reaction molecular process analysis within biofilms

Barrier againt penetration: biomass, EPS

(true interface)

Irrigation default against bioavailability:

heterogeneity, electrostatic interaction,

adsorption, viscosity

Destruction: hydrolisation by enzyme

(Oxaran et al. PLoS One , 2012)

Three-dimensional biofilm structures of L. lactis IL1403 strains

(Castelain et al. PLoS One , 2016)

TEM analysis of ILpPil

Freeze planctonic cells

subcult

Bacteria:

mL: 1

Medium: M17 glu

mL: 9

h: 8

°C: 30

static

Cryotube -80 ou -20°C

expo phase

at 0.05<OD<0.3

dilut

Bacteria:

mL: based on OD

Medium: M17 glu

mL: nb of wells x 250 µL

h: 1

°C: 30

static

changing of medium

by fresh one

sedim

Petri dish

Colonies of cells

+ rinsed six times with a solution of

1.5 x 10-1 M NaCl to remove non-

attached or weakly attached bacteria

+ rinsed one time with a

solution of 1.5 x 10-1 M NaCl

changing of medium by

fresh one with 200 µg

to 1 mg /mL FITC dextran

min: 30

°C: 30

static

Préparation des biofilms

h: 24h

°C: 30

static

Objectifs de l’atelier

o Utilisation d’un fluorophore « injecté » dans le biofim (FITC-dextran)

o Utilisation de la technique de FRAP pour mesurer la diffusion

o Analyse des données de FRAP

Comprendre comment les molécules (en particulier des antibiotiques)

diffusent au sein du biofilm :

Molécule immobile

Molécules fluorescentes

F(t)

t

Plaser

1

2

3

} Fraction immobile

Temps court/

dynamique observée

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)

• Présentation de l’instrument

• Mesure de diffusion par FRAP

• Determination des paramètres d’acquisition

dt images, Tbleach, taille zone bleachée

• Vérification et préparation des données brutes

correction éventuelle des données

• Extraction des courbes et profils

mesure F(t), C(x,t)

• Traitement des données extraites

normalisation, filtrage (logbin), représentation, moyenne

• Ajustement des données avec un modèle théorique :

- manuel : pas de calcul d’erreur sur les paramètres mais fourchette de valeurs

- régression non-linéaire (fit)

Analyse quantitative des expériences de FRAP

(Waharte et al. AEM , 2010)

fluorescent plastic

Intensity profiles in xy

Intensity profiles in z

Mesure du volume photoblanchi

x

z

Vérifier que les données acquises peuvent être exploitables pour l’analyse :

o Rapport signal sur bruit

o Dérives ou « accidents » pendant l’acquisition

o Vérifier que les zones bleachées soient correctes (taille, position)

o Visualiser chaque courbe de FRAP pour vérifier la qualité du retour de

fluorescence

Vérification des acquisitions

Exemples de dérive des cellules suite à l’impulsion laser de bleach

Comment réduire les hétérogénéités de fluorescence ?

Moyenne azimutale des profils de fluorescence

α

1. Ligne en rotation entre deux angles limites, avec un incrément d’angle petit

2. Extraction d’un profil d’intensité pour chaque angle

3. Calcul de la valeur moyenne entre tous les angles pour chaque point de la ligne

Mesure de diffusion par l’analyse des profils

D’après Seiffert et Oppermann, J.of Microsc. 2005

Mesures FITC-dextran

Application de la méthode des profils à la mesure de diffusion dans les biofilms

ImageJ

Solution analytique tenant compte de la diffusion pendant la phase de photoblanchiment

Profil bleaché :

KM : prof. de bleachWM : largeur du profil

D’où l’on calcule :

Evolution temporelle de la fluorescence :

Braga et al. MBC 2004

WM

KM

Floury et al. Food Chemistry 2012

Analyse du retour de fluorescence :

modèle de diffusion 2D

Application de la méthode de Braga et al.

Excel (ou Calc OpenOffice)

FRAP acquisitions for BODIPY-FL-daptomycin inside S. aureus ATCC 27217 biofilms.

(a) Kymogram representation (x,t) of FRAP acquisitions

(b) Typical fluorescence recovery curves

BODIPY-FL-daptomycin inside biofilms (black) and inside TSB without biofilm (gray).

(Rym Boudjemaa et al., AAC, 2016)

38 μm

Mesures de la diffusion d’antibiotiques

BODIPY BODIPY-vancomycin inside S. aureus ATCC 27217 biofilms

(S. Daddi Oubekka , Antimicrob Agents Chemother, 2012)

265 ms / image

5 μm

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