Medios deCultivoparaM icrobiologiaS.A.1981 . Edita: ADSA =MICROC/Muntaner, 483. Barcelona-21Depositolegal: B-6697-81.Imprime: Ratlles. Mallorca, 206.Barcelona.II-I;-jIhttp://booksmedicos.blogspot.comD.J so Jbe '-110/51-7.1. 5 -, - .....F ~ : _ . . -,r " ~ -:: ... " . :"w~ ... _ ~ ~ . - , ..Medios eCultivoparaM icrobiologiaSA.http://booksmedicos.blogspot.comNORMATIVA PARA LA CORRECTA MANIPULACIONEN MICROBIOLOGIALas siguientesnormativasproporcionanunaguladela correctamanipulacionmicro-bioloqicaquese aplicabajola responsabilidaddelosComitesdeSeguridad localesentodosloslaboratorios rnicrobioloqicosenInglaterrayquepuedenhacerse extensivos aotros parses.A. Tllcnicas personalesA.l.La limpieza es el rasgo esencial de la manipulacion segura.A.2. Sea cual fueresunaturaleza, hayquesuponer quetodoslosmicroorganismosmanipulados son potencialmente pat6genos. Por 10 tanto, hay unaseriedeaspectosquedebenevitarse: Pipeteobucal, aplicacion decosmeticos, comer,beber0 fumar en ellaboratorio y naturalmente,las etiquetas y envoltorios debenser autoadhesivos,A.3. Las manipulaciones de los microorganismos deben Iievarse a cabo de formaquenoprovcquencontaminacionesambientalesinadvertidas, por ejemplo: las pipe-tasdebensumergirseenundesinfectantedespuesdeusarse ysiemprese evi-taranlos aerosoles.A.4. Los manipuladoresdebenestar perfectamente enteradosde los riesgos ycomoevitarlos.A.5. Losmanipuladoresdeberanasegurarse quelosusuariosdesuequipoyutillajeestan perfecta mente resguardados de cualquier riesgo potencial.B. Equipo engeneralB.l. Debe existir un equipoestandarpara la esterilizacionde cualquier material poten-cialmente peligroso(autoclave, jarros con desinfectante para las pipetas, etc.).B.2. EI vestuariode protecci6ndebe usarse exclusivamenteen las areas de trabajoyno pasar con81 a las zonas de usa comunitario.B.3. Lavabosyanaloqosdebenestardisponiblesycercadelas zonasdetrabajo, yademas, separados de los otrosde uso comunal.B.4. Cualquieraparatosusceptible de producir aerosoles,debe manejarse siempre encabinas rnicrobioloqicas de seguridad.B.5. En caso de accidente debentenerse disponibles y a mano, sustanciasadecuadaspara minimizar0neutralizarlos riesgos.C. Caracteristicas generales dellaboratorioC.l. La olanta0 laboratorio nodebe estar en lugarde paso, para que el personal queno trabaje alii se pueda mantener alejado de el.C.2. EI sistemadeventilaciondebeseradecuadoysi esposibleregulado rnecani-camentepara producir corrientedesdelos lugaresde riesgobajoa los contami-nados y de alii afuera a travss de filtros HEPA.C.3. La planta0 laboratoriodebentener superficies que se puedanlavar facilmente,impermeablesa los Ifquidos y resistentes a los desinfectantes.D. Procedimientos administrativos0.1. Sistemasparacomprobar la efectividaddel codiqodeseguridadbioloqicaporpersonal adecuado.0.2. Programa de entrenarniento en seguridadde trabajoadaptadoa cada nivel de losmanipuladores.Recomendaciones para la utilizaci6nde losmediosdecultivodeshidratados0 yapreparadEI aspe ctoycal i daddel med ioprep aradodepende co n much a frecuen cia del a fo rmade rehidr at arloy al mac enarl o, por ell o es import an t eque en 10 posible se sigan lasrecome ndaciones queseofrecenacont inuacidn.REHIDRATACIONLas in stru ccionesparticularesderecon stitu cion decada medio vienendetal ladasencada f rasco ydebenseguirse de formarigurosa.EI agua empleada en la reconstitucion se radest il ada 0 desionizada, de " cal i dadfarrn aceut i ca" . La homogeneidaddela solucion0 de l a suspension ensucaso debe sertot al y la exposicion al calor, cuando sea pr eci so. sera mini ma , En cualquierc ircunsta nc ia, esrecomendablequeel aguaseca l i entepr ev i ament e a 50- 65 C con10que sefavor ec enotablementeladisolucion.Para l a pre paracion del medio de cultivola practi ce mas recomendabl e es la siguiente :A un volu mendeagua mitad delnecesarioy p reviamente ca lentada a 50-65C se aiiadela canti da d total del po lvonecesaria y se ag i t a co nstante mentehast a su diso lucion. Conel res tode l agua se l avan lasparedes de l recipi ent e y seco ntinu a agi tando y cal entandosi esprecise. La apti cacionde l calo r debe serdirecta y suave,conagitaci6nparaevi tarque los co mpone nt essepeguenalaspa redes del recipi ent e. quepara fac il itar estasmanipul ac ionesde be t ener unvolumende2a3vecessuperi or al del medioque se. prepara. Rarament e esnecesa riopr ol ongar l a ebul l ici6ndel medi omas de1minuto. Sipor cualqui er motivo l aebul l icionse pr o lo nga, debe rest i t ui rseel volumen de aguaevaporada.Los medios quenoconti en enagar ni agentes solid if i can t es (CALDOS y SOLUCION ESNUTR/TIVAS)sesue l endis olverbienenaguapre ca lent ada , aunq ue enalgunos casosseaprecisasuebu lt i cionpa radisol ver tota lmentealgunodesuscomponentes. Est osmediost i enentendencia afor mar ungradientede coric ent rac i ondesdeel Ion do de lrecipi ente a la superf icie y es conveniente qu e antes de calent arl os se agitenv igorosamentepara evi tar hi drol isi s, caramel izac ionasy carnbi os de pH .Los medi os que cont ienen agentes geli fi cantes (AGARESy M EDIOS FLUI DOS)precisanun cal ent ami ent oprev io antes desu est eri ti zacion. Los medios quecont eng anagar-aga r de be n Il ev arse a ebull icion pues es t ecomponen te no se disue lve hastatemperaturas de 98 -1 000 C. Es muy co nveniente que ant es deiniciar el cal entamiento sede jerep osar el agar enel aguapre ca lentada dura nte un os 5a 10 mi nu t es. con10 quesecons i que un esponjarnie ntodel agar queIacil it ara su disoluci6n y repa rto . Una prac t ica3muy aconsejableesretirar el medio del fuegocuandohaempezadoa hervir y volverlo acalentar hastaquevuelvaahervir. Esta operacicinsepuederepetir 2o3veces, conagitacicinconstantehastaqueel agar se disuelvatotalmente, 10quesepuedeobservarpor laausenciade qranulosen el recipiente.La disoluci6n de los medios de cultivo directamente durante el proceso deesterilizaci6nal autoclaveesunapr act icafrecuenteperodetodopuntoincorrecta, yaque las caracterlsticas del medio se alteran notablemente, siendo frecuente lasepar acion en capas con distintogradiente de concentraci6n de los componentes,modificaciones del pH, oscurecimientos, etc. Los medios de cultivo deshidratadossuelenmantener suscarac teres si se reconstituyen deforma adecuada.Sinembargo,esrecomendable que severifiquen algunos de ellos. como el color y el pHque variansensiblementesequn lascondicionesde reconstitucionyel agua utilizada.Es importantetenerencuentaque todasestasrecomendaciones sonespecial menteirnportant es cuando serefierena losmedios fluidos ya que al contener poca cantidad deagente gelificante sudelicadeza se incrementa. En estos cases. tanimportante comoelcalentamiento es elenfriamiento, puesto que si sehace de formabrusca puede provocarla aparici6nde fl6culos y nubes. Lo masrecomendable es unenfriamiento lento y suave.En losmedios en que haytamp6ndefosfatos pueden aparecer precipitados si el aguaqueseutiliza esdebajacalidad y si junto conlosfosfatoshayglucosau otros azucar es,se pueden producir oscurecimientos de color notables si el medio se calienta en exceso.Debetenerse especial cuidadocon los medios que contienen agar-agar aun pHinferior a5yaqueaestosvalores el agar se hidrolizaydisminuyesu capacidaddegelificacicin. Enestoscasos debeevitarsetotal mentecualquier calentamientoinnece-sario.ESTERI L1ZACIONDeben seguirse las instrucciones de la etiqueta teniendo en cuenta que seespecifican para pequeiios vohimenes. inferiores a los 100 mi. Para vohirnenasmayo res, cuando sea necesario, de ber an tenerse en cuenta las condiciones delautoclave y depenetraci6ndecalor enel medio.A continuacion. a tituloorientativo, sedaun escaladodetiemposuplementariodeesteritizacion. a aiiadir alos 15 minutosbasicos para grandesvolurnenes demedioconagar en botelias decristal:250ml prolongar laesterilizacicindurante12 minutos.500ml prolongar laesterilizacicindurante18 minutos.1.000ml prolongar laesterilizaci6ndurante22minutos.2.000ml prolongar laesterilizaci6ndurante27 minutos.5.000ml prolongar laesterilizacicindurante37minutos.De cualquier formadebe controlarse peri6dicamente el funcionamiento del autoclaveparaverificar los man6metros y terrnornstros y que el calor en suinterior se distribuye deforma adecuada. En la actualidad hay sistemas rnecanicos (termopares) quimicos(indicadoresterrnicos) 0 biol6gicos (esporastermoresistentes) adecuados para ello.Teniendoencuentaqueel calor excesivoesuna de las causasmas frecuentesde laalter aciondelosmediosdecultivoparecelogicoevitaren10posibleeltr at arnientodegrandes vohirnen es. 0los perfodos de tiempo deexposicion prolongados. En autoclavesmuygrandes es recomendable calentar antes deintroducir elmedio y unavezterminadoel ciclo. esperar que la temperatura desciendahasta unos 70-80" C antesde sacarlos deel. para evitar lasvariacionesterrnic asexcesivamentebruscas. Aunquesueleseruna4practicefrecuenteel enfriamientode losmediosenaguafria. para losquecontienenagar no es adecuadaya queconducealaproduce ion de Iloculosynubes.Losrecipientesempleadosenlaest erilizaciondebentener un a generosacarnaradeaireparapermitirla libre ebulliciOn. Si seemplean frascos con tapones roscados. estesdeberanaflojarseparapermitirquese equilibrenlas presionesinternayexterna. Losrecipientesempleadosdeberanser totalmenteinertespara impedir lasvariacionesdepH. Los mas recomendablessonlos de crist al bajoen boro-silicato.Los medios con azucaressiemprese oscurecen ligeramentecon la esterilizacionsiendorecomendablepara ellosquela temperaturano rebaselos1180C. cuandoellosea posible.Si nosedispone deautoclave s e puede esterilizar enuna olla a presion (30 minutosa100C)peroentoncesesrecomendablereiterarladurante 3diassi el medioaceptaeltratamiento.Algunosmedioscontienensustanciasselectivasparano precisar e steri liz acion. Enestoscasos. el procesoesmasrapido. yaqueinmediatamentedespuesdedisolver sepueden emplear. Estos medics sue len ser muy poco estables y es recomendablepreparar tan s610 lascantidades estrictamentenecesarias para suuso inmediato, yaquesu preparacion es rapidayIac il.Cuandoseaprecisoafiadir sustanciasal medioesterilizadodeberahacersedeformaas ept ic a. 10que supone una previa esterilizaci6n del aditivo. Por 10general lassustancias aahadir son terrnotabiles. ya quede otraformaquedarianincluidas en elmedio deshidratado. Es precise. por 10tanto que la adicion al medio sehaga cuando esteseha enfriado suficientemente(a unos 50-65 C) paranodestruir eladitivo ypermitir elcorrector epartoentodosuvolumen. Unavez hechala adiciondebeevitarsecualquiercalentamientodel rne dio.La distribucionenlos recipientes definitivos selIeva a cabo conlos medios fundidos ya unatemperaturaproximaa la qelificacion (45-500C). A ser posible debe hacerse antesdela esterllizacionparaevitar asf lasmanipulaciones. Sinembargoenlamayoriadeloscasesesto noes posible y par ello serecomiendael tr abajoencarnar as esterilesnoex-puestasa radiacionesdeninquntipoyaquesualtopoder reactivopuedeafectaraloscomponentes del medio. La excesiva condensac ion de vapor se puede evitar si sedistribuyeel medioatemperaturas proximas ala gelificaci6n.ALMACENAMIENTODELOSMEDIOSDESHIDRATADOSLosmediosdecultivo deshidratados debenconservarse al abrigo delahumedad, delaluz y calor queesencialmenteson los .agentesde alteracion masfrecuentes.Los medios ADSA-MICROsesuministranenbotesdeplasticoopac os eimpermea-bl es, con un unico t apon roscado sin obturador de, cierre herrrietico gracias aunapest ahainterna. No obstanteelcierre estanco solo seasegurasi seroscaa tope y tantoel bordede labocacomo las ranuras del tapdnse mantienen limpiasde material.Es recomendable que el frasco se abra en ambientes secos e inmediatamentedespues de su uso s evueIva a cerrar. No precisan retriqeracion aunque las bajastemperaturasprolongansuefectividad. Dadala naturalezadesuenvas e, los mediosdecultivoADSA-MICROpueden mantenerseporlargosperiodosde tiempoen un lugarfresco y seco. Si los medios sehumedecen quedanapelmazados y duros, perdiendo sus5propiedades, e incluso permitiendo el crecimiento directo demicroorganismos en ellos.Enestascondicionesno debenusarse. Sinembargo, ya pesar dequepor 10 generalsuaspectoessecoypulverulentoen algunoscasos(MRS, Bismutoysulfite>, etc.) sepuedenpresentar como humedecidos yuntosos. pero sin apelmazamiento. siendo estesu aspecto normal y sinqueellosignifiqueningunaalteracion.Decualquiermodo, laconservacionde losmediosdeshidratadosnoesindefinidaypor ell ono esrecomendable el almacenamientoen grandescantidades, sinoqueseaconsejaun pequeno"stock" paraquedeest a formasepu edamantenersiempreunarotacion dp, medios recien fabricados. Es recomendable fechar los botes de mediocuandose reciben para evitar quese acumulen los masantiguos.ALMACENAIVIIENTODELOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOSAunque10 mas adecuadoes preparar los mediosa medidaquesonnecesarios, esfrecuente que se almacenen ya preparados y es teriles para ahorrar as! tiempo depreparacion. Enestascircunstanciasel mayorpeligroesladeshidrataci6nycualquierpr sc aucionquelaevitepr oloriqaralavidadel medio, queenninquncasosesupo ndrasuperior a 4-6semanas. Enestesentidolosrecipientescontaponroscadoherrnetico(tubos0 frascos) sonmas aconsejables quelastorundasdealqodon. Por 10general unarefriqer acion moderada ( 4 C) alargala vida delmedio perc debe tenerse en cuenta queel ambienterefrigeradoes muysecoyfavoreceladeshidratacion. Inclusoenalgunoscases. como los medios al tioglicolatoy en general todos los recomendables paraanaerobicos, semantienenmejor a temperaturaambiente yaqueas! incorporanmenosaire La incidenciadela luzdirect a debe evitarse siempre pero sobre todo enlosmediosque Ilevan incorporados alqun tipo de indicador.Losmedios solidos para placa se mantienen mejor en el frasco original queya vertidosenpl acas. Sinembargo.estost arnbie n puedenprepararse y almacenarsesi se observanlas siqui en t esprecauciones:a) Refr iqerarlos inmediatamente despues de su solidificacion. controlando laesterilidaddel lotecon el minimarepr eseruativo.b) Si se prevee una duracion mas prolongada del almacenamiento, las placas seprecintaran individualmente con cinta adhesiva impermeable, y a ser posible seenvasaran t arnbien de forma individidual.c) Si el almacenam iento vaa sersuperior a unpar dediasseenvolveranenbolsas deptastic opara evitar la de shidratacion.De cualquier forma, la forrnaciondeaguadecon densacionserainevitable, por 10cuales recomendable que las placas se mantengan en posicion invertida. EI agua decondensaci6nfacilitamucholacontaminaci6nydebeevitarsevertiendoel medioenplacas 10 mas frioquese pueda.Los medios mantenidos en refriqe racion deben atemperarseantes de su usayesrecomendablemantenerlosunas horas atemperaturaambienteantesde inocularlos,evit andos e asi lacondensac iondehumedadambiental enla superficie ylosretrasos (yeventualmentefallostotales) en el crecimiento.Nodebenusarsenuncamediosdecultivopreparadosyalmacenadosenlosqueseobserve una fuerte deshidrat acion. que se manifiesta por la excesiva agua decoridensacion 0 por disminuci6n del volumen (en medios liquidos) aumento deconcentraci6n0 precipitaci6n(medioIlurdos0 liquidos) 0 retraccion. cuarteamientoyprecipitados (en medios sof idos). Tampoco deben utilizarse las placas con lassuperficies excesivamentesecas 0 quepresentencambiode color aparente.6REFUNDIDODELOSMEDIOSSOL/DOSAunqu e la rnavor iadel os med ios decult ivoso l i dos pueden almacenarse preparados vesteril es en I rascos. pararefundirl os Vvert erl os en pl aca cua ndoseprecisen. est apra cticenode bell evarsea cabocon losmed iosqu enopre cisaneste rili zacionni co naquell osqu eti ene nun pHde 50 infer ior porqueal te ran suscarac t erist ic as.Parael ref undi do 10 masaconsej abl eesban emarla0 el aut oclavea vapor fluentedurante30minut os . Enninguncasose aplicara ca l or dir ecto.Sin embargo debet enerse en cuenta que lo s medi os refundidos presentan unamarcadat enden ciaal oscureci mient o V precipitacionsi se manti enenfundidosduranteperiodosdet iemposuperio resauna horaV temperaturasco mp re ndi dasentrelos 45-65C. V qu e t odoel l osupone unaperdidadesu capacid adnutritiva detal modo queelrefund idode losmed iosso li do sdebeevitarseen 10 posible.ALTERACIONESFRECUENTESPORII\ICORRECTARECONSTITUCIONAf in de orie nta r enlos posibles f al los derec on sti tu ci onde los medios deshidratadosseof receaco nti nuac io nuna seriede losmasfr ecuentesV sus posiblescaus asEFECTOVariaci6n depHCAUSASxSobrecalentamientopor Excesiva esterilizacionMezcl aheteroqeneaRefundidosrepetidosAlmacen ami entoinadecuadoSolubiiizac ionincompl et aOscurecimi entox Recipi ent es de cri st al noi ner t esxAguano adecuadaxContarninacionqu imi ca delosrecipi ent esxMaladet erminaci on del pH(probable ment emedi omuvca l iente. EnfriarloV volver amed ir) .xAgua no adecuadax Pocoperiodode imbibi ci 6n 0 mez cl ahetercqeneaqueprovocasobrecalentami ento.xRecipientedemasiadopequ sfi oque nopermiteuna buenamezclav/oconveccion.xHaymediosqueIlevancompo nent es tot al menteinsolubles(EMS. tetrationato. bi srn ut o, etc .)xSobrecalentamientoxRefundidosrep etidosxMezcla heteroq en ea- so brec ale nta mie nto.7GelificacionincompletaPerdidade lascapacidadesnutritiva0diferencialxVolumende agua equivocadoxAgar no solubilizadoxSobrecalentamientoen pHacidoxRepartoincorrectopor falta de mezclado.x Refundidosrepetidos - Sobrecalentamiento.xSobrecalentamientoxRefundidorepetido- Sobrecalentamiento.xMezclaincorrecta.xDescompensacionpor el inoculo(adiciondeinhibidoresoel ectrolitosexcesivos).DIFEREI\lCIACIONDELOSMEDIOSDECULTIVOEnlasdesignaciones ADSA-MICROyasealudea la consistenciafinal del mediodecultivo. tlamandos eAGARalos mediossolidosconuncontenidode agar igual 0 superior al 1%MEDIOFLUIDOalos mediossernisolidoscon uncontenidode agar inferior al 1%CALDO a los medios de cultivo Ifquido con componentes orqanicos indefinidos(pept ona. extractosde orqanosytejidosetc.)SOLUCIONESNUTRITIVASalos mediosdecultivodecornposicionqufmicadefinida.MEDIO SELECTIVO es aquel que solopermite el crecimiento de unbiotipo0unos pocosbiotiposentrelos quesepresentanen el inOculo.MEDIODIFERENCIAL es aquelque permitela distincion entre tipos culturales proxirnosyrelativamenteparecidos.MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO es aquel que favorece mas el crecimiento de undeterminadobiotipopor encimade los otrospresentesen el inoculo.MEDIOGENERAL es aquel quesoporta el crecimiento de una amplia variedad demicroorganismossinexigenciasnutritivasespeciales.8AGARADEKI NGRef. 1.001ESPECIFICACIONMedioparaexaltar laproduccionde piocianinaenPseudomonasaeruginosa.FORMULAENgiLPeptonade carne 20,0Cloruromaqnesico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4Sulfatopotasico , 10,0Agar-agar 13,0p'Hdel medioapuntode uso aprox. 7,2INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONSuspender45 gramosdepolvoenunlitredeaguadestiladaque contenga10 ml deglicerol y deja rioembeber durante10 minutos. Calentar conaqitacionconstantehastaebullicion. Distribuir enrecipientesadecuadosy esterilizaral autoclave durante quinceminutos a 1210C. Si se utilizan tubes. dejar sol idificar con curia corta y fondo abundante.DESC RI PCIONEI medio Afueformuladopor King, Ward yRaneyen1954 paraexaltar la producciondepiocianinaenPseudomonasaeruginosa. La piocianinaesunpigmentoazulado quedifunde.enel mediodecultivoycuva produccionesvariableentrelascepasde estaespecie bacteriana, dependiendo esencialmentedelas condiciones decrecimiento. Enocasiones, a pesar deque esterne dio exaltaespecialmentela produceiondepigmentoazul. puedenaparecer simultaneamenteotrospigmentosdecoloresverdosos(piover-dina) 0 marrones (piomelaninas)queIlegana enmascararla piocianina. Enestoscasosse recomienda utilizar simultaneamente el AGARPIOCIANOGENO(Ref. 1-158) queinhibe tam bien la produccion de los pigmehtos secundarios. En cualquier case, lafluorescencia y otros pigmentos de los pseudomonas pueden observarse en otrosmedios de cultivo mas adecuados, como elAGARFLUORESCEINOGENO (1-085) y/o elAGARBDEKING(1-029).TECNICASDEusaRECOIVIENDADASLos tubesinclinados0 placasdepetri seinoculan por estria superficial y seincuban a30-320C durante 4-5dlas. EI uso deplacas tiene elinconveniente dela fuerte deshidra-tacion del medio durante la incubacion,por 10 que es mejor utilizar tubos inclinados,cui-dandolaaireaci6npara 10cual sedebenaflojarlostaponesroscados0 sustituirlos porlas clasicastorundasdealgod6n 0 loscapuchonesde aluminio.,9En cepasrec ienaisladasde materiales patol6gicos,la producci6n de pigmentos sue!emanifestarse deformatemprana,a las246 48horasdeincubacion.peroen cambio, enlasprocedentesde agua, alimentos 0 suelo. lapigmentaci6npuedeser tardia.Cuandoel pigmentonotieneel acostumbrado color azul sedebea ta producciondedos0 massustanciascoloreadas. En estas circunstancias y si nose confirma sobre otromediodecultivoesrecomendablel a confirrnacionporextracci6n: Sobrelacuiiadelmedio de cultivo se aiiaden 0,5-1ml de cloroformo y se agita durante unos minutos paraquese disuelva lapiocianina. que colorea de azul el disolvente. Acontinuaci6nseacidificael cloroformo con unas qotasdeHCI y se obtiene unrapido viraje deazul a rojo,confirmandoasf lapresenciadepiocianina.EI mediopreparado, tieneuncolor claro y debe mantenerseen sitiofresco yoscuro.REFERENCIASKing E.O.. M. WardyD.E. Raney(1954) J. Lab. Clin. Med. 44:301.Cent roNacional deAlimentacion y Nutricion, (CENAN)Metodos Recomendados parael Examen microbioloqicodeAlimentosy Bebidas. Madrid. 1976.AGARPARABACTERIOLOGIARef. 7.004Agar-Agar purificado, de tipo americano. que cumple las especificaciones USP/NF XXy APHA especialmente indicado para la preparaci6n de medios de cultivo. LassolucionesaI1.5% dangeles suficientemente consistentesparapoder hacer estrias ensuperfi cie.Sus caracterfsticasmas importantesson:Puntode fusion: 850C.Temperaturadegelificaci6n: 340C.Tiempode disoluci6n: 1minutoa1000C.Tamaiiopartrcula: 60/120mallas.pHde lasoluci6nal 1,5%despuesde esterilizar: 6,8Humedad: 10%.Cen izas: 4,5%.Nefelometria: 35 .10Ref. 2.002ESPECI FICACIONCALDOACMediodecultivoIfquidodealtopodernutritivomaramicroorganismosnutricional-menteexigentes._FORMULAengiLPeptonade carne .Peptonade caseina .Extractode carne .Extractode levadura .Extractode malta .Dextrosa .Acidoascorbico .. . .pHdel medioapuntode usaaproximadamente7.3INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCION10,010,03,03,03,05,00,2Disolver 349., depolvoenunlitrodeagua.calentandosi esnecesario. Distribuirenrecipientes adecuados y esterilizar al autoclavedurantequinceminutosa1210C.Ref. 3.003ESPECIFICACIONMEDIOFLUIDOACMediode cultivo en forma fluida. de alto poder nutrit ivo. para microorganismosanaerobiosomicroaer6filos exigentes.FORMULAENgiLPeptonade carne .Peptonade caseina .Extractode carne . .Extractode levadura .Extractode maltaDextrosa .Acidoascorbico .Agar-agar .pH del medioapuntode uso7,3 aprox.10,010,03,03,03,05,00,21.011II\1STRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONSuspender 35 g., de polvo en un litrode agua destiladay dejar embeber el agardurante10minutes. Calentarcon aqit acionconstantehastaebullicicnydistribuirenrecipientesadecuados. Esterilizar el autoclave durante quince minutos a 1210C. Enrriarlos recipientespara impedir lafloculacionirregular del agar.DESCRIPCIONEI medio decu Itivo AC, ya seaen su forma I fqu ida como flurda constituye unmagnificosoportepara el crecimientode cualquier tipode microorganismo.Suextraordinariariquezanutritivapermitesatisfacer las exigenciasdefactores decrecimientoaunenloscasos demicroorganismos mas delicados, al mismo tiempo quela inclusion de acido ascorbico proporcionasuficiente potencial reductor para quepuedancrecer losanaerobiosmasfrecuentes. Sin embargo, cuandoseusaconestafinalidad es mas aconsejable la ut iliz acion del medio f1uido, inoculando!o despues de uncalentamientoabanemariaen ebullicion para eliminar el airedisuelto.TECNICASDEusaRECOMEI\IDADASAunqueninqdnorganismo oficialloha adoptado como medio decultivo rutinario.suutilizacion como medio complementario y de confirrn ac ion en los controles deesterilidad escadavez masfrecuente.REFERENCIASReed, G. B. yJ. R. Orr. (1943) J. Bact. 45:309Kolb, J. yG. Schneiter (1950) J. Bact. 59:401Ref. 1.217ACINETOBACTERAGARESPECI FICACION.Medio de cultivo solido para el aislamiento de bacterias gramnegativas nofermentadarasdel grupode Acinetobacter.FORMULAENgiL12Peptanal.actosa .Mattosa .Sales biliares .Purpurade bromocresol .Clorurosodico .g ~ g r .pHdel mediaapuntode usaaprox. 6,820,010,010,01.250,025,0015,0INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONSuspender 61 ,3 go, depolvoenunlitrodeagua destiladaydejar embeber el agardurante 10 minutos. Calentar con aqitacion const ante hasta lIegar a ebulticion.Distribuir en recipientes ade cuados y esterili zar al autoclave durante 15 minutos a 1210C.DESCRIPCIONEstemedi o de cult ivo fuepropuesto por Mandel. Wright y McKinnon como medio deaislami ent o para l as bacterias gamnegativas no fermentadoras del grupo Mima-Herell ea.sobrelabasedesudistintaapari encia col oni al.TECNICASDEusaRECOMENDADASSobrel asup erf ici edelas placasrec ien preparadasseIlevanacabolasestriasdeagot ami ento a part ir dedilu ciones dela mu estraen examen. Seincuban 24horas a 370C.. y se obs erva la morfologiacolon ial. Por 10genfl ral. la concentr acionde sales biliaresimpide el cre cimiento de l os grampositivos. Los gramnegativos fermentadores delactosa0 maltosaproducencolonias grandes decolor amarillorodeadasdeunhalo deestemi smocolor. Lasbacter ias gramnegativas aparecencontamaiiosmasdiscretos ycoloracionessuaves detonosverdosos .REFERENCIASMandel. A.D" Wr ight. M.. yMcKinnonJ.M.(1964). J. Bact. 88:1524.AGARPARAACTINOMICETESRef. 1-003ESPECIFICACIONMediodecul t ivosol idopar ael mant enimi ent oypropaqaciondeactinomicetosdeacuerdoalaformulaci6ndeAjell oy col aboradores.13FORMULAENgiLPeptonade carnePeptonade caseinaExtractode coraz on .Extractode levadura .Dextrosa .Fosfatopot as ico .Cloruroso dico . . . . . . . . . . . . . .Almid6n .Sulfatoam6nico .. . .Cisteina . . .. . . . . . . . . . .Sulfatomaqnesico .Clorurocalcico . . . . . . . . . .g ~ g r .pHdel medioapuntode uso 7,0aprox.INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCION10,04,010,05,05,015,05,01,01,01,00,20,0120,0Suspender77gramos de polvoenunlitredeaguadestilada y dejarembeberel agardurante10minutos. Calentarconaqitacionconstantehastaebuliicionydistribuir enrecipientes adecuados. Esterilizar al autoclavedurantequinceminutos a1210C.CAlDOPARAACTINOMICETESRef. 2-003ESPECI FICACIONMedio de cultivo lfquido. susceptible de fluidificarse, para el mantenimiento ypropaqacion deactinomicetos patoqerios de acuerdocon faforrnulacion deAjelloycolaboradores.FORMULAEI\I q/LLa forrnuiaciondeestemediodecultivoesexactamentelamismaqueladel mediosolidocon latotal exclusiondel agar.INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONDisolver 57gramos de polvo en unlitro deagua destilada, calentando si es necesario.Distribuir en recipientesadecuados y esterilizar alautoclave durante 10 minutos a 1210CSi sedeseaunrne dio Iluldo. incorporar 7g, deagar-agar y reconstituir deacuerdoa14Jlas instrucciones para el mediosolido. Despues de la esteriliz acion enfriar raoida ysuavementepara evitar lafloculacion del .agar.DESCRIPCIONBasicarnente. estos medios decu Itivo son unarnodificacio n de Ajello y colaboradoresal clas icomedio demantenimientodeactinomicetospatoqenosdePine y Watson. Nopresentan nin qun agente inhibidor por 10 que no son recomendables para elaislamiento,pero su discrete poder reductor y elevada capacidadnutritivaloshace muyadecuados para anaerobicos no demesiadoexigentes.TECNICASDEusaRECOMENDADASSi lascondicionesdecrecimientosondeanaerobiosisestrictalaincubaciondebehacerse en los jarros especiales. pero si la anaerobiosis solo es moderada puedeconseguirseunabuenarespuestadecrecimientoprecintandolostubosconel Agar deSellado Anaerobico(Ref. 1-174) 0 conlosclasicostaponesdepirogalatoalcalinoquepueden prepararse dela forma siguiente: Serecortala torundaa niveldel borde del tuboy sehunde unosdoscm. Si laguatanoeshidrofi!a, secolocaunpocodealqodonyseimpregnadesoluciondelpirogalol (Sol. aq. de Ac. Piroqalico aI70%). Seaiiaden 506gotasdeuna solucional 10%decarbonatoso dico. Todoel conjuntosecierr a conuntapondegomade forma hermetica.EIuso del medioIfquidopermitelacoriqelacionposterioral crecimiento0 biensuut iliz acion comosistema de pr oduccion masiva para preparaciones celulares. Ensuformafluidaelcaldo para actinomicetos alcanza fuertes potenciales dereduccion. y porellopermiteunfacil crecimientoalosanaerobiosestrictos.La unica diferencia en10que a la formulacion se refiereentre elcaldoyla forma solidaconsiste en la incorporacion. en esteultimode20.0g/I de agar-agar comoagentegelificante,queIe da suficiente durezacomoparapermitir elcrecimientoensuperficie.REFERENCIASPine yWatson(1959) J. Lab. Clin. Med. 54:107Ajello. Georg, KaplanyHauffman(1963) CDCLabManual forMedical Mycology, U. S.P.H.S. Atlanta. Ga:Lennette, SpauldingyTrouant (1974) Manual of Clinical Microbiology. ASM2d. Ed.Washington.15AGUADEMARARTIFICIALRef.3-005ESPECI FICACIONSustitutivo del agua de mar, especialmente indicada para la microbiologia delpetr6leo.FORMULAENgiLCloruros6dicoanhidro .Sulfatos6dicoanhidro .Cloruromaqnesicoanhidro .Clorurocalcicoanhidro .Clorurode estroncio . . . . . . . . . . . . .Cloruropotasico . .Bicarbonatosodico .Bromuropot asico . .Acidob6rico . .INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCION24,534,1111,201.160,0420,70,10,10,0029Disolver 42 q.. de polvo en un litro de agua destilada y repartir en recipientesadecuados. Esterilizar al autoclavedurante15 minutosa1210C.DESCRIPCIONEI aguademar artificial seha formuladoparaobtener unmedio alternative y definidocon el cual sustituir al agua demar en cualquier laboratorio. ya que responde a lacomposici6nsalinamediade los ocean os. Esta particularmenteadecuadaparapoderefectuar estudios sobrela influencia dela microfloraenlosderivadosdel petr61eo yenlos tratamientosde crudesquepuedanverterseal mar.AGARALALCOHOLFEN I LETI L1CORef. 1-006ESPECIFICACIONMedio selectivopara bacteriasgrampositivas, especialmenteindicadoenmuestrascon fuertecontaminaci6nde gramnegativos.16FORMULAENgiLPeptonade caseina .Peptonade soja .Cloruros6dico .Fenil-etanol .'. : .Agar-agar .pHdel medioapuntode uso7.3 aprox.INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIO,\115.005,005,002,5015,00Suspender42,5g.. de polvoen un litrodeaguadestiladaydejar embeber el agarduranteun os10minutos. Calentar conagitaci6nconstantehastaebullcion ydistribuirenrecipientes adecuados. Esterilizar al autoclavedurante 15minutos a121 C.DESCRIPCIONEstemedioha sido recomendado por diversos autores parala utilizacionparalela conotrosnoselectivos comoel deTripticase y Soja(Ref. 1-200)cuandoenlaobservacionrnicroscopica de la muestra se ha comprobado la abundante presencia de bacilosgramnegativos.EI feniletanol inhibeel crecimientodelafloraacornpahantesinafectarapenasalosgrampositivos, quesuelendar colon ias de tarnanomedio, inclusolos estreptococosmas exigentes. Enalgunos cases siriernbarqo. es aconsejablequese prolongue laincubaciona37 C, durante48 horasyaqueayudamuchoaladiferenciacion.EI medio deshidratadosiempre presenta un aspecto untuoso y ruirnedo que noimplicaniriqunsignode alteraci6n.TECNICASDEusaRECOMENDADASLas placasse inoculan en superficie. directamente delhisopo rectal 0 biena partir dediluciones adecuadas de la rnuestra. para que crezcan las colonias separadas. Seincuban a 37C durante un periodo de 24 horas y se observa la diferencia colonial. Por 10general, la selec.tividadesbuena. por quesi bienenocasionespuedeaparecer algunacoloniadegramnegativo, sutarnafiosueleser muyinferioraladeresgrampositivos.Las condiciones decultivo puedenmejorarse sin perder la selectividad con la adicionde un 5%de sangredesfibrinada, pero el medioas! preparadono esadecuadoparaobservar las reacciones de hemdlisis. Con este fin es mucho mas aconsejable lautif izacidn deAgar Selectivopara Estreptococos(Ref. 1-071).REFERENCIASPagey Rawlings(1959) A.J. Med. Tech. 25:389Holzman(1958) A.J. Med. Tech. 24:32717AGARPARAALGASRef. 1-007ESPECI FICACIONMediodecultivosolidopara el aislamiento ycultivodealgasdel suelo. deaguasyaguas de des echo.FORMULAENgiLNitratosodico .Fosfatodipotasico .Sulfatornaqnesico .Cloruroarnonico .Clorurocalcico : .Cloruroferr ico .Agar-agar .pHdel medioapuntode uso 7,0 aproximadamenteINSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCION1,0000,2500,5130,0500,0580,00315,000Suspender 17 g., de polvo en un litro de agua destiladaydejar embeber el agardurante10minutos.Calentar conaqitacionconstante y Ilevar a ebullicion. Distribuir enrecipientesadecuadosyesterilizar al autoclavedurante15 minutosa1210C.DESCRIPCIONLa equilibradacornpcsiciondeestemediodecultivopermiteunbuendesarrollodelas algasen tanto que resu Ita deficitario paraloshongos y bacterias q ue0nocrecen0 10hacen con dificultadsobreel. Tambien resulta apropiado para el ensayo de ciertosalgu icidas pero esencialmente estarecomentadoparael mantenimiento y cultivodelasalgas patronen este tipo de ensayo0parael aislamiento delos contaminantes en aguas.TECNICASDEusaRECOMENDADASPara el mantenimiento de cepas de algas se recomienda una incubacion atemperaturaambientebajounaadecuadafuentede luz (natural, tubafluorescente 0larnpara incandescente)hasta obtener unbuen crecimiento,es decir, alrededor de una0dos semanas. En estas condiciones y sin quese produzca des ecacion del gel, lossubcultivospueden mantenersehast a dos meses.181jI,,,CALDOPARAALGASRef. 2-007ESPECIFICACIOI\lMedio decultivoliquido paraalgas y cianobacterias,recomendado parael bioensayode alguicidas en agua.FORMULALa composic iondeeste caldo decultivoes exactamentela misma queel medio sdlido(Agar para algas 1-007), con laornisiondel agentegelificante.INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONDisolver 1,87g., de polvoen un litrede aguadestiladaydistribuir en recipientesadecuados. Esterilizar el autoclavedurante15minutos a1210C.DESCRIPCIONEstemedioIfquidoesmuyadecuadoparael cultivodealgasycianobacterias yest aespecialmente adaptado para la preparacion del inocu!o y bioensayo de alguicidassequn la t ecnicade Fitzgerald. Debidoasu baja capacidadenerqeticalos horiqosybacteriasengeneral nosedesarrollanenel 0 10hacenmuymal, mientras quelasalgasencuentran todos los nutrientes para su crecimiento. a exc epcion de la fuenteerierqetic a.TECNICASDEusaRECOMENDADASEI procedimientode Fitzgeraldpara laverificacionde lacapacidadalguicidadelosproductosqufmicos en el agua es lasiguiente:a) Preparaciondel inoculoSeprepareel caldopara algasysedistribuyeen matraceserlenmeyer de50 ml araz6n de 20rnl/rnatraz. Se esterilizayse mantienerefrigerado hastasu uso.Periodic amant eseinoculaunode losmat racesconun par de asasdel cultivodeChIarella emersonii mantenida sobre agar inclinado (Ref. 1-007) y se incuba atemperaturaambientehastaobtenerbuencreci'miento. Estecultivoseut iliz aracomoinoculo enel bioensayo, pero no debera tener, enel momenta deusarlo mas de 30df as.b) Bioensayo1.- Muestras, Se preparaunlitrodeaguaenel quenosehayaahadidoalguicidayotrolitroenel queestedosificadoel inhibidor. ya cadaunadelasrnuestrasseah ade n120mgde nitratesodicoy2,5 mgde fosfatooipotas ico.2.- Tecnicasde ensayo. 5epreparaunaserieduplicadadematraceserlenmeyer de50ml enlos que sedosifican 5,12.5 y 25ml, respectivamente deagua con alguicida y seaiiadeaguasin inhibir paraque entodoslos rnatraceshavaunvolumenigual de25mi.19Asf mismose disponen1 62erlenmeyers con 25ml deagua sinalguicidaparaqueactuencomocontrol 0 testigo.Todoslosmatraces seinoculanconunvolumenigualdecultivo-in6culo. suficientepara que laconcentraci6nde algasquedenalrededor de300.000cetulas/rnt en losmatraces. Como norma practice (aunque noexacta)estaconcentraci6napenas produceuntinte verdosoal medio decultivo. Si es preciseseajustael in6culo previamente porcontaje 0 colorimetrfa.Losmatracesinoculadosseincubana temperaturaambientebajounailuminaci6nhorn oqerieaynormalizada[p. ej. tubosfluorescentesde20Wtipodfa).Diariamenteserealizanrecuentosconunacarnaracuenta-gl6bulos(tipoThoma0semejantes)a partir de todos y cadauno delosmatraces. EI ensayo seda por finalizadocuando enloserlenmeyer-control se alc anz a unaconcentraci6n celular media de 5x1 06celulas/rnl. con lacual secornparanlaslecturasdelos matracescon agua-problema.3.- Interpretacion. La conc entracion de inhibidor de los matraces que hayanproducidoel mismocrecimientoquelos controlesseconsideranot6xica0 ineficaz.La concentraci6nquehavamantenidola poblaciondealgasalrededordelascifrasinicialesseconsideraalquistatica.Lasconcentracionesqueal final del ensayohayanreducidolapoblaci6ninicial seconsideranalguicidas, endistintogradode eficacia, sequnlareducci6nalcanzada.REFERENCIASAllen, (1952) Arch. Mikrobiol. 17:34Fitzgerald(1962) Water and SewageWorks. 109:361MEDIOFLUIDOPARAANAEROBIOSRef. 3-008ESPECI FICACIONMediodeutilizaci6ngeneral para el cultivode anaerobiosexigentes.FORMULAEI\I giL20Peptonade caseina .Peptonadesoja .Extractode carne .Extractode levadura .Extractode hfgado .Dextrosa .Clorurosodico .Tioglicolatoso dico .L-Cistina .Sulfitosodico .Formaldehidosulfoxilatosodico .Resazurina .Agar-agar . . . . . . . . . .pHdel medioapuntode uso 7.2 aprox.15.0003.0003.0003.0003.0006.0002.5000.5000.3000.1000,5000.0010,500INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONSuspender38 gramosdeootvoenunlitrodeaguadestiladaydejarembeberel agardurante 10 minutos.Calentar conagitaci6nconstante yIlevar a ebullicion, Distribuir entubasy esterilizar el autoclavedurante15minutos a1210C.DESCRIPCIONEI MedioFluldopara Anaerobiosesunamodificac iona layaclas ic a deBrewer,paraconseguir un mayor poder reductor, al mismotiempoquese aumentasu capacidadnutritiva.TECNICASDEusaRECOMENDADASEstemedicdecultivoest a especialmenteindicadoparalarecup er acionymanteni-mientode anaerobios muyestrictos. percen cambiosuusanoes recomendableencontroles de esterilidad debido a su color, Aiiadiendo agar hasta alcanzar laconcentracionde15 g/I, elmedia sehace adecuado para utilizarlo enplacas depetri, yaseaconincubacionenjarra deanaerobios. enloscasasmasexigentes, 0 bien sinella,enlosaerotolorantes, ya quesufuertepotencial reductor permitesu usa conplacasdeBrewer 0 bienunasiembrade lamuestraen masacon 'doblecapade medio.REFERENCIASBrewer (1942) Science95:587Kemptony Sanclemente(1960) Appl. Microbiol 1:362Ref. 1-026ESPECI FICACIONAGARA.P.T.Mediosolido, de usa general, especialmente desarrollado para el cultivo de loslactobacilos heterofermentativos que provocan el verdeamiento ge los productoscamicos.FORMULAENgiLPeptoriade caseinaExtractode levaduraClorurosocico .Fosfatopotasico .Citrateso dico .Dextrosa ,Polisorbato80 .Sulfatomaqnes ico .Cloruromanganoso .Sulfateferroso .Tiamina .Carbonatesodic o .Agar-agar .pHdel medioapuntode usa6,7 aprox.10,0007,5005.0005.0005,00010,0000,2000,8000.1400,0400,00011,25015.00021INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONSuspender 59,5 gramosdel polvo en unlitro deaguadestilada y dejar embeber el agardurante 10 minutos.Calentar conaqitacionconstante yllevar a ebullicion. Distribuir enrecipientesadecuadosy esterilizar al autoclavedurante15 minutos a1210C.CALDOA. P.T.Ref. 2-026ESPECI FICACIONVersionliquidadel agar delamismadenominacion.especial mente adecuado paraelcultivode bacterias del acido lactico.FORM ULALacomposicionde estecaldode cultivocorrespondeexactamentealadel mediosolido(Agar APT ref. 1-026) con laornisiondel agentegelificante.INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONDisolver 44,5gramosdepolvoenunlitrodeaguadestilada, calentandoligeramentesi espreciso. Distribuirenrecipientesadecuadosyesterilizar al autoclavedurante15minutosa1210C.DESCRIPCIONEstos dos medios de aplicacion general (All PurposewithTween), originalmenteformuladosporEvansyNivenhan sidoutilizadoscongranexitopara el aislamientoycultivodelasbacterias del acido lactico que alteranalimentosy requierenunalto nivelde tiamina. Por este motive. prescindiendode la quepueda aportar lapeptonay elextractodelevadura, el medioseha suplementado conunacantidadsuficiente deest avitamina.Ensusdos versiones,solido yliquido. el medio APThademostradosueficaciaenladeteccion delos lactobacilosqueprodLicen verdeamientodela carne y suplementadoscon un 5%de zumos de fruta, tal como preconiza la APHA, se convierten en uninsustituible medio deprospeccion de cualquier tipo debioalteradores alimentarios. Sinembargo, al noincluir ensuforrnulacio n ninqiinagente inhibidor,carecenenabsolutode capacidad select iva y por ello soportan el crec irniento de casi todos los tiposmicrobianos.TECNICASDEusaRECOMENDADASLat ecnica habitual dedeteccionde bacteriasdel verdeamientoes lasiguiente: EImaterial a examinar se tritura cuidadosamente en agua peptonada (Ref. 3-156)y usando22el mismo diJuyente seprepara unbanco dediluciones. De cada unadelasdiluciones seinocula, portriplicadoyenmasa. placasdepetri, queseincubana 32 Cdurante48hor as. Pasado este tiempo se enumeran las colonias por la recnica habitual y seseleccionanlosd istintos tipos. Cada uno deestos se siembraen caldo APT y se incu ba a32 C duranteotras24horas. yapartirdeestoscultivospurossehacenestriassobrerebanadasdesalchichadeFrancfurt. Estasrebariadas junto a uncontrol sininocular, se'incuban en una carnara hurneda para verificar la capacidad de verdeamiento. Laidentificaci6nfinal se hacepor morfologiaycaracteres bioquimicos.REFERENCIASEvans y Niven(1951) J. Bact. 62:599Lessel y Rogosa(1971) Int. J. Syst. Bact. 21:238Speck, APHA/lntersociety (1976) Compendiumof methods for the microbiologicalexaminationof foods. Washington.CALDOAZIDADEROTHERef. 2-022ESPECIFICACIONMediopara ladetecci6nyenumeraci6ndeenterococosenagua (D. 607/75, B.O.E.29-3-1975).FORMULAEI\I giLPeptona de carne . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0Peptonade caseina . . . . . . . . . 10,0Dextrosa 5,0Cloruros6dico 5,0Fosfatodiootasico . . . . . . . . .. 2,7Fosfatornonopotasico . . . . . . . . . . . . . . . . 2,7Azidas6dica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2pHdel medioapuntode uso. aproximadamente, 7,0INSTRUCCIONESPARALARECONSTITUCIONDisolver35,6gramos depolvoen unlitro deagua destilada, calentandoligeramente,si espreciso. Repartir entubosa raz6nde10 ml/tubo y esterilizar al autoclavedurante15 minutos a 121 C.Para el medio a doble concentraci6n disolver 71,2giL y repetir laoperaci6n.DESCRIPCIONEI caldoazidadeRotheseha utilizado reiteradamente desde 1948 parala detecci6n23deestreptococosfecales. Va queenlascomparacionesconotrosmediossemejantessuele dar resultadospositivos mas altos. Su eficacia radicaenla seleccion a favor delosenterococos que producelaazidaso dicaqueinhibelaflora acompahante por bloqueode las cadenasrespiratorias.Estemedio se utiliza como enriquecimiento prima riode muestras de tipo alirnent icio.sobretodoverduras congeladas, V porel Decreto607/75seadoptooficialmenteenEspana para el examen bacterioloqico de aguas mineromedicinales, igual queanteriormente(1.0. de15-3-1960) sehizoenFranciaparael examende lasaguasdeconsumo.TECNICASDEusaRECOMENDADASEstreptometrfaenaguasA cadauno delostres tubos con10ml. de medio doble concentrado seahaden 10ml.de agua aexaminar.A otros tres tuboscon10 mi. demedio a concentracion sencilla, se ahaden 1 ml delarnuestra Va otros Ires con10ml demedio a concentracion sencillase aiiaden 0,1 ml deagua.Seincubana37 C, V se realizan lecturasalas 124 V 48 horas.Todos los tubosquepresentanturbidez debidaa crecimientoseconsiderancomoPRESUNTIVAMENTE POSITIVOS Vdeberan confirmarse sobre el medio de l.itskv(Referencia2-028). Todos los tubosqueresultenpositivosen estesegundoensavoseranlosque se consideranparaelcomputedel Nurnero masProbable sequnlas tablasadjuntas.CuandoseconsideranmuestrasdeotrotipodebehacersepreviamenteunadilucionenRinger 1/40 aguade, peptoriaV procederal inoculodelos tubosdeformaanaloqa.Enlos casosenquesesospechauna fuertecontarninacionesconvenienterealizardilucionesprevias al inoculo.IndiceNMPpor100ml3tubesde 3tubosde 3tubosde10ml 1ml 0.1 ml0 0 00 0 10 0 20 030 1 00 1 10 1 20 130 2 00 2 10 2 20 2324ESTREPTOMETRIA. Tablan,ONumerodetubosquedanreacci6npositivaentre3, B,O.E. Decreta 607/15, pagina6475Umitesde confianzadel95 por 100Limite Limite.inferior superior0396930,08513I6,19,2 126,29,31216ESTREPTOMETRIA. Tablan.O3, B.O.E.95 por 1003tubosde 3tubosde 3tubosdeIndiceUmite Umite10 ml 1ml 0.1 mlNMPinferior superiorpor100ml0 2 31603 0 9.40 3 1 130 3 2 160 3 3191 0 03.6 0.085 201 0 17.2 0.87 211 0 2 111 0 3151 1 07.3 0.88 231 1 1111 1 2 151 1 3191 2 0111 2 115 2.7 361 2 2201 2 3241 3 0161 3 1 201 3 2241 3 3292 0 0 9.2 1.0 362 0 1 14 2.7 372 0 2 202 0 3262 1 015 2.8 442 1 1 202 1 2272 1 3342 2 0213.5 472 2 1282 2 2 352 2 3422 2 0292 3 1362 3 2442 3 3 532 3 3533 0 0233.5 1203 0 1 39 6.9 1303 0 26425ESTREPTOMETRIA. Tablan.O3,B.O.E. Decreta 607475a pagina 6475Numerodetubos quedenreecci 6nUmltes e conflenzedelposit iveentre95 por 1003tubos de 3tubos de 3tubos deIndice. limite limite10 ml 1ml 0.1 mlNMPinferior superiorpor100ml3 0 3 953 1 0 43 . 7.1 2103 1 1 75 14. 2303 1 2 120 30 3802 3 2 442 3 3 533 0 0 23 3.51203 0 1 39 6.9 1303 0 2 643 0 3 953 1 0 4 3 7.1 2 103 1 1 75 142303 1 2 120 30 3803 1 3 1603 2 0 93 15 3BO3 2 1 150 30 4403 2 2 21 0 35 4 703 2 3 2903 3 0 240 36 13003 3 1 460 71 24003 3 2 1100 150 48003 3 3460REFERENC IASBolet ln Oficial del Estadode '29- 3- 19 75. Decreta60 7/75.Madrid.APHA-AWWA-WPCF(19 71) Standard Meth ods for theexaminati on of water andWastewat er. 13thed. Washington.Cent ro Nac ional de Alimenracion y Nutricion(1 976) Met odos de examen rnicrobiolo-gicodeAlimentosyBebidas. Madrid.SpeckAPHA/lntersoci ety (1976) Compendi umof methodsfor t hemicrobiologicalexaminationof Foods. Washi ngton.Gui nea . Sanc ho y Pares. (1979) Anali si s Mi cr obiol oqico de aguas : aspe ctosaplicados. Ed. Omega. Barcelona.MEDIOSPARAAI\lTIBIOTICOSEs unhecho que la unica metodologfa universalmente aceptada. parala valoracion deantibioticos es la microbioloqica. En este sentido. las distintas farmacopeas vanadaptandosea losnuevospreparados, dandounaseriedenormativasque varfanpocodeunaa otra. ActualmentelaBritishPharmacopeia (1973) ylaU.S. PharmacopeiaXX(1980). contienen las listasmasampliasdeantibioticosac eptadospara el consumohumano. Sin embargo, el mayor contenidode detalles seofreceanualmenteen lasdisposiciones del US/FDA.a los que concretamente. la farmacopea americana se refierecontinuamente.En 1959. Kirshbaun y Arret publicaron un esquema que simplificaba todas lasvariantes deestametodologfa tan definida. EI exit o de su primer intento y la aparicion denuevos ant ibioticos. ha hecho que estes autores vayan haciendo revisiones de sutrabajo inicial y ensupublic acion de 1967, seofrecian detalles de57metodos oficialesde analisis y la de1971se dan83oficiales y 10oficiosos. Hay que hacer notar. que enlaXIXe dicionde laU.S. Pharmacopeiase citaestaultimarevision. comofuentedeinformacion. .Enel presentepanfletosepretendesoloresumir losaspectosmasimportantesdeesta metodologfa, ya que no se dan instrucciones detalladas para realiz ar lasvaloraciones. considerandoquevadirigidoa microbioloqosyafamiliarizadosconlastecnicasbasicas, En este mismo senti doseremitea losinteresados al21 CFR, paralosdetalles de pr eparacion de muestras y extraccion de los antibioticos de cadapr eparaciontarrnaceutica.MICROORGANISMOSLasdiferentescepasdemicroorganismosqueseusanenlastitulaciones, asf comolosdistintosrnetodosde prepar acionsetabulan en latabla1.1.1. Preparaci6ndelas suspensionesmicrobianas1.1.1. Metodo1.Las cepas de ensayo se mantienen en tubes inclinados de medio I. (Ref. 1-009)subcultivandoseatubos frescos cada semana. EI crecimiento de un tubainclinado.incubado a 32-370C durante 24horas, selavacon 3ml., de soluciondeRinger 1/4. Estasuspensionseutiliza parainocularunfrascoderouxcon 250ml., demedioI. esteril ycontrolado. Parael mantenimiento delascepasresistentesa losdistintos antibioticos.se prepara el Medio I. (Ref. 1-009) que contenga las cantidades apropiadas deantibiotico. tal comosedescribeen lasseccionescorrespondientesdelatablaIII. EIcrecimiento obtenido enelfrasco deroux. despues deunaincubacion de 24horas a 32-370C serecoge con 50rnl., de solucio n deRinger 1/4 y se guarda enrefriqeracion (4-60C).1.1.2. Metodo 2Se procede comoel Metodo1, perc senorrnaliz a la suspension dela forma siguiente:Secentrifugaysedecantael liquido sobranadante. EI sedimentosesuspende con 50-70ml., deRinger 1/4 y secalientea 700durante3Qminutes, La suspensiondeesporasasf obtenidase mantieneen refrigerador.271.1.3. Metodo3Se procede como enel Metodo 2. pero el shock terrnico de 30 minutos a 700e seIlevaa cabo antes de la centrifuqacion. La suspension de esporas se lava tres vecesconsecutivasconaguadestilada (25-50ml ..cadavez) y centrifuqacion. La suspensionfinal se reconstituyecon 50-70rnl., de aguadestiladay seguardaen refriqeracion,1.1.4. Metodo4Loshongos sedejan crecer durante 6-8semanas. a temperatura ambiente (20-25C)en variosmatraces erlenmeyer debocaancha. de3litrosdecapacidad. queccintengancadauno unos 200 ml .. de Medio 22(Ref. 2-021).A partir dela 68semana se compruebala esporulacion y cuando hayaalcanzado un mlnimo del 80%, se recogenlasesporas delmicelio aereo. con avuda de una espatula esteril uotro instrumentoadecuado. Lasesporas constituyen lacapa superior de la capa flotante. Las esporas recogidas sesuspendenen20rnl.. desolucionde Ringer 1/4yse mantienenen refrigeraciOn.TABLAI- CEPASDEENSAYOPARALASDISTINTASVALORACIONESFDA Generay especieN.DMetoda(21AlCC deprep.CFR)A Staphylococcusaureus6538 P 1B Sarcinasubflava7468 1e Sarcinalutea (Micrococcus luteus) 9341 1D Staphylococcusepidermidis12228 1E Saccharomycescerevisiae9763 6(a)F Bordetellabronchiseptica4617 1G Bacilluscereusvar. mycoides11778 3H Bacillussubtilis6633 2I Klebsiellapneumoniae10031 1J Escherichiacoli10536 1J Streptococcus faecalis10541 5L Micrococcus flavus10240 1M Microsporumgypseum14683 4N Sarcinalutea(Micrococcus luteus)(resistentealadihidroestreptornicina)9341 a0 Staphylococcusaureus(resistentealanovobiocina)12692P Staphylococcusaureus(resistentealadihidroestreptomicina)6538DR Q StaphylococcusaureusJ[resist entealatetraciclina)12715IR Sarcinasuflava(resistentealadihidroestroptomicina)7468dS Sarcinalutea(resistentealaeritromicina)15957128ITABLAI - CEPASDEEI\JSAYOPARALASDISTINTASVALORACIOl\IESFDA(21. CFR)Genero y especieN.OATCCMetododeprep.10240A25619607TUVwXSaccharomycescerevisiae 2601Micrococcus tlevus (resistente a la neomicina)14452Micrococcus flavus(resistentealadihidroestreptomicina)PseudomonasaewginosaMycobacteriumsmegmatis61117(a) Para candicidina, utilfceseel metoda11.1.5Metoda5Apartir del cultivoentuboinclinado. seinoculaconunaasa. unfrascoque contenga100rnl., de Medio3(Ref. 2-011) estenl y control ado. Se incubadurante16-18 h.1.1.6. Metoda6Sesigueel metodo1, peroincubandolos subcultivosinclinadosa 30 C, durante 24horasy losfrascos de roux a30 C durante48 horas.1.1.7. Metoda7Los organismos se mantienensobre tubos inclinados de Medio36 (Ref. 1-025)subcultivandolos periodicarnente cada sernana, con una incubacion de48horas a 37C.EI crecimiento deunsubcultivo reciente se recoge con 3ml., de solucionRinger 1/4 y seutilizaparainocular 100ml, deMedio 34contenidosenunmatrazerlenmeyer de500ml. Aestematraz se aiiadenasepticarnente50g., de perl as de cristal est erilesy seincuba durante 5 drasa 27 C., con aqitacion constante (120rpm. y 3,5crn., 120 rpm. deradio). Lasuspensionse mantieneen refriqeracion.1.2. Determinaciondel inoculaausarDurantemuchosaiioslosmetodosoficialesde laUS/FDA, handadoinstruccionesespecfficas para la norrnaliz acion del inoculo, En las ultirnas ediciones de lasRegulacionesFederalesUSAy en laU. S. P. XIX, se haadoptadoun criteriouniforme,sugerido por Kirshbaum, Kramer y Gerth. que consiste en diluir la suspension demicroorganismos para quede unatramitanciadel 25%a580nm. en un tubade 13mm. Sin embargo, aun conest a norrnalizaciondebenhacersetanteosencadalotedeinoculo.para determinar el volumen exacto que hay que aiiadir a cada volumen de mediode ensavo, Si las suspensionesde inoculose preparancomose haexpresadoen lasseccionesprecedentes. quedansuficientementeuniformescomoparadeterminar losvolumenes a ahadir. con pruebas de tanteo, sin ninqun paso de norrnaliz acionintermedio.29 ,1.2.1 . Paraensayospor difusionen agarSe preparanuna seriede trascos, con 100rnl. . de los medios decap a sembradapreviamente esterilizado. Iundido y enfriado y a cadauno de ellos se ahade un volumendistinto desuspension demicroorganismos.utilizando comoquiael volumen sugeridoen la tabla V. Con estes medios inoculados. se hacen placas de acuerdo con lasespecificacionesdecada antibioticoysecolocaunpocillo. disco0 torrecilla. conlaconcentr acion dereferenciadel antibiotico. Las placas seincuban y luego se midenloshalosde inhibicionproducidos. EI volumendesuspensionde microorganismosqueproduce zonas optirnas. tantoen definicion comoen diarnetro, es el queseadopta parainoculo. En la tablaIV. se ofrecenlosdiametros deloshalos deinhibicion opurnos.quecabe esperar en lasdistintastitulaciones.1.2.2 . ParaensayosturbidimetricosSe precede comoen el casoanterior. perc enluqar deinocular sobre mediofundido.seinoculafrascoscon 100rnl.. del medioliquidoadecuado. utilizandolosvoliirnenesespecificadosenlalabiaV. comogufa. Con estes voturnenesdemedioinoculado. sesigue como si serealizaraunavaloracion. perc utilizando sololasconcentracionesmasaltasy masbajasdelas del patron. Se incuban 3-4horas y seleenlas absorbancias. Conestos datos.se establece cual es el inoculo queda mejor respuest a. entre el punto alloybajo. adaptando lopara latitulacion.1.3. M antenimientodelascepasLas cepas deensayo. semantienen. por propaqacion vegetativaen tubesconmedioinclinado ypor duplicado. Unodelos duplicadosseempleaIansoloparala siguienteresiernbra, mientras que el otro se utiliza para to do 10dernas. EI medio. si no seespecifica otra cos a. es el n.? 1 (Ref. 1-009)conlosantibioticos u otros aditivos cuandohacen falta. Los detalles pueden obtenerse enla tablaIII. Sinembarqo.jarnblen puedenemplearseotros mediosdecultivo. si secree oportuno.30SOLUCIONESTAMPONYDILUYEI\lTESLosdif erentestiposdesolucionestamponydiluyentes. mas utilizados. cuandonosonproductos quirnicos.se detallanenla tablaII.Derrecho. conlas solucionesI. III. IV.X XIII. XVy XVI. se pueden realizar casi todos los ensayos. No obstante. en estatabulacion se incluyen todoslosdiluyentes estipulados por la US/FDA, paraeste tipo detrabajos. En algunos cases. se precisa un ligero reajuste de pH. despues de laestetilizacion.TABLAIITAMPONESYDILUYENTESN.OUS/FDATAMPON INGREDIENTES CANTI-DADESIIIIIIVVIXXIXIITamponfosfat os 1% P04 HK2 2.- 9apH6.0 0.05 P04H2K 8.- 9Agua dest. hasta 1.000.- mlTampondecitrate Acidoenrico 13.29apH6.3 NaOH 7.069Citratesodico9.- 9Aguadest. c.s.p. 1.000.- mlTamponfosfatos0.1M P04HK2 16.739apH7.90.1P04H2K 0.523 9Agua dest. c.s. p. 1.000.- mlTamponfosfatos0.1M P04H2K13.69apH4.50.05Aguadest. C.S.p. 1.000.- mlTamponfosfatosall0%Igual que I. perc conapH6.00.05pesosde sales10 vecessuperior.Tamponfosfat os0.2 M P04HK235.- 9apH10.5 0.1OHK10N2.- mlAguades t, c.s.p. 1.000.- mlTamponfosfatoal 10%P04H2K100.- 9apH2.5HCI conc. 0.2 mlAguadest. C.S.p. 1.000.- mlTamponfosfato10%P04H2K100.- 9apH7Aguadest. c.s.p. 1.000.- ml31TABLAII -(Continuaci6n)TAMPONESYDILUYENTESN.DUS/FDATAMPON INGREDIENTES CANTIDADESXIIIAcidoclorhf drico HCI 1 N 10.- mlrnetanolico0.01N Metanol C.S.p. .000.- mlXIVSol. debicarbonato C03HNa 20.- 9so dicoal 2% Agua dest. c.s.p. 1.000.- mlXV Sol. dealcohol Isopropanol 800.- mlisopropilicoal 80% Aguadest, C.S.p. 1.000.- mlXVI TamponfosfatoO.lN P04 HK213.69apH7P04H2K 4.- 9Aguadestiladac.s. p. 1.000.- mlXVII Tamponfo sfato-metanol Metanol 50.- mlapH6 TamponI c.s.p. 1.000.- mlXVIII Solucionde carbonate Carbonarosodico 10.- g.s6dicoal 1% Agua dest, C.S.p. 1.000.- rnl,...Puederequerir ajusteprevia0 posterioral autoclavadoconac idofosforico18N0 KOH10N.Debeprepararseel mismodia de usoy no guardarse.Esta solucion no fiqura enla norma US/ FDA. pero en cambio Kirsh-banmy cols. citancon el n.O16.3. MEDIOSDECULTIVOEn la tablaIII. se ofrecela cornposicion delosdistintos medios de culrivo. a losque seconservala desiqnacionnurnericadela US/FDA, quiena su vezmantienela deGroveyRandall (Medios 1-13) y la de Kirshbaum y Arret para los medios 18-21. Loscomponentesdelosmedios decultivo debencurnplirlasespecificacionesdela USP0 1del N.F., aunquesedejaal criteriodel te cnicolautilizaciondemediosdeshidratados ,comerciales0 laintroducciondevariacionesenlasformulas, siemprequemantenganlascaracteristicasdelosmedios formulados. EI pHdelosmedics. debecomprobarsecuandoel medioesta totalmenteterminadoya25 C.32TABLAIIIMEDIOSDECULTIVOESPECIFICADOSENEL 21CFRN.ORef. I NGREDI ENTES CANTIDADENgr .ADSAMICRO1-009 Pept ona 6.-Digeri dopancrear icodecaseina 4.-Extra cto del evadura 3.-Extr actodecarne 1.5Dextrosa 1.-Agar 15.-Agua dest ilada c.s.p. 1.000.- mlpH6.55 0.052 1-010Igua l al Medio1.perc omitiendoel digeri-dopancreaticodecaseinay ladextrosa32-011Peptona5.-Extractodelevadura1.5Extractodecarne1.5Cloruro s6d ico3.5Dextr osa 1.-Fosf ato monopotasico1.32Fosfat odipotasico3.68Aguadest i l adac.s, p.1.000.- mlpH7 0.054 1-0 12 Peptone6.-Extractodel evadu ra3.-Extrac to decarne1.5Dextrosa1.-Agar15 .-Agua dest iladac.s.p,1.000.- mlpH6.5 a 6.65 1-013Igual que med io n.?2. perc con el pHajustadoa7.9 0.18 1-0 14 Igual que median.O2. perc conelpHajus-tado a5.90.0533TABLAIIIMEDIOSDEClILTIVOESPECIFICADOSENEL 21 CFRN.O Ref.ADSA MICRO9 1-015INGREDIENTESDigeridopancreati co decaseinaDigeridopapaini co desojaCloruroso dicoFosfatodiporasicoDextrosaAgarAgua destiladaC.S.p.pH7.25 0.05CANTIDADENgr.17 .-3.-5.-2.52.520 .-1.000.- ml10111-0161-017Igual que el medio n.?9.pero consolo 12g.deagar. Unavezdisueltos todos losingre-dientes, seanaden10 ml. de Polisorbato80.Igual que el medion.?1, perocon el pHajustadoa7,90,112 1-218Peptona 9.4Exto l evadura 4.7Extocarne 2.4Clorurosodi co 10.0Dextrosa 10.0Agar 23 .5Aguadestiladac.s.p. 1.000mlpH6.0 0.2132-211Peptona 10.-Dextrosa 20 .-Agua destiladac.s.p, 1.000.- mlpH5,65 0.0518 1-018Igual queelmedio n.O11 , pero despues dedisolver losingredientes,se ai'\aden20 ml.de Polisorbato80.34TABLAIIIMEDIOSDECULTIVOESPECIFICADOSENEL 21 CFRN.D Ref.ADSAMICRO19 1-01920 1-02021INGREDIENTESPeptonaExtractode levaduraExtractode carneCloruros6dicoDextrosaAgarAgua destiladac.s.p,pH6.10.1DextrosaPeptonaCloramfenicol (en activ.)AgarAgua destiladac.s .p.pH5.65 0.05Utilicese el medio n.?20. Cuando estaesteril y a unos 50DC. se Ie afiaden 20ml deuna solucionesterilizada. por filtr acion. decicloheximideal 0.1%CANTIDADENgr.9.44.72.410.-10.-23 .51.000.- ml40.-10.-0.0515. -1.000.- ml2223242-0211-022DextrosaPeptonaAgua destiladac.s.p.pH5.65 0.05Utilicese el medio n.D1. Cuando esta esterifyaunos 50 C.seIe ahaden 60ml deunasolucion de eritromicina al 0.1%previa-menteesterilizadapor filt raci6n.Igual queel median.? 1. perocon309 deagar enlugar de 15 .40.-10.-1.000.- ml35TABLAIIIMEDIOSDECULTIVOESPECIFICADOSENEL 21 CFRN.O Ref.ADSAMICRO2526INGREDIENTESUt ili cese el media n.O 1. Cuanda est a esterily a unos 50 C. se Ie ahade canti dadsuf i ciente de una solucion esteril de sulfatededih idroes treptamicina paraqueenelmediaqu edeauna cancent raci6n acti vede1 mg/ml.Utilicese el medio n." 1. Cuanda est a ester ilyaunos50C,seIeahadecantidadsuf i-cientede unasoluci6nesteril de tetr acicli-naHCI ,paraqueenel media quedea unacancent raci6nactivade 100mcg/ml.CANTIDADENgr.27282932361-0231-024Ut il i cese el media n.O 1. Cuarido est a ester ilya unos50C. seIeanadecant i dadsufi -cie nt e deunasoluci6n esteril de sul fat o deneomici na. paraqueenel medioquedeaunaconcentraci6nact ive de100mcg/ml.Ut i licese el medio n.O 1. Cuando estaesterily a unas 50 C, se Ie ahada cantidadsuf ici ent edeuna saluci6nesteril dedih i-dr oe streptom icinasulfate. paraque en elmedio quede a una conc ent raci6n activa de500mcg/ml.Extra ctodecarnePeptonaAg arAgua dest iladac.s.p.pH7.9 0,1Igual queel median.O 1. peroahad iendo300mg/LdeS04Mn. H20.6.-10.-15. -1.000.- mlTABLAIIIMEDIOSDECULTIVOESPECIFICADOSENEL 21 CFRN.O Ref.ADSAMICRO333435INGREDIENTESUtilfcese el medion.O 1. Cuando estaesterily a unos 50 C. se Ie afi ade cantidadsuficientedeunasoluci6nest eri l denovo-biocina sodica. para qu e enel medio quedea unaconcentracionact ivade 10mcg/ml.Gl icerinaPeptonaExtractode carneClorurosodicoAgua dest i ladac. s, p.pH7.00.1Igual queel medio34 . peroahadiendo17g/Ldeagar at caldo.CANTIDADENgr.10.-10.-10 .-3.-1.000.- ml36 1-025 Digeridopancreat ic ode easei naDigeridode papaln ico de soj aCloruros6di eoAgarAguadestiladae. s.p.pH7.30.115 .-5.-5.-15 .-1.000.- mlNOTA.-LosmediosADSArefereneiados enest a tabl a. estanpreparadoseon losin-gr ed i entesespe cif ieados enlaUSP XXy el 21 CFR paraest oseomponentes. y ofr eeenunareproductividad y fiabilidadabsoluta.Losnoref er enciados. noestanenstock. perosepu edensuministrar bajodemanda.374. PATRONESEvidentemente.cada anttbiotico debe valorarse contra un patron adecuado. Patronesde referenciase puedenobtener de USP- NF Co.Sin embargo. puede n utilizarse patrones dornesticos de riqueza conocida ycontrastadaadecuadamentecon un patronde referencia.En latabla IV. se ofrecenalgunos detallesrelativos alos patrones. comoson lascondicionesdedes ecacion. disolventeinicial paraobtenerla solucionmadrey tiempode duracion de fa actividad de esta sofucion en r efriqeracion. A continuacion seexponenlosrnet odosdedesec aciondelospatrones, conservandolanurneraciondelaUS/FDA.4.1. Metod01En estufadeva do. se secael patron durante 3hor asa 60 C y a unapresion de5mm.de Hg.4.2. Metodo3En estufade vacio, se secael patron durante 3horasa 40C y a unapresion de5mm.de Hg.4.3. Metodo4En estufadevado. sesecael patrondurante 2horasa 40C y a unapresionde5mmde Hg.4.4. M etodo5En estufa devado,sesecael patron durante 4horas a 1000C y una presionde5mm.de Hg.4.5. Metodo6En estufadevacio, se secael patron durante 3noras a 40C y una presion de5 mm deHg.4.6. Metodo7En estufa devacio,sesecael patron durante 4horasa 25 Cy una presion de5 mm deHg.38TABLAIVESPECIFICACIOI\lESRELATIVASALOSANTIBIOTICOSPATRON, PARADIFUSIONENAGARAntibiotico Condicionesde secadoDisolventeinicial(tablaII)Concentrac.dela solucionmadreActivo. en Dil.refriger. (TablaII)durante:Metanal 100uni.III 1.0 mg.DMF(4) 1.0 mg.ampicilina comopatron-III 1.0 mg.Agua dest. 1.0mg.I 1.0 mg.AmoxicilinaAnfomicina(1)Anfotericina B(3)AmpicilinaBacitracinaBleomicinaCarbenicilinaCefazolinaCefacetri ICefalexinaCefaloglicinaCefaloridinaCefalotinaCefapirinaCefradinaCol ist inaCicloserinaCloranfenicolClortetracicIin aClindamicinaCloxacidinaColistimetatoNaDactinomicinaDemeclociclinaDicloxacilinaDihidroestrep-tomicinaEritromicinaEstreptomicinaL-FeneticilinaFenoximetilpe-cilinaGentamicinaGris eofulvin aHetacilinaKanamicinaLincomicinaMeticilinaNinguna4.14.1Ninguna4.14.7NingunaNingunaNingunaNingunaNinguna4.14.1NingunaNinguna4.14.1NingunaNingunaNingunaNinguna4.14.1NingunaNinguna4.54.14.1NingunaNinguna4.3Ninguna-utiliceseNingunaNingunaNingunaAgua dest.IIIDMSO(2)Agua dest.IXVIIVIIIAgua dest.IIIIAgua dest.Agua dest.EtanalHCIO.OINAgua dest.IAgua dest.MetanalHCIO.OINIIIIMetanalIII,1.0 mg.0.1 mg.1.0 mg.0.1 mg.100uni.2 uni1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.0.1 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0 mg.10mg.1.0 mg.1.0 mg.1.0mg.1.000uni.7 dias14 dias24 horas1 semana7 dias15 di as15 dias5 dias7 oias7dfas7 df as5 dias5 dias3 dias5 df as15 dias30dias30 dfas4 dfas30 dfas7 dias24 horas3 meses5 dias7 dras30 dias14 dfas30dias7 dfas4 dias30dfas3 meses1 mes30dias4 diasIIIIIIIIIIIIIXVIIIIIIVIIIIVIIIIVIIIIVIIIIIVIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII39TABLAIVESPECIFICACIONESRELATIVASALOS ANTIBIOTICOSPATRON. PARADIFUSIONENAGARAntibi6tico Condiciones Disolvente Concentrac.Activo, enOil.de secado inicial delasoluci6n refriger.(TablaII)(tablaII) madredurante:Mitramicina4.7 Aguadest. 0.1 mg. 1dfa IMitomicina NingunaI 1.0mg. 14dfas INafcilina NingunaI 1.0mg. 2 diasINeomicina 4.1 III1.0mg. 15diasIIINovobiocina 4.5Etanol abs.1.0mg. 5dfas VINystatina(3) 4.4 DMF(4)1.000 un id. 24 horasVIOleandomicina Ninguna Etanol1.0mg. 30dlas IIIOxacilina Ninguna Etanol1.0mg. 3dfas IOxitetraciclina Ninguna HCI 0.01N1.0mg. 4 diasIVParomomicina 4.1 III1.0mg. 21 dfasIIIPenicilinaG Ninguna I1.000unid. 2dlasIPolimixinaB 4.1 Agua dest.10.000unid. 15 dras VIRifampicina Ninguna Metanol1.0mg. 1dla ITetraciclina Ninguna HCIO.IN1.0mg. 1dlaIVVancomicina 4.1 Agua dest.0.4 mg.semana IVViomicina4.1 Agua dest. 1.0mg.7 dias III(1) Puede ser necesariaunanochederepose. parasutotal disoluci6n.(2) Dimetilsulf6xido.(3) Utilfcesevidriotopacio0 trabajaren luz roja.(4) Dimetilformamida.Lospatrones dereferencia, sepuedenobtener de:- USP-NFReferenceStandards, 12601 TwinbrookParkway, Rockville. Md. 20852USA.- British Pharmacopoeia Commission Laboratory, Government Buildigs, Block 2.Honeypot Lane. Stanmore, Middlesex, HA7 1A4 INGLATERRA.405. TITULACIONESPOR DIFUSIOI\l ENAGAR(VALORACION EI\IPLACAjUnavezdeterminadaslascondicionesde la titulacionenlatablaV. seprocedealapreparacionde las placasdelaformasiguiente:5.1. Preparacionde lasplacasEn cada una de las placas de ensavose vierte el mediobasal fundidoV enfriadoalrededorde los50 CV sedejasolidificar en unasuperficiehorizontal. Si seutilizanplacasdepetri de10cm. dediarnetro. los vclumenesdemediorecomendados. sonde21 rnl., paralacapabasal V 4 rnl.. en lacapasembrada. Sinembargo. en el casode laanfotericina, nvstatina. tenecitinaV tiostrepton. seutilizauna unicacapasembradade8rnl.. prescindiendo total mente de la capa basal. Otras excepciones a esta norma, laconstituven lableomicina. queutilizauna capabasal de 10ml, V lasembradade6 rnl.:griseofulvin a queusa6 rnl.. de capabasal V cicloserina, dactinomicina, mitrarnicinaVmitomicina, quese hacenconunacapabasal de10rnl.. mientrasquelasembradaesnormal, es decir; de4 ml.Mientraslacapabasal sesolidifica. seajustala temperaturadel rne dio. paralacapasembrada a45-48CVse inocula con el volumen sugerido (0 comprobado) desuspensionde inoculo. Se homoqenizaporaqitacionsuaveV seviertesobrelacapabasal, envolurnenesde4 rnl.. conlas excepcionesantescitadas. Enestaoperacion.debeponerse especial cuidado. para que la capa sea rnuv uniforms. sin grumos niburbujas, quepuedenafectar losresultadosfinales. Lasplacassecubren con discosdeporcelana porosa. previamenteesterilizados. Cuando el agar hasolidificadosecolocanlastorrecillas0 sehacenlos pocillos, ennurnerode6por placa, aintervalosdeunos 60de anquloV alamitadde losradios.5.2. Preparaciondel patronycurvaestandarEI patronsepreparade acuerdoalas especificacionesde latabla IV, apartir de lasolucion madre, utilizando el diluventeadecuado. se alcanzan las concentracionesadecuadas. EI nivel dereferenciaessieinprelaconcentracioncentral de las 5queseempleanen laobtencionde lacurva patron. (Ver tablaV).5.3. Tecnicade latitulacionPara la curva, se utilizan un total de 12plac as. trespor nivel, exceptopara el dereferencia quefigura en todas. En cada lote de tres placas. se Ilenan 3 pocillos 0torrecillas, deformaalternada, conla conc entraciondereferenciaVlasotras tres, conlaconcentracioncorrespondiente. De estaforma, se obtendran30halos de inhibiclon.correspondientesalaconcentracion de referenciaV nueveporcadaunode losotrosnivelesde ensayo.Paracadaproblema, seutilizan 3placas, con seis pocillos0 torrecillas,que seIlenanalternativamente, conel nivel de referenciadel patronylamuestraproblema, dilufdaadecuadamente.Lasplacasseincubanalatemperaturaadecuada(ver tablaV), durante 16-18horas.entoncesse procedealalecturade loshalosde inhibicion. medianteun dispositivoadecuado. sea piede rev, compas de puntas 0 provector optico.5.4. Calculode lapotenciaPara el trazado de la curva patron, se promedian los 36 diarnetros del nivel dereferencia V los distintos lotesde9halos.que correspondena cada uno delos4 nivelesdeensayo. EI promedio, delos 36halos dereferencia, constituye elvalor decorrecc iondela curvapatron, conel cual. seconsiguecadaunodelos puntos enfunciondel valorpromediode losvaloresde referenciadel nivel corresponrliente.41Los valores asi obtenidos, se distribuyen sobra unos ejes semilogaritmicos,colocandola concentraciondeantibioticos.(enmcg/ml.) enlaescalalogaritmica ylosdiarnetros deloshalos enlasabcisas. La curva patron, setraza uniendo los cinco puntosobien, se traza una recta, queuna el puntoaltoy bajo, calculadas de acuerdoalassiguientesformulas estadisticas:A=B=3a+2d+c-a53a+2b+c-e5endondeA=Diarnetrodel halo, calculadopara lamayorconcentraciondepatron.B= Diarnetrodel halo, calculadopara lamenorconcentracion del patron.c=Diarnetro del nivel de referencia, promediode los36 halos, de las placas delpatron.a. b,d. e =Valorespromedio corregidos ya delosotros niveles deensayodel patrondemayor amenor.Para estimar la potencia del problema, se promedianlosdiametros deloshalos deinhibicion. delos nivelesdereferenciaydel problemadelastresplacas. sehacenlascorreccionescorrespondientes. respectoal puntodecorreccicn. EI valor corregidodelproblema, seproyectasobrelacurvapatronyseobtienelaconc entracionteorica. quemultiplicadapor el factor de dilucionexpresa el contenidoreal del antibioticoen lamuestra.42TABLA V ESPECIFICACIONESPARALOSENSAYOSPORDIFUSIONENAGAR:iii!mJ>m-

ANTIBIOTICO CEPADE-J>mm Z 3 CONCENTRACIONESFINALES:C;ovO-oven m O lDmNIVELESDEENSAYOPARAlA CURVAJ>;gENSAYO c8J>c; mO' J> ZC (TablaI)m enen0 ov... MEDIODEENSAYOmPATRONENUN1DADES0 ENmcg/mlm3c;ov 0c;z-C)m :n 0 g0 (TablaIII)Z;genCmZmJ>

mc;ov Zc ZO;:j 0-< -0iI 03: CAPA CAPA cim08zen :Ii" 0 0 BASA SEMBRADA Ref.Amoxici lina C 0.5 151 7 11 11 1 0.064 0.080 0.100 0.125 0.156 32 35Anfomicina U 0.5 1214 2 1 1 6.400 8.000 10 .000 12.500 15 .600 32 35AnlotericinaB E 0.2 1618 19 19 0 .640 0.800 1.000 1.250 1.560 30Ampicilina C 1.0 1820 11 11 1 0.064 0.080 0.100 0.125 0.156 3235Bacitraci na 86R(c) 0.2 1618 2 1 1 0.640 0.800 1.000 1.250 1. 560 32 358acitracina L6V (c) 0.05 161 8 9 10 1 0.640 0.800 1.000 1.2 50 1.560 32 35Bleomicina X 1.0 1820 35 35 36 0 .010 0.020 0.040 0.080 0.160 32 35Carben icilina W 0.05 1618 9 10 1 12.800 16.000 20 .000 25.00 0 31. 200 37Celazol ina A 0.05 1719 2 1 1 0.640 0.800 1.000 1.2 50 1.560 3235Cela cetr il A 0.5 1618 2 1 1 6.400 8.000 10.000 12 .500 15.600 3235Cefalexina A 0.05 1820 2 1 1 12.800 16 .000 20 .000 25 .000 31 .200 37Cefalogl icina A 0.2 1820 2 1 1 6.400 8.000 10 .000 12.500 15.600 32 :35Celal oridina A 0.3 19-21 2 1 1 0.640 0 .800 1.0001.250 1.560 32 35Cetalot ina A 0.05 14-16 2 1 1 0.640 0 .800 1.000. 1.250 1.560 3235Celapirina A 0.08 16-18 2 1 1 0.640 0.800 1.000 1.250 1.560 3235Celradina A 0.05 1618 2 1 1 6.400 8.000 10.000 12.500 15.600 3235Cictcserin a A 0.04 14 16 2 1 1 42.000 40.000 50 .000 62.500 78. 100 30Clindamicina C 1.5 18-20 11 11 1 0.640 0.800 1.000 1.250 t .560 37Ciora nfen icol C 2.0 17 19 1 1 1 32 .000 40 .000 50 .000 62 .500 78. 100 3235Clortetrac iclina G 0.4 1719 8 8 1 0.064 0.080 0.100 0.125 0.156 30Ctoxacilina A 0.2 18-20 2 1 1 3.200 4.000 5.000 6.250 7.8 10 3235Colist lmetatos6dico F 0.04 1315 9 10 1 0.640 0.800 1.000 1.250 1.560 37Colist ina F 0. 04 15-17 9 10 1 0.640 0.800 1.00 01.250 1.560 37Dact inomi cina H 0.02 16-18 5 5 1 0.500 0.710 1.000 1.410 2.000 37Oemeclociclina G 0.4 1719 8 8 1 0.064 0.080 0.100 0.125 0.156 30Oicloxac ilina A 0.2 18-20 2 1 1 3.200 4'.000 5.000 6.250 7.810 32 35

Dih idroestreptornlcina H 0.05 14-16 5 5 1 0.640 0.800 1.000 1.250 1.560 37 to)

TABLAV- ESPECIFICACIONESPARALOSENSAYOSPOR DIFUSIONENAGARS " 0 3()"m'l'5l - -i0202mm:t>m-J>m()S0::D()0 2 ::D 3 re 20C "ANTIBIOTICO CEPADE-l>mmo rp 3 -i-CONC ENT RACIONESFINALES;m O OJmJ>::DENSAYO 08J>cm() J>MEDIODEENSAYO20NIVELESDEENSAYOPARALACURVA()J>(Tabl aI)m. C/J Cll::DO""-PATRONENUNIDADES0 ENmcglmlO-im3 C "m2::DO(TablaIII)iiiZCZ-Glm "TI()O::DUlOm2. mOO2mJ>

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