Mécanismes moléculaires de la chimio-

résistance de Plasmodium falciparum et résistance de Plasmodium falciparum et

nouvelles stratégies thérapeutiques

Abdoulaye DjimdéPharmacien Microbiologiste

Université de Bamako, Mali

DHFR & DHPS

2

Molecular mechanism of SP resistance

• dhfr: Peterson DS et al. Evidence that a point mutation in dihydrofolate reductase-thymidylate synthase confers resistance to pyrimethamine in falciparum malaria. Proc Natl Acad Sci U S A 85:9114-9118, 1988.

3

• Dhps: Brooks DR et al. Sequence variation of the hydroxymethyldihydropterin pyrophospohkinase-dihydropteroate synthase gene in lines of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum, with differing resistance to sulfadoxine. Eur J Biochem 224:397-405, 1994.

MTX

NADP

108

5951

16

164

Sample collection on filter papers for molecular analysis

-Finger prick blood spotted onto filter paper

-Sample was air-dried

-Storage at room temperature

6

Sample ID

-Shipment in luggage or by regular mail

-DNA extracted by simple methods for

molecular analysis

PCR detection of dhfr 108 polymorphisms

AMP1SP1 108

7

AMP1

AMP2DIA3DIA9DIA12

DIAGNOSTIC PCR PCR1: AMP1+AMP2

PCR2: SP1+DIAx

Nested MS-PCR

8Plowe et al., AJTMH, 1995

Pyrimethamine resistance rate in 4 sites of Mali

30

40

50

60

0

10

20

30

Kolle

Bougo

ulaB

andia

gara

Mopt

iAsn-108

Plowe et al., AJTMH, 1996

DHFR mutations and pyrimethamine resistance

80

100

10851

0

20

40

605159164

Day 0 infections

village-wide (N=120)

Breakthrough

infections (N=52)

Doumbo et al., JID, 2000

DHFR mutations and pyrimethamine resistance

• Conclusions

– Pyrimethamine is strongly selective for DHFR mutations

– DHFR mutants arise very quickly under drug – DHFR mutants arise very quickly under drug pressure, even when undetectable in the initial infection

Molecular markers of SP resistance

12

Adapted from P. Wang et al. :Molecular and Biochemical Parasitology 89 (1997)

161–177

Molecular markers of SP resistance

• “Logistic regression showed that the 2 sets

of mutations (DHFR 108+51+59 and DHPS

437+540) interact and that the presence of

all 5 mutations (the quintuple mutant) was

most strongly associated with treatment

13

most strongly associated with treatment

failure” Kublin et al., JID, 2002.

Spread of SP resistant parasites

14

A Shared Asian Origin of the Triple-Mutant dhfr Allele in

Plasmodium falciparum from Sites Across Africa

1EA209, Université Paris 5 Descartes

Oumou Maïga,1,2 Abdoulaye A. Djimdé,2 Véronique Hubert,3 Emmanuelle Renard,1 Agnès Aubouy,4 Fred Kironde,5 Basile Nsimba,6 Kwadwo Koram,7 Ogobara Doumbo,2

Jacques Le Bras,1,3 and Jérôme Clain,1

15Maiga et al. JID, i2007

1EA209, Université Paris 5 Descartes2MRTC, Université de Bamako

3CNR Paludisme, Hôpital Bichat Claude Bernard, Paris4IRD Cotonou, Benin.

5Makerere University, Kampala, Uganda.6 NMCP Brazzaville, Congo.

7Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Accra, Ghana

Molecular Mechanism of Pyrimethamine Resistance

Génotype, en Afrique Sauvage

Simple mutantDouble mutant 1Double mutant 2

NNIN

CCCR

SNNN

51 59 108

: séquence codantedhfr ts

16

Double mutant 2Triple mutant

NI

RR

NN

Single origin of dhfr triple mutant

17

: microsatellite: séquence codante

dhfr ts

51 59 108 +0.5 +6 kb+10

Roper 2003

Origin of samples

18

Méthodes� Extraction de l’ ADN : méthode au methanol, Qiagen®

� Génotypage dhfr (codons 51, 59 et 108) : RFLP, PCR allèle spécifique,séquençage

� Génotypage de 4 marqueurs microsatellites à proximité du gène dhfr parPCR ‘multiplex’ : -3.9, -0.1, +0.5, +1.5

Taille (pb)

19Analyse de fragments sur séquenceur ABI PRISM 3100 (GENESCAN)

+ 0.5 - 0.1 - 3.9 + 1.5Distance par

rapport à dhfr (kb)

Résultats dhfr triples mutants

-3.9 -0.1 +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 +0.5 +1.5-3.9 -0.1 +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 +0.5 +1.5

F C M 2 9 1 9 4 1 4 7 1 0 5 2 0 2T H A I

GABON

MALI

CONGO

dhfr sauvages

20

GUINEE

BENIN

GHANA

SENEGAL

COMORES

OUGANDA

CAMEROUN

COTE D'IVOIRE

PfCRT story

21

Chloroquine resistance locus on Chr 7

22

Mutation Sites in the PfCRT Transmembrane Protein

K76

N75M74

C72

H97 Q271 R371

I356

NH2

COOHA220

N326

Fidock et al. (2000) Mol.Cell 6:861-871

Chloroquine Action & Resistance in the Parasite

What is the role of pfcrt in CQR in the field?

25

the field?

Kolle

Bandiagara

METHODSMETHODS

�� Study typeStudy type : Prospective chloroquine efficacy survey

�� Study populationStudy population :: Patients presenting to the clinic during the study period

�� Inclusion criteriaInclusion criteria ::

1. Live in study site since 6 months,

2. Aged ≥≥≥≥ 6 months, Axillary temperature ≥≥≥≥ 37,5°C,

27

2. Aged ≥≥≥≥ 6 months, Axillary temperature ≥≥≥≥ 37,5°C,

3. P.falciparum mono infection (2000- 200,000 Tf/mm3),

4. No signs of severe or complicated malaria,

5. Consent of patient and/or is guardian.

FollowFollow upup forfor 1414 daysdays :: CollectCollect filterfilter paperpaper andand bloodblood samplessamplesbeforebefore andand afterafter CQCQ

PCR detection of pfcrt K76T polymorphisms

P1 P3D1 Apo1

28

P1

P2

P3

P4-wP4-m

D1

D2

DIAGNOSTIC PCR PCR1: P1+P2

PCR2: P3+P4-w or P4-m

RESTRICTION PCR1: P1+P2PCR2: D1+D2Digestion with Apo1

Restriction digestion analysis of pfcrt K76T

M 1 2 3 4 5 Dd2 3D7 C M

29

300bp

PfCRT 76T is associated with CQR in Mali

Prevalence Prevalence

in sensitive in resistant All ages Age < 10 Age > 10

Polymorphisms infections (n) infections (n) OR 95% CI P OR 95% CI P OR 95% CI P

PfCRT T76 37.4% (107) 91.8% (61) 18.8 6.5 Š 58.3 <0.001 20.7 5.9 Š 80.3 <0.001 16.8 2.0 Š 373.3 0.001

Pgh1 Y86 49.0% (104) 75.4% (61) 3.2 1.5 Š 6.8 <0.001 3.5 1.4 Š 8.7 0.002 4.5 0.8 Š 32.9 0.05

CG2 37.1% (105) 71.4% (56) 4.2 2.0 Š 9.1 <0.001 4.8 1.8 Š 12.8 <0.001 2.5 0.6 Š 10.8 0.13

CG2 39.0% (100) 77.0% (61) 5.3 2.4 Š 11.5 <0.001 6.9 2.6 Š 19.0 <0.001 4.6 1.0 Š 24.8 0.02

30

T76 + Y86 21.6% (102) 72.7% (59) 9.8 4.4 Š 22.1 <0.001 13.3 4.5 Š 40.2 <0.001 12.5 2.1 Š 95.5 <0.001

T76 + Y86 + & 15.6% (90) 54.9% (51) 6.6 2.8 Š 15.9 <0.001 10.5 3.1 Š 37.7 <0.001 3.9 0.8 Š 20.8 0.06

Djimde et al. N Engl J Med, Vol. 344, No. 4 · January 25, 2001

Could Pfcrt 76T be used as a tool for monitoring CQR in the field?

31

monitoring CQR in the field?

Prevalence of pfcrt T76 (resistant gene) higher than clinical resistance

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

Mo

pti

97

Bg

ara

97

Bg

ara

98

Ko

lle

98

Ko

lle

99

Resistance

Genotype

Age-adjusted Genotype Resistance Index

33

Modèle GRI

Exemple Mantérou 2000

• Mali: GRI = 2.1GRI = Pm/PDR => PDR = Pm/GRI

34

• Prév. moléculaire = 75.8%

• Rés. in vivo = 75.8/2.1= 36.1%

Pm= Prévalence du marqueur moléculairePDR=Prévalence chimio-résistance in vivo

GRI= Indice de la Résistance Génotypique

35

Predicted Observed P

Manterou(Dolo et al.)

Bancoumana(Fofana et al.)

NS

NS

Resistant

Sensitive

36

Kangaba(Guindo et al.)

Sud de la Mauritanie(Jenilek et al., AJTMH, 2002)

Kolle 2002(Maiga H. et al.)

NS

NS

NS

Pilot implementation of GRI as a drug resistance surveillance tool in

Mali

37

Mali

Kolle

Bandiagara

A molecular map of CQR in Mali

39

Djimde et al., 2009

40

Quinine and PfNHE story

41

Genetics of decreased susceptibility to quinine

Ferdig et al., Mol Mic, (2004), 52 (4), 985-997

42

Pfnhe

43

((Ferdig et al., 2004))

Artemisinin resistance?

Nouvelles stratégies de prise en

charge du paludisme non charge du paludisme non

compliqué au Mali

Kolle

Bandiagara

Bougoula-Hameau

Koro

Prevalence de la Chloroquino-resistance au Mali

50

60

70

80

90

100

Res. Totale

0

10

20

30

40

50

Mop

ti 97

Kor

o 98

Don

egue

98Sot

uba 98

Man

tero

u 00

Kan

gaba

00Fal

adje

00

Bga

ra 0

3B

anco

u 03

Kol

le 0

3

%

Combinaisons Thérapeutiques à base d’Artémisinine (CTA)base d’Artémisinine (CTA)

Qu’est-ce qu’une combinaison thérapeutique

• CT avec des antipaludiques est l’usage simultané de 2 ou plusieurs schizontocides sanguins ayant des modes d’actions et des cibles biochimiques différents au niveau du cibles biochimiques différents au niveau du parasite

Qu’est-ce qu’une combinaison thérapeutique (2)

• Combinaison libre = co-administration de deux mdcts distincts

• Combinaison fixe = co-formulation des deux • Combinaison fixe = co-formulation des deux principes actifs sous une seule forme galénique

Pourquoi des combinaisons thérapeutiques?

• Prise en charge optimale du paludisme (Chimiorésistance)

• Protection des nouveaux • Protection des nouveaux antipaludiques

• Diminution de la transmission des parasites résistants

Pourquoi des combinaisons thérapeutiques?

• Prise en charge optimale du paludisme

• Protection des nouveaux • Protection des nouveaux antipaludiques

• Diminution de la transmission des parasites résistants

1 sur 1012 parasites résistant au mdct A

1 sur 1012 parasites résistant to drug B

1 sur 1024 parasites résistant simultanément1 sur 1024 parasites résistant simultanément

aux mdcts A et B

Pourquoi des combinaisons thérapeutiques?

• Prise en charge optimale du paludisme

• Protection des nouveaux • Protection des nouveaux antipaludiques

• Diminution de la transmission des parasites résistants

Evolution of gametocyte carriage by treatment arm on follow up days

25

30

35

40

45

50

AR_L

AS/ AQ

AS/ SP

0

5

10

15

20

D0 D3 D7 D14 D21 D28

Gametocyte carriage decreased following ACT treatment.

Artemisinine et ses derivés

RR DerivéH- DihydroartemisininCH3- ArtemetherCH2CH3- ArteetherNaOOC(CH2)2COO- Na Artesunate

Artemisinine et ses derivés

• Réduction rapide et substantielle de la biomasse parasitaire

• Efficace sur P. falcimulti-résistant

• ½ vie trop courte (~ 3 H)

• Étroite fenêtre d’activité (jeunes trophozoites)

• Taux de recrudescence en monotherapiemulti-résistant

• Portage de gameto

• Transmission?

• Faible toxicité?

monotherapie

• Insuffisance de données chez la femme enceinte

Demi-vie d’élimination de divers antipaludiques

Artemisinine derivates

Sulfadoxine

Sulfalene

Pyrimethamine

1- 2 heures

100 – 400 heures

65 – 80 heures

80 – 95 heuresPyrimethamine

Lumefantrine

Amodiaquine

Mefloquine

80 – 95 heures

72 – 140 heures

216 – 720 heures

~ 480 heures

Combinaisons à base de derivés de l’artemisinine (ACT)l’artemisinine (ACT)

CTAs sélectionnées par le PNLP Mali

• Artesunate/amodiaquine

• Artemether/lumefantrine

Inconvenient majeur des combinaisons:combinaisons:

Le coût

Autres problèmes

• L’observance

• Complexité du traitement surtout pour les combinaison libres– Risque de monotherapie

– Risque de ttt incomplets– Risque de ttt incomplets

• Faible recul pour les nouvelles molécules et les nouvelles co-formulations

• Insuffisance de données Régionales et Maliennes

• Problèmes de déploiement de ces shémas souvent complexes dans les niveaux primaires de nos systèmes de santé

Etudes du MRTC

Efficacité à J28 des combinaisons thérapeutiques

(sans correction moléculaire)

70

80

90

100

AS+AQ

0

10

20

30

40

50

60

70

RCPA

AS+AQ

AS+SP

AS

Coarinate

Coartem

Efficacité à J28 des combinaisons thérapeutiques

(avec correction moléculaire)

70

80

90

100

AS+AQ

0

10

20

30

40

50

60

70

RCPA+

AS+AQ

AS+SP

AS

Coarinate

Coartem

Conclusion

• Les combinaisons thérapeutiques représentent une chance à saisir pour améliorer le contrôle du paludisme en AfriqueAfrique

• Mais……

Problématique des CTA sur le terrain

• Besoin d’une couverture d’au moins 80% pour voir un impact réel

• Système de santé en Afrique couvre ~30 –40% seulement de la population à risque40% seulement de la population à risque

• Faut-il traiter le palu avec ou sans diagnostic biologique?

– Diagnostic + => coût additionnel des TDR

– Diagnostic (-) => accélération de la résistance

« Course contre la montre »• Développement et propagation de la

chimiorésistance à l’artemisinine

• Développement de la contrefaçon

• Découverte de nouvelles molécules efficaces• Découverte de nouvelles molécules efficaces

• Déploiement à large échelle des CTA dans les zones les plus reculées

Qui va remporter cette course????