MESACUP Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit ... ATP have been commonly used. This assay can be expensive,...

CODE No. 5235

MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. URL http://ruo.mbl.co.jp

e-mail [email protected], TEL 052-238-1904

Printed: May 29, 1997

Revised: February 14, 2013 (Ver. 6.1)

Non Radioisotopic Kit for Measuring Cdc2/Cdk1 Kinase Activity

MESACUP® Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit

CODE No. 5235 96 wells

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

CODE No. 5235

CONTENTS

1. Intended Use -------------------------------------------------------------------------------- 1

2. Summary and Explanation---------------------------------------------------------------- 1

3. Principle ------------------------------------------------------------------------------------- 1

4. Materials provided ------------------------------------------------------------------------- 3

5. Storage and Stability ----------------------------------------------------------------------- 3

6. Materials and equipment required ------------------------------------------------------- 3

7. Precautions ---------------------------------------------------------------------------------- 4

8. Procedure ------------------------------------------------------------------------------------ 4

9. Additional information -------------------------------------------------------------------- 8

10. Related products---------------------------------------------------------------------------- 8

11. References ---------------------------------------------------------------------------------- 8

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Before use, thoroughly read all Instructions.

Intended Use

The MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit is a non-radioisotopic assay kit for

measuring Cdc2/Cdk1 kinase activity.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

Summary and Explanation

Phosphorylation and dephosphorylation of proteins, which are catalyzed by protein

kinase and protein phosphatases respectively, were reported to regulate major cell

functions20)-22)

. Specially, Cdc2/Cdk1 kinase and its homologues play an essential role

in the regulation of the cell cycle and gene transcription15), 17), 18), 19)

.

Therefore the measurement of kinase activity is indispensable for study of cell function.

To assay for Cdc2/Cdk1 kinase activity, the protein substrate, Histone H1, and

radioactive ATP have been commonly used. This assay can be expensive, time

consuming and utilize large amounts of radioactive ATP. Furthermore, Histone H1 is

not a specific substrate for Cdc2/Cdk1 kinase. The phosphorylation of Histone H1 is

observed with several other protein kinases16)

. These drawbacks involve limitation of

research installation and affection of cold ATP in the assay. MBL has developed the

MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit to provide a simple, reliable and

non-radioactive method for measuring Cdc2/Cdk1 kinase activity.

Principle

The MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit is based on an enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA) that utilizes a synthetic peptide as a substrate for the

Cdc2/Cdk1 kinases and a monoclonal antibody recognizing the phosphorylated form of

the peptide (Fig. 1).

This method is as sensitive as the radioactive one and is less affected by concentrations

of ATP present in the reaction mixture.

The assay can be performed on crude cell extracts, column fractions or purified

enzymes.

The assay kit is of value for purification of Cdc2/Cdk1 kinase.

screening of inhibitors or activators of Cdc2/Cdk1 kinase.

detecting pharmacological effects on Cdc2/Cdk1 kinase.

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Fig. 1 Diagram of the Cdc2/Cdk1 kinase assay

(1) Cdc2/Cdk1 kinase present in the sample catalyzes phosphorylation of biotinylated MV

peptide. (2) Transfer the reaction mixture to anti-phospho MV peptide monoclonal antibody

(4A4) immobilized microwell. (3) The biotinylated phospho MV peptides are bound to

anti-phospho MV peptide monoclonal antibody (4A4). (4) And, the peptides are

subsequently detected with streptavidin conjugated to horseradish peroxidase. (5) The

horseradish peroxidase substrate is then added to the microwell and the intensity of the color

is measured photometrically at 492 nm.

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Materials provided

Each kit contains;

Name Materials Quantity (1 kit)

Microwells Microwell strips coated with the monoclonal

antibody 4A4 8-well strip × 12 strips

Reaction buffer Buffer for phosphorylation reaction (10× conc.)

(250 mM HEPES buffer (pH 7.5), 100 mM MgCl2) 0.5 mL × 1 vial

Biotinylated MV peptide MV peptide; SLYSSSPGGAYC 0.27 mL × 1 vial

POD conjugated

streptavidin POD conjugated streptavidin (ready-to-use) 6.0 mL × 2 vials

Wash concentrate Buffer for washing microwells (10× conc.) 50 mL × 2 bottles

Substrate A o-phenylenediamine 3 tablets

Substrate B H2O2 50 mL × 1 bottle

Phosphorylation stop

reagent PBS containing 50 mM EDTA (ready-to-use) 6.0 mL × 2 vials

Stop solution 20% H3PO4 (ready-to-use) (irritant) 40 mL × 1 bottle

Storage and Stability

All kit components must be stored at 2-8°C. All reagents are stable for two and a half

years (30 months) after manufacturing when stored at the indicated conditions.

Materials and equipment required

・ Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)

・ Water bath at 30°C

・ Microplate reader (492 nm)

・ Automatic plate washer or wash bottle

・ Adjustable micropipette

・ Multichannel micropipette

・ 1.5 mL of centrifuge tubes

・ Microplate holder ・ Disposable reagent vessels ・ Paper towels ・ Distilled water ・ Sample buffer

50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.01% Brij-35, 1 mM

PMSF, 0.05 mg/mL leupeptin, 50 mM 2-mercaptoethanol, 25 mM β-glycerophosphate, 1 mM

Sodium-orthovanadate

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Precautions

1. Microwells which are not immediately required should be returned to the ziplock

pouch, which must be carefully resealed to avoid moisture absorption.

2. POD conjugated streptavidin contains thimerosal (< 0.1 ppm). Protect eyes and

skin and handle with care.

3. Substrate A is o-phenylenediamine (20.6%). Handle with care.

5. Substrate B contains H2O2 (0.01%).

6. Stop Solution is 20% phosphoric acid. As it is corrosive product, protect eyes and

skin and handle with care.

7. This kit is intended for research use only. Not for use in diagnostic procedures. Do

not use internally or externally in humans or animals.

Procedure (recommended)

♦ Preparation of Reagents

1. ATP (0.1 M)

Dissolve 60 mg ATP in 0.8 mL of H2O. Adjust the pH to 7.0 with 0.1 M NaOH.

Adjust the volume to 1 mL with H2O. Dispense the solution into small aliquots and

store at -20°C.

The molar absorption coefficient of ATPε259 = 15.4 × 103 (pH 7.0)

Just prior to the assay, dilute 0.1 M ATP with distilled water and prepare 1 mM ATP.

2. Wash solution

Prepare “Wash solution” by diluting 1 part of the Wash concentrate with 9 parts of

distilled water. This Wash solution is stable for 1 month at 4°C.

Example: Dilute 10 mL of Wash concentrate with 90 mL of distilled water.

3. Substrate solution

“Substrate solution” must be prepared just prior to color development.

Prepare “Substrate solution” by dissolving one tablet of Substrate A in 12 mL of

Substrate B.

* Keep the solution in the dark and use as soon as possible.

* Use disposable or clean pipette and vessel, as Substrate solution is easily oxidized by metal

ions.

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♦ Preparation of samples

Prepare according to the Additional information.

♦ Assay procedure

Depends on its source, each application for Cdc2/Cdk1 kinase activity may exhibit

different optimum reaction temperature and incubation time. Therefore, the most

suitable condition may need to be determined for each application. Recommended

incubation temperature is at 30°C for phosphorylation reaction.

STEP 1: Phosphorylation reaction

(This reaction makes enough volume to be split into two different wells to permit

measuring the samples in duplicate. If you are not measuring each well in duplicate,

you will need to divide the volumes in half or you will run short of the biotinylated

peptide.)

The assay procedure is summarized in the Table 1.

It is advisable to set up the reactions on ice.

1) Label the sample tubes and place in a rack.

2) Pipette 5 µL of sample or Sample buffer into each appropriate tube.

3) Pipette 5 µL of 10× cdc2 Reaction buffer into each tube.

4) Pipette 5 µL of Biotinylated MV peptide into each tube.

5) Pipette 30 µL of distilled water into each tube.

6) Start the phosphorylation reaction by adding 5 µL of 1 mM ATP solution. Mix

well the contents of the tube.

7) Incubate for 5-30 minutes at 30°C (use a water bath).

8) Terminate the reaction with 200 µL of Phosphorylation stop reagent to each tube.

9) Mix well the terminated reaction mixture and centrifuge for 15 seconds at 14,000 rpm.

10) Separate phosphorylated peptide as described in the following section.

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Sample (µL) Blank (µL)

Sample 5 -

Sample buffer - 5

10× cdc2 Reaction buffer 5 5

Biotinylated MV peptide 5 5

Distilled water 30 30

1 mM ATP 5 5

|

Mix and incubate for 5-30 minutes at 30°C

|

Phosphorylation stop reagent 200 200

|

Centrifuge for 15 seconds at 14,000 rpm

Detect the phosphorylated MV peptide by ELISA

Final concentration of the reaction mixture;

25 mM HEPES buffer (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 0.1 mM ATP

STEP 2: Detection of Cdc2/Cdk1 kinase activity with antibody

Perform all assays in duplicate.

1) Transfer 100 µL of the terminated reaction mixture to each microwell strip coated

with a monoclonal antibody 4A4.

2) Incubate for 60 minutes at 25°C.

3) Aspirate or discard the well contents, then fill each well with Wash solution.

Aspirate or discard the Wash solution in the wells. Repeat this step another 4 times.

Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash solution. Be

carefully not to dry the wells.

4) After completely removing any remaining wash solution, pipette 100 µL of POD

conjugated streptavidin into each well.

5) Incubate for 30 minutes at 25°C.

Table 1 Summary of the phosphorylation assay assay assay assay

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STEP 3: Washing

Wash the wells again following the STEP 2 -3) procedure.

STEP 4: Substrate incubation

1) After the washing, pour Substrate solution into vessel. Add 100 µL of Substrate

solution into each well.

2) Incubate for 3-5 minutes at 25°C.

STEP 5: Stopping reaction

Pour Stop solution (ready-to-use) into the vessel. Add 100 µL of Stop solution into

each well.

♦ Reading

Read the absorbance of each well at 492 nm using a plate reader.

* Ensure that the back of the plate is clean and dry, and that no air bubbles are present on the

surface of the liquid in the wells before reading.

Fig. 2 Dilution curve of Cdc2/Cdk1 kinase

A: Radio Active (RI) method, B: MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit

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Additional information

♦ Cell culture and sample preparation

HeLa cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with

10% fetal calf serum.

Just before the cells reached confluence, 20 ng/mL (final concentration) colcemid was

added to the culture media.

12-18 hours later, the mitotic cells were scraped with a rubber policeman.

After 3 times washing with cold PBS, cell pellets (2.0 × 107 cells) were suspended in 1

mL of cold Sample buffer, and were sonicated for 30-60 seconds on ice.

Cell extract was separated by centrifugation at 100,000 × g for 1 hour at 4°C.

Sample buffer: (It is also described in Materials and equipments required)

50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.01% Brij-35, 1 mM PMSF,

0.05 mg/mL leupeptin, 50 mM 2-mercaptoethanol, 25 mM β-glycerophosphate, 1 mM


Related products

5230 MESACUP®

Protein Kinase Assay Kit

References

1) Enokido, Y., et al., J. Cell Biol. 189, 425-443 (2010)

2) Boulware, M. J. and Marchant, J. S., J. Physiol. 586, 2873-2888 (2008)

3) Kawahara, M., et al., Reproduction 130, 351-357 (2005)

4) Kano, F., et al., Genes Cells 10, 333-344 (2005)

5) Ito, J., et al., Reproduction 129, 171-180 (2005)


7) Kishigami, S., et al., Biol. Reprod. 70, 1863-1869 (2004)

8) Ito, J., et al., Biol. Reprod. 70, 797-804 (2004)


10) Shimada, M., et al., Reproduction 124, 557-564 (2002)

11) Shimada, M., et al., Biol. Reprod. 65, 442-448 (2001)


13) Shimada, M. and Terada, T. Biol. Reprod. 64, 1106-1114 (2001)

14) Dobashi, Y., et al., J. Biol. Chem. 275, 12572-12580 (2000)

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15) Tsujimura, K., et al., J. Biol. Chem. 269, 31097-31106 (1994)

16) Marshak, D., et al., J. Cell Biochem. 45, 391-400 (1991)

17) Less, J., et al., EMBO J. 10, 4279-4290 (1991)

18) Peter, M., et al., Cell 61, 591-602 (1990)

19) Moreno, S. and Nurse, P., Cell 61, 549-551 (1990)

20) Nishizuka, Y., Nature 334, 661-665 (1988)

21) Edelman, A. M., et al., Ann. Rev. Biochem. 56, 567-613 (1987)

22) Montminy, M. R. and Bilezikjian, L. M., Nature 328, 175-178 (1987)

23) Nishizuka, Y., Science 233, 305-312 (1986)

24) Wolf, M., et al., Nature 317, 546-549 (1985)

Manufacturer

MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.

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はじめにはじめにはじめにはじめに

MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kitは、ラジオアイソトープを必要としない Cdc2/Cdk1

kinase活性測定試薬です。

プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼによるリン酸化及び脱リン酸化は、cell

functionの調節に関与していると報告されています 20)-22)。特に、Cdc2/Cdk1 kinaseとそのホモログは、細胞周期の進行と関連遺伝子の転写調節に必須です 15), 17), 18), 19)。従来、Cdc2/Cdk1 kinase活性のアッセイには、基質としてヒストン H1を用い、放射性 ATPを利用した系が用いられてきました。このアッセイ系は、放射性 ATP の使用量が多く、且つ、時間により減衰するため、費用がかかります。また、ヒストン H1は Cdc2/Cdk1 kinaseに特異的な基質ではなく、他の数種のプロテインキナーゼの基質にもなっています 16)。放射性 ATPを用いた方法の場合、サンプル中に含まれる ATPの影響などもありアッセイ系として限界があります。

MBL は、ラジオアイソトープを必要とせず Cdc2/Cdk1 kinase 活性を測定可能なキット「MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit」を開発しました。このキットは、Cdc2/Cdk1 kinaseの基質となる合成ペプチドとリン酸化ペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた ELISA法を利用した試薬です。この方法は、放射性 ATPを用いた方法と同等の感度があり、反応溶液中の ATP濃度による影響をほとんど受けません。

特徴特徴特徴特徴

1) 放射性 ATPを必要としないため、RI施設の無い研究室でも Cdc2/Cdk1 kinaseの活性測定ができ、廃液等の処理も通常におこなえます。

2) 高濃度 ATP（2 mM）存在下でも測定できます。

3) 多数のサンプルを短時間で測定できます。

4) 長期間保存することができます。（2-8°C、1年）

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測定原理測定原理測定原理測定原理

MESACUP®

Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kitは、Cdc2/Cdk1 kinaseの基質となる合成ペプチドとリン酸化ペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた ELISA 法を利用した試薬です。試験管内で、Cdc2/Cdk1 kinaseサンプルとビオチン標識MV peptideを反応させます。リン酸化されたビオチン標識MV peptideを、抗リン酸化MV peptideモノクローナル抗体感作マイクロカップに移して反応させます。さらに、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼを反応させた後、o-phenylenediamine（OPD）と過酸化水素を添加してペルオキシダーゼにより発色させることにより、酵素反応溶液中のキナーゼの活性量を間接的に測定します。

Fig. 1 MESACUP

® Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit測定原理測定原理測定原理測定原理

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キットキットキットキット構成構成構成構成

Name Materials Quantity (1 kit)

Microwells Microwell strips coated with the monoclonal

antibody 4A4 8-well strip × 12 strips

Reaction buffer Buffer for phosphorylation reaction (10× conc.)

(250 mM HEPES buffer (pH 7.5), 100 mM MgCl2) 0.5 mL × 1 vial

Biotinylated MV peptide MV peptide; SLYSSSPGGAYC 0.27 mL × 1 vial

POD conjugated

streptavidin POD conjugated streptavidin (ready-to-use) 6.0 mL × 2 vials

Wash concentrate Buffer for washing microwells (10× conc.) 50 mL × 2 bottles

Substrate A o-phenylenediamine 3 tablets

Substrate B H2O2 50 mL × 1 bottle

Phosphorylation stop

reagent PBS containing 50 mM EDTA (ready-to-use) 6.0 mL × 2 vials

Stop solution 20% H3PO4 (ready-to-use) (irritant) 40 mL × 1 bottle

保存保存保存保存

2-8°Cにて保存してください。

有効期間有効期間有効期間有効期間製造後 2年 6ヶ月（30ヶ月）

準備準備準備準備するものするものするものするもの・ Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) ・ウォーターバス（30°C）・マイクロプレートリーダー（492 nm）・プレートウォッシャーまたは洗浄ビン・マイクロピペット・マルチチャンネルマイクロピペット・ 1.5 mLマイクロチューブ・マイクロカップ専用ホルダー・リザーバー・ペーパータオル・精製水・ Sample buffer

50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.01% Brij-35, 1 mM PMSF,

0.05 mg/mL leupeptin, 50 mM 2-mercaptoethanol, 25 mM β-glycerophosphate, 1 mM


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操作上操作上操作上操作上のののの留意点留意点留意点留意点

1. 抗体感作マイクロカップは湿気をきらいますので、十分室温（20-25°C）に戻してから開封して下さい。また、開封後はアルミ袋のチャックを確実に締めて保存して下さい。 2. 本試薬の構成品のうち、POD conjugated streptavidinにはチメロサール（0.1 ppm未満）が含まれます。使用の際には十分注意して取り扱って下さい。

3. Substrate Aは o-phenylenediamine（20.6%）です。使用の際には十分注意して取り扱って下さい。

4. Substrate Bには 0.01%過酸化水素（H2O2）が含まれます。濃度は 0.01％ですので毒物には該当しませんが、誤って目や口に入ったり、皮膚に付着した場合は水で十分に洗い流すなどの応急処置を行い、必要があれば、医師の手当てを受けて下さい。

5. 本試薬の構成品のうち、Stop solution には、20% リン酸（H3PO4）を用いています。使用の際には十分注意して取り扱って下さい。

6. 本試薬は研究用試薬です。ヒトの体内に用たり、診断の目的に使用しないで下さい。

操作法操作法操作法操作法

♦ 試薬試薬試薬試薬のののの調製調製調製調製

1. ATP（（（（0.1 M））））

ATP60 mgを 0.8 mLの精製水に溶解し、0.1 M NaOHで pH 7.0 に調整した後、精製水で 1

mLにします。0.1 M ATPは、凍結融解の繰り返しを避けるため、小分けして-20°Cで凍結保存してください。モル分子吸収係数 ATPε259 = 15.4 × 103 (pH 7.0) 使用直前に、精製水で 1 mMに調整してください。

2. Wash solution [[[[洗浄液洗浄液洗浄液洗浄液]]]]

Wash Concentrate を精製水で 10倍希釈し、“Wash solution” とします。Wash solutionは 4°C で保存すると、およそ 1ヶ月間安定です。例: 10 mLのWash concentrateに 90 mLの精製水を加え、10倍希釈します。

3. Substrate solution [[[[酵素基質溶液酵素基質溶液酵素基質溶液酵素基質溶液]]]]

“Substrate solution”は保存できないので、発色直前に調製します。室温に戻した 12 mL の Substrate B に 1 錠の Substrate A を加えて溶解し、“Substrate

solution”とします。＊ Substrate solutionはできる限り遮光してください。＊ Substrate solutionは金属イオンにより酸化されやすいので取り扱いは、ディスポーザブル、あるいは精製水で十分にすすいだきれいな器具を使用して下さい。

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♦ サンプルサンプルサンプルサンプルのののの調製調製調製調製後述の Additional informationを参照してください。

♦ 測定測定測定測定のののの手順手順手順手順アッセイの準備は氷中でおこなってください。

Cdc2/Cdk1 kinase活性測定では、各々のアプリケーションで最適な反応温度やインキュベーション時間が異なります。よって、各々のアプリケーションにおける最適反応温度、及びインキュベーション時間を設定する必要があります。リン酸化反応における温度は 30°C をお勧めします。

STEP 1. ＜＜＜＜リンリンリンリン酸化反応酸化反応酸化反応酸化反応＞＞＞＞

Table 1に測定手順概要を示します。（構成試薬の容量は、二重測定をおこなった場合に十分な容量に設定してあります。二重測定をおこなわない場合には、Table 1の方法に従って測定サンプルを調製する時に、サンプル及び試薬量を減量してください。）

1) サンプルにラベルし、ラックに入れます。

2) 適当な試験管にサンプルあるいは Sample buffer 5 µLを入れます。

3) 各試験管に、10× cdc2 Reaction buffer 5 µLを加えます。

4) 各試験管に、Biotinylated MV peptide 5 µLを加えます。

5) 各試験管に精製水 30 µLを加えます。

6) 各試験管に 1 mM ATP solution 5 µLを加え、よく混合します。1 mM ATP solutionを加えた時点より反応が開始します。

7) 30°Cで 5-30分間インキュベートします。（ウォーターバスを使用します。実験の目的により反応時間を変更してください。）

8) Phosphorylation stop reagent 200 µLを加えてリン酸化反応を停止させます。

9) 反応を停止したリン酸化ペプチド溶液を混合し、14,000 rpmで 15秒間遠心します。

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Sample (µL) Blank (µL)

Sample 5 -

Sample buffer - 5

10× cdc2 Reaction buffer 5 5

Biotinylated MV peptide 5 5

Distilled water 30 30

1 mM ATP 5 5

|

Mix and incubate for 5-30 minutes at 30°C

|

Phosphorylation stop reagent 200 200

|

Centrifuge for 15 seconds at 14,000 rpm

Detect the phosphorylated MV peptide by ELISA

リンリンリンリン酸化酸化酸化酸化ペプチドペプチドペプチドペプチド溶液溶液溶液溶液のののの最終濃度最終濃度最終濃度最終濃度；

25 mM HEPES buffer（pH 7.5）, 10 mM MgCl2, 0.1 mM ATP

STEP 2. ＜＜＜＜抗体反応抗体反応抗体反応抗体反応＞＞＞＞二重測定二重測定二重測定二重測定をををを推奨推奨推奨推奨しますしますしますします。。。。

1) STEP 1.で反応させたリン酸化ペプチド溶液をマイクロカップ 1ウェルにつき 100 µL添加します。

2) 25°Cで 60分間反応させます。

3) ウェル内の反応液を完全に除去後、ウェルを十分な量の Wash solution で満たし、捨てます。これをさらに 4回行います（5回洗浄）。その後、プレートをペーパータオルなどに軽くたたきつけて完全に洗浄液を除去してください。また、洗浄中にウェルを乾燥させないでください。

4) POD conjugated streptavidinを 1ウェルにつき 100 µL添加します。

5) 25°Cで 30分間反応させます。

STEP 3. ＜＜＜＜洗浄洗浄洗浄洗浄＞＞＞＞

STEP 2. -3)と同様にマイクロカップを洗浄します。

Table 1 リンリンリンリン酸化反応酸化反応酸化反応酸化反応測定手順概要測定手順概要測定手順概要測定手順概要

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STEP 4. ＜＜＜＜酵素反応酵素反応酵素反応酵素反応＞＞＞＞

1) Substrate solutionを 1ウェルにつき 100 µL添加します。

2) 25°C で 3-5分間反応させます。

STEP 5. ＜＜＜＜反応停止反応停止反応停止反応停止＞＞＞＞リザーバーに移した Stop solution をマルチチャンネルマイクロピペットで 100 µL ずつ各ウェルに添加し、反応を停止させます。

♦ 吸光度吸光度吸光度吸光度のののの測定測定測定測定マイクロプレートリーダーにマイクロカップをセットして、波長 492 nm の吸光度を測定します。＊プレートの裏側は汚れのない乾いた状態を保つようにしてください。また、吸光度を測定する前にウェル内に気泡がないことを確認してください。

Fig. 2 Dilution curve of Cdc2/Cdk1 kinase

A: Radio Active (RI) method, B: MESACUP® Cdc2/Cdk1 Kinase Assay Kit

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Additional information

♦ Cell culture and sample preparation

HeLa cellsを 10% fetal calf serumを添加したDulbecco’s modified Eagle’s mediumで培養します。細胞が confluenceになる直前に、colcemidを培養液に添加します（最終濃度 20 ng/mL）。

12-18時間培養後、分裂期細胞を集めます。細胞を冷却した PBSにて洗浄後、cell pellets（2.0 × 107 cells）を 1 mLの冷却した Sample bufferに加え、氷中で 30-60秒ソニケートします。

4°C 、100,000 × gで 1時間遠心します。

Sample buffer：：：：（準備準備準備準備するものするものするものするもので紹介したものと同じです。）

50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.01% Brij-35, 1 mM PMSF, 0.05

mg/mL leupeptin, 50 mM 2-mercaptoethanol, 25 mM β-glycerophosphate, 1 mM Sodium-orthovanadate

関連製品関連製品関連製品関連製品

5230 MESACUP®

Protein Kinase Assay Kit

参考文献参考文献参考文献参考文献

1) Enokido, Y., et al., J. Cell Biol. 189, 425-443 (2010)

2) Boulware, M. J. and Marchant, J., S. J. Physiol. 586, 2873-2888 (2008)

3) Kawahara, M., et al., Reproduction 130, 351-357 (2005)

4) Kano, F., et al., Genes Cells 10, 333-344 (2005)



7) Kishigami, S., et al., Biol. Reprod. 70, 1863-1869 (2004)



10) Shimada, M., et al., Reproduction 124, 557-564 (2002)



13) Shimada, M. and Terada, T., Biol. Reprod. 64, 1106-1114 (2001)

14) Dobashi, Y., et al., J. Biol. Chem. 275, 12572-12580 (2000)

15) Tsujimura, K., et al., J. Biol. Chem. 269, 31097-31106 (1994)

16) Marshak, D., et al., J. Cell Biochem. 45, 391-400 (1991)

17) Less, J., et al., EMBO J. 10, 4279-4290 (1991)

CODE No. 5235

-18-

18) Peter, M., et al., Cell 61, 591-602 (1990)

19) Moreno, S. and Nurse, P., Cell 61, 549-551 (1990)

20) Nishizuka, Y., Nature 334, 661-665 (1988)

21) Edelman, A. M., et al., Ann. Rev. Biochem. 56, 567-613 (1987)

22) Montminy, M. R. and Bilezikjian, L. M., Nature 328, 175-178 (1987)

23) Nishizuka, Y., Science 233, 305-312 (1986)

24) Wolf, M., et al., Nature 317, 546-549 (1985)

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