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Meios de cultura: componentes e tipos de meio
ProfProf.. PauloPaulo HercílioHercílio ViegasViegas RodriguesRodrigues
CENCEN001001
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Meios de Cultivo
• Meios de cultura consistem da associação qualitativaqualitativa e quantitativaquantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de organismos fora do seu meio natural.
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Meios de Cultivo
-- Soluções inorgânicas simples:Soluções inorgânicas simples:
Solução de Knop (1865)
Solução de Knudson (1925)
Solução de Hoagland & Arnon (1938)
-- Soluções mais completas:Soluções mais completas:
White (White, 1943)
MS (Murashige & Skoog, 1962)
B5 (Gamborg et al, 1968)
KM (Kao & Michayluk, 1975)
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Casos...
1- Aula em Cuiabá!
2- Guia com seqüência dos sais e orgânicos na preparação do meio de cultivo
(evita colocar 2 x a mesma solução!!)
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Fácil e $$$$...
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Componentes Orgânicos
VitaminasVitaminas -São fatores catalíticos de rotas metabólicas nas células;
-São utilizadas fração de 1 mg/L a 10 mg/L
* Primeiros trabalhos em cultura de tecidos
-Definida a mistura básica de vitaminas:
B1 (tiamina), B6 (piridoxina), ácido nicotínico (niacina), ácido pantotênico e ácido ascórbico.
TiaminaTiamina: exerce maior estímulo para o crescimento.
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Componentes Orgânicos
•• MioMio--inositolinositol:
É um hexitol ou composto cíclico com grupos
-OH em todos os seus carbonos.
a concentração mais usada é 100 mg/L
é incorporado a moléculas de fosfolipídeos da membrana plasmática.
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Componentes Orgânicos
•• Fonte de CarbonoFonte de Carbono:
Células, tecidos e órgãos cultivados in vitro:
# são heterotróficos;
# dependem de fonte externa de energia;
# necessário incorporar fonte de carbono.
- Fornecem energia e esqueletos de carbono para:
* biossintese de polissacarídeos, aminoácidos e proteínas, enfim para o crescimento da célula.
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Componentes Orgânicos
•• Fonte de carbonoFonte de carbono:
Sacarose 2 - 3%:
- é a mais utilizada nos meios (açúcar cristal);
- em presença de auxina contribui para a diferenciação celular.
Outros açúcares (frutose, glicose, maltose, galactose, celobiose).
Ácidos orgânicos e alcoóis (sorbitol) Em excesso conservam material vegetal (agente osmótico)
crescimento mais lento da cultura.
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Componentes Orgânicos
•• Misturas complexasMisturas complexas: água de coco
extrato de levedura
extrato de malte
água de coco é a mais utilizada:
- estimula o crescimento de calo,
- aumenta a formação de embriões somáticos,
- induz o desenvolvimento de embriões imaturos.
* Endosperma líquido!* Endosperma líquido!
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Reguladores de crescimento
• Substâncias orgânicas que regulam o crescimentocrescimento, diferenciaçãodiferenciação e desenvolvimentodesenvolvimento das plantas em baixas concentrações (0,1 – 100 µM).
AuxinasAuxinas
CitocininasCitocininas
GiberilinasGiberilinas
AcAc.. AbscísicoAbscísico
EtilenoEtileno
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Reguladores de crescimento
•• AUXINASAUXINAS: crescimento e alongamento celular
divisão celular
indução e crescimento de raízes
dominância apical
produção de etileno
In vitro: divisão celular
enraizamento
indução de calo
embriogênese somática
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Reguladores Abreviatura P.M
Auxinas
Ácido 3-indolacético AIA 175,20
Ácido naftalenoacético ANA 186,20
Ácido indolbutírico AIB 203,23
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,4-D 221,04
Ácido 4-clorofenoxiacético 4-CPA 184,50
Ácido 4-amino-3,5,6-tricloropico-
línico
Picloran 241,46
Ácido naftóxiacético NOA 202,21
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Reguladores de crescimento
• Auxinas
AIA AIA NaturaisNaturais
AIBAIB
ANA
2,4-D SintéticasSintéticas
2,4,5-T
PicloranPicloran Substitutos de auxinasSubstitutos de auxinas
DicambaDicamba
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Reguladores de crescimento
•• Auxinas no meio de culturaAuxinas no meio de cultura:
-- ANAANA bastante utilizado em protocolos de protocolos de
estabelecimentoestabelecimento (cerca de 51%);
-- 2,42,4--DD indução de calo indução de calo mesmo em baixa concentração;
-- AIB AIB muito utilizado para enraizamentoenraizamento;
-- AIAAIA menos estável menos estável em meio de cultura (fotoxidação e
ação da AIA-oxidase).
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Reguladores de crescimento
•• CITOCININASCITOCININAS: derivadas da adenina (base púrica).
•• In vitroIn vitro: divisão celular
quebra da dormência apical
morfogênese (gemas adventícias)
desenvolvimento de brotos laterais
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Reguladores de crescimento
Reguladores Abreviatura P.M
Citocininas
6-Benzilaminopurina ou 6-
Benziladenina
BAP ou BA 225,20
6-Furfurilaminopurina ou
Cinetina
CIN 215,20
Isopenteniladenina 2iP 203,30
Zeatina ZEA 219,20
Tidiazuron TDZ 220,20
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Reguladores de crescimento
•• CitocininasCitocininas
Zeatina Naturais
2iP
BAP ou BA Sintéticas
Cinetina
TDZ Substituto de citocinina
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Reguladores de crescimento
•• Citocininas no meio de culturaCitocininas no meio de cultura
- em excesso é tóxica, produzindo:
*Demasiado entufamento;
*Falta de alongamento das culturas;
*Redução do tamanho das folhas;
*Encurtamento dos entrenós;
*Hiperidricidade (vitrificação);
*Dificuldade de enraizamento;
*Variação somaclonal.
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Estágios da propagação in vitro
Stage I:
Introduction of
aseptic cultures
Stage II:
Multiplication
Stage III:
Rooting and
preparation
Stage IV:
AcclimatizationGrowth
Selection of a
superior
germplasm
Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4Chapter 4
In vitro under
photomixotrophic
conditions
In vitro under
photoautotrophic
conditions
Ex vitro under
controlled environment
conditions with
artificial light
Stage I:
Introduction of
aseptic cultures
Stage II:
Multiplication
Stage III:
Rooting and
preparation
Stage IV:
AcclimatizationGrowth
Selection of a
superior
germplasm
Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4Chapter 4
In vitro under
photomixotrophic
conditions
In vitro under
photoautotrophic
conditions
Ex vitro under
controlled environment
conditions with
artificial light
Adaptado de Couceiro (2006)
0 I II III IV
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Balanço Balanço citocininacitocinina/auxina /auxina (c/a)(c/a)
•• Alta relação c/aAlta relação c/a: promove a proliferação de brotos; suprime a formação de raízes (estádio II).
•• Baixa relação c/aBaixa relação c/a: favorece a formação de raízes (estádio III).
•• Concentrações iguaisConcentrações iguais: propiciam a produção de calo.
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Foto c/a
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• Exemplos:
• Banana ?
• Heliconia ?
• Mirtilo ?
• Mangaba ?
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Outros Aditivos
•• Antibiótico e fungicidasAntibiótico e fungicidas:
- Controle de contaminação microbiana;
- Não apresenta ação fitotóxica.
-- BenomilBenomil ((BenlateBenlate))
-- CefotaximaCefotaxima sódica sódica
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Outros Aditivos
PolifenóisPolifenóis AntioxidantesAntioxidantes
OxidaçãoOxidação Carvão ativado
Ácido ascórbico
EscurecimentoEscurecimento Ácido cítrico
L-cisteína
Morte da planta Polivinilpirrolidona (PVP)
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•• Carvão ativado: 1 a 3 %Carvão ativado: 1 a 3 %
- adsorção de fenóis;
- adsorção de componentes orgânicos (auxinas e citocininas);
- contribui para a morfogênese e embriogênese;
- desenvolvimento de raízes;
- estabiliza pH.
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Meios de cultura – forma física
•• LíquidoLíquido
•• Semi sólidoSemi sólido:
– Agar
– Goma (Gelrite, Phytagel)
– Agarose
BifásicoBifásico: meio semi-sólido coberto com meio líquido.
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Meio de cultura líquido
• Condições de cultivo + uniformes;
• Renovação do meio sem mudança sem mudança de recipiente;
•• EsterilizaçãoEsterilização pode ser por microfiltraçãomicrofiltração;
•• LavagemLavagem dos recipientes + fácil;
• Asfixia e hiperidratação dos explantes –
distúrbios fisiológicosdistúrbios fisiológicos.
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Sistemas de suporte
•• AgarAgar: mistura de polissacarídeos derivados de algas marinhas.
- fusão: 100C
- solidificação: 45C
- concentração: 0,6 – 1,0%
• Não reage com componentes do meio de cultivo;
• Não é digerido pelas enzimas das plantas;
• Não solidifica em pH ácido;
• Impurezas (sais inorgânicos, compostos orgânicos, fenóis, etc)
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Sistemas de suporte GomaGoma: polissacarídeo produzido pela bactéria
P.elodea;
• Phytagel (Sigma), Gelrite (Merck) – 0,2%
• Mais translúcido que o ágar (contaminação)
• Impurezas (sais inorgânicos)
• Não contém componentes orgânicos
• Solidifica na presença de ions de Ca e Mg
AgaroseAgarose: extraído do ágar, alto grau de pureza
MecânicoMecânico: pontes de papel de filtro (meio líquido).
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VariantesVariantes SomaclonaisSomaclonais dede HH..bihaibihai,,
obtidasobtidas inin vitrovitro..
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Variantes Variantes SomaclonaisSomaclonais de de H.bihaiH.bihai, ,
obtidas obtidas in vitro.in vitro.
Variabilidade genética que ocorre em decorrência do processo in
vitro!
repicagens, reguladores de crescimento e tempo de cultivo.