MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit -...

78
MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 MBL Oligomer ELISA Kit Diagnostics EN EN EN DE FR IT ES DA SE CZ

Transcript of MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit -...

Page 1: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

MBL Oligomer ELISA Kit

MBL Oligomer ELISA Kit

IVD

KIT 029

MBL Oligomer ELISA Kit

Diagnostics

ENENEND

EFR

ITES

DA

SE

CZ

Page 2: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

2

MBL Oligomer ELISA Kit

Please read these instructions carefully

INTENDED USEFor the determination of oligomerized mannan-binding lectin in human serum or heparin plasma.

CLINICAL SIGNIFICANCEDetermination of susceptibility to infections, and hence a possible requirement for the aggressive administration of antibiotics in:

• Patients receiving or about to receive cancer chemotherapy or immunosuppressive treatment

• Patients with cystic fibrosis

• Children with recurrent infectionsMay also be used as a prognostic marker for disease severity in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus.

Mannan-binding lectin (MBL; also called mannose-binding lectin or protein) is a multimeric carbo-hydrate-binding protein produced in the liver and secreted into the blood, where it constitutes an important element in innate immune defense against invading microorganisms. Its normally oligomerized forms are associated with specific serine pro- proteases (the MASPs) which are activated when MBL binds to microbial carbo hydrate surfaces and in turn activate complement via the MBL or lectin pathway1. Deficiency of normally oligomerized MBL may be associated with increased susceptibility to infections when the adaptive immune system is immature (in early childhood)2 or has been suppressed (e.g. after organ transplantation or during cancer chemothera py)3. Deficiency is also associated with a more severe course of autoim-mune diseases such as systemic lupus erythemato-sus (SLE)4 or rheumatoid arthritis5, and with a poorer prognosis in cystic fibrosis6. MBL deficiency can be due to allelic variants in the promoter and/or structural regions of the MBL gene7. Certain promoter alleles are associated with lower serum concentrations of MBL, while the structural variants impair both normal oligomeriza-tion of MBL and total chain synthesis. Subjects who

are homozygous for a structural defect show very low levels of oligomerized MBL, while heterozy-gotes show low-intermediate levels. In 100 healthy Danish blood donors, serum MBL concentrations determined by an oligomer-selective immunoassay showed low values (<50 ng/ml) in 12 individuals. These were due to a variety of combinations of structural and/or promoter alleles7. This indicates the prevalence in a Western population of low levels of MBL that may give rise to clinical manifestations. It is, however, unknown why only some individuals with low MBL levels show increased susceptibility to infection; explanations include chance differ-ences in exposure or a possible requirement for the coexistence of another, perhaps subtle, immunode-ficiency. The determination of MBL concentrations in serum may be useful for the elucidation of suspected immune defects and as a prognostic indicator alerting to the need for heightened therapeutic or prophylactic measures in immuno-suppressed patients, including patients receiving cancer chemotherapy, and patients with cystic fibrosis, SLE or rheumatoid arthritis.

PRINCIPLE OF THE ASSAY PROCEDUREThe assay is an ELISA performed in microwells coated with a monoclonal antibody against the MBL carbohydrate-binding domain. Bound MBL is detected with the same antibody that has been labeled with biotin, followed by development with horseradish peroxidase (HRP)-conjugated strepta-vidin and incubation with a chromogenic substrate. Comparison of the assay results with molecular size chromato graphy of MBL immunoreactivity in individual human serum samples suggests that the monoclonal antibody used is selective for MBL oligomers when used as both capture and detection antibody. The assay is a four-step procedure: Step 1. Aliquots of calibrators, diluted serum samples and any controls are incubated in microw-ells precoated with monoclonal antibody against MBL. MBL present in the solutions will bind to the antibody-coated wells via its carbohydrate-binding domains. Unbound material is removed by washing.

Page 3: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

3

MBL Oligomer ELISA Kit

Step 2. Biotinylated monoclonal detection antibody is added to each test well and incubated. The detection antibody attaches to bound MBL oligomers via carbohydrate-binding domains that are not occupied by being bound down to the coat. Unbound detection antibody is removed by washing. Step 3. HRP-conjugated streptavidin is added to each test well and allowed to form a complex with the bound biotinylated antibody. Unbound conjugate is removed by washing. Step 4. A chromogenic peroxidase substrate containing tetramethylbenzidine (TMB) is added to each test well. The bound HRP-streptavidin reacts with the substrate to generate a colored product. The enzymatic reaction is stopped chemically, and the color intensity is read at 450 nm in an ELISA reader. The color intensity (optical density) is a function of the concentration of MBL oligomeric forms originally added to each well. The results for the calibrators are used to construct a calibration curve from which the concentrations of MBL in the test specimens are read.

PRINCIPLE OF THE ASSAY PROCEDURE

EN

MBL Antibody

Plates are precoated with MBL anti-body. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incubated

Biotinylated MBL Antibody

Biotinylated detection antibody is add-ed to each well and incubated

Streptavidin ñ HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incubated

TMB Substrate

Substrate is added to each well. De-velop for 15 minutes in the dark

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Stop solution

Mannan

Plates  are  precoated  with  Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted  samples  and  calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated  streptavidin  is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop  for  15  minutes  in  the dark

15 min.

Stop  Solution  is  added  to  each well. Read plate within 30 min.

Quantitative  results  are  obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates  are  precoated  with  Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted  samples  and  calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated  streptavidin  is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop  for  15  minutes  in  the dark

15 min.

Stop  Solution  is  added  to  each well. Read plate within 30 min.

Quantitative  results  are  obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates  are  precoated  with  Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted  samples  and  calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated  streptavidin  is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop  for  15  minutes  in  the dark

15 min.

Stop  Solution  is  added  to  each well. Read plate within 30 min.

Quantitative  results  are  obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates  are  precoated  with  Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted  samples  and  calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated  streptavidin  is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop  for  15  minutes  in  the dark

15 min.

Stop  Solution  is  added  to  each well. Read plate within 30 min.

Quantitative  results  are  obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates  are  precoated  with  Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted  samples  and  calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated  streptavidin  is added  to each well  and  incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop  for  15  minutes  in  the dark

15 min.

Stop  Solution  is  added  to  each well. Read plate within 30 min.

Quantitative  results  are  obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

B B

B B

B B

B B

B

B B

SS

B B

B

B B

S

SS

B B

B B

B

Page 4: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

4

MBL Oligomer ELISA Kit

KIT COMPONENTS

Note: Liquid reagents contain the preservatives sodium azide, thimerosal or Bronidox L. These may be harmful if ingested.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED1. Adjustable micropipettes covering the range

1-1000 µL and corresponding disposable pipette tips

2. Polypropylene tubes to contain up to 1000 µL3. Tube racks4. Adjustable 8- or 12-channel micropipette

(50-250 µL range) or repeating micropipette (optional).

5. Clean 1 L graduated cylinder6. Deionized or distilled water7. Cover for microplate8. Clean container for diluted Wash Solution9. Apparatus for filling wells during washing

procedure (optional)10. Lint-free paper towels or absorbent paper11. Disposable pipetting reservoirs12. Timer (60-minute range)13. Calibrated ELISA plate reader capable of

reading at 450 nm (preferably subtracting reference values at 650 or 620 nm)

14. Sodium hypochlorite (household bleach 1:10 dilution) for decontamination of specimens, reagents, and materials

PRECAUTIONSFor in vitro diagnostic use only1. This kit should only be used by qualified labora-

tory staff.2. The MBL calibrators were prepared from MBL

purified from human plasma. Each blood unit used for its preparation was tested by approved methods and found to be nonreac-tive for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies against human immunodeficiency virus (HIV) 1 and 2, and hepatitis C virus (HCV). In addition, the product was subjected to virus deactivation procedures. However, as no test method can offer complete security that infectious agents are absent, the calibrators and patients’ specimens should be handled at Biosafety Level 2 as recommended for any potentially infectious human serum or blood specimen in the CDC/NIH manual “Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories”, 1999. Solutions containing human serum should be treated as potentially infectious and handled accordingly.

3. Use separate pipette tips for each sample, calibrator and reagent to avoid cross-contami-nation.

4. Use separate reservoirs for each reagent. This applies especially to the TMB Substrate.

5. After use, decontaminate all specimens, reagents and materials by soaking for at least 30 minutes in sodium hypochlorite solution (household bleach diluted 1:10).

6. To avoid droplet formation during washing, aspirate the wash solution into a bottle contain-ing bleach.

7. Avoid release to the environment. Dispose of containers and unused contents in a safe way and in accordance with national and local regulations.

8. Reagents in this kit are preserved with up to 0.05% sodium azide, 0.038% thimerosal, also called thiomersal or merthiolate, or 0.2% Bronidox L. These may be toxic if ingested.

9. The Stop Solution contains 0.5 mol/L sulfuric acid and can cause irritation or burns to the

Item Contents Quantity

112 x 8 coated Microwells + Frame

96 wells

2 Sample Diluent 1 x 60 mL

3a - 3h MBL Calibrator 1-8 8 x 1 mL

4 25x Wash Solution Conc. 1 x 30 mL

5 Biotinylated MBL Antibody 1 x 12 mL

6 HRP-Streptavidin 1 x 12 mL

7 TMB Substrate 1 x 12 mL

8 Stop Solution 1 x 16 mL

Page 5: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

5

MBL Oligomer ELISA Kit

skin and eyes. If contact occurs, rinse immedi-ately with plenty of water and seek medical advice.

10. Do not interchange components from kits with different batch numbers. The components have been standardized as a unit for a given batch.

11. Hemolyzed or hyperlipemic specimens may give erroneous results.

12. Do not dilute serum or plasma specimens directly in the microwells.

13. Do not touch or scrape the bottom of the microwells when pipetting or aspirating fluid.

14. Incubation times and temperatures other than those specified may give erroneous results.

15. Do not allow the wells to dry once the assay has begun.

16. The TMB Substrate is light sensitive. Keep away from bright light.

17. Do not reuse microwells or pour reagents back into their bottles once dispensed.

STABILITY AND STORAGE1. Store the kit with all reagents at 2-8°C. Do not

freeze.2. Use all reagents before the expiry date on the

vial labels.3. Diluted Wash Solution remains stable for

4 weeks at 2-8°C. If not all wells are to be used, dilute only the portion of Wash Solution Concentrate required.

4. For subsequent use, store unused wells in the foil pouch with the desiccant provided and reseal. Always allow foil pouch to equilibrate to room temperature before opening to avoid condensation in/on the coated microwells.

COLLECTION OF SPECIMENSHandle and dispose of all blood, serum or plasma specimens as if they were potentially infectious. See Precautions, sections 2, 3, 5, 6 and 7.Determination of MBL in a single specimen requires 5-50 µL of serum or plasma. Blood specimens should be collected aseptically into a plain or heparinized tube by qualified staff using approved venepuncture techni ques. Serum or plasma should

be prepared by standard techniques for clinical laboratory testing. Cap the specimens and store them at 2-8°C for assay within 24 hours. If the assay cannot be performed within 24 hours or if the specimen is to be shipped, cap the specimen and keep it frozen at −20°C or below. Avoid repeated freezing and thawing. Do not use hemolyzed, hyperlipemic, heat-treated or contaminated specimens.

PREPARATION OF REAGENTS AND SAMPLES1. Bring all specimens and reagents to room

temperature (20-25°C). Mix specimens thoroughly by gentle inversion and if necessary clear visible particulate matter by low-speed centrifugation.

2. Determine the number of specimens to be tested (in duplicate) plus any internal labora-tory control specimens (in duplicate) plus any reagent blank wells. The pre-coated wells can be used as strips of 8 or as individual wells. Single wells are handled by breaking individual wells apart and placing each well in the frame at an appropriate position. Letters and notches on the wells allow the individual wells to be identified. Add 16 wells for the 8 calibrators (in duplicate). Remove the number of microwells required and replace the remainder in the foil pouch with desiccant at 2-8°C.

3. Wash Solution: Dilute the 25x Wash Solution Concentrate by pouring the total contents of the bottle (30 mL) into a 1-L graduated cylinder and add distilled or deionized water to a final volume of 750 mL. Mix thoroughly and store at 2-8°C after use.

4. Sample Diluent: Ready to use, do not dilute further.

5. MBL Calibrators: Ready to use. The assigned concentrations are indicated on their labels. Do not dilute further.

6. Biotinylated MBL Antibody: Ready to use, do not dilute further.

7. HRP-Streptavidin Conjugate: Ready to use, do not dilute further.

8. TMB Substrate: Ready to use, do not dilute

EN

Page 6: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

6

MBL Oligomer ELISA Kit

further.9. Stop Solution: Ready to use, do not dilute

further.10. Patient specimens: Dilute each specimen in

a recorded proportion with Sample Diluent to obtain at least 250 µL of diluted solution that can be set up in duplicate wells at 100 µL per well. An initial screening at a dilution of 1/100 (e.g. 5 µL of serum + 495 µL of Sample Diluent, mixed by inversion or slow vortexing) is suggested for most samples, followed by reassay of out-of-range samples at lower or higher dilution, as appropriate. Dilutions lower than 1/10 should not be used.

ASSAY PROCEDURE1. Prepare the assay protocol, assigning the

appropriate wells for setting up calibrators, diluted patient specimens and any internal laboratory controls in duplicate. If a reference wavelength of 650 or 620 nm is not available on the ELISA reader, a reagent blank well can be assigned. This is set up with 100 µL of Sample Diluent instead of diluted serum or plasma and processed like the other wells.

2. Pipette 100 μL volumes of each calibrator, diluted specimens and any internal laboratory controls into the corresponding positions in the microwells. Cover the wells and incubate for 60 minutes at room temperature on a shaking platform set at 200/minute.

3. Aspirate the contents of the microwells and wash the microwells three times with at least 300 μL of diluted Wash Solution. If washing is done manually, empty the microwells by inversion and gentle shaking into a suitable container, followed by blotting in the inverted position on a paper towel. A dwell time of 1 minute before emptying is recommended for at least the last wash of the cycle. The vigor with which Wash Solution is filled into or emptied from the wells influences final color develop-ment. Manual pipetting, which may be very gentle and lead to high color development, is only recommended in the absence of alterna-

tives such as filling the wells by immersion, using a multi-channel manual washing dispenser, or using an automatic washing apparatus.

4. Dispense 100 μL of Biotinylated MBL Antibody (ready to use) into each microwell. A multichan-nel or repeating micropipette can be used. Cover the wells and incubate for 60 minutes at room temperature on a shaking platform (200/minute).

5. Wash as described above in Step 3.6. Dispense 100 μL of HRP-Streptavidin

Conjugate (ready to use) into each microwell. A multichannel or repeating micropipette can be used. Cover the wells and incubate for 60 minutes at room temperature on a shaking platform (200/minute).

7. Wash as described above in Step 3. 8. Dispense 100 μL of TMB Substrate (ready

to use) into each microwell. The use of a multichannel micropipette is recommended to reduce pipetting time. Cover the wells and incubate for exactly 15 minutes at room temperature in the dark. Start the clock when filling the first well.

9. Add 100 µL of Stop Solution (ready to use) to each well, maintaining the same pipetting sequence and rate as in Step 7. Mix by gentle shaking for 20 seconds, avoiding splashing. Read the wells within 30 minutes.

10. Read the absorbances of the wells at 450 nm in an appropriate microplate reader (reference wavelength 650 or 620 nm). If no reference wavelength is available, the value of the reagent blank well is subtracted from each of the other values before other calculations are performed.

Page 7: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

7

MBL Oligomer ELISA Kit

SCHEMATIC OVERVIEW

CALCULATION OF RESULTSThe basic principle is to construct a calibration curve by plotting the mean of duplicate absorbance values for each MBL Calibrator on the y-axis against the corresponding MBL concentrations in ng/mL

on the x-axis. The calibration curve must meet the validation requirements. The MBL concentration of each diluted serum sample is then found by locating the point on the curve corresponding to the mean of duplicate absorbance values for the diluted serum sample and reading its corresponding concentra-tion in ng/mL from the x axis. The concentration of MBL in the undiluted serum specimen is calculated by multiplying this result by the sample dilution factor. This procedure can be performed manually using graph paper with linear x and y scales. A smooth curve can be drawn through the points or adjacent points can be joined by straight lines. The latter procedure may slightly overestimate concen-tration values between points when the curve is slightly convex to left, which is the typical finding. Although the curve may approxi mate to a straight line, it is both practically and theore tically incorrect to calculate and draw the straight line of best fit and to read the results from this. The procedure can also be performed by an ELISA reader software program incorporating curve fitting procedures. The procedure of choice is to use linear x and y axes with 4-parameter logistic curve fitting. Diluted samples that give a mean absorbance above that for the 40 ng/mL MBL Calibrator or below that for the 0.5 ng/mL MBL Calibrator are out of the range of the assay and their concentrations should be noted as >40 ng/mL and <0.5 ng/mL respectively. The corresponding concentrations in the undiluted sera are calculated >(40 x dilution factor) ng/mL and <(0.5 x dilution factor) ng/mL, respectively. These samples should be reassayed at higher and lower dilutions for high- and low-reading samples, respectively. The new dilution factors should be those estimated to give absorbance values that fall well within the range of the calibration curve, but dilutions lower than 1/10 should not be used.

VALIDATION OF CALIBRATION CURVEThe mean absorbance for the 40 ng/mL MBL Calibrator should be >1.5. The mean absorbance for any MBL Calibrator should be higher than that for

Wash x 3Incubate  1 h at RT

100 µL Calibrator or diluted sample

Wash x 3Incubate  1 h at RT

100 µL Biotinylated MBL Antibody

Wash x 3Incubate  1 h at RT

100 µL HRP-Streptavidin

Incubate 15 min at RT in the dark

100 µL TMB Substrate

Read at 450 nm

Dilute samples

Bring reagents to room temperature (RT)

100 µL Stop Solution

EN

Page 8: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

8

MBL Oligomer ELISA Kit

the previous MBL Calibrator, e.g. absorbance(10 ng/mL MBL) > absorbance(5 ng/mL). The curve should be slightly convex to the left when the results are plotted on linear axes.

Out-of-line points for individual calibrators: One or more individual calibrators may give anomalous absorbance readings. One or both of the duplicate values may be out of line, and the mean of the duplicates may be out of line. This error is significant if it impairs satisfactory curve fitting by the 4-parameter logistic method, which as a result of the anomalous value, is shifted away from other calibrator points that are in fact correct. The calibrator points and fitted curve should always be examined for correct fit before any calculations of concentration from it are accepted. A poorly fitting curve will also be revealed by a high value for the sum of residual squares. If only one calibrator is affected, which is not the highest calibrator, two courses of action are possible: i) An erroneous singlet or duplicate result should be eliminated from the curve, and the remaining results refitted by the 4-parameter logistic procedure. If a satisfactory fit is obtained, provisional concentration results can be calculated from it. ii) If no satisfactory fit can be obtained in this way, but the curve is otherwise consistent, provisional results can be obtained from straight lines between the means of duplicates, omitting the erroneous point. If two or more calibrators are affected, the assay should be repeated. A deviant result for an individual calibrator can be due to operator error or to calibrator deteriora-tion. If both duplicate values are consistently out of line in successive assays, the calibrator is faulty and should be omitted.

TRACEABILITY OF CALIBRATOR VALUEAssignment of the MBL value was carried out by ELISA ensuring traceability to in-house standards at Statens Serum Institut (Denmark).

INTERPRETATION OF RESULTSThe full range of MBL concentrations in serum or plasma from healthy human donors as measured by this assay and analogous assays is 0 to 7000 ng/mL. Values below 100 ng/mL may be found in O/O structural genotypes (where O = B, C or D) regard-less of promoter genotype, or in A/O structural genotypes (where A = wild-type) in combination with HY/LX or LX/LY promoter genotypes, or in the LX/LX promoter genotype. Values between 100 ng/mL and 1000 ng/mL may be found in A/O structural genotypes or in LX/LY or LX/LX promoter genotypes. Values above 1000 ng/mL are associ-ated with wild-type MBL (A/A), although A/D hetero-zygotes may occasionally reach this level. The HY/HY promoter genotype typically shows values above 1500 ng/mL for wild-type MBL, but such values are also shown by other promoter genotypes in the absence of O structural alleles. Clinical studies have used cutoff values of 50 ng/mL or 100 ng/mL for defining severe MBL deficiency. Values below these cutoffs may be associated, in certain individuals, with a history of increased susceptibility to infections.

QUALITY CONTROLLaboratories intending to perform repeated assays should establish their own high-reading (>1000 ng/mL) and low-reading (<100 ng/mL) control sera, stored in small (e.g. 50 µL) aliquots at -20°C or below. An aliquot of each should be thawed and tested in each assay and a record kept of successive results. This serves as a control of test performance, test integrity and operator reliability. The results should be examined for drift (tendency for successive results to rise or fall) or significant deviation from the mean of previous results. Values not deviating by more than 20% from the mean of previous values can be taken to indicate acceptability of the assay. Aliquots of control serum should not be refrozen for repeated assay once thawed, and if a further assay is performed, fresh control aliquots and fresh dilutions of patient specimens should be used.

Page 9: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

9

MBL Oligomer ELISA Kit

LIMITATIONSA low concentration of MBL in serum or plasma does not necessarily imply the existence of any disease. Physicians must interpret the significance of any MBL deficiency in the light of each patient’s clinical features.

EXPECTED RESULTS108 plasma specimens from healthy Danish blood donors were assayed in the BioPorto Diagnostics MBL Oligomer ELISA. MBL concentration values ranged from <2 ng/mL to 4443 ng/mL. Mean and median concentrations were 1470 ng/mL and 1190 ng/mL, respectively, with a standard deviation (SD) of 1325 ng/mL. 18 specimens (16.7%) gave readings below 100 ng/mL, 30 specimens (27.8%) gave readings between 100 ng/mL and 1000 ng/mL, and 60 specimens (55.5%) gave readings over 1000 ng/mL.

PERFORMANCE CHARACTERISTICSLimit of detection: The lowest concentration of MBL giving an absorbance reading greater than 2 SD above the mean zero calibrator reading (n = 8) was 0.02 ng/mL, corresponding to a serum concen-tration of 2 ng/mL in a specimen diluted 1/100.

Intra assay (within-run) reproducibility: Two sera were run in 10 replicates to determine within-run reproducibility. The following results were obtained (CV = coefficient of variation):

Inter assay (between-run) reproducibility (different days/operators): The same two sera were run in duplicate in 4 different assays carried out by 2 operators on different days to determine between-run reproducibility. The following results were obtained:

Specificity: Western blotting of plasma or plasma fractions has not identified bands reacting with the antibody other than those attributable to MBL. The absence of cross-reaction with other plasma components is supported by the fact that readings indistinguishable from zero are obtained from some MBL-deficient but otherwise normal donors.

LIABILITYFor in vitro diagnostic use in selected countries only.See www.bioporto.com for availability in your country. This kit is only intended for the in vitro determi-nation of mannan-binding lectin in human serum or plasma. The kit is only intended for use by qualified personnel carrying out research or diagnostic activities. If the recipient of this kit passes it on in any way to a third party, this instruction must be enclosed, and said recipient shall at own risk secure in favor of BioPorto Diagnostics A/S all limitations of liability herein. BioPorto Diagnostics A/S shall not be respon-sible for any damages or loses due to using the kit in any way other than as expressly stated in these Instructions. The liability of BioPorto Diagnostics A/S shall in no event exceed the commercial value of the kit. BioPorto Diagnostics A/S shall under no circumstances be liable for indirect, special or consequential damages, including but not limited to loss of profit.

REVISION: MO2010-07-EN

Serum 1 Serum 2

Mean MBL conc. 2279 ng/mL 28.4 ng/mL

SD 81.2 1.07

CV 3.6% 3.8%

Serum 1 Serum 2

Mean MBL conc. 2310 ng/mL 29.7 ng/mL

SD 212 1.28

CV 9.2% 4.3%

EN

Page 10: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

10

MBL Oligomer ELISA Kit

Diese Anleitung bitte sorgfältig lesen

VERWENDUNGSZWECKZur Bestimmung von oligomerisiertem Mannan-bindendem Lektin in humanem Serum oder hepari-nisiertem Plasma. KLINISCHE BEDEUTUNGBestimmung der Infektionsanfälligkeit und daraus folgend einer möglicherweise notwendigen aggres-siven Verabreichung von Antibiotika an:

• Patienten, die eine Krebschemotherapie oder immunsuppressive Behandlung erhalten oder erhalten sollen.

• Patienten mit Mukoviszidose (cystischer Fibrose).

• Kinder mit rekurrierenden Infektionen.Kann auch als prognostischer Marker für den Schweregrad der Erkrankung bei rheumatischer Arthritis und systemischem Lupus erythematodes eingesetzt werden.

Das Mannan-bindende Lektin (MBL; auch bekannt als mannosebindendes Lektin oder Protein) ist ein multimeres kohlenhydratbindendes Protein, das in der Leber produziert und ins Blut abgegeben wird, wo es ein wichtiges Element in der unspezifischen Immunantwort gegen eindringende Mikroorganis-men ist. Seine normal oligomerisierten Formen sind mit spezifischen Serin-Proproteasen (den MASPs) assoziiert, die durch Bindung von MBL an mikrobi-elle Kohlenhydratoberflächen aktiviert werden und ihrerseits über den MBL- oder Lektinweg Komple-ment aktivieren1. Mangel an normalem oligomeren MBL kann in Situationen mit unreifem (in früher Kindheit)2 oder unterdrücktem (z. B. nach Organtransplantation oder unter Krebschemotherapie)3 adaptivem Immunsys-tem mit erhöhter Anfälligkeit gegenüber Infektionen zusammenhängen. Der Mangel ist ebenfalls mit einem schwereren Verlauf von Autoimmunerkrankun-gen wie systemischem Lupus erythematodes (SLE)4 oder rheumatoider Arthritis5 verbunden, sowie mit einer schlechteren Prognose bei Mukoviszidose6. MBL-Defizienz kann durch unterschiedliche Allele in der Promotorregion und/oder den struktu-

rellen Regionen des MBL-Gens verursacht werden7. Bestimmte Promotorvarianten sind mit niedrigeren MBL-Serumkonzentrationen assoziiert, während strukturelle Varianten sowohl die normale Oligome-risierung als auch die Gesamtkettensynthese von MBL beeinträchtigen. Individuen mit homozygotem strukturellem Defekt zeigen sehr niedrige Werte für oligomerisiertes MBL, während heterozygote Individuen niedrige bis mittlere Werte aufweisen. Die Untersuchung der MBL-Serumkonzentration in 100 gesunden dänischen Blutspendern mit einem oligomerselektiven Immunoassay ergab für 12 Individuen niedrige Werte (<50 ng/mL). Diese beruhten auf unterschiedlichen Kombinationen von strukturellen und/oder Promotor-Allelvarianten7. Dies weist auf die Prävalenz von niedrigen MBL-Werten in der westlichen Bevölkerung hin, die zu klinischen Manifestationen führen könnten. Es ist jedoch unbekannt, warum nur manche Individuen mit niedrigen MBL-Werten eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Infektionen zeigen; als Erklärungen wurden zufällige Expositionsunterschiede oder eine mögliche Erfordernis der Koexistenz einer anderen, vielleicht subtilen, Immunschwäche genannt. Die Bestimmung von MBL-Serumkonzentratio-nen kann bei der Aufdeckung vermuteter Immunde-fekte helfen und als prognostischer Hinweis dienen, der auf den Bedarf nach verstärkten therapeu-tischen oder prophylaktischen Maßnahmen in immunsupprimierten Patienten aufmerksam macht, darunter Patienten, die eine Krebschemotherapie erhalten, sowie Patienten mit Mukoviszidose, SLE oder rheumatoider Arthritis.

TESTPRINZIPBei dem Test handelt es sich um einen ELISA, der in Mikrotitervertiefungen durchgeführt wird, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen die kohlenhydratbindende Domäne von MBL beschichtet sind. Gebundenes MBL wird durch Inkubation mit dem gleichen Antikörper in biotinylierter Form und nachfolgenden Inkuba-tionen mit Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase; HRP)-konjugiertem Streptavidin und einem chromogenen Substrat nachgewiesen. Ein

Page 11: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DE

11

MBL Oligomer ELISA Kit

Vergleich der MBL-Immunreaktivität in einzelnen Humanserumproben zwischen den Testergebnis-sen und Molekülgrößen-Chromatographie lässt darauf schließen, dass der eingesetzte monoklonale Antikörper spezifisch für MBL-Oligomere ist, wenn er sowohl als Capture- als auch als Detektions-antikörper benutzt wird. Der Test besteht aus vier Schritten: Schritt 1. Aliquots der Standards, verdünnten Serumproben und Kontrollen werden in Mikroti-tervertiefungen inkubiert, die mit monoklonalem Antikörper gegen MBL vorbeschichtet sind. Das in den Lösungen vorhandene MBL wird über seine kohlenhydratbindenden Domänen an die antikörperbeschichteten Oberflächen der Vertie-fungen binden. Ungebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Schritt 2. Biotinylierter monoklonaler Detekti-onsantikörper wird zu jeder Vertiefung gegeben und inkubiert. Der Detektionsantikörper bindet über freie kohlenhydratbindende Domänen, die nicht an die Beschichtung der Vertiefung gebunden sind, an die MBL-Oligomere. Ungebundener Detektionsantikör-per wird durch Waschen entfernt. Schritt 3. HRP-konjugiertes Streptavidin wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, um mit dem gebundenen biotinylierten Antikörper einen Komplex zu bilden. Ungebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Schritt 4. Ein chromogenes, Tetramethyl-benzidin (TMB) enthaltendes Peroxidasesubstrat wird zu den Testvertiefungen hinzugegeben. Das gebundene HRP-Streptavidin reagiert mit dem Substrat, wodurch ein farbiges Produkt entsteht. Die enzymatische Reaktion wird chemisch gestoppt und die Farbintensität bei 450 nm in einem ELISA-Platten-Lesegerät gemessen. Die Farbintensität (optische Dichte) wird durch die Konzentration der ursprünglich in die einzelnen Vertiefungen gegebenen MBL-Oligomere bestimmt. Die Ergebnisse der Standards werden zur Erstel-lung einer Standardkurve genutzt, von der die MBL-Konzentrationen in den Testproben abgelesen werden.

TESTPRINZIP

MBL-Antikörper

Die gebrauchsfertigen Platten sind mit primärem MBL-Antikörper vorbeschich-tet.

MBL

Verdünnte Proben und Standards wer-den in die Vertiefungen gegeben und inkubiert.

Biotinylierter MBL-Antikörper

Biotinylierter Detektionsantikörper wird in jede Vertiefung gegeben und inku-biert

HRP-konjugiertes Streptavidin

HRP-konjugiertes Streptavidin wird in jede Vertiefung gegeben und inkubiert

TMB-Substrat

Substrat wird in jede Vertiefung gege-ben. Für 15 Minuten im Dunkeln ent-wickeln

Stopplösung wird zu den Vertiefungen gegeben. Platte innerhalb von 30 min. messen.

Durch die Messung der Absorption bei 450 nm werden quantitative Ergebnisse erzielt.

Stopplösung

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 12: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

12

MBL Oligomer ELISA Kit

BESTANDTEILE DES KITS

Anmerkung: Flüssige Reagenzien enthalten die Konservie-rungsmittel Natriumazid, Thimerosal oder Bronidox L. Diese sind gesundheitsschädlich beim Verschlucken.

ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN1. Einstellbare Mikropipetten (für einen Bereich

von 1-1000 µL) sowie dazugehörige Einweg-Pipettenspitzen

2. Polypropylen-Reaktionsgefäße mit einem zulässigen Füllvolumen von mindestens 1000 µL

3. Reaktionsgefäßhalter4. Eine einstellbare 8- oder 12-Kanal-Mikropipette

(für einen Bereich von 50-250 µL) oder Multipi-pette (optional)

5. Einen sauberen 1-L-Messzylinder6. Deionisiertes oder destilliertes Wasser7. Eine Abdeckung für Mikrotiterplatten8. Einen sauberen Behälter für die verdünnte

Waschlösung9. Ein Gerät zur Befüllung der Vertiefungen in den

Waschschritten (optional)10. Flusenfreie Papierhandtücher oder absorbie-

rendes Papier11. Einweg-Pipettierreservoirs

12. Eine Zeitschaltuhr (für eine Zeitspanne bis 60 Minuten)

13. Ein kalibriertes ELISA-Platten-Lesegerät, das die Platten bei 450 nm messen kann (vorzugs-weise mit der Möglichkeit, Referenzwerte bei 650 oder 620 nm abziehen zu können)

14. Natriumhypochlorit (Haushaltsbleiche, 1:10-Verdünnung) zur Dekontamination der Proben, Reagenzien und Materialien

VORSICHTSMASSNAHMENNur für die In-vitro-Diagnostik 1. Dieser Kit sollte nur von qualifiziertem

Laborpersonal benutzt werden.2. Die MBL-Standards wurden mit MBL aus

gereinigtem Humanplasma hergestellt. Alle zur Präparation verwendeten Bluteinheiten wurden mit anerkannten Methoden getestet und waren negativ für das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg), Antikörper gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) 1 und 2, sowie das Hepatitis C-Virus (HCV). Zusätzlich durchlief das Produkt Verfahren zur Virusinaktivierung. Da jedoch keine Testmethode die Abwesenheit von Infektionserregern garantieren kann, sollten die Standards und Patientenproben unter den Bedingungen der Biologischen Sicherheitsstufe 2 gehandhabt werden, so wie in dem CDC/NIH-Handbuch „Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories“ (1999) für alle potenzi-ell infektiösen humanen Seren oder Blutproben empfohlen. Lösungen, die Humanserum enthalten, sollten als potenziell infektiös betrachtet und entsprechend behandelt werden.

3. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen für jede Probe, jeden Standard und jedes Reagenz gesonderte Pipettenspitzen benutzen.

4. Für jedes Reagenz gesonderte Reservoirs benutzen. Dies gilt im Besonderen für das TMB-Substrat.

5. Alle Proben, Reagenzien und Materialien nach Gebrauch durch mindestens 30-minütiges Einweichen in Natriumhypochloritlösung (Haushaltsbleiche, 1:10 verdünnt) dekontami-nieren.

Einheit Inhalt Menge

1

12 x 8 beschichtete Mikrotitervertiefungen + Rahmen

96 Vertfg.

2 Probenverdünnungsmittel 1 x 60 mL

3a - 3h MBL-Standards 1-8 8 x 1 mL

425x Waschlösungs-konzentrat

1 x 30 mL

5Biotinylierter MBL- Antikörper

1 x 12 mL

6 HRP-Streptavidin 1 x 12 mL

7 TMB-Substrat 1 x 12 mL

8 Stopplösung 1 x 16 mL

Page 13: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DE

13

MBL Oligomer ELISA Kit

6. Um Tröpfchenbildung während der Waschpro-zedur zu vermeiden, sollte die Waschlösung in eine Bleiche enthaltende Flasche abgesaugt werden.

7. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Behälter und unbenutzte Bestandteile müssen unter Beachtung der nationalen und örtlichen Vorschriften sicher entsorgt werden.

8. Die Reagenzien in diesem Kit sind mit bis zu 0,05% Natriumazid, 0,038% Thimerosal, auch bekannt als Thiomersal oder Merthiolat, oder 0,2% Bronidox L konserviert. Diese sind giftig beim Verschlucken.

9. Die Stopplösung enthält 0,5 mol/L Schwefel-säure und kann Reizungen oder Verätzun-gen der Haut und Augen verursachen. Bei Berührung sofort mit viel Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen.

10. Komponenten von Kits mit unterschiedlichen Chargennummern nicht vertauschen. Die Komponenten wurden als Einheit für eine bestimmte Charge standardisiert.

11. Hämolysierte oder hyperlipämische Proben können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.

12. Verdünnungen der Serum- order Plasmapro-ben nicht direkt in den Mikrotitervertiefungen durchführen.

13. Beim Pipettieren oder Absaugen von Flüssig-keit die Berührung oder das Kratzen am Boden der Mikrotitervertiefungen vermeiden.

14. Die Verwendung anderer als der angegebenen Inkubationszeiten und –temperaturen kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen.

15. Während des Versuchs dürfen die Vertiefungen nicht austrocknen.

16. Das TMB-Substrat ist lichtempfindlich. Vor Licht geschützt aufbewahren.

17. Benutzte Mikrotitervertiefungen und Reagen-zien nicht wieder verwenden oder in ihre Flaschen zurückschütten.

STABILITÄT UND LAGERUNG1. Kit mit allen Reagenzien bei 2-8°C lagern. Nicht

einfrieren.2. Alle Reagenzien sind vor den auf den Fläsch-

chenetiketten angegebenen Verfallsdaten zu verwenden.

3. Die verdünnte Waschlösung ist bei 2-8°C für 4 Wochen haltbar. Falls nicht alle Vertiefungen benutzt werden, nur den benötigten Anteil des Waschlösungskonzentrats verdünnen.

4. Nicht eingesetzte Vertiefungen können für späteren Gebrauch zusammen mit dem Antikondensationsmittel in dem mitgelie-ferten Folienbeutel versiegelt und gelagert werden. Folienbeutel vor dem Öffnen stets auf Raumtemperatur bringen, um eine Kondensa-tion in/auf den beschichteten Mikrotitervertie-fungen zu vermeiden.

PROBENENTNAHMEAlle Blut-, Serum- oder Plasmaproben sind als potenziell infektiöses Material zu behandeln und zu entsorgen. Siehe Vorsichtsmaßnahmen, Abschnitte 2, 3, 5, 6 und 7.Die Bestimmung von MBL in einer einzelnen Probe erfordert 5-50 µL Serum oder Plasma. Blutproben sollten von qualifiziertem Personal mittels einer anerkannten Venenpunktionstechnik aseptisch in einem einfachen oder heparinisierten Gefäß gesammelt werden. Serum oder Plasma sollte mit klinischen Standardlabormethoden hergestellt werden. Proben verschließen und bis zur Analyse innerhalb von 24 Stunden bei 2-8°C lagern. Falls der Test nicht innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden kann oder falls die Probe verschickt werden soll, kann die verschlossene Probe bei -20°C oder darunter gelagert werden. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden. Keine hämoly-sierten, hyperlipämischen, hitzebehandelten oder kontaminierten Proben verwenden.

VORBEREITUNG DER REAGENZIEN UND PROBEN1. Alle Proben und Reagenzien auf Raumtem-

peratur (20-25°C) bringen. Die Proben durch vorsichtiges Schütteln gründlich mischen. Falls notwendig, sichtbare Teilchen durch Zentrifu-gation bei niedriger Geschwindigkeit entfernen.

2. Anzahl der zu testenden Proben (im Duplikat)

Page 14: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

14

MBL Oligomer ELISA Kit

plus Anzahl der internen Laborkontrollpro-ben (im Duplikat) plus Anzahl der Leerwerte bestimmen. Die vorbeschichteten Vertiefungen können einzeln oder als 8er-Streifen verwendet werden. Nach dem Abbrechen einzelner Vertiefungen werden diese jeweils an einer passenden Position im Rahmen platziert. Individuelle Vertiefungen können anhand von Buchstaben und Einkerbungen auf den Vertie-fungen identifiziert werden. 16 Vertiefungen für die 8 Standards (im Duplikat) hinzufügen. Die benötigte Anzahl der Mikrotiterstreifen abtrennen und den Rest zusammen mit dem Antikondensationsmittel im Folienbeutel bei 2-8°C lagern.

3. Waschlösung: Den gesamten Inhalt des 25x Waschlösungskonzentrats (30 mL) in einen 1-L-Messzylinder geben und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 750 mL auffüllen. Gründlich mischen und nach gebrauch bei 2-8°C lagern.

4. Probenverdünnungsmittel: Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.

5. MBL-Standards: Gebrauchsfertig. Die entsprechenden Konzentrationen sind auf den Etiketten angegeben. Nicht weiter verdünnen.

6. Biotinylierter MBL-Antikörper: Gebrauchsfer-tig, nicht weiter verdünnen.

7. HRP-Streptavidin: Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.

8. TMB-Substrat: Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.

9. Stopplösung: Gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen.

10. Patientenproben: Jede Probe in einem notierten Verhältnis mit dem Probenverdün-nungsmittel bis auf ein Volumen von mindes-tens 250 µL verdünnte Lösung verdünnen, so dass Doppelbestimmungen mit 100 µL pro Vertiefung möglich sind. Für die meisten Proben wird empfohlen, einen Vorversuch mit einer Verdünnung von 1/100 (z. B. 5 µL Serum + 495 µL Probenverdünnungsmittel, durch Inversion oder langsames Vortexen gemischt) durchzuführen, gefolgt von einem erneuten

Test für Proben außerhalb des Messbereichs bei entsprechend niedrigerer oder höherer Verdünnung. Niedrigere Verdünnungen als 1/10 sollten nicht verwendet werden.

TESTDURCHFÜHRUNG1. Testprotokoll erstellen und dabei die Standards,

verdünnten Patientenproben und internen Laborkontrollen den entsprechenden Vertiefun-gen (im Duplikat) zuweisen. Falls das ELISA-Platten-Lesegerät keine Referenz-Wellenlänge bei 650 oder 620 nm zulässt, kann einer Vertiefung ein Reagenzleerwert zugewiesen werden. Hierfür wird eine Vertiefung mit 100 µL des Probenverdünnungsmittels anstelle von verdünntem Serum oder Plasma befüllt und in gleicher Weise behandelt wie die anderen Vertie-fungen.

2. 100 μL-Volumina der Standards, verdünnten Proben und internen Laborkontrollen in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Vertiefungen abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 200 U/min inkubieren.

3. Inhalt der Mikrotitervertiefungen absaugen und die Vertiefungen dreimal mit mindestens 300 μL der verdünnten Waschlösung waschen. Falls der Waschvorgang von Hand durchge-führt wird, die Mikrotitervertiefungen durch Umdrehen und vorsichtiges Schütteln über einem passenden Behälter leeren, gefolgt von Ausklopfen in der umgedrehten Position auf einem Papierhandtuch. Eine Verweilzeit von 1 Minute vor dem Leeren wird mindestens beim letzten Waschgang empfohlen. Die Heftigkeit, mit der die Waschlösung in die Vertiefungen gefüllt oder aus diesen geleert wird, beeinflusst die Farbentwicklung am Ende. Pipettieren von Hand, welches sehr behutsam sein und zu hoher Farbentwicklung führen kann, wird nur in der Abwesenheit von Alternativen wie z. B. Füllung der Vertiefungen durch Eintauchen, Anwendung eines manuellen Mehrkanal-Waschlösungsspenders oder Nutzung eines automatischen Waschapparats empfohlen.

Page 15: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DE

15

MBL Oligomer ELISA Kit

4. 100 μL des gebrauchsfertigen biotinylierten MBL-Antikörpers pro Mikrotitervertiefung verteilen. Hierzu kann eine Mehrkanal- oder Multipipette benutzt werden. Vertiefungen abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (200 U/min) inkubieren.

5. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.6. 100 μL des gebrauchsfertigen HRP-Streptavi-

dinkonjugats pro Mikrotitervertiefung verteilen. Hierzu kann eine Mehrkanal- oder Multipipette benutzt werden. Vertiefungen abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (200 U/min) inkubieren.

7. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.8. 100 μL des gebrauchsfertigen TMB-Substrats

pro Mikrotitervertiefung verteilen. Die Anwendung einer Mehrkanal-Pipette wird empfohlen, um die Pipettierzeit zu reduzieren. Vertiefungen abdecken und genau 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Uhr starten, wenn die erste Vertiefung gefüllt wird.

9. 100 µL der gebrauchsfertigen Stopplösung pro Vertiefung zugeben, unter Beibehaltung der gleichen Pipettierreihenfolge und -geschwin-digkeit wie in Schritt 7. 20 Sekunden lang durch vorsichtiges Schütteln unter Vermeidung von Spritzern mischen. Vertiefungen innerhalb von 30 Minuten analysieren.

10. Extinktion der Vertiefungen bei 450 nm in einem geeigneten Mikrotiterplatten-Lesegerät messen (Referenz-Wellenlänge 650 oder 620 nm). Falls keine Referenz-Wellenlänge verfügbar ist, den Wert der Reagenzleerwert-Vertiefung von allen anderen Werten abziehen, bevor weitere Berechnungen durchgeführt werden.

SCHEMATISCHE ÜBERSICHT

AUSWERTUNGAls Grundlage für die Auswertung dient die Erstellung einer Standardkurve, bei der die Extink-tionsmittelwerte für jeden der doppelt bestimm-ten MBL-Standards auf der y-Achse gegen die

3 x Waschen1 h bei RT inkubieren

100 μL Standards oder verdünnte Probe

3 x Waschen1 h bei RT inkubieren

100 μL Biotinylierter MBL-Antikörper

3 x Waschen1 h bei RT inkubieren

100 μL HRP-konjugiertes Streptavidin

15 min bei RTim Dunkeln inkubieren

100 μL TMB-Substrat

Messung bei 450 nm

Proben verdünnen

Reagenzien auf RT bringen

100 μL Stopplösung

Page 16: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

16

MBL Oligomer ELISA Kit

entsprechende MBL-Konzentration des jeweiligen Standards (in ng/mL) auf der x-Achse aufgetragen werden. Die Standardkurve muss mit den Validie-rungsanforderungen übereinstimmen. Zur Ermitt-lung der MBL-Konzentration einer verdünnten Probe wird demjenigen Punkt der Kurve, der dem Extink-tionsmittelwert der doppelt bestimmten Probe auf der y-Achse entspricht, die dazugehörige Konzen-tration auf der x-Achse (in ng/mL) zugeordnet. Die MBL-Konzentration der unverdünnten Probe erhält man durch die Multiplikation dieses Resultats mit dem Probenverdünnungsfaktor. Dieses Verfahren kann unter Verwendung von Millimeter-Papier mit linearen x- und y-Achsen von Hand durchgeführt werden. Es kann entweder eine stetige Kurve durch die Punkte gezeichnet oder angrenzende Punkte können durch gerade Linien verbunden werden. Durch letztere Vorgehens-weise könnten Konzentrationswerte zwischen den Punkten leicht überbewertet werden, falls die Kurve leicht konvex nach links verläuft, was häufig vorkommt. Auch wenn die Kurve ungefähr einer geraden Linie entspricht, ist es sowohl praktisch als auch theoretisch inkorrekt, eine Ausgleichsge-rade zu zeichnen und von dieser die Ergebnisse abzulesen. Die Analyse kann ebenso mit einem ELISA-Plat ten-Lesegerät-Sof twareprogramm durchgeführt werden, sofern es mit Kurvenanpas-sungsmethoden ausgestattet ist. Die Methode der Wahl ist die Kurvenanpassung mit Hilfe eines Vier-Parameter-Modells (4-parameter logistic curve fitting) mit linearen x- und y-Achsen. Verdünnte Proben, deren durchschnittliche Extinktionswerte oberhalb dem des 40 ng/mL MBL-Standards oder unterhalb dem des 0,5 ng/mL MBL-Standards liegen, sind außerhalb des Messbereichs des Tests, und ihre Konzentrationen sollten als >40 ng/mL beziehungsweise <0,5 ng/mL notiert werden. Die entsprechenden Konzen-trationen in den unverdünnten Seren werden mit >(40 x Verdünnungsfaktor) ng/mL beziehungsweise <(0,5 x Verdünnungsfaktor) ng/mL berechnet. Diese Proben sollten in höheren oder niedrigeren Verdünnungen (je nachdem, ob die Werte ober-

oder unterhalb des Messbereichs lagen) erneut analysiert werden. Die neuen Verdünnungsfaktoren sollten so gewählt werden, dass die voraussichtli-chen Extinktionswerte gut innerhalb des Messbe-reichs der Standardkurve liegen, wobei geringere Verdünnungen als 1/10 vermieden werden sollten.

VALIDIERUNG DER STANDARDKURVEDie mittlere Extinktion des 40 ng/mL MBL-Standards sollte >1,5 sein. Die mittlere Extinktion eines MBL-Standards sollte größer sein als diejenige des vorherigen MBL-Standards, beispielsweise Extink-tion (10 ng/mL MBL) > Extinktion (5 ng/mL). Nach Auftragen der Ergebnisse auf linearen Achsen sollte die Kurve links leicht konvex verlaufen.

Aus dem Rahmen fallende Punkte für einzelne Standards: Für einen oder mehrere individuelle MBL-Standards können abweichende Extinktions-werte auftreten. Es kann vorkommen, dass einer oder beide der Doppelwerte aus dem Rahmen fallen oder dass der Mittelwert der Duplikate aus dem Rahmen fällt. Dieser Fehler ist signifikant, wenn er die zufrieden stellende Kurvenanpassung mittels des Vier-Parameter-Modells beeinträchtigt, wobei die Kurve sich aufgrund des abweichenden Wertes von anderen Standardpunkten entfernt, obwohl diese eigentlich korrekt sind. Die angemessene Übereinstimmung zwischen den Standardpunkten und der angepassten Kurve sollte immer überprüft werden, bevor hieraus berechnete Konzentratio-nen akzeptiert werden. Eine schlecht angepasste Kurve kommt auch durch eine große Summe der Abweichungsquadrate zum Ausdruck. Falls nur ein Standard betroffen ist, und es sich dabei nicht um den höchsten Standard handelt, sind zwei Vorgehensweisen möglich: i) Ein einzelner fehlerhafter Wert oder fehlerhaf-tes Resultat einer Doppelbestimmung sollte von der Kurve ausgeschlossen und für die übrigen Resultate mit dem Vier-Parameter-Modell eine neue Kurve erstellt werden. Wenn eine zufrieden stellende Kurve ermittelt wurde, können mit ihrer Hilfe vorläufige Konzentrationsbestimmungen vorgenommen werden. ii) Falls auf diese Weise keine zufrieden

Page 17: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DE

17

MBL Oligomer ELISA Kit

stellende Anpassung erzielt werden kann, die Kurve ansonsten jedoch konsistent ist, können vorläufige Resultate anhand gerader Linien zwischen den Mittelwerten der Duplikate, unter Ausschluss des fehlerhaften Punktes, bestimmt werden. Wenn zwei oder mehr Standards betroffen sind, sollte der Test wiederholt werden. Ein abweichendes Ergebnis für einen einzelnen Standard kann durch Anwenderfehler oder durch einen verdorbenen Standard verursacht werden. Wenn beide Doppelwerte in aufeinander folgenden Tests durchweg aus dem Rahmen fallen, ist der Standard fehlerhaft und sollte verworfen werden.

RÜCKVERFOLGBARKEIT DER STANDARDWERTEDer MBL-Wert wurde durch einen ELISA bestimmt, mit dem die Rückverfolgbarkeit zu hausinter-nen MBL-Standards am Statens Serum Institut (Dänemark) gewährleistet ist.

INTERPRETATION DER ERGEBNISSEDie Spannbreite von MBL-Konzentrationen im Serum oder Plasma von gesunden humanen Spendern wurde mit diesem Test und analogen Tests als 0 bis 7000 ng/mL bestimmt. Werte unterhalb von 100 ng/mL können in strukturellen O/O-Genotypen (wobei O = B, C oder D) ungeach-tet des Promotor-Genotyps oder in strukturellen A/O-Genotypen (wobei A = Wildtyp) in Verbindung mit HY/LX- oder LX/LY-Promotor-Genotypen oder in LX/LX-Promotor-Genotypen gefunden werden. Werte zwischen 100 ng/mL and 1000 ng/mL können in strukturellen A/O-Genotypen oder in LX/LY- oder LX/LX-Promotor-Genotypen gefunden werden. Werte über 1000 ng/mL sind assoziiert mit Wildtyp-MBL (A/A), wenngleich heterozygote Individuen für A/D ebenfalls gelegentlich dieses Niveau erreichen. Der HY/HY-Promotor-Genotyp zeigt typischerweise Werte über 1500 ng/mL für Wildtyp-MBL, aber solche Werte werden auch von anderen Promotor-Genotypen in der Abwesenheit von O-Struktur-Allelen erreicht. In klinischen Studien wurden Grenzwerte von 50 ng/mL oder 100 ng/mL als Definition einer

schweren MBL-Defizienz benutzt. Werte unterhalb dieser Grenzen können in bestimmten Individuen mit einer Geschichte einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Infektionen assoziiert sein.

QUALITÄTSKONTROLLELaboratorien, die häufiger Tests durchführen wollen, sollten ihre eigenen hoch (>1000 ng/mL) und niedrig (<100 ng/mL) messenden Kontrollseren herstellen und in kleinen (z. B. 50 µL) Aliquots bei -20°C oder darunter lagern. Je ein Aliquot der Kontrollseren sollte aufgetaut und in jedem Test mitgetestet werden, wobei die Ergebnisse aus einander folgenden Tests aufbewahrt werden sollten. Dies dient zur Kontrolle der Testleistung, Testintegrität und Anwenderzu verlässigkeit. Die Ergebnisse sollten auf Drift (Tendenz aufeinander folgender Ergebnisse zur Zu- oder Abnahme) oder signifikante Abweichungen vom Mittelwert früherer Ergebnisse untersucht werden. Wenn die Werte nicht mehr als 20% vom Mittelwert früherer Werte abweichen, können sie als Indiz für die Annehmbarkeit des Tests gelten. Aliquots von Kontrollseren sollten nach dem Auftauen nicht zur Mehrfachverwendung erneut eingefroren werden. Falls ein weiterer Test durchgeführt wird, sollten frische Kontrollaliquots und frische Verdünnungen von Patientenproben benutzt werden.

EINSCHRÄNKUNGENEine niedrige MBL-Konzentration im Serum oder Plasma bedeutet nicht notwendigerweise das Vorhandensein einer Krankheit. Ärzte müssen die Signifikanz einer MBL-Defizienz im Lichte der indivi-duellen klinischen Charakteristika eines Patienten deuten.

ERWARTETE ERGEBNISSE108 Plasmaproben von gesunden dänischen Blutspendern wurden mit dem BioPorto Diagnostics MBL Oligomer ELISA untersucht. Die MBL-Konzen-trationswerte befanden sich im Bereich von <2 ng/mL bis 4443 ng/mL. Die durchschnittliche und die Median-Konzentration waren 1470 ng/mL beziehungsweise 1190 ng/mL, bei einer Standard-

Page 18: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

18

MBL Oligomer ELISA Kit

abweichung (SD) von 1325 ng/mL. 18 Proben (16,7%) erzielten Messergebnisse unter 100 ng/mL, 30 Proben (27,8%) zeigten Messergebnisse zwischen 100 ng/mL und 1000 ng/mL, und 60 Proben (55,5%) erzielten Messwerte über 1000 ng/mL.

TESTEIGENSCHAFTENNachweisgrenze: Die niedrigste MBL-Konzent-ration, die einen Extinktionswert größer als 2 SD über dem mittleren Extinktionswert des Nullstan-dards (n = 8) ergab, war 0,02 ng/mL, welches einer Serumkonzentration von 2 ng/mL in einer Probe entspricht, die 1/100 verdünnt wurde.

Intra-Test (innerhalb des Versuchs)-Reprodu-zierbarkeit: Zur Ermittlung der Reproduzierbarkeit innerhalb desselben Versuchs wurden zwei Seren in 10-facher Parallelbestimmung getestet. Dies ergab die folgenden Resultate (VK = Variationskoeffizient):

Inter-Test (zwischen verschiedenen Versuchen)-Reproduzierbarkeit (unterschiedliche Tage/Anwender): Zur Bestimmung der Reproduzierbar-keit zwischen verschiedenen Versuchen wurden die gleichen zwei Seren im Duplikat in vier verschiede-nen Tests durch zwei Anwender an verschiedenen Tagen untersucht. Dies ergab die folgenden Resultate:

Spezifität: In Western-Blot-Untersuchungen von Plasma oder Plasmafraktionen wurden keine anderen mit dem Antikörper reagierenden Banden als den MBL zuschreibbaren gefunden. Die Abwesenheit von Kreuzreaktionen mit anderen Plasmabestand-teilen wird durch die Tatsache unterstützt, dass Messungen von einigen MBL-defizienten, ansonsten aber normalen Spendern von Null ununterscheidbare Ergebnisse ergaben.

HAFTUNGZur In-vitro-Diagnose in ausgewählten Ländern. Für Erhältlichkeit in Ihrem Land siehe www.bioporto.com. Dieser Kit ist einzig zur In-vitro-Bestimmung von Mannan-bindendem Lektin in humanem Serum oder Plasma vorgesehen. Der Kit ist nur für die Anwendung durch qualifi-ziertes Personal vorgesehen, welches Forschungs- oder Diagnosetätigkeiten ausführt. Falls der Empfänger dieses Kits diesen in irgendeiner Weise an Dritte weitergibt, muss diese Anleitung beigefügt sein, und der Drittempfänger stellt BioPorto Diagnostics A/S auf eigenes Risiko von allen Haftungsansprüchen frei. BioPorto Diagnostics A/S kann in keiner Weise für jedwede Schäden oder Verluste aufgrund einer anderen Nutzung dieses Kits als ausdrücklich in dieser Anleitung angegeben verantwortlich gemacht werden. Die Haftung von BioPorto Diagnostics A/S übersteigt unter keinen Umständen den kommerzi-ellen Wert des Kits. BioPorto Diagnostics A/S ist unter keinen Umständen für indirekte, konkrete oder Folgeschä-den, insbesondere für entgangenen Gewinn, verant-wortlich zu machen.

REVISION: MO2010-07-EN-DE

Serum 1 Serum 2

Durchschnittliche MBL-Konz.

2279 ng/mL 28,4 ng/mL

SD 81,2 1,07

VK 3,6% 3,8%

Serum 1 Serum 2

Durchschnittliche MBL-Konz.

2310 ng/mL 29,7 ng/mL

SD 212 1,28

VK 9,2% 4,3%

Page 19: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DE

19

MBL Oligomer ELISA Kit

Page 20: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

20

MBL Oligomer ELISA Kit

Veuillez lire les instructions attentivement

UTILISATIONPour le dosage in vitro d’oligomère de la lectine fixant la mannane dans le sérum humain ou le plasma hépariné.

PERTINENCE CLINIQUEDétermination de la susceptibilité aux infections et donc de la nécessité d’une administration agressive d’antibiotiques chez:

• Les patients recevant ou qui vont recevoir de la chimiothérapie pour le traitement du cancer ou sous un traitement avec des immunosuppres-seurs

• Les patients atteints de mucoviscidose

• Les enfants avec des infections récurrentes.Ce dosage peut aussi être utilisé comme un marqueur pronostique de sévérité de l’arthrite rhumatoïde et du lupus érythémateux disséminé.

La lectine fixant la mannane (MBL, appelée aussi la lectine ou protéine fixant le mannose) est une protéine multimérique fixant les glucides, produite par le foie et sécrétée dans le sang où elle constitue un élément important dans la réponse immunitaire innée contre les microorganismes envahissants. Ses formes normales oligomérisées sont associées à des pro-protéases sérines spécifiques (les MASPs) qui sont activées quand la MBL se fixe aux groupe-ments glucidiques des surfaces microbiennes et qui activent, à leur tour, le complément via la voie lectine ou la MBL1. La déficience en MBL normalement oligoméri-sée peut être associée à une susceptibilité accrue aux infections quand le système immunitaire acquis est immature (pendant la petite enfance2 ou quand celui-ci a été supprimé (ex. après une transplanta-tion d’organe ou pendant un traitement contre le cancer avec de la chimiothérapie)3. La déficience est aussi associée à des maladies auto-immunes plus graves comme le lupus érythémateux systémique (LES4 ou l’arthrite rhumatoïde5 et à un plus mauvais pronostic pour la mucoviscidose6.La déficience en MBL peut être due à la présence de

variants allèliques au niveau du promoteur et/ou des régions structurales du gène MBL7. Certains allèles du promoteur sont associés à des concentrations sériques de MBL plus faibles tandis que les variants structuraux affectent à la fois l’oligomérisation normale de la MBL et tout le processus de synthèse des chaînes. Les sujets qui sont homozygotes pour une anomalie structurale ont des taux de MBL oligomérisée très faibles alors que les hétéro-zygotes ont des taux bas-intermédiaires. Chez 100 donneurs de sang danois sains, les concentrations de la MBL sérique déterminées par un immunoessai oligomère-sélectif sont basses (<50 ng/mL) chez 12 individus. Ceci est dû à diverses combinaisons d’allèles structuraux et/ou du promoteur7. Ceci indique que la prévalence des faibles taux de MBL, dans la population occidentale, peut conduire à des manifestations cliniques. Cependant, on ignore pourquoi seuls certains individus qui ont des taux de MBL faibles présentent une suscepti-bilité accrue aux infections; les explications incluent des différences d’exposition dues au hasard ou la co-existence d’une autre immunodéficience probablement plus subtile. La détermination des concentrations de MBL dans le sérum peut être utile pour élucider des anomalies immunitaires suspectées et comme indicateur pronostic prévenant de la nécessité de mesures prophylactiques ou thérapeutiques plus poussées chez les patients immunosuppressés incluant les patients cancéreux recevant de la chimiothérapie et les patients souffrant de mucovis-cidose, de LES ou d’arthrite rhumatoïde.

PRINCIPE DE LA PROCÉDURE DU DOSAGE Le dosage est une ELISA effectuée dans des micropuits recouverts d’un anticorps monoclonal dirigé contre le domaine de fixation des glucides de la MBL. La MBL liée est détectée avec le même anticorps qui a été marqué à la biotine, suivi d’un développement avec de la streptavadine conjuguée à la peroxydase de raifort(HRP) et de l’incubation avec un substrat chromogénique. La comparaison des résultats des essais avec la chromatographie de taille moléculaire vis à vis de l’immunoréactivité

Page 21: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

FR

21

MBL Oligomer ELISA Kit

de la MBL dans des échantillons individuels de sérums humains suggère que l’anticorps monoclo-nal utilisé est spécifique aux oligomères MBL quand il est utilisé à la fois comme anticorps de détection et de capture. Cet essai est une procédure en quatre étapes: Étape 1. Les aliquotes des étalons, les échantillons de sérum dilués et les contrôles sont incubés dans des micropuits recouverts avec un anticorps monoclonal anti-MBL. La MBL présente dans les solutions va se lier aux micropuits recouverts d’anticorps via son domaine de fixation aux glucides. Les éléments non fixés sont éliminés par lavage. Étape 2: L’anticorps de détection monoclonal biotinylé est ajouté à chaque puits et mis à incuber. L’anticorps de détection se lie aux oligomères MBL liés au niveau de leurs domaines de fixation glucidiques qui ne sont pas occupés par la fixation aux anticorps de revêtement des puits. Les anticorps de détection non fixés sont éliminés par lavage. Etape 3: La streptavidine-HRP conjuguée est ajoutée dans chaque puits pour former un complexe avec l’anticorps biotinylé fixé. Les conjugués non fixés sont éliminés par lavage. Etape 4: Un substrat chromogénique de la peroxydase contenant du tétraméthylbenzidine (TMB) est ajouté à chaque puits. La streptavidine-HRP liée réagit avec le substrat pour donner un produit coloré. La réaction enzymatique est stoppée chimiquement et l’intensité de la coloration est lue à 450 nm dans un lecteur ELISA. L’intensité de la coloration (la densité optique) est proportionnelle à la concentration d’oligomères de MBL ajoutée initia-lement dans chaque puits. Les résultats des étalons sont utilisés pour tracer une courbe de calibration à partir de laquelle les concentrations de MBL présentes dans les échantillons testés sont lues.

PRINCIPE DE LA PROCÉDURE DU DOSAGE

Anticorps MBL

Les plaques sont recouvertes avec l’anticorps MBL primaire. Les plaques sont prêtes à l’emploi.

MBL

Les échantillons dilués et les étalons sont ajoutés à chaque puits et mis à incuber

Anti-MBL biotinylé

L’anticorps de détection biotinylé est ajouté à chaque puits et mis à incuber

Streptavidine - HRP

La streptavidine HRP-conjuguée est ajoutée à chaque puits et mise à incuber

Substrat TMB

Le substrat est ajouté à chaque puits. Développer pendant 15 minutes dans le noir

La solution d’Arrêt est ajoutée à chaque puits. Lire la plaque dans les 30 minu-tes.

Des résultats quantitatifs sont obtenus en mesurant l’absorbance des puits à 450 nm

Solution d’arrêt

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 22: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

22

MBL Oligomer ELISA Kit

COMPOSITION DE LA TROUSSE

Note: Les réactifs liquides contiennent comme conserva-teurs de l’azide de sodium, du Thimérosal ou du Bronidox L. L’ingestion de ces produits peut être nocive.

MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI1. Micropipettes ajustables allant de 1 à 1000

μL et embouts de pipettes correspondants jetables

2. Tubes de polypropylène pouvant contenir jusqu’à 1000 μL

3. Portoirs à tubes. 4. Micropipettes ajustables de 8 ou de 12

canaux (50-250 µL) ou une pipette répétitrice (optionnel)

5. Une éprouvette graduée et propre de 1L.6. Eau distillée ou déionisée7. Couvercle pour microplaque8. Contenant propre pour la dilution de la Solution

de Lavage9. Appareil pour remplir les puits pendant les

procédures de lavage (optionnel).10. Du papier serviette sans peluche ou du papier

absorbant11. Contenants pour récupérer les déchets des

pipettes 12. Minuterie (de 60 minutes)13. Lecteur de plaque d’ELISA calibré capable de

lire à 450 nm (de préférence capable de faire la soustraction des valeurs de références à 650 ou 620 nm)

14. Hypochlorite de sodium (eau de Javel ménagère, dilution 1:10) pour la décontamina-tion des spécimens, des réactifs et du matériel.

PRÉCAUTIONSUniquement pour le diagnostic in vitro 1. Cette trousse ne devrait être utilisée que par du

personnel de laboratoire qualifié.2. Les étalons MBL ont été préparés à partir de la MBL

purifiée à partir du plasma humain. Chaque unité de sang utilisée pour sa préparation a été testée par des méthodes approuvées et s’est révélée non réactive vis-à-vis de l’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs) et des anticorps contre le virus de l’immunodéficience humaine(VIH) 1 et 2 et le virus de l’hépatite C (VHC). En outre, le produit a été soumis à des procédures de désactivation des virus. Cependant, étant donné qu’aucun test ne peut garantir l’absence totale d’agents infectieux, les étalons et les spécimens des patients doivent être manipulés à un niveau de biosécurité 2 comme il est recommandé pour n’importe quel spécimen de sérum humain ou de sang potentiellement infectieux dans le manuel CDC/NIH «Biosafety in Micribiology and Biomedical Laboratories», 1999. Les solutions contenant du sérum humain doivent être traitées comme étant potentiellement infectieuses et doivent donc être manipulées comme telles.

3. Utiliser des embouts de pipettes différents pour chaque spécimen, étalon et réactif pour empêcher la contamination croisée.

4. Utiliser des contenants différents pour chaque réactif. Ceci s’applique particulièrement au Substrat TMB.

5. Après utilisation, décontaminer tous les spécimens, réactifs et matériels en les trempant au moins 30 minutes dans une solution d’hypo-chlorite de sodium (eau de Javel ménagère, dilution 1:10).

6. Pour prévenir la formation de gouttelettes pendant le lavage, aspirez la solution de lavage

Item Eléments Quantité

112 x 8 micropuits avec revêtement + Cadre

96 puits

2 Diluant Échantillon 1 x 60 mL

3a - 3h Etalons MBL, 1-8 8 x 1 mL

4Solution de lavage concentrée 25x

1 x 30 mL

5 Anticorps MBL Biotinylé 1 x 12 mL

6 Streptavidine-HRP 1 x 12 mL

7 Substrat TMB 1 x 12 mL

8 Solution d’Arrêt 1 x 16 mL

Page 23: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

FR

23

MBL Oligomer ELISA Kit

dans une bouteille contenant de l’eau de Javel. 7. Eviter le rejet dans l’environnement. Se débarras-

ser des récipients et du contenu non utilisé en suivant les règles de sécurité conformément à la législation nationale et aux règlements locaux.

8. Les réactifs de cette trousse sont préservés avec jusqu’à 0,05% de azodure de sodium, 0,038% de Thimérosal, aussi appelé Thiomersal ou merthio-late ou 0,2% de Bronidox L. Ces réactifs peuvent être toxiques s’ils sont ingérés.

9. La Solution d’Arrêt contient 0,5 mol/L d’acide sulfurique et peut causer de l’irritation ou des brûlures au niveau de la peau et des yeux. En cas de contact, rincer abondamment et immédiate-ment à l’eau et consulter un médecin.

10. Ne pas changer les composants de cette trousse avec les composants de trousses portant des numéros de lots différents. Les composants ont été standardisés comme une unité pour un lot donné.

11. Les spécimens hémolysés ou hyperlipémiques peuvent donner des résultats erronés.

12. Ne pas diluer les spécimens de sérums ou de plasma directement dans les micropuits.

13. Ne pas toucher ou gratter le fond des micropuits quand vous pipetez ou aspirez du liquide.

14. Des temps d’incubation et des températures différents de ceux recommandés peuvent donner des résultats erronés.

15. Ne pas laisser les puits s’assécher une fois l’analyse commencée.

16. Le substrat TMB est sensible à la lumière. À conserver à l’abri de la lumière intense.

17. Ne pas réutiliser les micropuits ni remettre les réactifs dans leurs bouteilles une fois utilisés.

STABILITÉ ET STOCKAGE1. Stocker la trousse et tous les réactifs à 2-8°C. Ne

pas congeler. 2. Utiliser tous les réactifs avant la date d’expiration

indiquée sur les étiquettes des flacons. 3. La Solution de Lavage diluée reste stable pendant

4 semaines à 2-8°C. Si les puits ne sont pas tous utilisés, diluer seulement la quantité de Solution de Lavage Concentrée requise.

4. Pour une utilisation ultérieure, conserver les micropuits non utilisés dans le sac en aluminium contenant le déshydratant fourni et fermer hermétiquement. Avant utilisation, toujours laisser la pochette d’aluminium revenir à la température ambiante avant de l’ouvrir afin d’éviter la conden-sation sur ou dans les micropuits enduits.

COLLECTE DES SPÉCIMENSManipuler et éliminer tous les spécimens de sang, de plasma ou de sérum comme s’ils étaient potentiellement infectieux. Voir Précautions, sections 2, 3, 5, 6 et 7.La détermination de la MBL dans un spécimen requiert 5-50 µL de sérum ou de plasma. Les spécimens de sang doivent être collectés dans un tube sec ou hépariné, de façon stérile et par un personnel qualifié selon les procédures de prélève-ments veineux approuvées. Le sérum ou le plasma doivent être obtenus selon les techniques standards de dosages en laboratoire clinique. Reboucher les spécimens et gardez-les à 2-8°C pour un dosage dans les 24 heures. Si l’analyse ne peut pas être effectuée dans les 24 heures ou que le spécimen doit être expédié, reboucher le spécimen et le congeler à -20°C ou moins. Eviter des cycles de congélation-décongélation répétés. Ne pas utiliser des spécimens hémolysés, hyperlipémiques, traités par la chaleur ou contaminés.

PRÉPARATION DES RÉACTIFS ET DES ÉCHANTILLONS1. Laisser tous les spécimens et réactifs

atteindre la température ambiante (20-25°C). Bien mélanger les spécimens en inversant doucement les tubes et si nécessaire éliminer les particules visibles par centrifugation à basse vitesse.

2. Déterminer le nombre d’échantillons à tester (en duplicata) plus les échantillons de contrôle interne (en duplicata) et les puits blanc. Les puits à revêtement peuvent être utilisés par bande de 8 puits ou par puits individuels. Pour l’utilisation des puits individuellement, il faut les séparer et les placer dans le cadre à l’empla-

Page 24: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

24

MBL Oligomer ELISA Kit

cement approprié. Les lettres et les encoches dont les puits sont dotés permettent d’identifier les puits individuellement. Ajouter 16 puits pour les étalons (en duplicata). Enlever le nombre de micropuits nécessaires et replacer les puits restants dans le sac en aluminium contenant le déshydratant à 2-8°C.

3. Solution de Lavage: Diluer la Solution de Lavage Concentrée 25x en versant tout le contenu de la bouteille (30 mL) dans une éprouvette graduée de 1L et compléter avec 750 mL d’eau distillée ou déionisée. Bien mélanger et conserver entre 2-8°C après usage.

4. Diluant d’Échantillon: Prêt à l’emploi, ne pas diluer.

5. Etalons MBL: Prêts à l’emploi. Les concen-trations assignées sont indiquées sur les étiquettes. Ne pas diluer.

6. Anticorps Biotinylé MBL: Prêt à l’emploi, ne pas diluer.

7. Streptavidine-HRP Conjuguée: Prête à l’emploi, ne pas diluer.

8. Substrat TMB: Prêt à l’emploi, ne pas diluer.9. Solution d’Arrêt: Prête à l’emploi, ne pas diluer.10. Spécimens des patients: Diluer chaque

spécimen avec le Diluant d’Échantillon pour obtenir au moins 250 µL de solution diluée pour déposer en duplicata 100 µL par puits. Un criblage initial avec une dilution de 1/100 (ex. 5 µL de sérum + 495 µL de Diluant d’Échan-tillon, mélanger par inversion ou doucement au vortex) est suggéré pour la plupart des échantillons, suivi par un second dosage des échantillons qui se situent en dehors des limites de mesure à des dilutions plus grandes ou plus faibles selon les cas. Des dilutions de moins de 1/10 ne doivent pas être utilisées.

PROCEDURE DU DOSAGE1. Préparer le protocole d’essai, en identifiant

les puits pour les étalons, les spécimens des patients dilués et les contrôles internes de laboratoire en duplicata. Si une longueur d’onde de référence de 650 ou 620 nm n’est pas disponible sur le lecteur ELISA, faire un

blanc avec le réactif. Le blanc est obtenu avec 100 µL de Diluant d’Échantillon au lieu du sérum dilué ou du plasma et procéder ensuite comme pour les autres puits.

2. Pipeter des volumes de 100 μL de chaque étalon, spécimens dilués et des contrôles internes de laboratoire dans les micropuits aux positions correspondantes. Couvrir les puits et incuber pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur de plaque réglé à 200/minute.

3. Aspirer le contenu des micropuits et laver les micropuits trois fois avec au moins 300 μL de Solution de Lavage diluée. Si le lavage est manuel, vider les micropuits par inversion et secouer les légèrement dans un récipient adéquat suivi d’une absorption en position inversée sur une serviette en papier. Il est recommandé, au moins pour le dernier cycle de lavage, de laisser la Solution de Lavage pendant une minute avant de la vider. La vigueur avec laquelle la Solution de Lavage est déposée ou vidée du micropuits a un effet sur le dévelop-pement de la coloration finale. Le pipetage manuel qui peut être très doux et conduit ainsi au développement d’une forte coloration est recommandé uniquement en l’absence d’autres alternatives comme le remplissage des puits par immersion, l’utilisation d’une pipette de lavage multicanaux manuelle ou l’utilisation d’un appareil de lavage automatique.

4. Déposer 100 μL d’Anticorps Biotinylé MBL (prêt à l’emploi) dans chaque micropuits. Une pipette multicanaux ou une micropipette répétitrice peuvent être utilisées. Couvrez les puits pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur de plaque (200/minute).

5. Laver comme décrit ci-dessus à l’étape 3.6. Déposer 100 μL de Streptavidine-HRP

conjuguée (prête à l’emploi) dans chaque micropuits. Une pipette multicanaux ou une micropipette répétitrice peuvent être utilisées. Couvrir les puits et incuber pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur de plaque (200/minute).

Page 25: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

FR

25

MBL Oligomer ELISA Kit

7. Laver comme décrit ci-dessus à l’étape 3.8. Déposer 100 μL de Substrat TMB (prêt à

l’emploi) dans chaque micropuits. L’utilisation d’une pipette multicanaux est recommandée pour réduire le temps de pipetage. Couvrir les puits et incuber pendant exactement 15 minutes à température ambiante dans l’obscu-rité. Déclencher la minuterie dés le remplissage du premier puits.

9. Ajoutez 100 µL de Solution d’Arrêt (prête à l’emploi) dans chaque puits, en maintenant la même séquence de pipetage et la même vitesse qu’à l’étape 7. Mélanger en secouant doucement pendant 20 secondes, éviter de faire gicler. Lire les puits dans les 30 minutes.

10. Lire les densités optiques (absorbances) des puits à 450 nm dans un lecteur de microplaque approprié (longueur d’onde de référence 650 nm à 620 nm). Si la longueur d’onde de référence n’est pas disponible, la valeur du blanc est soustraite de chaque autre valeur des autres puits avant d’effectuer d’autres calculs.

RÉSUMÉ SCHEMATIQUE

CALCUL DES RÉSULTATSLe principe de base est de tracer une courbe de calibration en mettant la moyenne des densités optiques de chaque Etalon MBL sur l’axe des

Lavage x 3Incubez1 h à TA

100 μL Etalons ou échantillon dilué

Lavage x 3Incubez1 h à TA

100 μL Anti-MBL biotinylé

Lavage x 3Incubez1 h à TA

100 μL de Conjugué HRP-Streptavidine

Incubez15 min à TADans le noir

100 μL Substrat TMB

Lire à 450 nm

Diluez les échantillons

Laissez les réactifs atteindre la TA

100 μL Solution d’arrêt

Page 26: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

26

MBL Oligomer ELISA Kit

ordonnées et les concentrations correspondantes de MBL en ng/mL sur l’axe des abscisses. La courbe de calibration doit satisfaire les conditions de validation. La concentration en MBL de chaque échantillon dilué est ensuite déterminée en localisant le point de la courbe correspondant à la moyenne des valeurs de la densité optique en duplicata et en lisant la concentration correspondante sur l’axe des abscisses en ng/mL. La concentration en MBL dans l’échantillon non dilué est calculée en multipliant ce résultat par le facteur de dilution de l’échantillon. Cette procédure peut être effectuée manuel-lement en utilisant du papier millimétré avec des échelles linéaires pour les abscisses et les ordonnées. Une courbe lissée peut être tracée en passant entre les points ou en joignant les points adjacents par des lignes droites. Cette dernière procédure peut légèrement surestimer les valeurs de concentrations entre les points quand la courbe est légèrement convexe sur la gauche, ce qui est généralement le cas. Même si la courbe peut s’approcher d’une ligne droite, il est à la fois théori-quement et pratiquement incorrect de calculer et de tirer une ligne droite puis de lire les résultats à partir de celle-ci. Cette procédure peut aussi être effectuée par un logiciel de lecture d’ELISA qui incorpore des procédures de lissage des courbes. La procédure de choix doit utiliser des axes linéaires pour les abscisses et les ordonnés avec un lissage des courbes logistique à 4 paramètres. Les échantillons dilués qui donnent une valeur de densité optique moyenne supérieure à celle de 40 ng/mL de l’Etalon MBL ou inférieure à celle de 0,5 ng/mL de l’Etalon MBL sont en dehors des limites de mesure et leurs concentrations doivent être rapportées comme étant respectivement >40 ng/mL et <0,5 ng/mL. Les concentrations correspondantes dans les sérums non dilués sont respectivement calculées >(40 x facteur de dilution) ng/mL et <(0,5 x facteur de dilution) ng/mL. Ces échantillons doivent être re-testés avec des dilutions plus grandes ou plus faibles selon que les lectures ont été respec-tivement supérieures ou inférieures aux limites de mesures. Les nouveaux facteurs de dilution

doivent être ceux estimés pour donner des valeurs de densité optique qui sont dans les limites de la courbe de calibration, mais des dilutions inférieures à 1/10 ne doivent pas être utilisées.

VALIDATION DE LA COURBE DE CALIBRATIONL’absorbance moyenne pour l’Étalon MBL 40 ng/mL devrait être >1,5. L’absorbance moyenne pour tout Étalon MBL devrait être supérieure à celle de l’Étalon MBL précédent, ex., absorbance (10 ng/mL MBL) > absorbance (5 ng/mL). La courbe devrait être légèrement convexe dans sa partie gauche lorsque les résultats sont tracés sur des axes linéaires.

Points hors limites pour les étalons indivi-duels: Un ou plusieurs étalons peuvent donner des lectures de densité optique anormales. L’une ou les deux valeurs du duplicata ainsi que la moyenne des duplicata peuvent être hors limites. L’erreur est significative si elle diminue l’efficacité du lissage de la courbe par la méthode logistique à 4-paramètres, qui à cause de la valeur anormale, est décalée par rapport aux autres valeurs de points des étalons qui sont en fait correctes. La correspondance des points des étalons et de la courbe lissée doit toujours être examinée avant d’accepter les calculs de concentrations effectués. Une courbe mal lissée peut être détectée par une somme des carrés résiduels élevée. Si un étalon seulement est affecté mais pas l’étalon le plus concentré, deux recours sont possibles: i) Une valeur simple ou en duplicata erronée doit être éliminée de la courbe et le reste des résultats repris par la procédure logistique à 4-paramètres. Si on obtient un lissage satisfaisant, des résultats provisoires de concentrations peuvent alors être calculés. ii) Si on n’obtient pas de lissage satisfaisant de cette façon, mais que la courbe est par ailleurs cohérente, des résultats provisoires peuvent être obtenus à partir d’un tracé de lignes droites entre les moyennes des duplicata, en ignorant le point erroné. Si deux ou plusieurs étalons sont affectés, il faut refaire l’analyse.

Page 27: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

FR

27

MBL Oligomer ELISA Kit

Un résultant erroné pour un seul étalon peut être dû à une erreur de manipulation ou à la détério-ration de l’étalon. Si les deux valeurs du duplicata sont hors limites de la même façon dans deux essais successifs, l’étalon est en cause et doit être omis.

TRAÇABILITÉ DE LA VALEUR DE L’ÉTALONLa valeur de MBL assignée a été attribuée à l’aide d’ELISA garantissant la traçabilité conformément aux normes internes appliquées au Statens Serum Institut (Danemark).

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSLes concentrations de MBL dans le sérum ou le plasma des donneurs humains sains, mesurées par cet essai, et des essais analogues s’étendent de 0 à 7000 ng/mL. Des valeurs inférieures à 100 ng/mL peuvent être trouvées en présence des génotypes structuraux O/O (dans lesquels O = B, C ou D) quel que soit le génotype du promoteur, ou en présence des génotypes structuraux A/O (dans lesquels A = souche sauvage) en combinaison avec les génotypes de promoteurs HY/LX ou LX/LY ou avec le génotype de promoteur LX/LX. Des concentrations comprises entre 100 ng/mL et 1000 ng/mL peuvent être trouvées avec les génotypes structuraux A/O ou les génotypes de promoteur LX/LY ou LX/LX. Des concentrations supérieures à 1000 ng/mL sont associées à un génotype de la souche sauvage (A/A) de MBL, même si les hétéro-zygotes A/D peuvent occasionnellement atteindre ce niveau. Le génotype du promoteur HY/HY donne généralement des concentrations supérieures à 1500 ng/mL pour les souches sauvages de MBL mais d’autres génotypes de promoteur en l’absence des allèles structuraux O aussi. Des études cliniques ont utilisées comme valeur seuil pour définir une déficience grave en MBL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL. Les valeurs inférieures à ces seuils peuvent être associées, chez certains individus, à des antécédents de susceptibi-lité aux infections accrue.

CONTROLE DE QUALITÉLes laboratoires qui effectuent des analyses répétées doivent préparer leurs propres sérums de contrôle pour les valeurs élevées (>1000 ng/mL) et les valeurs basses (<100 ng/mL) et les stocker en petites aliquotes (ex. 50 µL) à -20°C ou moins. Une aliquote de chaque niveau doit être déconge-lée et testée lors de chaque essai et les résultats successifs doivent être sauvegardés. Cela permet le contrôle de la performance et de l’intégrité du test et de la fiabilité de la personne qui l’effectue. On doit analyser les résultats pour déceler une dérive (la tendance des résultats successifs à augmenter ou à diminuer) ou une déviation significative de la moyenne des résultats précédents. Les valeurs ne déviant pas de plus de 20% de la moyenne des valeurs précédentes peuvent être retenues pour valider l’essai. Une fois décongelées, les aliquotes du sérum contrôle ne doivent pas être recongelées pour des essais répétés et si d‘autres essais sont effectués, de nouvelles aliquotes du sérum contrôle et de nouvelles dilutions des spécimens de patients doivent être utilisées.

LIMITATIONSUne faible concentration de MBL dans le sérum ou le plasma n’implique pas nécessairement la présence de maladies. Les médecins doivent interpréter la signification d’une déficience en MBL à la lumière des antécédents cliniques de chaque patient.

RÉSULTATS ATTENDUS108 spécimens de plasma de donneurs de sang danois sains ont été testés avec l’ELISA BioPorto Diagnostics MBL oligomer. Les concentrations en MBL s’échelonnaient de <2 ng/mL à 4443 ng/mL. Les concentrations de la moyenne et de la médiane étaient respectivement de 1470 ng/mL et 1190 ng/mL, avec un écart-type (ET) de 1325 ng/mL. 18 spécimens (16,7%) ont donné des lectures inférieures à 100 ng/mL, 30 spécimens (27,8%) ont donné des lectures entre 100 ng/mL et 1000 ng/mL et 60 spécimens (55,5%) ont donné des lectures supérieures à 1000 ng/mL.

Page 28: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

28

MBL Oligomer ELISA Kit

CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCELimite de détection: La plus faible concentration de MBL avec une absorbance supérieure à 2 ET au dessus de l’absorbance moyenne de l’étalon zéro (n = 8) était de 0,02 ng/mL, correspondant à une concentration de sérum de 2 ng/mL dans un spécimen dilué à 1/100.

Reproductibilité intra-essai (pendant un essai): Deux échantillons de sérums ont été testés en 10 exemplaires pour déterminer la reproductibilité de l’essai. Les résultats suivants ont été obtenus (CV = coefficient de variation):

Reproductibilité inter-essai (entre les essais) (jours et techniciens différents): Deux mêmes échantillons de sérum ont été testés en duplicata lors de 4 essais effectués par 2 techniciens à différents jours pour déterminer la reproductibilité inter-essai. Les résultats suivants ont été obtenus:

Spécificité: Le Western blot du plasma ou des fractions du plasma n’a pas mis en évidence de bandes qui réagissent avec l’anticorps autres que celles correspondant à la MBL. L’absence de réaction croisée avec les autres composants du plasma s’explique par le fait que les lectures non distinguables du zéro ont été obtenues avec des donneurs déficients en MBL mais par ailleurs normaux

RESPONSABILITÉPour le diagnostic in vitro dans certains pays uniquement. Voir www.bioporto.com pour trouver s’il est disponible dans votre pays. Cette trousse est destinée uniquement à la détermination in vitro de la lectine fixant la mannane dans le sérum humain ou le plasma. La trousse doit être utilisée uniquement par un personnel qualifié impliqué dans des activités de recherche ou de diagnostique. Si le récipiendaire de cette trousse la prête, de n’importe quelle façon, à un tiers, cette instruction doit être incluse et ledit récipiendaire doit, à ses propres risques, assurer en faveur de BioPorto Diagnostics A/S toutes les limitations et responsa-bilités décrites ici. BioPorto Diagnostics A/S ne sera pas respon-sable des dommages ou pertes pouvant être occasionnés par l’utilisation de cette trousse d’une autre façon que celle indiquée dans ces instruc-tions. La responsabilité de BioPorto Diagnostics A/S n’excèdera en aucun cas la valeur marchande de cette trousse. BioPorto Diagnostics A/S ne sera en aucun cas responsable de dommages indirects ou spéciaux, incluant sans s’y limiter la perte de profit.

REVISION: MO2010-07-EN-FR

Sérum 1 Sérum 2

Conc. MBL Moy. 2279 ng/mL 28,4 ng/mL

ET 81,2 1,07

CV 3,6% 3,8%

Sérum 1 Sérum 2

Conc. MBL Moy. 2310 ng/mL 29,7 ng/mL

ET 212 1,28

CV 9,2% 4,3%

Page 29: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

FR

29

MBL Oligomer ELISA Kit

Page 30: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

30

MBL Oligomer ELISA Kit

Leggere attentamente queste istruzioni

DESTINAZIONE D’USOPer la determinazione in vitro della lectina legante mannosio nel siero e nel plasma-eparina.

IMPORTANZA CLINICA Determinazione della suscettibilità alle infezioni e quindi di una aggressiva somministrazione di antibiotici in:

• Pazienti sottoposti o che stanno per sottoporsi a chemioterapia o a trattamento immunosoppres-sivo

• Pazienti affetti da fibrosi cistica

• Bambini con infezioni ricorrentiPuò anche essere usato come marker prognostico della gravità della malattia nell’artrite reumatoide e nel lupus eritematoso sistemico.

La lectina legante-mannosio (MBL, chiamata anche proteina legante il mannosio) è una proteina multimerica che si lega ai carboidrati, prodotta nel fegato e secreta nel sangue dove costituisce un importante elemento nella immunodifesa innata contro microrganismi invasori. Le sue forme di norma oligomerizzate si associano alle specifiche pro-proteasi del siero (le MASP) che si attivano quando MBL si lega alle superfici microbiche del carboidrato e, successivamente, attivano il comple-mento attraverso il percorso di MBL o della lectina1. La mancanza di MBL normalmente oligome-rizzata può essere associata con una accresciuta suscettibilità alle infezioni quando il sistema immune adattivo è immaturo (nella prima infanzia)2 o è stato soppresso (per es. dopo un trapianto o durante la chemioterapia)3. La mancanza è anche associata con gravi malattie auto-immuni come il lupus eritematoso sistemico (SLE)4 o l’artrite reumatoide5 e con una prognosi infausta nella fibrosi cistica6. La mancanza di MBL può essere causata da varianti alleliche nelle regioni promotrici e/o struttu-rali del gene MBL7. Certi alleli promotori vengono associati con concentrazioni di MBL più basse nel siero mentre le varianti strutturali hanno effetto sia sulla normale oligomerizzazione di MBL che

sulla sintesi totale della catena. Soggetti omozigoti per un difetto strutturale mostrano livelli di MBL oligomerizzerata molto bassi mentre gli eterozigoti mostrano livelli basso-intermedi. In 100 donatori di sangue danesi sani, le concentrazioni di MBL nel siero determinate da un immunotest oligomero-selettivo mostrarono valori bassi (<50 ng/mL) in 12 soggetti Ciò era dovuto ad una serie di combina-zioni di alleli strutturali e/o promotori7. Questo indica la prevalenza, in una popolazione occidentale, di bassi livelli di MBL che possono dare origine a manifestazioni cliniche. Non si sa perché, però, alcuni soggetti con bassi livelli di MBL mostrano una accresciuta suscettibilità alle infezioni; tra le spiega-zioni c’è la possibilità di differenze nell’esposizione o la possibile necessità della coesistenza di un’altra, magari leggera, immunodeficienza. La determinazione delle concentrazioni di MBL nel siero può essere utile per chiarire sospetti difetti immuni e come indicatore prognostico che avvisa della necessità di misure terapeutiche o profilattiche maggiori in pazienti immunosoppressi tra cui quelli sottoposti a chemioterapia e quelli affetti da fibrosi cistica, SLE o artrite reumatoide.

PRINCIPIO DELLA PROCEDURA DEL TEST Si tratta di un test ELISA eseguito in micropoz-zetti rivestiti di anticorpo monoclonale contro il dominio MBL che si lega ai carboidrati. MBL legata viene rilevata con lo stesso anticorpo che è stato etichettato con biotina, seguito dallo sviluppo di streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e incubazione con un substrato cromogenico. Il confronto dei risultati del test con la cromatografia della dimensione molecolare della immunoreattività di MBL in singoli campioni di siero umano, suggeri-sce che l’anticorpo monoclonale usato è selettivo per gli oligomeri MBL se usato sia come anticorpo di cattura che di rilevamento. Il test è una procedura in quattro fasi: Fase 1. Aliquote di calibratori, campioni di siero diluiti e qualsiasi controllo vengono incubati in micropozzetti pre-rivestiti con anticorpo monoclo-nale contro MBL. MBL presente nella soluzione si legherà ai pozzetti rivestiti di anticorpo attraverso i

Page 31: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

IT

31

MBL Oligomer ELISA Kit

domini leganti i carboidrati. Il materiale non legato viene rimosso per mezzo di lavaggio. Fase 2. Anticorpo biotinilato MBL monoclonale di rilevamento viene aggiunto a ciascun pozzetto e incubato. L’anticorpo di rilevamento si attacca agli oligomeri MBL attraverso i domini leganti i carboidrati che non sono occupati essendo legati al rivestimento. L’anticorpo di rilevamento non legato viene rimosso per mezzo di lavaggio. Fase 3. Streptavidina-HRP viene aggiunta a ciascun pozzetto a formare un complesso con l’anticorpo biotinilato legato. Il coniugato non legato viene rimosso per mezzo di lavaggio. Fase 4. Un substrato cromogenico per la perossidasi contenente tetrametilbenzidina (TMB) viene aggiunto a ciascun pozzetto del test. La HRP-streptavidin legata reagisce con il substrato generando un prodotto colorato. La reazione enzimatica viene interrotta chimicamente e l’inten-sità del colore viene letta a 450 nm in un lettore ELISA. La densità del colore (densità ottica) è una funzione della concentrazione delle forme oligome-riche di MBL originariamente aggiunta a ciascun pozzetto. I risultati per i calibratori vengono utiliz-zati per costruire una curva di calibrazione da cui vengono lette le concentrazioni di MBL presenti nei campioni.

PRINCIPIO DELLA PROCEDURA DEL TEST

Anticorpo MBL

Le piastre sono pre-rivestite con an-ticorpo primario MBL. Le piastre sono pronte per l’uso

MBL

Campioni e calibratori diluiti sono ag-giunti a ciascun pozzetto e incubati

Anticorpo Biotilinata MBL

Anticorpo Biotilinata MBL di rivelazione è aggiunto a ciascun pozzetto e incu-bato

Streptavidina HRP-conjugata

Streptavidina HRP-conjugata -è aggiun-ta a ciascun pozzetto e incubata

Substrato TMB

Il substrato è aggiunto a ciascun poz-zetto. Sviluppare per 15 minuti al buio

Soluzione di Arresto viene aggiunta a ciascun pozzetto. Leggere la piastra entro 30 min.

I risultati qualitativi si ottengono misu-rando le assorbanze dei pozzetti 450 nm

Soluzione di Arresto

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 32: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

32

MBL Oligomer ELISA Kit

COMPONENTI DEL KIT

Nota: i reagenti liquidi contengono i conservanti azoturo di sodio, timerosal o Bronidox L. Le sostanze in esso contenute possono essere nocive se ingerite.

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette regolabili in una gamma da 1 a

1000 µL e corrispondenti punte per pipette usa e getta

2. Provette il polipropilene in grado di contenere fino a 1000 µL

3. Porta-provette 4. Micropipetta regolabile da 8- o 12-canali

(gamma 50-250 µL) o micropipetta a ripetizione (opzionale)

5. 1 cilindro pulito graduato da 1 L6. Acqua deionizzata e distillata7. Coperchio per micropiastra 8. Contenitore pulito per soluzione di lavaggio diluita9. Dispositivo per pulire i pozzetti durante la

procedura di lavaggio (opzionale)10. Fazzoletti di carta non garzati o carta

assorbente11. Serbatoi per pipettaggio usa e getta 12. Timer (60-minuti)13. Lettore a piastra ELISA calibrato in grado di

leggere a 450 nm (preferibilmente sottraendo i valori di riferimento a 650° 620 nm)

14. Ipoclorito di sodio (candeggiante domestico diluizione 1:10) per la decontaminazione di campioni, reagenti e materiali)

PRECAUZIONI Solo per uso diagnostico in vitro 1. L’utilizzo di questo kit è riservato esclusiva-

mente a personale di laboratorio qualificato. 2. I calibratori MBL furono preparati da MBL

purificata di plasma umano. Ciascuna unità di sangue usata per la preparazione fu testata secondo metodi approvati e trovata non reattiva per l’antigene superficiale dell’epa-tite B (HBsAg) e per anticorpi contro il virus da immunodeficienza umana (HIV) e il virus dell’epatite C (HCV). Inoltre il prodotto fu sottoposto a procedure di disattivazione dei virus. siccome, però, nessuna metodica di test può offrire la completa sicurezza che siano assenti agenti infettivi, i calibratori e i campioni dei pazienti devono essere maneggiati a livello di biosicurezza 2 come raccomandato nel manuale CDC/NIH “Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories”, 1999. Per qualsiasi siero umano o campione di sangue potenzialmente infetto, le soluzioni contenenti siero umano devono essere trattate come potenzialmente infette e maneggiate di conseguenza.

3. Usare punte di pipette separate per ciascun campione, calibratore e reagente per evitare la contaminazione incrociata.

4. Usare serbatoi separati per ciascun reagente. Questo si applica soprattutto al substrato TMB.

5. Dopo l’uso, decontaminare tutti i campioni, i reagenti e i materiali immergendo per almeno 30 minuti in soluzione di ipoclorito di sodio (candeggiante domestico diluito 1:10).

6. Per evitare la formazione di goccioline durante il lavaggio, aspirare la soluzione di lavaggio in una bottiglia contenente candeggiante.

7. Evitare il rilascio nell’ambiente. Smaltire i contenitori e il contenuto inutilizzato in modo sicuro e in conformità con le disposizioni nazionali e locali.

Articolo Contenuto Quantità

112 x 8 Pozzetti ricoperti + supporto

96 pozzetti

2 Diluente per campione 1 x 60 mL

3a - 3h Calibratori MBL, 1-8 8 x 1 mL

425x soluzione di lavaggio concentrata

1 x 30 mL

5 Anticorpo biotinilato MBL 1 x 12 mL

6 Streptavidina-HRP 1 x 12 mL

7 Substrato TMB 1 x 12 mL

8 Soluzione di arresto 1 x 16 mL

Page 33: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

IT

33

MBL Oligomer ELISA Kit

8. I reagenti di questo kit sono conservati con un massimo di 0,05% di azoturo di sodio, 0,038% timerosal, chiamato anche tiomersal o mertiolato, o 0,2% Bronidox L. Questi possono essere tossici se ingeriti.

9. La soluzione di arresto contiene 0,5 mol/L di acido solforico e può causare irritazioni o ustioni alla pelle e agli occhi. In caso di contatto, sciacquare abbondantemente con acqua e consultare immediatamente un medico.

10. Non scambiare i componenti di kit con numeri di lotto diversi. I componenti sono stati standardizzati come unità per un dato lotto.

11. Campioni emolizzati o iperlipemici possono dare risultati errati.

12. Non diluire i campioni di siero o il plasma direttamente nei micropozzetti.

13. Non toccare né raschiare il fondo dei micropoz-zetti quando si pipetta o si aspira il liquido.

14. Tempi e temperature diversi da quelli specificati possono dare risultati errati.

15. Non lasciare che i pozzetti si asciughino una volta che il test è iniziato.

16. Il substrato TMB è sensibile alla luce. Conser-vare lontano da fonti di luce.

17. Non riutilizzare i pozzetti né versare di nuovo i reagenti nelle bottiglie una volta versati.

STABILITÀ E CONSERVAZIONE1. Conservare il kit con tutti i reagenti a 2-8°C.

Non congelare.2. Usare tutti i reagenti prima della data di

scadenza riportata sull’etichetta delle fiale.3. La soluzione di lavaggio diluita resta stabile

per 4 settimane a 2-8°C. Se non devono essere utilizzati tutti i pozzetti, diluire solo la parte di soluzione di lavaggio concentrata richiesta.

4. Per l’uso successivo, conservare le strisce di pozzetti nella sacca di alluminio con il dissec-cante in dotazione e sigillare di nuovo. Lasciare sempre che la sacca protettiva si equilibri a temperatura ambiente prima di aprire per evitare la condensazione in/su i micropozzetti rivestiti.

RACCOLTA DEI CAMPIONIManeggiare e smaltire tutti i campioni di sangue, siero e plasma come se fossero potenzialmente infetti. Vedere Precauzioni, sezioni 2, 3, 5, 6 e 7.La determinazione di MBL in un singolo campione richiede 5-50 µL di siero o plasma. I campioni di sangue devono essere raccolti in modo asettico in una provetta semplice o eparinizzata da parte di personale qualificato che usa tecniche di venopun-tura approvate. Il siero o il plasma devono essere preparati con tecniche standard per test clinici di laboratorio. Coprire i campioni e conservarli a 2-8°C per testarli entro 24 ore. Se il test non può essere eseguito entro 24 ore o se il campione deve essere spedito, coprire il campione e tenerlo congelato ad una temperatura di almeno −20°C. Evitare congelamento e scongelamento ripetuti. Non usare campioni emolizzati, iperlipemici, trattati a caldo o contaminati.

PREPARAZIONE DI REAGENTI E CAMPIONI 1. Portare tutti i campioni e i reagenti a tempera-

tura ambiente (20-25°C). Mescolare a fondo i campioni capovolgendoli delicatamente e, se necessario, eliminare materia particellare visibile con una centrifugazione a bassa velocità.

2. Stabilire il numero di campioni da testare (in duplicato) oltre a qualunque campione di controllo interno del laboratorio (in duplicato) e qualsiasi pozzetto del bianco reagente. I pozzetti pre-rivestiti possono essere utilizzati nel formato strip o singolarmente. I pozzetti singoli possono essere utilizzati spaccandoli individualmente ed inserendoli nell’apposita cornice nella posizione prevista. Lettere e numeri permettono l’identificazione di ogni pozzetto. Aggiungere 16 pozzetti per gli 8 calibratori (in duplicato). Estrarre il numero di micropozzetti necessario e rimettere le rimanenti nel sacchetto di alluminio con il dissecante a 2-8°C.

3. Soluzione di lavaggio: Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 25x versando tutto il contenuto della bottiglia (30 mL) in un cilindro

Page 34: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

34

MBL Oligomer ELISA Kit

graduato da 1 L e aggiungere acqua distillata o deionizzata fino a raggiungere un volume di 750 mL. Mescolare bene e, dopo l’uso conservare a 2-8°C.

4. Diluente per campione: Pronto all’uso, non diluire ulteriormente.

5. Calibratori MBL: Pronti all’uso. Le concentra-zioni assegnate sono indicate sulle etichette. Non diluire ulteriormente.

6. Anticorpo biotinilato MBL: Pronto all’uso, non diluire ulteriormente.

7. Streptavidina HRP-coniugata: Pronta all’uso, non diluire ulteriormente.

8. Substrato TMB: Pronto all’uso, non diluire ulteriormente.

9. Soluzione di arresto: Pronta all’uso, non diluire ulteriormente.

10. Campioni paziente: Diluire ciascun campione in una proporzione registrata con diluente per campione fino ad ottenere almeno 250 µL di soluzione diluita che può essere impostata in pozzetti duplicati a 100 µL per pozzetto. Per la maggior parte dei campioni, si consiglia uno screening iniziale ad una diluizione di 1/100 (per es. 5 µL di siero + 495 µL di diluente per campione, mescolati capovolgendo o ruotando lentamente), seguito da un nuovo test di campioni fuori gamma a diluizione più bassa o più alta secondo come è appropriato. Non usare diluizioni inferiori a 1/10.

PROCEDURA DEL TEST1. Preparare il protocollo del test, assegnando i

pozzetti appropriati per impostare calibratori, campioni paziente diluiti e qualsiasi controllo interno di laboratorio in duplicato. Se non è disponibile una lunghezza d’onda di riferimento di 650 o 620 nm sul lettore ELISA, può essere assegnato un pozzetto del bianco-reagente Questo viene impostato con 100 µL di diluente per campione invece che siero o plasma diluiti ed elaborati come gli altri pozzetti.

2. Pipettare volumi di 100 μL di ciascun calibra-tore, campioni diluiti e qualsiasi controllo interno di laboratorio nelle corrispondenti

posizioni di micropozzetti. Coprire i pozzetti e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante impostata a 200/minuto.

3. Aspirare il contenuto dei micropozzetti e lavarli tre volte con almeno 300 μL di soluzione di lavaggio diluita. Se il lavaggio si esegue manual-mente, svuotare i micropozzetti capovolgendoli e scuotendoli delicatamente in un contenitore adatto tamponando successivamente in posizione capovolta su un asciugamano di carta. Si consiglia una sosta di 1 minuto prima di svuotare almeno per l’ultimo lavaggio del ciclo. La forza con cui la soluzione di lavaggio entra o esce dai pozzetti influenza lo sviluppo finale del colore. Il pipettaggio manuale, che può essere molto delicato e portare ad un elevato sviluppo di colore, è consigliato solo in assenza di alternative come il riempimento dei pozzetti per immersione, utilizzando un dispenser di lavaggio manuale multicanale o un dispositivo di lavaggio automatico.

4. Versare 100 μL di anticorpo biotinilato MBL (pronto all’uso) in ciascun micropozzetto. Può essere usata una micropipetta multicanale o a ripetizione. Coprire i pozzetti e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente su una piatta-forma oscillante (200/minuto).

5. Lavare come descritto in precedenza, nella fase 3.

6. Versare 100 μL di streptavidina HRP-coniugata (pronta all’uso) in ciascun micropozzetto. Può essere usata una micropipetta multicanale o a ripetizione. Coprire i pozzetti e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente su una piatta-forma oscillante (200/minuto).

7. Lavare come descritto in precedenza, nella fase 3.

8. Versare 100 μL di substrato TMB (pronto all’uso) in ciascun micropozzetto. L’uso di una micropipetta multicanale è consigliato per ridurre il tempo di pipettaggio. Coprire i pozzetti ed incubare per esattamente 15 minuti a temperatura ambiente, al buio. Impostare l’orologio quando si riempie il primo pozzetto.

Page 35: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

IT

35

MBL Oligomer ELISA Kit

9. Aggiungere 100 µL di soluzione di arresto (pronta all’uso) a ciascun pozzetto, mantenendo la stessa sequenza e lo stesso tasso di pipettaggio della fase 7. Mescolare scuotendo delicatamente per 20 secondi, evitando fuoriuscite. Leggere i pozzetti entro 30 minuti.

10. Leggere le densità ottiche (OD) o assorbanze dei pozzetti a 450 nm in un lettore per micropiastra appropriato (lunghezza d’onda di riferimento 650 o 620 nm). Se non è disponi-bile alcuna lunghezza d’onda di riferimento, il valore di ciascun bianco reagente è sottratto da ciascuno degli altri valori prima di eseguire gli altri calcoli.

VISTA SCHEMATICA

CALCOLO DEI RISULTATIIl principio di base è quello di costruire una curva di calibrazione punteggiando la media dei valori di densità ottica duplicata per ciascun MBL calibratore sull’asse y rispetto alle corrispondenti concentra-

Lavare x 3Incubare1 h a TA

Calibratori o campione diluito 100 μL

Lavare x 3Incubare1 h a TA

100 μL Anticorpo Biotilinato MBL

Lavare x 3Incubare1 h a TA

100 μL Streptavidina HRP-coniugata

Incubare15 min a TAal buio

100 μL Substrato TMB

Leggere a 450 nm

Diluire i campioni

Portare i reagetni a TA

100 μL Soluzione di Arresto

Page 36: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

36

MBL Oligomer ELISA Kit

zioni di MBL in ng/mL sull’asse x. La curva di calibra-zione deve corrispondere ai requisiti di validazione. La concentrazione di MBL per ciascun campione di siero diluito viene quindi trovata localizzando il punto sulla curva che corrisponde alla media dei valori di densità ottica in duplicato per il campione diluito e leggendo la concentrazione corrispondente in ng/mL sull’asse x. La concentrazione di MBL nel campione di siero non diluito è calcolata moltipli-cando questo risultato per il fattore di diluizione del campione. Questa procedura può essere eseguita manualmente usando grafici con scale lineari x e y. Una curva intera può essere disegnata attraverso i punti oppure i punti adiacenti possono essere uniti con linee diritte. La seconda procedura può leggermente sovrastimare i valori di concentrazione tra i punti nel caso in cui la curva è leggermente convessa verso sinistra, cosa che si riscontra comunemente. Sebbene la curva può approssimarsi ad una linea diritta, è praticamente e teoricamente scorretto calcolare e tracciare la linea diritta del miglior adattamento e leggere i risultati da questo. La procedura può anche essere eseguita con un programma software di lettura ELISA che include procedure di adattamento alla curva. La procedura maggiormente scelta è usare assi lineari x e y con adattamento logistico alla curva a 4-parametri. Campioni diluiti che danno un valore di densità ottica medio superiore a quello per il MBL calibra-tore da 40 ng/mL o al di sotto di quello per il MBL calibratore da 0,5 ng/mL sono fuori dalla gamma del test e le loro concentrazioni devono essere annotate rispettivamente come >40 ng/mL e <0,5 ng/mL. Le concentrazioni corrispondenti nei sieri non diluiti sono calcolate rispettivamente >(fattore di diluizione 40 x) ng/mL e <(fattore di diluizione 0,5 x ) ng/mL. Questi campioni devono essere ritestati a diluizioni maggiori e minori, rispettivamente per campioni ad alta e bassa lettura. I nuovi fattori di diluizione devono essere quelli stimati per dare valori di densità ottica che ricadano entro la gamma della curva di calibrazione ma non devono essere usate diluizioni inferiori a 1/10.

VALIDAZIONE DELLA CURVA DI CALIBRAZIONEIl valore medio OD (densità ottica) per 40ng/mL di calibratore MBL dovrebbe essere >1,5. Il valore medio OD per ogni calibratore MBL dovrebbe essere superiore a quello del precedente calibra-tore MBL, per es. OD(10 ng/mL MBL) > OD(5 ng/mL). La curva standard dovrebbe essere lievemente convessa verso sinistra quando i risultato vengono plottati su un asse lineare.

Punti fuori linea per singoli calibratori: Uno o più calibratori singoli possono dare letture anomale dell’OD. Uno o entrambi i valori duplicati possono essere fuori linea e la media dei duplicati può essere fuori linea. Questo errore è significativo se crea problemi ad un adattamento soddisfacente della curva con il metodo logistico a 4 parametri che, come risultato del valore anomalo, viene allontanato dagli altri punti del calibratore che sono in realtà corretti. I punti del calibratore e la curva adattata devono essere esaminati per verificare l’adat-tamento corretto prima di accettare qualunque calcolo della concentrazione desunto da esso. Una curva che non si adatta in modo soddisfacente sarà rivelata anche da un’alta somma di quadrati residuali. Se è influenzato solo un calibratore, che non è il più alto, sono possibili due azioni: i) Un risultato erroneo singolo o duplicato deve essere eliminato dalla curva e i rimanenti risultati riadattati con la procedura logistica a 4-parametri. Se si ottiene un adattamento soddisfacente, i risultati di concentrazione di previsione possono essere calcolati a partire da esso. ii) Se non si può ottenere un adattamento soddisfacente in questo modo ma la curva è comunque coerente, i risultati di previsione si possono ottenere dalle linee diritte tra le medie dei duplicati, omettendo i punti erronei. Se sono influenzati due o più calibratori, il test deve essere ripetuto. Un risultato deviante per un singolo calibratore può essere dovuto ad un errore dell’operatore o ad un deterioramento del calibratore. Se entrambi i valori duplicati sono coerentemente fuori linea

Page 37: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

IT

37

MBL Oligomer ELISA Kit

in test successivi, il calibratore è difettoso e deve essere tralasciato.

TRACCIABILITÀ DEL VALORE DEL CALIBRATOREL’assegnazione del valore MBL è stata realizzata da ELISA assicurando la tracciabilità rispetto agli standard interni applicati presso lo Statens Serum Institut (Danimarca).

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATIL’intera gamma delle concentrazioni di MBL nel siero o nel plasma di donatori umani sani così come misurata da questo test è da 0 a 7000 µg/mL. Valori al di sotto di 100 ng/mL possono essere trovati in genotipi strutturali O/O (dove O = B, C o D) qualunque sia il genotipo promotore, o in genotipi strutturali A/O (dove A = di tipo selvatico) in combinazione con genotipi promotori HY/LX o LX/LY, o nel genotipo promotore LX/LX. Valori tra 100 ng/mL e 1000 ng/mL possono essere trovati in genotipi strutturali A/O o in genotipi strutturali LX/LY o LX/LX. Valori al di sopra di 1000 ng/mL sono associati con MBL di tipo selvatico (A/A), sebbene eterozigoti A/D possono occasionalmente raggiun-gere questo livello. Il genotipo promotore HY/HY di solito mostra valori al di sopra di 1500 ng/mL per MBL di tipo selvatico ma tali valori sono anche mostrati da altri genotipi promotori in assenza di alleli strutturali O. Studi clinici hanno usato valori di cut-off di 50 ng/mL o 100 ng/mL per definire una grave deficienza di MBL. Valori al di sotto di questi cut-off possono essere associati, in certi soggetti, con una storia di accresciuta suscettibilità alle infezioni.

CONTROLLO DELLA QUALITÀLaboratori che intendono eseguire test ripetuti devono fissare i propri sieri di controllo ad alta lettura (>1000 ng/mL) e a bassa lettura (<100 ng/mL) conser-vati in piccole aliquote (per es. 50 µL) a temperatura di -20°C o inferiori. Un’aliquota di ciascuno deve essere scongelata e testata in ciascun saggio e deve essere conservata una registrazione dei successivi risultati. Ciò serve da controllo della performance

e dell'integrità del test e dell'affidabilità dell'opera-tore. Questi risultati devono essere esaminati per verificare lo spostamento (tendenza dei risultati successivi a innalzarsi o a cadere) o una significativa deviazione dalla media dei risultati precedenti. I valori che non deviano di più del 20% dalla media dei valori precedenti possono essere presi ad indicare l’accet-tabilità del test. Una volta scongelate, le aliquote del siero di controllo non devono essere ricongelate per saggi ripetuti e, se si esegue un altro test, devono essere usate aliquote di controllo fresche e diluizioni fresche di campioni paziente.

LIMITIUna bassa concentrazione di MBL nel siero o nel plasma non implica necessariamente l’esistenza di una patologia. I medici devono interpretare il signifi-cato di qualunque deficienza di MLB alla luce del quadro clinico di ciascun paziente.

RISULTATI PREVISTI108 campioni di plasma di donatori di sangue danesi, sani, furono testati nell’BioPorto Diagno-stics MBL oligomer ELISA. I valori di concentra-zione di MBL andavano da <2 ng/mL a 4443 ng/mL. Le concentrazioni medie e mediane erano rispettivamente di 1470 ng/mL e 1190 ng/mL, con una deviazione standard (standard deviation, SD) di 1325 ng/mL. 18 campioni (16,7%) diedero letture al di sotto di 100 ng/mL, 30 campioni (27,8%) diedero letture tra 100 ng/mL e 1000 ng/mL, e 60 campioni (55,5%) diedero letture oltre 1000 ng/mL.

CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE Limite di rilevamento: La concentrazione più bassa di MBL che dà una lettura OD superiore a 2 SD al di sopra della lettura media del calibratore zero (n = 8) era di 0,02 ng/mL, che corrisponde ad una concentrazione di siero di 2 ng/mL in un campione diluito 1/100.

Riproducibilità intratest (entro un ciclo): Due sieri furono elaborati in 10 repliche per stabilire la riproducibilità entro un ciclo. Furono ottenuti i seguenti risultati (CV = coefficiente di variazione):

Page 38: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

38

MBL Oligomer ELISA Kit

Riproducibilità intertest (fra cicli) (giorni/operatori diversi): Gli stessi due sieri furono elaborati in duplicato in 4 diversi test eseguiti da 2 operatori in giorni diversi per stabilire la riproducibi-lità tra cicli. Si ottennero i seguenti risultati:

Specificità: Il Western blot di plasma o frazioni di plasma non ha identificato bande che reagiscono con l’anticorpo se non quelle attribuibili a MBL. L’assenza di reazioni incrociate con altri componenti del plasma è supportata dal fatto che letture non distinguibili da zero si ottengono da alcuni donatori con deficienza di MBL ma normali sotto altri profili.

RESPONSABILITÀPer uso diagnostico in vitro solo in paesi autorizzati. Visitare il sito www.bioporto.com per verificare la disponibilità nel vostro paese. Questo kit è destinato solo alla determinazione in vitro della lectina legante mannosio nel siero e nel plasma umano. Il kit è destinato ad essere usato solo da personale qualificato che svolge attività di ricerca o di diagnostica. Se la persona che riceve questo kit, lo passa in qualunque modo a terzi, queste istruzioni devono essere allegate, e il suddetto ricevente deve a proprio rischio rendersi garante nei confronti della BioPorto Diagnostics A/S per tutti i relativi limiti e responsabilità.

BioPorto Diagnostics A/S non sarà responsa-bile per danni o perdite causati dall’uso di questo kit diverso da quello espressamente dichiarato in queste istruzioni. La responsabilità di BioPorto Diagnostics A/S non andrà in alcun modo oltre il valore commerciale del kit. In nessuna circostanza, BioPorto Diagnostics A/S sarà responsabile per danni indiretti, speciali o consequenziali compresa, ma non solo, la perdita di profitti.

REVISION: MO2010-07-EN-IT

Siero 1 Siero 2

Conc. MBL media 2279 ng/mL 28,4 ng/mL

SD 81,2 1,07

CV 3,6% 3,8%

Siero 1 Siero 2

Conc. MBL media 2310 ng/mL 29,7 ng/mL

SD 212 1,28

CV 9,2% 4,3%

Page 39: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

IT

39

MBL Oligomer ELISA Kit

Page 40: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

40

MBL Oligomer ELISA Kit

Le rogamos que lea atentamente estas instruc-ciones

USO PREVISTOPara la determinación in vitro de la lectina fijadora de manano oligomerizada en suero o plasma con heparina humanos.

IMPORTANCIA CLÍNICADeterminación de la susceptibilidad ante las infecciones y, por tanto, de la necesidad de la administración agresiva de antibióticos en:

• Pacientes con cáncer que reciben o van a recibir un tratamiento de quimioterapia o inmunodepre-sión

• Pacientes con fibrosis quística

• Niños con infecciones recidivantesSe puede utilizar también como marcador pronós-tico para determinar la gravedad de la enfermedad en los casos de artritis reumatoide y lupus eritema-toso sistémico.

La lectina fijadora de manano (MBL, también denominada lectina o proteína fijadora de la manosa) es una proteína multimérica fijadora de hidratos de carbono que se produce en el hígado y se secreta a la sangre, donde constituye un elemento importante en la defensa inmunitaria innata ante microorganismos invasores. Sus formas oligomerizadas habituales se asocian a serinproteasas específicas (MASP) que se activan cuando la MBL se une a los hidratos de carbono de las superficies microbianas y activa el comple-mento mediante la ruta de la MBL o de la lectina1. La deficiencia de MBL normalmente oligomeri-zada puede asociarse a un aumento de la suscep-tibilidad ante las infecciones cuando el sistema inmunitario adaptativo es inmaduro (en la niñez temprana)2 o está deprimido (p.ej. tras el transplante de un órgano o durante la quimioterapia contra el cáncer)3. La deficiencia también se asocia a una evolución más intensa de las enfermedades autoin-munitarias como, por ejemplo, el lupus eritematoso (SLE)4 o la artritis reumatoide5, y con un pronóstico más complicado de la fibrosis quística6.

La deficiencia de MBL puede deberse a variantes alélicas en las regiones promotora y/o estructural del gen MBL7. Ciertos alelos promotores se asocian a concentraciones séricas menores de MBL, mientras que las variantes estructu-rales dificultan tanto la oligomerización normal de la MBL como la síntesis total de la cadena. Los pacientes homocigóticos para un defecto estructural presentan niveles muy bajos de MBL oligomerizada, mientras que los heterocigóticos muestran niveles bajos/medios. En 100 donantes de sangre daneses sanos, las concentraciones de MBL en suero determinadas mediante un inmunoanálisis selectivo de oligómeros mostraron valores bajos (<50 ng/mL) en 12 casos. Esto se debió a una multitud de combinaciones de alelos estructurales y/o promotores7 e indica la prevalen-cia en una población occidental de bajos niveles de MBL, que pueden dar lugar a manifestaciones clínicas. Sin embargo, se desconoce la razón por la que sólo algunas personas con bajos niveles de MBL presentan una mayor susceptibilidad ante las infecciones. Entre las explicaciones se incluyen las diferencias probabilísticas relativas a la exposición o la posible necesidad de coexistencia con otra, quizás sutil, inmunodeficiencia. La determinación de las concentraciones de MBL en suero puede resultar útil para aclarar la existencia de defectos inmunitarios y como indicador pronóstico que alerte ante la necesidad de unas medidas terapéuticas o profilácticas de mayor nivel en los pacientes inmunodeprimidos, entre los que se encuentran los pacientes tratados con quimioterapia contra el cáncer y los pacientes con fibrosis quística, SLE o artritis reumatoide.

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO DE ANÁLISISEl análisis consiste en un ELISA realizado en micropocillos recubiertos con un anticuerpo monoclonal contra el dominio de fijación de hidratos de carbono de la MBL. La MBL fijada se detecta con el mismo anticuerpo que se ha marcado con biotina, seguido de un revelado con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) e incubación con un sustrato

Page 41: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

ES

41

MBL Oligomer ELISA Kit

cromógeno. La comparación de los resultados del análisis con la inmunorreactividad de la MBL mediante cromatografía de tamaño molecular en muestras de suero humano individuales sugiere que el anticuerpo monoclonal empleado es selectivo para los oligómeros de MBL cuando se utiliza como anticuerpo, tanto de captura como de detección. El análisis consiste en un procedimiento en cuatro etapas: Etapa 1. Las alícuotas de los calibradores, de las muestras de suero diluidas y de los controles necesarios se incuban en los micropocillos recubier-tos previamente con anticuerpo monoclonal contra la MBL. La MBL presente en las soluciones se unirá a los pocillos recubiertos con anticuerpo a través de sus dominios de fijación de hidratos de carbono. El material no fijado se elimina mediante lavado. Etapa 2. Se añade a cada pocillo de prueba un anticuerpo de detección monoclonal biotinilado y se incuba. El anticuerpo de detección se une a los oligómeros de MBL fijados a través de los dominios de fijación de hidratos de carbono que no estén ocupados por estar unidos al recubrimiento. El anticuerpo de detección no fijado se elimina mediante lavado. Etapa 3. Se añade a cada pocillo de prueba estreptavidina conjugada con HRP y se deja que forme un complejo con el anticuerpo biotinilado fijado. El conjugado no fijado se elimina mediante lavado. Etapa 4. Se añade a cada pocillo de prueba un sustrato cromógeno de la peroxidasa que contiene tetrametilbenzidina (TMB). La estreptavidina-HRP fijada reacciona con el sustrato para dar lugar a un producto coloreado. La reacción enzimática se detiene químicamente y se lee la intensidad de color a 450 nm en un lector ELISA. La intensidad de color (densidad óptica) es función de la concentración de las formas oligoméricas de MBL añadida inicial-mente a cada pocillo. Los resultados obtenidos con los calibradores se emplean para construir una curva de calibración con la que se leen las concen-traciones de MBL en las muestras de prueba.

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS

Anticuerpo anti-MBL

Las placas están recubiertas con anticuerpo primario contra MBLy están listas para su uso

MBL

Se añaden las muestras diluidas y los calibradores a cada pocillo y se incuba

Anticuerpo Biotinilado anti-MBL

Se añade a cada pocillo Anticuerpo de Detección Biotinilado y se incuba

Estreptavidina-HRP

Se añade Estreptavidina conjugada con HRP a cada pocillo y se incuba

Sustrato TMB

Se añade el sustrato a cada pocillo. Se revela durante 15 minutos protegido de la luz

Se añade Solución de Parada a cada pocillo. Leer la placa tras 30 min.

Se obtienen resultados cuantitativos midiendo las absor-bancias de los po-cillos a 450 nm

Solución de Parada

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 42: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

42

MBL Oligomer ELISA Kit

COMPONENTES DEL KIT

Nota: los reactivos líquidos contienen los conservantes azida sódica, timerosal o Bronidox L. Estos compuestos pueden resultar nocivos por ingestión.

MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS1. Micropipetas ajustables que cubran un

intervalo de 1-1000 µL y las correspondientes puntas de pipeta desechables

2. Tubos de polipropileno con capacidad de hasta 1000 µL

3. Gradillas para tubos4. Micropipeta de 8 ó 12 canales ajustables

(intervalo 50-250 µL) o micropipetas de repeti-ción (opcional)

5. Probeta graduada de 1 L limpia6. Agua desionizada o destilada7. Cubierta para microplacas8. Envase limpio para la Solución de lavado

diluida9. Aparato para el llenado de los pocillos durante

el procedimiento de lavado (opcional)10. Toallitas de papel sin pelusa o papel absorbente11. Recipientes para pipetas desechables12. Cronómetro (intervalo de 60 minutos)13. Lector de placas ELISA calibrado, capaz de

leer a 450 nm (preferiblemente con capacidad

para restar valores de referencia a 650 ó 620 nm)

14. Hipoclorito sódico (lejía doméstica diluida 1:10) para la descontaminación de muestras, reactivos y materiales

PRECAUCIONESSólo para diagnóstico in vitro1. Este kit sólo debe ser utilizado por personal de

laboratorio cualificado.2. Los calibradores MBL se prepararon a partir

de MBL purificada de plasma humano. Se analizó cada unidad de sangre empleada en su preparación mediante métodos aprobados y se comprobó que no mostró reactividad ante el antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB) y ante los anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 1 y 2 y el virus de la hepatitis C (VHC). Además, el producto se sometió a procedimientos de desactivación vírica. No obstante, dado que ningún método de prueba puede descartar con total seguridad la presencia de agentes infecciosos, las muestras de los calibradores y de los pacientes deben manipularse con un nivel de seguridad biológica 2, según las recomendaciones para la manipulación de muestras de suero o sangre humanos potencialmente infecciosas, descritas en el manual del CDC/NIH “Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories” (seguridad biológica en laboratorios microbio-lógicos y biomédicos) de 1999. Las soluciones que contengan suero humano deben tratarse como material potencialmente infeccioso y manipularse adecuadamente.

3. Utilice puntas de pipeta nuevas para cada muestra, calibrador y reactivo, para evitar la contaminación cruzada.

4. Utilice depósitos separados para cada reactivo, en especial para el Sustrato TMB.

5. Una vez utilizados, descontamine todos los materiales que hayan entrado en contacto con las muestras y los reactivos sumergiéndolos durante al menos 30 minutos en una solución de hipoclorito sódico (lejía doméstica diluida 1:10).

Elemento Contenido Cantidad

112 x 8 Micropocillos recubiertos + Estructura

96 pocillos

2 Tampón de dilución 1 x 60 mL

3a - 3h Calibrador MBL 1-8 8 x 1 mL

4Solución de lavado concentrada 25x

1 x 30 mL

5Anticuerpo biotinilado anti-MBL

1 x 12 mL

6 Estreptavidina-HRP 1 x 12 mL

7 Sustrato TMB 1 x 12 mL

8 Solución de parada 1 x 16 mL

Page 43: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

ES

43

MBL Oligomer ELISA Kit

6. Aspire la solución de lavado en un frasco que contenga lejía para evitar la formación de gotas durante el lavado.

7. Evite su emisión al medio ambiente. Deseche los recipientes y el contenido no utilizado de forma segura y de conformidad con la normativa nacional y local.

8. Los reactivos incluidos en este kit se conservan con hasta un 0,05% de azida sódica, 0,038% de timerosal, también denominado tiomersal o mertiolato, o 0,2% de Bronidox L. Estos compuestos pueden resultar tóxicos por ingestión.

9. La Solución de parada contiene ácido sulfúrico 0,5 mol/L y puede causar irritación o quemadu-ras dérmicas u oculares. En caso de contacto, aclare inmediatamente con agua abundante y consulte a un médico.

10. No intercambie componentes procedentes de kits con números de lote distintos. Los componentes se han estandarizado como una unidad para un lote dado.

11. Las muestras hemolizadas o hiperlipidémicas pueden dar lugar a resultados erróneos.

12. No diluya las muestras de suero o plasma directamente en los micropocillos.

13. No toque ni rasque el fondo de los micropoci-llos al pipetear o aspirar el líquido.

14. Tiempos y temperaturas de incubación diferen-tes a los especificados pueden conducir a resultados erróneos.

15. Una vez comenzado el análisis, no se debe dejar que los pocillos se sequen.

16. El Sustrato TMB es sensible a la luz. Mantén-galo apartado de la luz brillante.

17. No reutilice los micropocillos ni vierta nuevamente los reactivos en sus frascos una vez administrados.

ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO1. Conserve el kit con todos los reactivos a 2-8°C.

No los congele.2. Utilice todos los reactivos antes de la fecha

de caducidad indicada en las etiquetas de los viales.

3. La Solución de lavado diluida permanece estable durante 4 semanas a 2-8°C. Si no se van a emplear todos los pocillos, diluya únicamente la parte de Solución de lavado concentrada necesaria.

4. Para su uso posterior, almacene los pocillos no utilizados en la bolsa de aluminio con el desecante suministrado y séllela nuevamente. Deje que la bolsa de aluminio se estabilice a temperatura ambiente antes de abrirla, para evitar la condensación en o sobre los micropo-cillos recubiertos.

OBTENCIÓN DE MUESTRASManipule y deseche todas las muestras de sangre, suero o plasma como si fueran potencialmente infecciosas. Consulte la sección Precauciones, apartados 2, 3, 5, 6 y 7.La determinación de MBL en una única muestra precisa 5-50 µL de suero o plasma. Solo el personal cualificado debe recoger las muestras de sangre asépticamente en un tubo vacío o con heparina, mediante técnicas de venopunción aprobadas. El suero o el plasma deben prepararse mediante técnicas estándar para pruebas clínicas de labora-torio. Tape las muestras y consérvelas a 2-8°C si se va a realizar el análisis antes de 24 horas. En caso de que el análisis no se pueda realizar antes de 24 horas o si es necesario enviar la muestra, tápela y manténgala congelada a una temperatura inferior a −20°C. Evite congelar y descongelar las muestras repetidamente. No utilice muestras hemolizadas, hiperlipidémicas, sometidas a tratamiento térmico o contaminadas.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MUESTRAS1. Deje que todas las muestras y los reactivos

alcancen temperatura ambiente (20-25°C). Mezcle bien las muestras invirtiendo los tubos suavemente y, si es necesario, elimine las partículas visibles mediante centrifugación a baja velocidad.

2. Determine el número de muestras a analizar (por duplicado), el número de muestras de control interno del laboratorio (por duplicado) y

Page 44: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

44

MBL Oligomer ELISA Kit

el número de pocillos para blanco de reactivo. Los pocillos previamente recubiertos pueden usarse en tiras de ocho o de manera indivi-dual. Para manipular los pocillos de uno en uno es preciso separarlos y colocar cada uno de ellos sobre la estructura, en la posición adecuada. Se pueden identificar mediante letras y muescas. Añada 16 pocillos para los 8 calibradores (por duplicado). Tome el número de micropocillos necesarios y guarde el resto en la bolsa de aluminio con desecante, conser-vándolos a 2-8°C.

3. Solución de lavado: Diluya la Solución de lavado concentrada 25x vertiendo todo el contenido del frasco (30 mL) en una probeta graduada de 1 L y añada agua destilada o desionizada hasta un volumen final de 750 mL. Mezcle bien y conserve la solución a 2-8°C una vez utilizada.

4. Tampón de dilución: Listo para su uso, no precisa dilución adicional.

5. Calibradores MBL: Listos para su uso. Las concentraciones asignadas se indican en sus etiquetas. No precisan dilución adicional.

6. Anticuerpo biotinilado anti-MBL: Listo para su uso, no precisa dilución adicional.

7. Estreptavidina-HRP conjugada: Lista para su uso, no precisa dilución adicional.

8. Sustrato TMB: Listo para su uso, no precisa dilución adicional.

9. Solución de parada: Lista para su uso, no precisa dilución adicional.

10. Muestras de pacientes: Diluya cada muestra en una proporción registrada con Tampón de dilución para obtener al menos 250 µL de solución diluida que se pueda distribuir en pocillos duplicados a 100 µL por pocillo. Para la mayor parte de las muestras, se sugiere realizar una prueba de detección inicial con una dilución de 1/100 (p.ej. 5 µL de suero + 495 µL de Tampón de dilución, mezclados por inversión de los tubos o agitando lentamente con ayuda de un mezclador vorticial), repitiendo a continuación el ensayo con las muestras que se encuentren fuera del intervalo con una

dilución menor o mayor, según proceda. No deben emplearse diluciones inferiores a 1/10.

PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS1. Prepare el protocolo del análisis, asignando los

pocillos apropiados para disponer los calibra-dores, las muestras de pacientes diluidas y cualquier control interno del laboratorio por duplicado. En caso de que el lector ELISA no cuente con una longitud de onda de referencia de 650 ó 620 nm, puede asignarse un pocillo de blanco de reactivo. A éste se le añaden 100 µL de Tampón de dilución en lugar de suero o plasma diluido y se procesa de igual forma que el resto de los pocillos.

2. Pipetee volúmenes de 100 μL de cada calibra-dor, de las muestras diluidas y de cualquier control interno del laboratorio en las posiciones correspondientes de las tiras de micropocillos. Cubra los pocillos e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente en una plataforma de agitación fijada a 200/minuto.

3. Aspire el contenido de los micropocillos y lávelos tres veces con al menos 300 μL de Solución de lavado diluida. Si el lavado se realiza de forma manual, vacíe los micropoci-llos invirtiéndolos y agitándolos suavemente sobre un recipiente adecuado, dejándolos reposar en posición invertida sobre una toallita de papel. Se recomienda un tiempo de reposo de 1 minuto antes del vaciado, al menos durante el último lavado del ciclo. La fuerza con la que se añade o se retira la Solución de lavado de los pocillos influye en el color final alcanzado. El pipeteo manual, que puede ser muy suave y conducir a una elevada formación de color, sólo se recomienda en ausencia de alternativas como el llenado de los pocillos por inmersión, el uso de un dispensador de lavado manual multicanal o el uso de un aparato de lavado automático.

4. Añada 100 μL de Anticuerpo biotinilado anti-MBL (listo para su uso) a cada micropoci-llo. Puede emplearse una micropipeta multica-nal o de repetición. Cubra los pocillos e incube

Page 45: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

ES

45

MBL Oligomer ELISA Kit

durante 60 minutos a temperatura ambiente en una plataforma de agitación (200/minuto).

5. Realice el lavado según lo descrito anterior-mente en la etapa 3.

6. Añada 100 μL de Estreptavidina-HRP conjugada (lista para su uso) a cada micropoci-llo. Puede emplearse una micropipeta multica-nal o de repetición. Cubra los pocillos e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente en una plataforma de agitación (200/minuto).

7. Realice el lavado según lo descrito anterior-mente en la etapa 3.

8. Añada 100 μL de Sustrato TMB (listo para su uso) a cada micropocillo. Se recomienda utilizar una micropipeta multicanal para reducir el tiempo de pipeteo. Cubra los pocillos e incúbelos durante 15 minutos exactamente a temperatura ambiente protegidos de la luz. Ponga en marcha el cronómetro al llenar el primer pocillo.

9. Añada 100 µL de Solución de parada (lista para su uso) a cada pocillo, manteniendo la misma secuencia y ritmo de pipeteo que en la etapa 7. Mezcle el contenido agitando suavemente durante 20 segundos, evitando las salpicadu-ras. Lea los pocillos pasados 30 minutos.

10. Lea las absorbancias de los pocillos a 450 nm en un lector de microplacas adecuado (longitud de onda de referencia 650 ó 620 nm). Si no se dispone de una longitud de onda de referencia, el valor del pocillo de blanco de reactivo se resta de cada uno de los demás valores antes de realizar cálculos posteriores.

RESUMEN ESQUEMÁTICO

CÁLCULO DE LOS RESULTADOSEl principio básico consiste en construir una curva de calibración representando la media de los valores duplicados de la absorbancia para cada calibrador MBL en el eje y, en función de las correspondientes

Lavar x 3Incubar1 h a TA

100 μL Calibrator o muestra diluida

Lavar x 3Incubar1 h a TA

100 μL Anticuerpo Biotinilado anti-MBL

Lavar x 3Incubar1 h a TA

100 μL Estreptavidina-HRP

Incubar15 min a TAprot. de la luz

100 μL Sustrato TMB

Leer a 450 nm

Diluir las muestras

Dejar que reactivos alcancen TA

100 μL Solución de Parada

Page 46: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

46

MBL Oligomer ELISA Kit

concentraciones de MBL en ng/mL en el eje x. La curva de calibración debe cumplir los requisitos de validación. Posteriormente se calcula la concen-tración de MBL de cada muestra de suero diluida localizando el punto sobre la curva correspondiente a la media de los valores duplicados de la absorban-cia para la muestra de suero diluida y leyendo en el eje x su concentración correspondiente en ng/mL. La concentración de MBL en la muestra de suero sin diluir se calcula multiplicando este resultado por el factor de dilución de la muestra. Este procedimiento puede realizarse de forma manual empleando un papel gráfico con escalas x e y lineales. Puede dibujarse una curva suavizada a través de los puntos o se pueden unir puntos adyacentes mediante líneas rectas. Es posible que este último procedimiento estime por exceso los valores de concentración entre los puntos cuando la curva sea ligeramente convexa hacia la izquierda, lo que ocurre habitualmente. Aunque la curva puede aproximarse a una línea recta, resulta incorrecto, tanto desde el punto de vista práctico como teórico, calcular y dibujar la línea recta que mejor se ajuste y leer los resultados a partir de la misma. De igual modo, el procedimiento puede realizarse con ayuda de un programa de software incluido en el lector ELISA, que incorpore procedi-mientos de ajuste de curvas. Debe elegirse el procedimiento que emplee ejes x e y lineales con un ajuste de curva logística de 4 parámetros. Las muestras diluidas que proporcionen un valor medio de la absorbancia superior al corres-pondiente al calibrador MBL 40 ng/mL o inferior al correspondiente al calibrador MBL 0,5 ng/mL se encuentran fuera del intervalo del ensayo y sus concentraciones han de indicarse como >40 ng/mL y <0,5 ng/mL, respectivamente. Las concen-traciones correspondientes de los sueros sin diluir se calculan como >(40 x factor de dilución) ng/mL y <(0,5 x factor de dilución) ng/mL, respectivamente. Deben repetirse los análisis con diluciones mayores o menores para las muestras con lecturas altas y bajas, respectivamente. Los nuevos factores de dilución deben ser los estimados para conseguir unos valores de absorbancia que se encuentren

holgadamente dentro del intervalo de la curva de calibración, pero no deben emplearse diluciones inferiores a 1/10.

VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓNLa absorbancia media del calibrador MBL 40 ng/mL debe ser >1,5. La absorbancia media de cualquier calibrador MLB debe ser superior a la del calibrador MBL anterior, p.ej., absorbancia (10 ng/mL MBL) > absorbancia (5 ng/mL). La curva debe ser ligera-mente convexa por la izquierda si los resultados se presentan en ejes lineales.

Puntos desalineados para calibradores indivi-duales: Es posible que uno o más calibradores individuales produzcan unas lecturas de absorbancia anómalas. Uno o ambos valores duplicados pueden estar desalineados y es posible que la media de los duplicados se encuentre desalineada. Este error es significativo siempre que perjudique el ajuste satisfac-torio de la curva mediante el método logístico de 4 parámetros que, como resultado del valor anómalo, se desplaza de otros puntos de calibradores que son realmente correctos. Deben examinase siempre los puntos de los calibradores y la curva ajustada para comprobar que el ajuste es correcto, antes de aceptar cualquier cálculo de concentración obtenido a partir de estos. Asimismo, un valor elevado de la suma de cuadrados residuales pondrá de manifiesto una curva mal ajustada. En caso de que sólo un calibrador se vea afectado, siempre que no sea el calibrador más alto, existen dos opciones: i) Puede eliminarse de la curva un resultado simple o duplicado erróneo y ajustarse de nuevo el resto de los resultados mediante el procedimiento logístico de 4 parámetros. Si se obtiene una curva satisfactoria, es posible calcular resultados de concentración provisionales a partir de la misma. ii) Si no se puede obtener un ajuste satisfactorio de esta forma, pero la curva parece coherente por lo demás, pueden obtenerse resultados provisio-nales mediante líneas rectas entre la media de los duplicados, omitiendo el punto erróneo. En caso de que dos o más calibradores se vean afectados, debe repetirse el análisis.

Page 47: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

ES

47

MBL Oligomer ELISA Kit

Un resultado desviado para un calibrador individual puede deberse a un error del investi-gador o al deterioro del calibrador. Si ambos valores duplicados se encuentran constantemente desalineados en análisis sucesivos, el calibrador es defectuoso y debe omitirse.

TRAZABILIDAD DEL VALOR DEL CALIBRADORSe asignó el valor de MBL mediante ELISA, asegurando su trazabilidad por normas internas en el Statens Serum Institut (Dinamarca).

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSEl intervalo completo de concentraciones de MBL en suero o plasma procedente de donantes humanos sanos medido según este análisis y análisis análogos es de 0 a 7000 ng/mL. Es posible encontrar valores inferiores a 100 ng/mL en genotipos estructurales O/O (donde O = B, C o D) independientemente del genotipo promotor, o en genotipos estructurales A/O (donde A = tipo salvaje) combinados con genotipos promotores HY/LX o LX/LY, o en el genotipo promotor LX/LX. Se pueden encontrar valores entre 100 ng/mL y 1000 ng/mL en los genotipos estructurales A/O o en los genotipos promotores LX/LY o LX/LX. Los valores superiores a 1000 ng/mL se asocian al tipo salvaje de MBL (A/A), mientras que los heterocigotos A/D pueden alcanzar este nivel ocasionalmente. El genotipo promotor HY/HY normalmente muestra valores superiores a 1500 ng/mL para MBL de tipo salvaje, pero otros genotipos promotores también presentan estos valores en ausencia de alelos estructurales O. En los estudios clínicos se han empleado valores discriminatorios de 50 ng/mL ó 100 ng/mL para definir la deficiencia grave de MBL. Los valores inferiores a estos valores discriminatorios pueden asociarse, en algunos casos, a una historia de mayor susceptibilidad ante las infecciones.

CONTROL DE CALIDADLos laboratorios que pretendan realizar análisis repetidos deben establecer sus propios sueros de control de lectura alta (>1000 ng/mL) y de lectura

baja (<100 ng/mL), almacenados en pequeñas alícuotas (p.ej. 50 µL) a -20 °C o temperaturas inferio-res. Debe descongelarse una alícuota de cada uno de ellos y analizarse en cada análisis, manteniendo un registro de los resultados sucesivos. Esto sirve como control del funcionamiento de la prueba, de su integridad y de la fiabilidad del investigador. Deben examinarse los resultados para comprobar la presencia de desplazamientos (tendencia de los resultados sucesivos a aumentar o disminuir) o de desviaciones significativas con respecto a la media de los resultados previos. Se considera que los valores que no se desvíen más de un 20% de la media de los valores previos indican la aceptabili-dad del análisis. Las alícuotas del suero de control no deben volver a congelarse para repetir el análisis una vez descongeladas y, en caso de que se realice un análisis adicional, deben emplearse nuevas alícuotas de control y diluciones de las muestras de los pacientes recién preparadas.

LIMITACIONESUna baja concentración de MBL en suero o en plasma no implica necesariamente la existencia de enfermedad. Los médicos deben interpretar la relevancia de cualquier deficiencia de MBL en función de las características clínicas de cada paciente.

RESULTADOS ESPERADOSSe analizaron 108 muestras de plasma proceden-tes de donantes de sangre daneses sanos con el BioPorto Diagnostics MBL oligomer ELISA. Los valores de la concentración de MBL se encontraron entre <2 ng/mL y 4443 ng/mL. Las concentraciones media y mediana fueron de 1470 ng/mL y 1190 ng/mL respectivamente, con una desviación típica (DT) de 1325 ng/mL. Con 18 muestras (16,7%) se obtuvieron lecturas por debajo de 100 ng/mL; con 30 muestras (27,8%) se obtuvieron lecturas entre 100 ng/mL y 1000 ng/mL, y 60 muestras (55,5%) dieron lecturas superiores a 1000 ng/mL.

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTOLímite de detección: La menor concentración

Page 48: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

48

MBL Oligomer ELISA Kit

de MBL que produjo una lectura de absorbancia superior a 2 DT por encima de la lectura media del cero del calibrador (n=8) fue 0,02 ng/mL, correspon-diente a una concentración de suero de 2 ng/mL en una muestra diluida 1/100.

Reproducibilidad intraanálisis (dentro del análisis): Se analizaron dos sueros con 10 repeti-ciones para determinar la reproducibilidad dentro del análisis. Se obtuvieron los siguientes resultados (CV = coeficiente de variación):

Reproducibilidad interanálisis (entre análisis, distintos días/investigadores): Se analizaron los mismos dos sueros por duplicado en cuatro análisis distintos realizados por dos investigadores en días diferentes para determinar la reproducibilidad entre análisis. Se obtuvieron los siguientes resultados:

Especificidad: No se han identificado bandas que reaccionen con el anticuerpo, aparte de las atribui-bles a la MBL, mediante Western blot del plasma o de fracciones de plasma. La ausencia de reacción cruzada con otros componentes del plasma se ve respaldada por el hecho de que se obtienen lecturas no distinguibles de cero a partir de muestras de donantes normales con deficiencia de MBL.

RESPONSABILIDADDestinado únicamente para el uso diagnóstico in vitro en determinados países. Visite www.bioporto.com para consultar la disponibilidad en su país. Este kit está pensado únicamente para la determinación cuantitativa in vitro de lectina fijadora de manano en suero o plasma humanos. El kit sólo está pensado para su uso por parte del personal cualificado que realice actividades de investigación y diagnóstico. Si el receptor de este kit lo transfiere de cualquier forma a un tercero, deberá adjuntar estas instrucciones, y dicho receptor debe por su cuenta y riesgo garantizar, en favor de BioPorto Diagnos-tics A/S, todas las limitaciones de responsabilidad respecto al mismo. BioPorto Diagnostics A/S no será responsable de ningún daño o pérdida debidos al uso de este kit de forma diferente a la indicada expresamente en estas instrucciones. La responsabilidad de BioPorto Diagnostics A/S no excederá en ningún caso el valor comercial del kit. BioPorto Diagnostics A/S no será responsable bajo ninguna circunstancia de los daños indirectos, especiales o resultantes incluyendo, sin limitación, la pérdida de beneficios.

REVISION: MO2010-07-EN-ES

Suero 1 Suero 2

Con. MBL media 2279 ng/mL 28,4 ng/mL

DT 81,2 1,07

CV 3,6% 3,8%

Suero 1 Suero 2

Con. MBL media 2310 ng/mL 29,7 ng/mL

DT 212 1,28

CV 9,2% 4,3%

Page 49: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

ES

49

MBL Oligomer ELISA Kit

Page 50: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

50

MBL Oligomer ELISA Kit

Læs venligst disse instruktioner omhyggeligt

TILSIGTET ANVENDELSETil bestemmelse af oligomeriseret mannan-bindende lektin i humant serum eller heparinplasma.

KLINISK BETYDNINGBestemmelse af modtagelighed over for infektioner, og derfor et muligt behov for aggressiv indgivelse af antibiotika hos:

• Patienter, der modtager eller skal til at modtage cancer kemoterapi eller immunosuppresiv behandling

• Patienter med cystisk fibrose

• Børn med tilbagevendende infektionerKan også anvendes som prognostisk markør for sygdomsalvor ved reumatoid artritis og systemisk lupus erythematosus.

Mannan-bindende lektin (MBL; også kaldet mannose-bindende lektin eller protein) er et multimerisk kulhydrat-bindende protein, der produceres i leveren og udskilles i blodet, hvor det udgør et vigtigt element i det medfødte immunfor-svar mod invaderende mikroorganismer. Dets normalt oligomeriserede former er associeret med specifikke serine pro-proteaser (MASP’erne), som aktiveres når MBL binder til mikrobielle kulhydrato-verflader og derefter aktiverer komplement via MBL- eller lektinpathway’en1. Mangel på normalt oligomeriseret MBL kan være associeret med øget modtagelighed for infektioner, når det adaptive immunsystem er umodent (i tidlig barndom)2 eller er blevet suppri-meret (f.eks. efter organtransplantation eller under cancer-kemoterapi)3. Mangel associeres også med et mere alvorligt forløb af autoimmune sydomme såsom systemisk lupus erythematosus (SLE)4 eller reumatoid artritis5, og med en dårligere prognose i cystisk fibrose6. MBL-mangel kan skyldes alleliske varianter i promotor og/eller strukturelle regioner af MBL-genet7. Visse promotor-alleler er associeret med lavere serumkoncentrationer af MBL, mens de strukturelle varianter svækker såvel normal

oligomerisation af MBL som total kædesyntese. Personer, der er homozygote for en strukturel defekt, viser meget lave niveauer af oligomeriseret MBL, mens heterozygoter viser lave til mellemhøje niveauer. Hos 100 sunde danske bloddonorer viste serum MBL-koncentrationer, bestemt med en oligomer-selektiv immunanalyse, lave værdier (<50 ng/mL) hos 12 individer. Disse skyldtes flere kombinationer af strukturelle og/eller promotor-alleler7. Dette tyder på udbredelsen i en vestlig befolkning af lave niveauer af MBL, der kan føre til kliniske manifestationer. Det vides imidlertid ikke, hvorfor kun nogle individer med lave MBL-niveauer viser øget modtagelighed for infektion. De mulige forklaringer omfatter tilfældige forskelle i ekspone-ring eller at det er en forudsætning, at der samtidig eksisterer en anden, muligvis subtil, immundefekt. Bestemmelse af MBL-koncentrationen i serum kan være nyttig til belysning af formodede immundefekter og som prognostisk indikator, der gør opmærksom på behovet for øgede terapeutiske eller profylaktiske foranstaltninger hos immuno-supprimerede patienter, deriblandt patienter, der modtager cancer-kemoterapi, samt patienter med cystisk fibrose, SLE eller reumatoid artritis.

PRINCIPPET I ASSAY PROCEDURENAssay’et er en ELISA, der udføres i mikrotiterbrønde coatet med et monoklonalt antistof imod det MBL-kulhydrat-bindende domæne. Bundet MBL detekteres med det samme antistof, som er blevet mærket med biotin, efterfulgt af fremkaldelse med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret strepta-vidin og inkubation med et kromogent substrat. Sammenligning af analyseresultaterne med molekylstørrelseskromatografi af MBL-immunre-aktivitet i individuelle humanserumprøver viser, at det anvendte monoklonale antistof er selektivt for MBL-oligomerer, når det anvendes både som capture- og detektionsantistof. Analysen er en fire-trins procedure: Trin 1. Alikvoter af kalibratorer, fortyndede serumprøver og eventuelle kontroller inkuberes i mikrotiterbrønde, som i forvejen er coatet med monoklonalt antistof imod MBL. MBL tilstede i

Page 51: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DA

51

MBL Oligomer ELISA Kit

opløsningerne vil binde sig til de antistofbelagte brønde via dets kulhydratbindende domæner. Ubundet materiale fjernes ved vask. Trin 2. Biotinyleret monoklonalt detektions-antistof tilsættes til hver testbrønd og inkuberes. Detektionsantistoffet fæstner sig til bundne MBL-oligomerer via de kulhydratbindende domæner, som ikke er optaget ved at være bundet ned til belægningen. Ubundet detektionsantistof fjernes ved vask. Trin 3. HRP-konjugeret streptavidin tilsættes til hver testbrønd og får lov til at danne et kompleks med det bundne biotinylerede antistof. Ubundet konjugat fjernes ved vask. Trin 4. Et kromogent peroxidase-substrat indeholdende tetrametylbenzidin (TMB) tilsættes til hver testbrønd. Det bundne HRP-streptavidin reagerer med substratet og danner et farvet produkt. Den enzymatiske reaktion standses kemisk, og farveintensiteten aflæses ved 450 nm i en ELISA-læser. Farveintensiteten (optisk densitet) er en funktion af koncentrationen af det oligome-riserede MBL, der oprindeligt blev tilsat til hver brønd. Resultaterne for kalibratorerne anvendes til at konstruere en kalibrationskurve, hvorfra koncen-trationerne af MBL i prøverne aflæses.

PRINCIPPET I ASSAY PROCEDUREN

MBL-antistof

Pladerne på forhånd coatet med pri-mært MBL-antistof. Pladerne er klar til brug.

MBL

Fortyndede prøver og kalibratorer til-sættes hver brønd og inkuberes.

Biotinyleret MBL Antistof

Biotinyleret detektionsantistof tilsættes hver brønd og inkuberes

HRP-Streptavidin

HRP-konjugeret streptavidin tilsættes hver brønd og inkuberes.

TMB substrat

Substrat tilsættes hver brønd. Reagerer 15 minutter i mørke.

Stopopløsningen tilsættes til hver brønd. Pladen aflæses inden for 30 min.

Kvantitative resultater opnås ved at måle prøvens absorbans ved 450 nm

Stopopløsning

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 52: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

52

MBL Oligomer ELISA Kit

KITKOMPONENTER

Bemærk: Flydende reagenser indeholder konserveringsmid-lerne natriumazid, thimerosal eller Bronidox L. Disse kan være sundhedsskadelige ved indtagelse.

NØDVENDIGE MATERIALER, SOM IKKE MEDFØLGER1. Justerbare mikropipetter dækkende en skala

1-1000 µL og tilsvarende engangs pipettespid-ser

2. Polypropylen reagensglas indeholdende op til 1000 µL

3. Stativer til reagensglas4. Justerbar 8- eller 12-kanals mikropipette

(50-250 µL) eller repeterende mikropipette (valgfri)

5. Rent 1 L gradueret cylinderglas6. Deioniseret eller destilleret vand7. Låg til mikrotiterplade8. Ren beholder til fortyndet vaskeopløsning9. Udstyr til påfyldning af brønde under vaskepro-

cedure (valgfri)10. Fnugfrie papirhåndklæder eller absorberende

papir11. Engangs pipetteringsreservoirer12. Timer (område 60 minutter)13. Kalibreret ELISA pladelæser, som kan aflæse

ved 450 nm (og helst fratrække referencevær-dier ved 650 eller 620 nm)

14. Natriumhypoklorit (husholdningsblegemiddel fortyndet 1:10) til dekontaminering af prøver, reagenser, og materialer

SIKKERHEDSFORANSTALTNINGERKun til in vitro-diagnostik1. Dette kit må kun anvendes af kvalificeret

laboratoriepersonale.2. MBL-kalibratorerne er fremstillet ud fra MBL

oprenset fra humant plasma. Hver blodenhed anvendt til fremstillingen er blevet testet med anerkendte metoder og fundet at være ikke-reaktiv over for hepatitis B overflade-antigen (HBsAg) og antistoffer mod human immundefekt virus (HIV) 1 og 2, samt hepatitis C virus (HCV). Derudover blev produktet underkastet virus de-aktiveringsprocedurer. Men da ingen testmetode kan give fuldstændig sikkerhed for fravær af smitsomme stoffer, skal kalibratorerne og patientprøverne behandles i overensstemmelse med biosik-kerhedsniveau 2 som anbefalet for potentielt smitsomme humane sera eller blodprøver i CDC/NIH-manualen ”Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories” (Biosikkerhed i mikrobiologiske og biomedicinske laborato-rier), 1999.

3. Anvend separate pipettespidser til hver prøve, kalibrator og reagens for at undgå kryds-kontamination.

4. Anvend separate reservoirer til hvert reagens. Dette gælder især TMB-substratet.

5. Efter brug dekontamineres alle prøver, reagenser og materialer ved iblødsætning i mindst 30 minutter i natriumhypokloritopløs-ning (husholdningsblegemiddel fortyndet 1:10).

6. For at undgå dråbedannelse under vask aspireres vaskeopløsningen i en flaske indehol-dende blegemiddel.

7. Undgå udslip til miljøet. Ubrugte beholdere og indhold bortskaffes på en sikker måde i overensstemmelse med nationale og lokale regler.

8. Reagenserne i dette kit er konserveret med op til 0,05% natriumazid, 0,038% thimerosal også

Enhed Indhold Antal

112 x 8 coatede mikrotiter-brønde + ramme

96 brønde

2 Prøvediluent 1 x 60 mL

3a - 3h MBL-kalibrator 1-8 8 x 1 mL

4 25x Vaskeopløsningskonc. 1 x 30 mL

5 Biotinyleret MBL-antistof 1 x 12 mL

6 HRP-streptavidin 1 x 12 mL

7 TMB-substrat 1 x 12 mL

8 Stopopløsning 1 x 16 mL

Page 53: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DA

53

MBL Oligomer ELISA Kit

kaldet thiomersal eller merthiolat, eller 0,2% Bronidox L. Disse kan være skadelige ved indtagelse.

9. Stopopløsningen indeholder 0,5 mol/L svovlsyre og kan forårsage irritation eller forbrændinger på hud og øjne. I tilfælde af kontakt skyl med rigeligt vand og søg læge.

10. Udskift ikke komponenter fra kits med forskel-lige batch-numre. Komponenterne er blevet standardiseret som en enhed for en given batch.

11. Hæmolyserede eller hyperlipæmiske prøver kan give fejlagtige resultater.

12. Fortynd ikke serum- og plasmaprøver direkte i mikrotiterbrøndene.

13. Undgå at berøre eller skrabe imod bunden af mikrotiterbrøndene under pipettering eller aspirering af væske.

14. Andre inkubationstider og –temperaturer end de specificerede kan give forkerte resultater.

15. Lad ikke brøndene tørre, når først analysen er i gang.

16. TMB-substratet er lysfølsomt. Hold det væk fra stærkt lys.

17. Genbrug ikke mikrotiterbrøndene og hæld ikke reagenser tilbage i flaskerne, når de er hældt fra.

STABILITET OG OPBEVARING1. Opbevar kittet med alle reagenser ved 2-8°C.

Må ikke nedfryses.2. Anvend alle reagenser inden udløbsdatoen på

flaskeetiketterne.3. Fortyndet vaskeopløsning forbliver stabil i 4

uger ved 2-8°C. Hvis ikke alle brøndene skal bruges, skal man kun fortynde den mængde vaskeopløsningskoncentrat, som er nødvendig.

4. Til senere brug placeres ubrugte brønde i folieposen sammen med den medfølgende desikkant, hvorefter posen og genforsegles. Lad altid folieposen afbalancere til stuetempe-ratur før den åbnes. Herved undgås kondens-dannelse i/på de coatede mikrotiterbrønde.

INDSAMLING AF PRØVERAlle blod-, serum- eller plasmaprøver skal håndteres og bortskaffes som om de var potentielt smitsomme. Se Sikkerhedsforanstalt-ninger, afsnit 2, 3, 5, 6 og 7.Bestemmelse af MBL i en enkelt prøve kræver 5-50 µL serum eller plasma. Blodprøver skal indsamles aseptisk i et almindeligt eller heparini-seret reagensglas af kvalificeret personale under anvendelse af anerkendte venepunkturteknikker. Serum eller plasma skal klargøres med standard-teknikker for klinisk laboratorietestning. Sæt låg på prøverne og opbevar dem ved 2-8°C til analyse inden for 24 timer. Hvis analysen ikke kan udføres inden for 24 timer, eller hvis prøven skal transpor-teres, skal man sætte låg på prøven og holde den frossen ved -20°C eller derunder. Undgå gentagen frysning og optøning. Anvend ikke hæmolyserede, hyperlipæmiske, varmebehandlede eller kontami-nerede prøver.

KLARGØRING AF REAGENSER OG PRØVER1. Bring alle prøver og reagenser til stuetempera-

tur (20-25°C). Prøverne blandes grundigt ved let invertering og om nødvendigt fjernes synligt partikelmateriale med centrifugering ved lav hastighed.

2. Bestem antallet af prøver, der skal testes (som dobbeltbestemmelse) plus eventuelle interne laboratoriekontroller (som dobbeltbestemmelse) plus eventuelle blankprøver. De på forhånd coatede brønde kan anvendes som strimler på 8 eller som individuelle brønde. Enkelte brønde behandles ved at brække individuelle brønde fra hinanden og placere dem i rammen i en passende position. Bogstaver og hak på brøndene bruges til at identificere de individuelle brønde. Tilføj 16 brønde til de 8 kalibratorer (som dobbeltbestemmelse). Udtag det ønskede antal mikrotiterbrønde og opbevar resten i folieposen med desikkant ved 2-8°C.

3. Vaskeopløsning: Fortynd 25x vaskeopløsnings-koncentrat ved at hælde hele flaskens indhold (30 mL) i et 1 L gradueret cylinderglas og tilsæt destilleret eller deioniseret vand, til en slutvolu-

Page 54: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

54

MBL Oligomer ELISA Kit

men på 750 mL. Bland grundigt og opbevar ved 2-8°C efter brug.

4. Prøvediluent: Klar til brug, skal ikke fortyndes yderligere.

5. MBL-kalibratorer: Klar til brug. De tildelte koncentrationer er angivet på etiketterne. Skal ikke fortyndes yderligere.

6. Biotinyleret MBL-antistof: Klar til brug, skal ikke fortyndes yderligere.

7. HRP-streptavidin-konjugat: Klar til brug, skal ikke fortyndes yderligere.

8. TMB-substrat: Klar til brug, skal ikke fortyndes yderligere.

9. Stopopløsning: Klar til brug, skal ikke fortyndes yderligere.

10. Patientprøver: Fortynd hver prøve i noteret forhold med prøvediluent for at opnå mindst 250 µL fortyndet opløsning, som kan bruges til dobbeltbestemmelse i brønde med 100 µL pr. brønd. En indledende screening ved en fortynding på 1/100 (f.eks. 5 µL serum + 495 µL prøvediluent, blandet ved invertering eller langsom vortexning) foreslås for de fleste prøver, efterfulgt af gentagen analyse af prøver, der er uden for området, ved lavere eller højere fortynding, efter behov. Fortyndinger under 1/10 bør ikke anvendes.

ANALYSEPROCEDURE1. Klargør analyseprotokollen ved at tildele de

relevante brønde til opsætning af kalibratorer, fortyndede patientprøver og eventuelle interne laboratoriekontroller til dobbeltbestemmelse. Hvis en referencebølgelængde på 650 eller 620 ikke er tilgængelig på ELISA-læseren, kan en blankprøve medtages. Denne opsættes med 100 µL prøvediluent i stedet for fortyndet serum eller plasma og behandles som de andre brønde.

2. Pipettér 100 μL volumener af hver kalibrator, fortyndede prøver og eventuelle interne labora-torikontroller ned i de tilsvarende positioner i mikrotiterbrøndene. Dæk brøndene til og inkubér i 60 minutter ved stuetemperatur på en rysteplatform sat til 200/minut.

3. Aspirér indholdet i mikrotiterbrøndene og vask mikrotiterbrøndene tre gange med mindst 300 μL fortyndet vaskeopløsning. Hvis vaskningen udføres manuelt, tømmes mikrotiterbrøndene ved invertering og let rysten over i en passende beholder, efterfulgt af aftrykning i omvendt position på et papirhåndklæde. En hviletid på 1 minut inden tømning anbefales for mindst den sidste vask i cyklusen. Kraften, hvormed den fortyndede vaskeopløsning fyldes i eller tømmes fra brøndene, påvirker den endelige farveudvikling. Manuel pipettering, som kan være meget skånsom og føre til kraftig farveud-vikling, anbefales kun i mangel af alternativer som at fylde brøndene ved nedsænkning, anvendelse af en multikanals manuel vaskedis-penser eller anvendelse af et automatisk vaskeudstyr.

4. Fyld 100 μL biotinyleret MBL-antistof (klar til brug) i hver mikrotiterbrønd. En multikanals eller repeterende mikropipette kan anvendes. Dæk brøndene til og inkubér i 60 minutter ved stuetemperatur på en rysteplatform (200/minut).

5. Vask som ovenfor beskrevet i Trin 3.6. Fyld 100 μL HRP-streptavidin-konjugat (klar

til brug) i hver mikrotiterbrønd. En multikanals eller repeterende mikropipette kan anvendes. Dæk brøndene til og inkubér i 60 minutter ved stuetemperatur på en rysteplatform (200/minut).

7. Vask som ovenfor beskrevet i Trin 3. 8. Fyld 100 μL TMB-substrat (klar til brug) i hver

mikrotiterbrønd. Anvendelse af en multikanals mikropipette anbefales for at reducere pipette-ringstid. Dæk brøndene til og inkubér i nøjagtigt 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Start uret under påfyldning af den første brønd.

9. Tilsæt 100 µL stopopløsning (klar til brug) til hver brønd, idet man opretholder den samme pipetteringssekvens som i Trin 7. Bland ved forsigtig omrysten i 20 sekunder idet sprøjt skal undgås. Aflæs brøndene inden for 30 minutter.

10. Aflæs brøndenes absorbanser ved 450 nm i en passende mikrotiterplade-læser (referen-

Page 55: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DA

55

MBL Oligomer ELISA Kit

cebølgelængde 650 eller 620 nm). Hvis ingen referencebølgelængde er tilgængelig, trækkes værdien af blankprøven fra hver af de andre værdier, inden andre beregninger udføres.

SKEMATISK OVERSIGT

BEREGNING AF RESULTATERDet grundlæggende princip er at konstruere en kalibreringskurve ved at plotte gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne af absorbansværdierne for hver MBL-kalibrator ind på y-aksen mod de tilsva-rende MBL-koncentrationer i ng/mL på x-aksen. Kalibreringskurven skal opfylde valideringskravene. MBL-koncentrationen i hver fortyndet serumprøve findes herefter ved at lokalisere det punkt på kurven, der svarer til gennemsnittet af dobbeltbestemmel-serne af absorbansværdierne for den fortyndede serumprøve og aflæse dets tilsvarende koncentra-tion i ng/mL fra x-aksen. Koncentrationen af MBL i den ufortyndede prøve beregnes ved at gange dette resultat med prøvens fortyndingsfaktor. Denne procedure kan udføres manuelt ved hjælp af grafpapir med lineære x og y skalaer. En jævn kurve kan tegnes gennem punkterne eller man kan forbinde punkter, der ligger ved siden af hinanden, med lige linier. Sidstnævnte procedure kan overvurdere koncentrationsværdier mellem punkter en smule, når kurven er let konveks til venstre, hvilket er det typiske resultat. Selv om kurven kan nærme sig en lige linie, er det såvel praktisk som teoretisk ukorrekt at beregne og tegne en tilpasset lige linie og aflæse resultater herfra. Proceduren kan også udføres med et ELISA-læser-softwareprogram, der inkorporerer kurvetil-pasningsprocedurer. Den bedste procedure er at anvende lineære x og y akser med 4-parameter logistisk kurvetilpasning. Fortyndede prøver, der giver en gennemsnitsab-sorbans over den for 40 ng/mL MBL-kalibratoren eller under den for 0,5 ng/mL MBL-kalibratoren, er uden for analyseområdet, og deres koncentrationer skal noteres som henholdsvis >40 ng/mL og <0,5 ng/mL. De tilsvarende koncentrationer i de ufortyndede sera beregnes, henholdsvis >(40 x fortyndingsfaktor) ng/mL og <(0,5 x fortyndingsfaktor) ng/mL. Disse prøver skal analyseres igen ved højere og lavere fortyndin-ger for prøver der giver henholdsvis høje- og lave aflæsninger. De nye fortyndingsfaktorer skal være dem, der estimeres at give absorbansværdier, som falder sikkert inden for kalibreringskurvens område. Dog må fortyndinger under 1/10 ikke anvendes.

Vask x 3Inkuber 1 time ved stuetemp.

100 μL Kalibrator eller fortyndet prøve

Vask x 3Inkuber 1 time ved stuetemp.

100 μL Biotinyleret MBL antistof

Vask x 3Inkuber 1 time ved stuetemp.

100 μL HRP-Streptavidin

Inkuber 15 min. ved stuetemp. i mørke

100 μL TMB-Substrat

A� æs ved 450 nm

Fortynd prøver

Lad reagenserne opnå stuetemperatur

100 μL Stopopløsning

Page 56: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

56

MBL Oligomer ELISA Kit

VALIDERING AF KALIBRERINGSKURVEDen gennemsnitlige absorbans for 40 ng/mL MBL-kalibrator skal være >1,5. Den gennemsnitlige absorbans for enhver MBL-kalibrator skal være højere end for den for den forudgående kalibrator, f.eks. absorbans (10 ng/mL MBL) > absorbans (5 ng/mL). Kurven skal være let konveks til venstre, når resultaterne plottes på lineære akser.

Punkter uden for linien for individuelle kalibra-torer: En eller flere individuelle kalibratorer kan give unormale absorbansaflæsninger. En eller begge dobbeltbestemmelser kan ligge uden for linien, og gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne kan ligge uden for linien. Denne fejl er signifikant, hvis den forringer tilfredsstillende kurvetilpasning ved den 4-parameter logistiske metode, der som resultat af den unormale værdi, flyttes væk fra andre kalibratorpunkter, der i virkeligheden er korrekte. Kalibratorpunkter og den tilpassede kurve skal altid undersøges for korrekt tilpasning, før nogen koncentrationsberegning derfra accepteres. En dårligt tilpasset kurve vil også blive afsløret af en høj værdi for summen af resterende kvadrater. Hvis kun én kalibrator, som ikke er den højeste kalibrator, er påvirket, er der to handlemuligheder: i) En fejlagtig enkelt- eller dobbeltbestem-melse kan elimineres fra kurven, og de resterende resultater gentilpasses ved den 4-parameter logisti-ske procedure. Hvis en tilfredsstillende tilpasning opnås, kan der beregnes foreløbige koncentrations-resultater derfra. ii) Hvis der ikke kan opnås en tilfredsstillende tilpasning ad denne vej, men kurven ellers er konsistent, kan foreløbige resultater opnås fra lige linier mellem gennemsnittene af dobbeltbestem-melserne, idet man udelader det forkerte punkt. Hvis to eller flere kalibratorer er påvirket, skal analysen gentages. Et afvigende resultat for en individuel kalibra-tor kan skyldes operatørfejl eller nedbrydning af kalibratoren. Hvis begge dobbeltbestemmelses-værdier konsekvent ligger uden for linien i flere på hinanden følgende analyser, er kalibratoren defekt og skal udelades.

SPORBARHED AF KALIBRATORVÆRDITildeling af MBL-værdien blev udført med ELISA, under sikring af sporbarhed til interne standarder hos Statens Serum Institut (Danmark).

TOLKNING AF RESULTATERDet fulde område af MBL-koncentrationer i serum eller plasma fra sunde humane donorer som målt med denne analyse og analoge analyser er 0 til 7000 ng/mL. Værdier under 100 ng/mL kan findes i O/O strukturelle genotyper (hvor O = B, C eller D) uanset promotorgenotype, eller i A/O strukturelle genotyper (hvor A = vildtype) i kombination med HY/LX- eller LX/LY-promotorgenotyper, eller i LX/LX-promotor-genotypen. Værdier mellem 100 ng/mL og 1000 ng/mL kan findes i A/O strukturelle genotyper eller i LX/LY- eller LX/LX-promotorgenotyper. Værdier over 1000 ng/mL associeres med vildtype MBL (A/A), selv om A/D-heterozygoter af og til kan nå dette niveau. HY/HY-promotorgenotypen viser typisk værdier over 1500 ng/mL for vildtype MBL, men sådanne værdier vises også af andre promotorgenotyper i fravær af O-strukturelle alleler. Kliniske studier har anvendt grænseværdier på 50 ng/mL eller 100 ng/mL for at definere alvorlig MBL-mangel. Værdier under disse grænseværdier kan hos visse personer være associeret med en anamnese med øget modtagelighed over for infektioner.

KVALITETSKONTROLLaboratorier, der agter at udføre gentagne analyser, skal etablere deres egne høje (>1000 ng/mL) og lave (<100 ng/mL) kontrolsera, som opbevares i små (f.eks. 50 µL) alikvoter ved -20°C eller derunder. En alikvot af hver skal optøs og testes i hver analyse og successive resultater skal registreres. Dette tjener som kontrol af testens ydelse, testintegritet og operatørpålidelighed. Resultaterne skal undersø-ges for drift (tilbøjelighed for successive resultater til at stige eller falde) eller væsentlig afvigelse fra gennemsnittet af tidligere resultater. Værdier, der ikke afviger mere end 20% fra gennemsnit-tet af tidligere resultater, kan anses for at angive analysens acceptabilitet. Alikvoter af kontrolserum må ikke genfryses med henblik på fornyet analyse,

Page 57: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

DA

57

MBL Oligomer ELISA Kit

efter de først er tøet op, og såfremt en ny analyse skal udføres, skal der anvendes friske kontrolalikvo-ter og friske fortyndinger af patientprøver

BEGRÆNSNINGEREn lav koncentration af MBL i serum eller plasma indebærer ikke nødvendigvis eksistensen af sygdom. Lægen skal tolke betydningen af enhver MBL-mangel i lyset af patientens kliniske tilstand.

FORVENTEDE RESULTATER108 plasmaprøver fra sunde danske bloddonorer blev analyseret i BioPorto Diagnostics MBL oligomer ELISA. MBL-koncentrationsværdierne spændte fra <2 ng/mL til 4443 ng/mL. Gennemsnits- og middel-koncentrationer var henholdsvis 1470 ng/mL og 1190 ng/mL, med en standardafvigelse (SD) på 1325 ng/mL. 18 prøver (16,7%) gav aflæsninger under 100 ng/mL, 30 prøver (27,8%) gav aflæsninger mellem 100 ng/mL og 1000 ng/mL, og 60 prøver (55,5%) gav aflæsninger over 1000 ng/mL.

YDEEVNEDetektionsgrænse: Den laveste koncentration af MBL, der gav en absorbansaflæsning mere end 2 SD over den gennemsnitlige nulkalibrator-aflæsning (n = 8) var 0,02 ng/mL, svarende til en serumkoncen-tration på 2 ng/mL i en prøve fortyndet 1/100.

Reproducerbarhed inden for analysen (i kørslen): To sera blev kørt i 10 gentagelser for at bestemme reproducerbarheden inden for samme kørsel. Følgende resultater blev opnået (CV = variationskoefficient):

Reproducerbarhed mellem analyser (mellem kørsler)(forskellige dage/operatører): De samme to sera blev kørt som dobbeltbestemmelse i 4 forskellige analyser udført af mindst 2 operatører på forskellige

dage for at bestemme reproducerbarheden mellem forskellige kørsler. Følgende resultater blev opnået:

Specificitet: Western blotting af plasma eller plasma-fraktioner har ikke identificeret bånd, der reagerer med antistoffet, bortset fra dem, der kan henføres til MBL. Fraværet af krydsreaktion med andre plasma-komponenter underbygges af det forhold, at der opnås aflæsninger, der ikke kan skelnes fra nul, fra visse MBL-deficiente men i øvrigt normale donorer.

ANSVARKun til in vitro diagnostisk anvendelse i bestemte lande. Se venligst www.bioporto.com for tilgængelig-hed i forskellige lande. Dette kit er kun beregnet til in vitro-bestemmelse af mannan-bindende lektin i humant serum eller plasma. Kittet er kun beregnet til brug af kvalificeret personale, der udfører forskning eller diagnostiske aktiviteter. Såfremt modtageren af dette kit videregiver det på nogen måde til tredjepart, skal denne instruktion medsendes, og nævnte modtager skal for egen risiko sikre i BioPorto Diagnostics A/S’ favør, alle begræns-ninger i ansvar heri. BioPorto Diagnostics A/S skal ikke være ansvarlig for skader eller tab, der skyldes brug af kittet på anden måde end udtrykkeligt nævnt i disse instruktioner.BioPorto Diagnostics A/S’ ansvar skal i intet tilfælde overstige kittets kommercielle værdi. BioPorto Diagnostics A/S skal under ingen omstændigheder være ansvarlig for indirekte, specielle eller følgeskader, deriblandt, men ikke begrænset til, gevinsttab.

REVISION: MO2010-07-EN-DA

Serum 1 Serum 2

Gns. MBL-konc. 2279 ng/mL 28,4 ng/mL

SD 81,2 1,07

CV 3,6% 3,8%

Serum 1 Serum 2

Gns. MBL-konc. 2310 ng/mL 29,7 ng/mL

SD 212 1,28

CV 9,2% 4,3%

Page 58: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

58

MBL Oligomer ELISA Kit

Läs dessa anvisningar noggrant

AVSEDD ANVÄNDNINGFör bestämning av oligomeriserat mannan-bindande lectin i humanserum eller heparinplasma.

KLINISK SIGNIFIKANSBestämning av infektionskänslighet som kan kräva aggressiv administration av antibiotika hos:

• Patienter som får eller ska få cancerkemoterapi eller immunsuppressiv behandling

• Patienter med cystisk fibros

• Barn med återkommande infektionerKan också användas som en prognostisk markör för allvarlighetsgraden hos sjukdomar som reumatoid artrit och systemisk lupus erytematosus.

Mannan-bindande lectin (MBL, också kallat mannos-bindande lectin eller -protein) är ett multimert kolhydrat-bindande protein som bildas i levern och utsöndras i blodet där det utgör en viktig del i medfött immunförsvar mot invaderande mikroorganismer. Dess vanligtvis oligomeriserade former associeras med specifika serinpro-proteaser (MASP) som aktiveras när MBL binder till mikrobiella kolhydratytor och i sin tur aktiverar komplement via MBL- eller lectinreaktionsvägen1. Brist på vanligtvis oligomeriserat MBL kan associeras med ökad infektionskänslig-het när det adaptiva immunsystemet är omoget (i tidig barndom)2 eller har dämpats (t.ex. efter organtransplantation eller vid cancerkemoterapi)3. Brist associeras också med en allvarligare form av autoimmuna sjukdomar som systemisk lupus erytematosus (SLE)4 eller reumatoid artrit5 och med en sämre prognos för cystisk fibros6. MBL-brist kan bero på allelvarianter i promotorn och/eller strukturella regioner i MBL-genen7. Vissa promoteralleler associeras med lägre serumkon-centrationer av MBL, medan strukturella varianter både försämrar normal oligomerisering av MBL och total kedjesyntes. Försökspersoner som är homozygota för en strukturell defekt visar mycket låga nivåer av oligomeriserat MBL, medan heterozy-gota visar låga-intermediära nivåer. Hos 100 friska

danska blodgivare bestämdes koncentrationer av serum-MBL med en oligomer-selektiv immunanalys och då uppvisades låga värden (<50 ng/mL) hos 12 personer. Detta berodde på olika kombinationer av strukturella alleler och/eller promotoralleler7. Detta indikerar en förekomst i västvärlden av låga nivåer av MBL som ger upphov till kliniska manifestationer. Det är emellertid okänt varför endast vissa individer med låga MBL-nivåer uppvisar ökad infektionskäns-lighet. Förklaringar är bl.a. skillnaden i risken för exponering eller ett möjligt krav på samexistens av en annan, kanske lindrig, immunbrist. Bestämningen av MBL-koncentrationer i serum kan vara användbar för påvisning av misstänkta immundefekter och som prognostisk indikator som varnar om behov av utökade terapeutiska eller profylaktiska åtgärder hos immunsuppressiva patienter, inklusive patienter som får cancerkemo-terapi och patienter med cystisk fibros, SLE eller reumatoid artrit.

ANALYSPRINCIPAnalysen är en ELISA utförd i mikrobrunnar belagda med en monoklonal antikropp mot den MBL-kolhydrat-bindande domänen. Bundet MBL detekteras med samma antikropp som märkts med biotin, följt av en reaktion med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerat streptavidin och inkubation med ett kromogent substrat. Jämförelse av analys-resultaten med molekylstorlekskromatografi av MBL-immunreaktivitet i enskilda humanserumpro-ver anger att den monoklonala antikroppen som används är selektiv för MBL-oligomerer när den används som både infångnings- och detektionsanti-kropp. Analysen är en procedur i fyra steg: Steg 1. Alikvoter av kalibratorer, spädda serumprover och kontroller inkuberas i mikrobrun-nar som är förbelagda med monoklonal antikropp mot MBL. MBL som förekommer i lösningarna kommer att binda till de antikroppsbelagda brunnarna via dess kolhydrat-bindande domäner. Obundet material avlägsnas med tvättning. Steg 2. Biotinylerad monoklonal detektions-antikropp tillsätts till varje testbrunn och inkuberas. Detektionsantikroppen binder till bundna

Page 59: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

SE

59

MBL Oligomer ELISA Kit

MBL-oligomerer, via kolhydrat-bindande domäner, som inte är bundna till beläggningen. Obunden detektionsantikropp avlägsnas med tvättning. Steg 3. HRP-konjugerat streptavidin tillsätts till varje testbrunn och tillåts bilda ett komplex med den bundna biotinylerade antikroppen. Obundet konjugat avlägsnas med tvättning. Steg 4. Ett kromogent peroxidassubstrat innehållande tetrametylbenzidin (TMB) tillsätts till varje testbrunn. Bundet HRP-streptavidin reagerar med substratet för att ge en färgad produkt. Den enzymatiska reaktionen stoppas kemiskt och färgin-tensiteten avläses vid 450 nm i en ELISA-avläsare. Färgintensiteten (optisk densitet) är en funktion av koncentrationen av MBL-oligomerformer som ursprungligen tillsattes till varje brunn. Resultaten för kalibratorerna används för att konstruera en kalibreringskurva från vilken man avläser koncen-trationerna av MBL i proverna.

ANALYSPRINCIP

MBL-antikropp

Plattor är förbelagda med primär MBL-antikropp. Plattorna är bruksfärdiga.

MBL

Spädda prover och kalibratorer tillsätts till varje brunn och inkuberas

Biotinylerad MBL-Antikropp

Biotinylerad detektionsantikropp till-sätts till varje brunn och inkuberas

HRP-Streptavidinkonjugat

HRP-konjugerat streptavidin tillsätts till varje brunn och inkuberas

TMB-Substrat

Substrat tillsätts till varje brunn. Låt verka i 15 minuter i mörker

Stopplösning tillsätts till varje brunn. Avläs platta inom 30 min.

Kvantitativa resultat erhålls genom att mäta brunnarnas absorbanser vid 450 nm

Stopplösning

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 60: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

60

MBL Oligomer ELISA Kit

KITKOMPONENTER

Obs! Flytande reagenser innehåller konserveringsmedlen natriumazid, timerosal eller Bronidox L. Dessa kan vara hälsoskadliga vid förtäring.

MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER1. Justerbara mikropipetter i intervallet 1-1000 µL

och motsvarande engångspipettspetsar2. Provrör av polypropylen som rymmer 1000 µL3. Rörställ4. Justerbar mikropipett med 8 eller 12 kanaler

(50-250 µL) eller repeterbar mikropipett (valfri)5. Ren bägare på 1 L6. Avjoniserat eller destillerat vatten7. Lock för mikroplatta8. Rena behållare för spädd tvättlösning9. Apparat för att fylla brunnarna under tvättpro-

ceduren (valfri)10. Luddfria pappershanddukar eller absorbe-

rande papper11. Engångsbehållare för pipettering12. Tidtagarur (för 60 minuter)13. Kalibrerad ELISA-plattavläsare som kan

avläsa vid 450 nm (helst med subtraktion av referensvärden vid 650 eller 620 nm)

14. Natriumhypoklorit (hushållsblekmedel, spädning 1:10) för dekontaminering av prover, reagenser och material

FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDEREndast för in vitro-diagnostik1. Denna sats ska endast användas av kvalifice-

rad laboratoriepersonal.2. MBL-kalibratorerna bereddes från MBL renat

från humanplasma. Varje blodenhet som användes vid beredningen testades med godkända metoder och befanns vara inreaktiv för hepatit B-ytantigen (HBsAg) och antikrop-par mot humant immunbristvirus (HIV) 1 och 2 och hepatit C-virus (HCV). Dessutom genomgick produkten virusavaktiverings-procedurer. Ingen testmetod kan emellertid fullständigt garantera att smittsamma ämnen inte förekommer och därför bör kalibratorer och patientprover hanteras vid biosäkerhetsnivå 2 enligt rekommendationerna för potentiellt smittsamt humanserum eller blodprov i CDC/NIH-handboken ”Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories”, 1999. Lösningar innehållande humanserum bör hanteras som potentiellt smittsamt och hanteras därefter.

3. Använd separata pipetter för varje prov, kalibrator och reagens för att undvika korskon-tamination.

4. Använd separata behållare för varje reagens. Detta gäller särskilt TMB-substrat.

5. Efter användning ska alla prover, reagenser och allt material dekontamineras med blötläggning under minst 30 minuter i natriumhypokloritlös-ning (hushållsblekmedel, spädning 1:10).

6. För att undvika droppbildning vid tvättning ska tvättlösningen tillsättas en flaska med blekmedel.

7. Undvik utsläpp till miljön. Kassera behållare och oanvänt innehåll på ett säkert sätt och i enlighet med nationella och lokala riktlinjer.

8. Reagenserna i detta kit är konserverade med upp till 0,05% natriumazid, 0,038% timerosal, också kallat tiomersal eller mertiolat, eller 0,2% Bronidox L. Dessa kan vara giftiga vid förtäring.

9. Stopplösning innehåller 0,5 mol/L svavelsyra och kan ge irritationer eller brännskador på hud och ögon. Vid kontakt, skölj omedelbart med stora mängder vatten och kontakta läkare.

Artikel Innehåll Kvantitet

112 x 8 belagda mikrobrunnar + ram

96 brunnar

2 Provspädningsvätska 1 x 60 mL

3a - 3h MBL-kalibratorer, 1-8 8 x 1 mL

4 25x koncentrerad tvättlösning 1 x 30 mL

5 Biotinylerad MBL-antikropp 1 x 12 mL

6 HRP-streptavidin 1 x 12 mL

7 TMB-substrat 1 x 12 mL

8 Stopplösning 1 x 16 mL

Page 61: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

SE

61

MBL Oligomer ELISA Kit

10. Blanda inte ihop komponenter från satser med olika batchnummer. Komponenterna har standardiserats som en enhet för en given batch.

11. Hemolyserade eller hyperlipemiska prover kan ge felaktiga resultat.

12. Späd inte serum- eller plasmaprover direkt i mikrobrunnarna.

13. Vidrör eller skrapa inte mikrobrunnarnas botten vid pipettering eller aspiration av vätska.

14. Andra inkubationstider och temperaturer än de specificerade kan ge felaktiga resultat.

15. Låt inte brunnarna torka när analysen väl har börjat.

16. TMB-substratet är ljuskänsligt. Håll borta från skarpt ljus.

17. Återanvänd inte mikrobrunnar eller häll inte oanvända reagenser tillbaka i flaskorna.

STABILITET OCH FÖRVARING1. Förvara satsen med alla reagenser vid 2-8°C.

Frys inte ned.2. Använd alla reagenser före utgångsdatumet på

flasketiketterna.3. Spädd tvättlösning är stabil i fyra veckor vid

2-8°C. Om inte alla brunnarna ska användas, späd endast den del av tvättlösningen som krävs.

4. Förvara oanvända brunnar i foliepåsen med den medföljande torkmedelspåsen och försegla igen för senare användning. Låt alltid foliepåsen komma i jämvikt vid rumstemperatur före öppnande för att undvika kondensation i/på de belagda mikrobrunnarna.

PROVTAGNINGHantera och kassera alla blod-, serum- eller plasmaprover som om de är potentiellt smittsamma. Se Försiktighetsåtgärder, avsnitt 2, 3, 5, 6 och 7.Bestämning av MBL i ett enskilt prov kräver 5-50 µL serum eller plasma. Blodprover bör tas aseptiskt i ett tomt eller hepariniserat provrör av kvalificerad personal med användning av godkända venpunktionstekniker. Serum eller plasma bör beredas med standardmeto-

der för klinisk laboratorietestning. Förse proverna med lock och förvara dem vid 2-8°C för analys inom 24 timmar. Om analysen inte kan utföras inom 24 timmar eller om provet ska transporteras ska provet förses med lock och hållas nedfryst vid -20°C eller lägre. Undvik upprepad nedfrysning och upptining. Använd inte hemolyserade, hyperlipemiska, värmebehandlade eller kontaminerade prover.

BEREDNING AV REAGENSER OCH PROVER1. Låt alla prover och reagenser anta rumstem-

peratur (20-25°C). Blanda proverna noggrant genom att försiktigt vända på provröret och ta vid behov bort synliga partiklar med låghastig-hetscentrifugering.

2. Bestäm antal prover (dubbla) och interna labora-toriekontroller (dubbla) som ska testas samt eventuella reagensblankprov. De förbelagda brunnarna kan användas som stickor med åtta brunnar eller som enskilda brunnar. Enskilda brunnar hanteras genom att man bryter av dem en och en som därefter placeras i ramen på lämplig plats. Bokstäver och skåror på brunnarna gör att enskilda brunnar kan identi-fieras. Lägg till 16 brunnar för 8 kalibratorer (dubbla). Ta fram antalet mikrobrunnar som krävs och placera tillbaka de återstående i foliepåsen med torkmedel vid 2-8°C.

3. Tvättlösning: Späd 25x koncentrat av tvättlös-ning genom att hälla flaskans hela innehåll (30 mL) i en bägare på 1 L och tillsätt destillerat eller avjoniserat vatten till en slutvolym på 750 mL. Blanda noggrant och förvara vid 2-8°C efter använding.

4. Provspädningsvätska: Bruksfärdig, späd inte ytterligare.

5. MBL-kalibratorer: Bruksfärdiga. De tilldelade koncentrationerna anges på etiketterna. Späd inte ytterligare.

6. Biotinylerad MBL-antikropp: Bruksfärdig, späd inte ytterligare.

7. HRP-streptavidinkonjugat: Bruksfärdigt, späd inte ytterligare.

8. TMB-substrat: Bruksfärdigt, späd inte ytterli-gare.

Page 62: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

62

MBL Oligomer ELISA Kit

9. Stopplösning: Bruksfärdig, späd inte ytterli-gare.

10. Patientprover: Späd varje prov i en angiven proportion med provspädningsvätska för att erhålla minst 250 µL spädd lösning som kan tillsättas dubbla brunnar med 100 µL per brunn. En initial undersökning vid en spädning på 1/100 (t.ex. 5 µL serum + 495 µL provspäd-ningsvätska blandad med upp- och nedvänd-ning eller långsam vortexblandning) föreslås för de flesta prover, följt av omanalys av prover utanför intervall vid lägre eller högre spädning, beroende på vad som är lämpligt. Spädningar lägre än 1/10 ska inte användas.

ANALYSPROCEDUR1. Förbered analysprotokollet genom att

tilldela lämpliga brunnar för kalibratorer, spädda patientprover och interna labora-toriekontroller i dubbel uppsättning. Om en referensvåglängd på 650 eller 620 nm inte finns tillgänglig på ELISA-avläsaren kan ett reagens-blankprov tilldelas. Reagensblankprovet är 100 µL provspädningsvätska istället för spätt serum eller spädd plasma och det bearbetas på samma sätt som de andra brunnarna.

2. Pipettera 100 µL av varje kalibrator, spädda prover och interna kontroller till motsvarande positioner på mikrobrunnsremsan. Täck brunnarna och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur på en skakplatta vid 200 skakningar/minut.

3. Aspirera innehållet i mikrobrunnarna och tvätta mikrobrunnarna tre gånger med minst 300 µL spädd tvättlösning. Om tvättning utförs manuellt ska brunnarna tömmas genom att vända och försiktigt skaka dem över en lämplig behållare, följt av avtorkning upp och ned med en pappershandduk. En väntetid på en minut innan tömning rekommenderas för åtminstone den sista tvättcykeln. Sättet på vilket tvättlös-ning fylls i eller töms ur brunnarna påverkar den slutliga färgutvecklingen. Manuell pipettering, som kan utföras mycket försiktigt och leda till stark färgutveckling, rekommenderas

endast när det inte finns alternativ som t.ex. immersionsfyllning av brunnarna, användning av en manuell flerkanalstvättdispenser eller användning av en automatisk tvättapparat.

4. Dispensera 100 µL biotinylerad MBL-antikropp (bruksfärdig) i varje mikrobrunn. En flerkanals- eller repeterbar mikropipett kan användas. Täck brunnarna och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur på en skakplatta (200 skakningar/minut).

5. Tvätta som beskrivet ovan i steg 3.6. Dispensera 100 µL HRP-streptavidinkonjugat

(bruksfärdigt) i varje mikrobrunn. En flerkanals- eller repeterbar mikropipett kan användas. Täck brunnarna och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur på en skakplatta (200 skakningar/minut).

7. Tvätta som beskrivet ovan i steg 3.8. Dispensera 100 µL TMB-substrat (bruksfärdigt)

i varje mikrobrunn. Användning av en flerkanal-spipett rekommenderas för att minska pipette-ringstiden. Täck brunnarna och inkubera i exakt 15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Starta klockan när den första brunnen fylls.

9. Tillsätt 100 µL stopplösning (bruksfärdig) till varje brunn med samma pipetteringssekvens och hastighet som i steg 7. Blanda genom att försiktigt skaka i 20 sekunder och undvik spill. Avläs brunnarna inom 30 minuter.

10. Avläs brunnarnas optiska densiteter (absorban-ser) vid 450 nm i en lämplig mikroplattavläsare (referensvåglängd 650 eller 620 nm). Om ingen referensvåglängd finns tillgänglig ska värdet för reagensblankprovet subtraheras från varje annat värde innan andra beräkningar utförs.

Page 63: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

SE

63

MBL Oligomer ELISA Kit

SCHEMATISK ÖVERSIKT

BERÄKNING AV RESULTATHuvudprincipen är att konstruera en kalibrerings-kurva genom att rita upp medelvärdet för optisk densitet för dubbelproverna av varje MBL-kalibrator

på y-axeln mot motsvarande koncentrationer av MBL i ng/mL på x-axeln. Kalibreringskurvan måste överensstämma med valideringskraven. Koncentrationen av MBL för varje spätt serumprov uppskattas därefter genom att man letar efter den punkt på kurvan som motsvarar medelvärdet för optisk densitet för dubbelproverna av det spädda serumprovet och avläser den motsvarande koncen-trationen i ng/mL på x-axeln. Koncentrationen av MBL i det ospädda serumprovet beräknas genom att man multiplicerar resultatet med provets spädningsfaktor. Denna procedur kan utföras manuellt med hjälp av ett diagrampapper med linjära x- och y-skalor. En mjuk kurva kan dras genom punkterna eller närlig-gande punkter kan sammanfogas med raka linjer. Den senare proceduren kan övervärdera koncentra-tionsvärdena mellan punkter en aning när kurvan är konvex åt vänster, vilket är vanligt. Även om kurvan kan uppskattas till en rak linje är det både praktiskt och teoretiskt inkorrekt att beräkna och dra den raka linjen för bäst anpassning och därefter avläsa resultaten. Proceduren kan också utföras med en programvara med kurvanpassningsfunktion för en ELISA-avläsare. Proceduren som ska användas är linjära x- och y-axlar med en 4-parameters logistisk kurvanpassning. Spädda prover som ger ett medelvärde på optisk densitet över det för 40 ng/mL MBL-kalibrator eller under det för 0,5 ng/mL MBL-kalibrator ligger utanför analysens intervall och koncentrationerna bör registreras som >40 ng/mL repektive <0,5 ng/mL. Motsvarande koncentrationer i ospädda sera beräknas som > (40 x spädningsfaktor) ng/mL respektive < (0,5 x spädningsfaktor) ng/mL. Dessa prover bör omanalyseras vid högre och lägre spädningar för prover med höga respektive låga avläsningar. De nya spädningsfaktorerna ska uppskattas på så sätt att värden för optisk densitet hamnar inom kalibreringskurvans intervall, men spädningar lägre än 1/10 ska inte användas.

VALIDERING AV KALIBRERINGSKURVAMedelabsorbansen för 40 ng/mL MBL-kalibrator bör

Tvätta x3Inkubera 1 t vid RT

100 μL Kalibrator eller spätt prov

Tvätta x3Inkubera 1 t vid RT

100 μL Biotinylerad MBL-Antikropp

Tvätta x3Inkubera 1 t vid RT

100 μL HRP-Streptavidinkonjugat

Inkubera 15min vid RTi mörker

100 μL TMB-Substrat

Avläs vid 450 nm

Späd prover

Låt reagenserna anta rumstemp.

100 μL Stopplösning

Page 64: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

64

MBL Oligomer ELISA Kit

vara >1,5. Medelabsorbansen för en MBL-kalibrator bör vara högre än den för den föregående MBL-kalibratorn, t.ex. absorbans (10 ng/mL MBL) > absorbans (5 ng/mL). Grafen bör vara svagt konvex till vänster när resultaten plottas på linjära axlar.

Punkter utanför linjen för enskilda kalibratorer: En eller flera enskilda kalibratorer kan ge avvikande OD-avläsningar. Ett eller båda av de dubbla värdena kan ligga utanför linjen och medelvärdet kan ligga utanför linjen. Detta fel är signifikant om det försämrar en tillfredsställande kurvanpassning med den 4-parameters logistiska metoden som, på grund av det avvikande värdet, kommer att avvika från de andra kalibratorpunkterna som är korrekta. Kalibratorpunkterna och den anpassade kurvan bör alltid undersökas för korrekt anpassning innan några koncentrationsberäkningar accepteras. En dåligt anpassad kurva kommer också att avslöjas av en hög restkvadratsumma. Om endast en kalibrator är påverkad, som inte är den högsta kalibratorn, kan två åtgärder utföras: i) Ett felaktigt enkel- eller dubbelresultat bör elimineras från kurvan och återstående resultat ska anpassas igen med den 4-parameters logistiska proceduren. Om en tillfredsställande anpassning erhålls kan provisoriska koncentrationsresultat beräknas från den. ii) Om ingen tillfredsställande anpassning erhålls på detta sätt, men kurvan är konsekvent i övrigt, kan provisoriska resultat erhållas från raka linjer mellan medelvärden för dubbelprov och uteslutning av den felaktiga punkten. Om två eller fler kalibratorer påverkas bör analysen göras om. Ett avvikande resultat för en enskild kalibrator kan bero på operatörsfel eller försämring av kalibra-torn. Om båda dubbelvärdena konsekvent ligger utanför linjen i flera analyser är kalibratorn felaktig och bör uteslutas.

SPÅRBARHET FÖR KALIBRATORVÄRDEFastställandet av MBL-värdet utfördes med ELISA för att garantera spårbarheten till interna standarder vid Statens Serum Institut (Danmark).

TOLKNING AV RESULTATHela intervallet för koncentrationer av MBL i serum eller plasma från friska humangivare med denna analys och analoga analyser är 0 till 7000 ng/mL. Värden under 100 ng/mL kan påträffas i O/O-strukturella genotyper (där O = B, C eller D) oavsett promotergenotyp eller i A/O-strukturella genotyper (där A = vildtyp) i kombination med HY/LX- eller LX/LY-promotergenotyper eller i LX/LX-promotergenotypen. Värden mellan 100 ng/mL och 1000 ng/mL kan påträffas i A/O-strukturella genotyper eller i LX/LY- eller LX/LX-promoterge-notyper. Värden över 1000 ng/mL associeras med vildtyp MBL (A/A), även om A/D-heterozygoter ibland kan uppnå denna nivå. HY/HY-promoter-genotypen visar vanligtvis värden över 1500 ng/mL för vildtyp MBL, men sådana värden uppvisas också av andra promotergenotyper i frånvaro av O-strukturella alleler. Kliniska studier har använt cutoff-värden på 50 ng/mL eller 100 ng/mL för definition av allvarlig MBL-brist. Värden under dessa cutoff-värden kan associeras, hos vissa individer, med en anamnes av ökad infektionskänslighet.

KVALITETSKONTROLLLaboratorier som tänker utföra upprepade analyser bör fastställa sina egna kontrollsera för hög (>1000 ng/mL) och låg (<100 ng/mL) avläsning, förvarade i små (t.ex. 50 µL) alikvoter vid -20 °C eller lägre. En alikvot av vardera bör tinas upp och testas i varje analys och registreras för senare resultat. Det fungerar som en kontroll av testprestanda, testin-tegritet och operatörspålitlighet. Resultaten bör undersökas för drivning (tendens att efterföljande resultat stiger eller faller) eller signifikant avvikelse från medelvärdet av föregående resultat. Värden som inte avviker mer än 20% från medelvärdet av föregående resultat kan antas påvisa att analysen är acceptabel. Alikvoter av kontrollserum ska inte frysas ned igen för upprepad analys när de väl har tinats upp och om vidare analys utförs ska färska kontrollalikvoter och spädningar av patientprover användas.

Page 65: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

SE

65

MBL Oligomer ELISA Kit

BEGRÄNSNINGAREn låg koncentration av MBL i serum eller plasma behöver inte nödvändigtvis betyda förekomst av någon sjukdom. Läkare måste tolka signifikansen av MBL-brist i ljuset av varje patients kliniska tillstånd.

FÖRVÄNTADE RESULTAT108 plasmaprover från friska danska blodgivare analyserades i BioPorto Diagnostics MBL-oligomer ELISA. Koncentrationsvärden för MBL fanns i ett intervall från <2 ng/mL till 4443 ng/mL. Medel- och mediankoncentrationer var 1470 ng/mL respektive 1190 ng/mL, med en standardavvikelse (SD) på 1325 ng/mL. 18 prover (16,7%) gav avläsningar under 100 ng/mL, 30 prover (27,8%) gav avläsningar mellan 100 ng/mL och 1000 ng/mL och 60 prover (55,5%) gav avläsningar över 1000 ng/mL.

PRESTANDAEGENSKAPERDetektionsgräns: Den lägsta koncentrationen av MBL som gav en OD-avläsning som var större än 2 SD (standardavvikelser) över medelavläsningen för nollkalibratorn (n = 8) var 0,02 ng/mL, vilken motsvarar en serumkoncentration på 2,0 ng/mL i ett prov spätt 1/100.

Reproducerbarhet inom analyser (inom körning): Två sera kördes i tio replikat för att bestämma reproducerbarheten inom körningar. Följande resultat erhölls (CV = variationskoefficient):

Reproducerbarhet mellan analyser (mellan körningar) (olika dagar/operatörer): Samma två sera kördes dubbelt i fyra olika analyser av minst två operatörer på olika dagar för att bestämma reproducerbarheten mellan körningar. Följande resultat erhölls:

Specificitet: Western blotting av plasma eller plasmafraktioner har inte identifierat andra band som reagerat med antikroppen än de som härrör från MBL. Frånvaron av korsreaktion med andra plasmakomponenter stöds av det faktum att avläsningar som inte kunde skiljas från noll erhölls från annars normala givare med MBL-brist.

FRISKRIVNINGFår endast användas in vitro i vissa länder. Gå till www.bioporto.com för att kontrollera tillgänglighet i ditt land. Detta kit är endast avsedd för in vitro-bestäm-ning av mannan-bindande lectin i humanserum eller -plasma. Kittet är endast avsedd att användas av kvalifi-cerad personal med forsknings- eller diagnostik-funktioner. Om mottagaren av detta kit överlåter den på något sätt till tredje part måste denna instruktion ingå och mottagaren ska på egen risk ansvara för friskrivning för BioPorto Diagnostics A/S räkning. BioPorto Diagnostics A/S ska inte hållas ansvarigt för någon skada eller förlust som orsakas av en annan användning av detta kit än vad som uttryckligen angivits i dessa instruktioner. Ansvarsskyldigheten för BioPorto Diagnostics A/S ska under inga händelser övergå det kommersi-ella värdet för satsen. BioPorto Diagnostics A/S ska inte under några omständigheter hållas ansvarigt för indirekta, särskilda skador eller följdskador inklusive, men inte begränsat till, vinstförlust.

REVISION: MO2010-07-EN-SE

Serum 1 Serum 2

MBL-medelkonc. 2279 ng/mL 28,4 ng/mL

SD 81,2 1,07

CV 3,6% 3,8%

Serum 1 Serum 2

MBL-medelkonc. 2310 ng/mL 29,7 ng/mL

SD 212 1,28

CV 9,2% 4,3%

Page 66: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

66

MBL Oligomer ELISA Kit

Přečtěte si prosím pozorně tyto instrukce

PoužitíMBL oligomer ELISA je souprava pro in vitro detekci oligomerizovaného mannan-vázajícího lektinu v lidském séru nebo plazmě. 

KlinicKé využitíStanovení  MBL  pomáhá  při  určování  náchylnosti k  infekcím,  a  tedy  zjištění  potřeby  agresivní preventivní antibiotické intervence v následujících případech:• Pacienti podstupující (nebo u nichž je zahajována) 

chemoterapii nebou imunosupresivní léčbu• Pacienti s cystickou fibrózou• Děti s rekurentními infekcemiMannan-vázající  lektin  (MBL;  zvaný  také  manózu vázající lektin nebo protein) je multimerní karbohyd-ráty  vázající  protein  produkovaný  v  játrech  a vylučovaný do krve, kde se stává důležitým prvkem vrozené obranyschopnosti jedince proti napadajícím mikroorganismům.  Jeho  normální  oligomerizované formy  jsou  spojeny  se  specifickými  serinovými pro-proteázami  (MASPs),  které  jsou  aktivovány vazbou MBL na karbohydrátové povrchy mikrobů a dále aktivují komplement cestou MBL nebo lektinu1.  Deficience  normálně  oligomerizovaných  forem MBL  může  být  spojena  se  zvýšenou  náchylností k  infekcím  v  době,  kdy  je  získaná  imunita  ještě nezralá  (v  časném  dětství)2, nebo je suprimovaná (po transplantaci orgánů, nebo v průběhu chemote-rapie)3. Deficience  také souvisí s  těžším průběhem autoimunitních  nemocí  jako  je  systémový  lupus erythematosus  (SLE)4 nebo revmatoidní artritida (RA)5, a cystická fibróza s nepříznivou prognózou6.    Deficience  MBL  může  vzniknout  následkem alelických variant v promotorových a/nebo struktu-rálních oblastech MBL genu7. Přítomnost některých promotorových alel souvisí s nižší sérovou koncen-trací  MBL,  zatímco  abnormality  strukturálních  alel poškozují  jak  normální  oligomerizaci  MBL,  tak celkovou  syntézu  řetězce.  Jedinci  homozygotní v  defektech  strukturálních  alel  vykazují  velmi nízké  hladiny  oligomerizovaného  MBL,  zatímco 

heterozygoti pouze nízké. Ze skupiny 100 zdravých dánských  dárců  krve  byly  oligomer-selektivní imunometodou  zjištěny  nízké  hodnoty  (<50  ng/mL) sérové  koncentrace MBL  ve  12  případech.  Bylo  to následkem variability kombinací strukturálních nebo promotorových alel7. Znamená to přítomnost nízkých hladin MBL v západní populaci, která by mohla dát vznik klinickým projevům deficience MBL. Nicméně není  jasné,  proč  pouze  někteří  pacienti  s  nízkými hladinami  MBL  vykazují  zvýšenou  náchylnost k  infekcím;  vysvětlení  zahrnují možnost  vyhnutí  se expozici infekci nebo případnou nutnost koexistence jiné, snad slabé imunodeficience.  Stanovení  koncentrace  MBL  v  séru  může  být užitečné  jako  prognostický  indikátor  pro  vysvětlení suspektních imunitních defektů a jako upozornění na nezbytnost zintenzivnění terapeutických a profylak-tických  kroků  u  imunosuprimovaných  pacientů, zahrnujících  pacienty  prodělávající  chemoterapii, pacienty s cystickou fibrózou, SLE nebo RA.

PrinciP stanoveníJedná se o ELISA metodu prováděnou v mikrodes-tičkách  pokrytých  monoklonální  protilátkou  proti MBL karbohydráty-vázající doméně. Navázaný MBL je detekován  toutéž protilátkou značenou biotinem, následnou reakcí se streptavidinem konjugovaným s  křenovou  peroxidázou  a  inkubací  s  chromogen-ním  substrátem.  Srovnání  výsledků  této  metody  s chromatografií imunoreaktivity MBL u individuálních vzorků  lidského séra ukazuje, že použitá monoklo-nální protilátka je pro MBL oligomer selektivní, je-li použita zároveň jako vázající a detekční. Metoda má čtyři kroky: 1)  Alikvotní  množství  kalibrátorů,  naředě-ných  vzorků  séra  a  všech  kontrol  je  inkubováno  v mikrodestičkách,  které  jsou  pokryty  monoklonální protilátkou proti MBL. MBL přítomný v  roztocích se naváže na protilátkou potažené  jamky prostřednic-tvím svých karbohydráty vázajících domén. Nenavá-zaný materiál je odstraněn promytím. 2)  Do  každé  testovací  jamky  je  přidána biotinylovaná  monoklonální  detekční  protilátka a  inkubována.  Detekční  protilátka  se  váže  na navázané  oligomery  MBL  prostřednictvím  svých 

Page 67: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

67

MBL Oligomer ELISA Kit

karbohydráty  vázajících  domén,  které  nejsou obsazeny vazbou k protilátce. Nenavázaná detekční protilátka je odstraněna promytím. 3)  Do  každé  testovací  jamky  je  přidán streptavidin  konjugovaný  s  křenovou  peroxidázou (HRP-streptavidine)  a  ponechán,  aby  vytvořil komplex  s  navázanou  biotinylovanou  protilátkou. Nenavázaný konjugát je odstraněn promytím. 4)  Do  každé  testovací  jamky  je  přidán chromogenní peroxidázový substrát obsahující tetramethylbenzidin (TMB). Navázaný HRP-strepta-vidin  reaguje  se  substrátem  a  vytváří  zabarvený produkt. Enzymatická reakce je chemicky zastavena a ELISA readerem je změřena barevná intenzita při 450 nm. Barevná intenzita (optická hustota) je funkcí koncentrace  MBL  oligomerových  forem  původně přidaných do každé jamky. Výsledky měření kalibrá-torů slouží pro sestrojení kalibrační křivky, ze které jsou  poté  odvozeny  koncentrace  MBL  v  původním vzorku séra.

PrinciP stanovení

CZ

MBL protilátka

Destičky jsou potažené primární MBL protilátkou. Destičky jsou připraveny k použití.

MBL

Naředěné vzorky a kalibrátory jsou přidány do každé jamky a inkubovány.

Biotinylovaná MBL protilátka

Biotinylovaná detekční protilátka je přidána do každé jamky a inkubována.

Streptavidin – HRP

Streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou je přidán do každé jamky a inkubován.

TMB Substrát

Substrát je přidán do každé jamky. Nech-te reagovat ve tmě po dobu 15 minut.

Stop činidlo je přidáno do každé jamky. Odečtení destičky proveďte do 30 mi-nut.

Kvantitativní výsledky se získají měřením absorbance jamek při vlnové délce 450 nm

Stop činidlo

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Mannan

Plates are precoated with Man-nan. The plates are ready for use

MBL

Diluted samples and calibrators are added to each well and incu-bated

1 hour

B

Biotinylated MBL antibody

Biotinylated detection antibody is added to each well and incuba-ted

1 hour

Streptavidin - HRP

HRP-conjugated streptavidin is added to each well and incuba-ted

1 hour

S

S

SS

TMB Substrate

Substrate is added to each well. Develop for 15 minutes in the dark

15 min.

Stop Solution is added to each well. Read plate within 30 min.

Quantitative results are obtained by measuring the absorbances of the wells at 450 nm

Total assay time lessthan 4 hours

Stop solution

B B

B B

B B

Page 68: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

68

MBL Oligomer ELISA Kit

složení souPravy

Poznámka:  Tekuté  reagencie  obsahují  jako  konzervans  azid sodný,  thimerosal  nebo  Bronidox  L.  Mohou  být  škodlivé  při požití.

Další Potřebný materiál (nedodávaný se soupravou)1.   nastavitelné  mikropipety  pracující  v  rozsahu 

1-1000 µL a odpovídající jednorázové špičky2.   polypropylenové zkumavky s objemem do 1000 µL3.   stojany na zkumavky4.   nastavitelná 8- nebo 12-ti kanálová mikropipeta 

(s  rozsahem  50-250  µL)  nebo  mikropipeta dávkující opakovaně stejná množství (volitelná)

5.   čistý válec se stupnicí do 1 litru6.   deionizovaná nebo destilovaná voda7.   kryt na mikrodestičku8.   čistou nádobku pro naředěný promývací roztok9.   přístroj  pro  plnění  jamek  během  promývací 

procedury (volitelný)10.   papírové ubrousky nepouštějící chloupky nebo 

absorpční papír11.   jednorázové pipetovací kontejnery12.   budík (s rozsahem 60 min)13.   kalibrovaný  reader  ELISA  destiček  schopný 

odečítat při 450 nm (s referenční vlnovou délkou 650 nebo 620 nm)

14.   chlornan sodný (domácí bělidlo v ředění 1:10) pro dekontaminaci vzorků, reagencií a materiálů

uPozorněníPouze pro použití in vitro1.   Tato  souprava  by  měla  být  používána  pouze 

kvalifikovanou laboratorní obsluhou 2.   MBL kalibrátory byly připraveny z MBL purifikova-

ného z lidské plazmy. Každá jednotka krve použitá pro  jejich  přípravu  byla  schválenými  metodami testována a potvrzena negativní na hepatitis B povrchový  antigen  (HBsAg)  a  protilátky  proti  viru lidské  imunodeficience  (HIV)  1  a  2,  a  dále  viru hepatitidy  C  (HCV).  Navíc  byl  výsledný  produkt podroben  virus  deaktivačním  procedurám. Nicméně, protože žádný test není schopen poskyt-nout kompletní důkazy o absenci infekčních agens, mělo by být s kalibrátory a se vzorky od pacientů manipulováno  dle  úrovně  biologické  bezpečnosti číslo 2, tak jak je doporučeno pro každé potenciálně infekční lidské sérum nebo vzorek krve v návodech CDC/NIH  „Bezpečnost  práce  v  mikrobiologických a  biomedicínských  laboratořích“,  1999.  Roztoky obsahující lidské sérum by měly být považovány za potenciálně infekční a podle toho by s nimi mělo být manipulováno.

3.   K předcházení křížové kontaminace používejte pro  každý  vzorek,  kalibrátor  a  reagencii samostatnou pipetovací špičku. 

4.   Pro  každou  reagencii  používejte  samostatnou nádobku, to platí zejména pro TMB substrát.

5.   Po  použití  dekontaminujte  všechny  vzorky, reagencie  a  materiály  namočením  do  roztoku chlornanu  sodného  min.  na  30  min  (domácí bělidlo naředěné 1:10).

6.   K  zamezení  tvorby  kapek  během mytí  aspirujte promývací roztok do lahvičky obsahující bělidlo.

7.   Zabraňte  znečištění  životního  prostředí. Likvidujte nádobky a nepoužité zbytky reagencií v souladu s národními a místními předpisy.

8.   Reagencie v  této  soupravě  jsou konzervovány azidem  sodným  v  koncentraci  až  0,05%, thimerosalem v koncetraci do 0,038% (zvaným také thiomersal, merthiolát) nebo 0,2% Bronido-xem L. Tyto mohou být po pozření toxické.

Položka Obsah Množství

1

12 proužků po 8 jamkách potažených protilátkou proti MBL + rámeček

96 jamek

2 ředicí roztok 1 x 60 mL

3a - 3h MBL kalibrátor 1-8 8 x 1 mL

425x koncentrovaný promývací roztok 1 x 30 mL

5Biotinylovaná protilátka proti MBL 1 x 12 mL

6 HRP-streptavidin 1 x 12 mL

7 TMB substrát 1 x 12 mL

8 Stop činidlo 1 x 16 mL

Page 69: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

69

MBL Oligomer ELISA Kit

9.   Stop činidlo obsahuje 0,5 mol/L kyselinu sírovou a může  způsobit  podráždění  nebo  popáleniny kůže a očí. Jestliže dojde ke kontaktu, okamžitě postižené  místo  opláchněte  proudem  vody  a vyhledejte lékařskou pomoc.

10.   Nezaměňujte součásti souprav z různých šarží. Komponenty  jsou  standardizovány  jednotlivě pro každou šarži.

11.   Hemolytické  nebo  vysoce  lipemické  vzorky mohou způsobit nesprávné výsledky.

12.   Neřeďte vzorky sér přímo v jamkách mikrodes-tiček.

13.   Nedotýkejte  se  a  nepoškrábejte  dno  jamek  v mikrodestičkách  při  pipetování  nebo  aspiraci tekutiny.

14.   Jiné než zde uvedené inkubační doby a teploty mohou způsobit nesprávné výsledky. 

15.   Jakmile  jednou  začnete  provádět  metodu, nenechejte vyschnout jamky mikrodestiček.

16.   TMB substrát je citlivý na světlo. Uchovávejte jej mimo přímé světlo.

17.   Jakmile  jednou  rozlijete  jakékoliv  reagens, nevracejte  je  do  jejich  lahviček  zpět;  použité mikrodestičky nepoužívejte znovu. 

stabilita a uchovávání1.   Uchovávejte soupravu se všemi reagenciemi při 

teplotě 2-8°C. Nezmrazujte ji.2.   Použijte  všechny  reagencie  před  uplynutím 

exspirační doby uvedené na etiketě lahvičky.3.   Naředěný promývací roztok je stabilní při teplotě 

2-8°C 4 týdny. Pokud nepoužijete všechny jamky, nařeďte si pouze část promývacího roztoku.

4.   Pro  následné  použití  jednotlivých  proužků mikrodestiček vložte nepoužité proužky zpět do původního obalu s desikantem a znovu zalepte. Před otevřením nechte vždy obal s destičkami vytemperovat  na  laboratorní  teplotu,  aby  se zabránilo kondenzaci vlhkosti v/na jamkách.

oDběr vzorKůzacházejte se všemi vzorky krve, séra nebo plazmy jako s potenciálně infekčními. viz. upozor-nění, body 2, 3, 5, 6 a 7.Stanovení  MBL  v  jednom  vzorku  vyžaduje  5-50 

µL  séra  nebo  plazmy.  Vzorky  krve  by  měly  být odebírány  asepticky  do  obyčejných  nebo  heparini-zovaných zkumavek kvalifikovanou osobou schvále-ným  způsobem  odběru  krve.  Sérum  nebo  plazma by  měly  být  zpracovány  standardními  technikami pro  klinické  laboratorní  testování.  Uzavřete  vzorky zátkou a pro stanovení do 24 hodin je uchovejte při teplotě  2-8°C.  Nebude-li  měření  provedeno  do  24 hodin, nebo musí-li být vzorek poslán do laboratoře, uzavřete zkumavku zátkou a uchovejte zmražené na teplotu -20°C nebo nižší. Vyhněte se opakovanému zamrazování a rozmrazování. Nepoužívejte hemoly-tické,  vysoce  lipemické,  tepelně  ošetřené  nebo kontaminované vzorky.

PříPrava reagencií a vzorKů1.   Před  zahájením  měření  ponechte  všechny 

vzorky a reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu (20-25°C). Důkladně promíchejte vzorky jemným  obracením  a  je-li  to  nutné,  odstraňte viditelné pevné částice šetrnou nízkorychlostní centrifugací.

2.   Určete  počet  vzorků,  který  budete  testovat  (v dubletech)  plus  počet  vzorků  potřebných  pro vnitřní  laboratorní  kontrolu  (v  dubletech),  plus počet  jamek  pro  blanky.  Mikrojamky  mohou být  použity  ve  stripech  po  8  nebo  jednotlivě. Jednotlivé jamky se vylomí ze stripu a umístí se do rámečku na vhodné místo. Písmena a zářezy na  jamkách  slouží  k  identifikaci  jednotlivých jamek.  Přidejte  16  jamek  pro  8  kalibrátorů  (v dubletech).  Vyjměte  potřebný  počet  proužků, zbytek  v  hliníkové  fólii  nahraďte  desikantem a uchovejte při  teplotě 2-8°C.  

3.   Promývací  roztok: Nařeďte 25x koncentrovaný promývací  roztok  vylitím  celkového  objemu lahvičky  (30  mL)  do  válce  (kalibrovaného  do objemu 1l) a přidejte destilovanou nebo deioni-zovanou vodu do výsledného objemu 750 mL. Důkladně  promíchejte  a  uchovejte  při  teplotě 2-8°C.

4.   Ředicí roztok: Připraven k použití, dále neředit.5.   MBL kalibrátory: Připraveny k použití. Příslušné 

koncentrace  jsou  uvedeny  na  etiketách.  Dále neředit.

CZ

Page 70: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

70

MBL Oligomer ELISA Kit

6.   Biotinylovaná  MBL  protilátka:  Připravena  k použití, dále neředit..

7.   HRP-streptavidin konjugát: Připraven k použití, dále neředit..

8.   TMB substrát: Připraven k použití, dále neředit.9.   Stop činidlo: Připraveno k použití, dále neředit.10.   Vzorky  pacienta:  Nařeďte  každý  vzorek  s 

ředicím roztokem tak, aby jste získali minimálně 250 µL naředěného  roztoku,  který může být  v dubletech  připraven  do  jamek  v množství  100 µL  na  jamku. Pro  počáteční  screening  většiny vzorků  je  doporučováno  ředění  1:100  (např.  5 µL séra + 495 µL ředicího roztoku, promícháno obracením  nebo  pomalým  vortexováním), které je následováno přeměřením více či méně naředěných  vzorků  (jak  je  nutno)  u  výsledků ležících  mimo  měřící  rozsah  metody.  Ředění nižší než 1/10 by nemělo být používáno.

PostuP měření1.   Připravte  si  protokol metody  a  přiřaďte  v  něm 

příslušné  jamky  kalibrátorům,  naředěným vzorkům  séra  a  veškerým  laboratorním kontrolám  v  dubletech.  Jestliže  na  ELISA readeru není dostupná referenční vlnová délka 620 nebo 650 nm, může být přiřazena jamka pro blank. Ten  je  připraven napipetováním 100 µL ředicího  roztoku místo  naředěného  séra  nebo plazmy  a  dále  je  postupováno  stejně  jako  u ostatních jamek.

2.   Napipetujte  100  µL  objemu  každého  kalibrá-toru, naředěných vzorků a všech laboratorních kontrol  do  patřičných  pozic  v  mikrodestičce. Zakryjte jamky a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě na třepačce nastavené na rychlost 200/min.

3.   Odsajte  obsah  jamek  a  třikrát  je  promyjte naředěným  promývacím  roztokem  v  množství minimálně  300  µL/jamka.  Promýváte-li  jamky manuálně,  vyprázdněte  jamky  otočením destičky  a  jemným  vytřepáním  jejího  obsahu do  vhodného  kontejneru,  a  následně  osušte takto  otočenou  destičku  papírovým  ručníkem. Minimálně před posledním promývacím cyklem je  doporučeno  před  vyprázdněním  jamek  cca 

1  min  počkat.  Energičnost,  s  jakou  je  plněn nebo  odstraňován  promývací  roztok  z  jamek, ovlivňuje  vývoj  finálního  zabarvení.  Manuální pipetování,  které může být velmi  jemné a vést ke vzniku intenzivního zabarvení, je doporučo-váno pouze při absenci alternativ jako je plnění jamek  ponořením  multikanálového  manuál-ního  promývacího  automatu,  nebo  používání automatického promývacího přístroje.

4.   Napipetujte  do  každé  jamky  100  µL  biotinylo-vané MBL protilátky (připravené k použití). Může být  použita  multikanálová  pipeta  nebo  pipeta dávkující  opakovaně  stejná  množství.  Zakryjte jamky a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě na třepačce nastavené na rychlost 200/min.

5.   Promyjte tak, jak je popsáno výše v bodě 3.6.   Napipetujte  do  každé  jamky  100  µL 

HRP-streptavidin  konjugátu  (připraveného k  použití).  Může  být  použita  multikanálová pipeta nebo pipeta dávkující opakovaně stejná množství. Zakryjte  jamky a  inkubujte 60 minut při pokojové teplotě na třepačce nastavené na rychlost 200/min.

7.   Promyjte tak, jak je popsáno výše v bodě 3.8.   Napipetujte  do  každé  jamky  100  µL  TMB 

substrátu  (připraveného  k  použití).  Z  důvodu úspory  času  je  doporučeno  použití multikaná-lové pipety. Zakryjte  jamky a  inkubujte přesně 15 minut při pokojové teplotě v temnu. Zapněte odpočítávání, když plníte první jamku.

9.   Přidejte  100  µL  Stop  činidla  (připraveného  k použití)  do  každé  jamky,  a  dodržujte  stejný pipetovací  postup  a  rychlost  jako  v  kroku  7. Promíchejte  jemným  protřepáváním  cca  20  s, vyhněte se vystříknutí obsahu z jamek. Během 30 minut změřte absorbanci jamek.

10.   Absorbanci jamek měřte při vlnové délce 450 nm na vhodném readeru mikrodestiček (referenční vlnová  délka  620  nebo  650  nm).  Jestliže  není k dispozici žádná referenční vlnová délka, pak absorbance jamky obsahující blank je odečtena od  každé  jednotlivé  naměřené  absorbance ostatních  jamek  předtím,  než  jsou  provedeny jakékoliv další kalkulace.

Page 71: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

71

MBL Oligomer ELISA Kit

schématicKý PřehleD

výPočet výsleDKůZákladním  principem  je  vytvoření  kalibrační  křivky vynesením  průměrů  získaných  hodnot  absorbancí MBL kalibrátorů měřených v dubletech na osu Y proti odpovídající koncentraci MBL v ng/mL vynesených na 

osu  X.  Kalibrační  křivka  musí  respektovat  validační požadavky.  Koncentrace MBL  v  každém  naředěném vzorku séra je poté zjištěna nalezením místa na křivce odpovídajícím průměrné hodnotě absorbancí naředě-ného vzorku séra a zjištěním odpovídající koncentrace v  ng/mL  na  ose  X.  Koncentrace  MBL  v  neředěném vzorku séra je vypočítána vynásobením této hodnoty dilučním faktorem.  Tato  metoda  může  být  prováděna  manuálně použitím  milimetrového  papíru  s  vynesenými  osami X a Y. Skrz body může být nakreslena plynulá křivka nebo  mohou  být  vedle  sebe  ležící  body  spojeny přímkami.  Druhý  způsob  může  mírně  nadhodnotit hodnoty  koncentrací  mezi  body,  je-li  křivka  mírně konvexní vlevo, což je typické zjištění. Ačkoli se křivka může  podobat  přímé  lince,  je  prakticky  i  teoreticky nesprávné počítat a nakreslit přímou nejvíce vyhovu-jící linku a odečítat výsledky z ní.  Metoda  může  být  prováděna  také  za  použití softwarového programu ELISA readeru, který dokáže vytvářet kalibrační křivky. Metodou volby k sestavení křivky je 4-parametrová funkce za použití lineární X a Y osy.  Naředěné  vzorky  dávající  střední  hodnotu absorbance vyšší než hodnotu absorbance kalibrátoru o  koncentraci  40  ng/mL,  resp.  nižší  než  hodnotu absorbance kalibrátoru o koncentraci 0,5 ng/mL  jsou mimo měřící rozsah a jejich koncentrace by měla být uváděna  jako  >40ng/mL,  resp.  <0,5  ng/mL. Odpoví-dající koncentrace neředěných sér jsou vypočítávány jako >(40 x diluční faktor) ng/mL, resp. <(0,5 x diluční faktor) ng/mL. Tyto vzorky by měly být přeměřeny ve vyšších, resp. nižších ředěních (pro vzorky s vysokou, resp. nízkou absorbancí). Nové diluční faktory by měly být odhadnuty tak, aby výsledné hodnoty absorbance ležely v rozmezí kalibrační křivky; neměla by však být používána ředění nižší než 1/10.

sestavení Kalibrační KřivKyStřední  hodnoty  absorbance  pro  kalibrátory  o obsahu 40 ng/mL by měly být >1,5. Střední hodnota absorbance každého dalšího MBL kalibrátoru by měla být  vyšší  než  hodnota  pro  předešlý  MBL  kalibrátor, např.  absorbance  (10  ng/mL  MBL)  >  absorbance (5  ng/mL MBL).  Kalibrační  křivka  by měla  být  lehce 

Promyjte 3xInkubujte 1h připokojové teplotě

100 μL kalibrátoru nebo naředěného vzorku

Promyjte 3xInkubujte 1h připokojové teplotě

100 μL Biotinylované MBL protilátky

Promyjte 3xInkubujte 1h připokojové teplotě

100 μL HRP-Streptavidinu

Inkubujte 15minpři pokojovéteplotě ve tmě

100 μL TMB substrátu

Změřte absorbance při 450 nm

Nařeďte vzorky

Nechte reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu

100 μL Stop činidla

CZ

Page 72: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

72

MBL Oligomer ELISA Kit

konvexní  doleva  pokud  jsou  výsledky  vynášeny  na lineární osy.

hodnoty kalibrátorů ležící mimo rozmezí: Jeden nebo  více  jednotlivých  kalibrátorů  může  vykazovat abnormální  hodnoty  absorbance.  Jedna  nebo  obě hodnoty dubletu mohou být mimo rozmezí, a průměr hodnot  dubletů může být mimo  rozmezí. Tato  chyba je  významná,  pokud  ovlivňuje  uspokojivé  vytvoření kalibrační  křivky  pomocí  4-parametrové  funkce, která  je  následkem  abnomální  hodnoty  odchýlena od  ostatních  vynesených  hodnot  kalibrátorů,  které jsou  ve  skutečnosti  správné.  Správnost  vynesených hodnot kalibrátorů a vytvořená křivka by měly být před jakýmikoliv  kalkulacemi  koncentrací  vždy  prověřeny. Špatně  vytvořená  křivka  se  také  projevuje  vysokou hodnotou R2. Je-li ovlivněn pouze  jeden kalibrátor  (a není-li nejvyšším kalibrátorem), existují 2 možnosti:  i)  Z  bodů  tvořících  křivku  by  měla  být  elimino-vána nesprávná hodnota, a ostatní zbývající hodnoty použity k vytvoření nové křivky 4-parametrovou funkcí. Je-li dosaženo uspokojivého výsledku, mohou z ní být provizorně odvozeny koncentrace vzorků.  ii)  Jestliže  není  možno  tímto  způsobem  získat uspokojivou  křivku,  ale  křivka  je  jinak  konzistentní, mohou  být  prozatímní  výsledky  získány  z  přímých úseček  vedených  průměry  dubletů  s  vynecháním nesprávného bodu. Jestliže jsou špatné hodnoty dvou nebo více kalibrá-torů, mělo by být měření zopakováno. Odlišný výsledek u některého z kalibrátorů může být následkem chyby laboranta nebo vadného kalibrátoru. Jestliže jsou obě hodnoty měření v dubletu opakovaně mimo  linii  hodnot,  je  kalibrátor  vadný  a  měl  by  být vynechán.

návaznost KalibrátoruStanovení hodnoty koncentrace MBL kalibrátoru bylo zajištěno  pomocí  ELISA  stanovení  v  návaznosti  na interní standardy v Statens Serum Institutu (Dánsko). interPretace výsleDKůRozmezí  koncentrací  MBL  v  plazmě  nebo  séru zdravých  lidských  dárců  krve,  které  bylo  naměřeno touto metodou nebo analogickými metodami, je

0-7000 ng/mL. Hodnoty menší než 100 ng/mL mohou být zachyceny při strukturálním genotypu O/O (O=B, C, nebo D) bez ohledu na promotorový genotyp, nebo při  A/O  strukturálních  genotypech  (kdy  A  =  divoký typ) v kombinaci s HY/LX nebo LX/LY promotorovými genotypy, nebo při LX/LX promotorových genotypech. Hodnoty  mezi  100  ng/mL  a  1000  ng/mL mohou  být zachyceny u A/O strukturálních genotypů nebo LX/LY nebo LX/LX promotorových genotypů. Hodnoty vyšší než 1000 ng/mL souvisejí s divokým typem MBL (A/A), ačkoli  heterozygoti  s  genotypem  A/D  mohou  také příležitostně  dosáhnout  těchto  hodnot.  Promotorový genotyp HY/HY divokého  typu MBL  typicky vykazuje hodnoty nad 1500 ng/mL, ale takové hodnoty jsou také charakteristické  pro  ostatní  promotorové  genotypy s absencí O strukturálních alel.  Klinické studie používaly pro definici těžké defici-ence MBL hodnoty cut-off 50 ng/mL nebo 100 ng/mL. Hodnoty nižší než tyto cut-off mohou být u některých jedinců  spojeny  s  anamnézou  zvýšené  náchylnosti k infekcím.

Kontrola KvalityLaboratoře  provádějící  tuto  metodu  opakovaně by  měly  vyrobit  svá  vlastní  kontrolní  séra  s  nízkou absorbancí  (méně  než  100  ng/mL)  a  vysokou absorbancí  (více  než  1000  ng/mL)  a  uchovávat  je v  alikvotních množstvích  cca  50  µL  při  teplotě  -20°C nebo  nižší.  Alikvotní  množství  každého  kontrolního séra by mělo být rozmraženo a změřeno při každém jednotlivém  měření  a  záznam  o  tom  uschován.  To slouží  jako  kontrola  kvality  testu,  neporušenosti testu a věrohodnosti laboranta. Výsledky by měly být přešetřeny na posun (tendence následných výsledků růst nebo klesat), nebo významné kolísání od průměrů předchozích měření. Výsledky neodchylující se o více než  20%  od  průměrů  předchozích  měření  mohou být  považovány  za  indikátory  přijatelnosti  testu. Uschovaná  alikvotní  množství  kontrolních  sér  by neměla být opakovaně rozmrazována pro opakovaná měření,  byla-li  již  jednou  zmrazena.  Jestliže  je prováděno nové měření, měly by být použity čerstvé vzorky kontrol a čerstvá ředění vzorků pacienta.

Page 73: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

73

MBL Oligomer ELISA Kit

omezeníNízké  množství  MBL  v  séru  nebo  plazmě  nemusí nezbytně  znamenat  přítomnost  jakéhokoliv  onemoc-nění. Lékaři musí interpretovat významnost deficience MBL  v  porovnání  s  klinickým  obrazem  každého pacienta.

očeKávané výsleDKySoupravou BioPorto Diagnostics MBL oligomer ELISA   bylo v Dánsku vyšetřeno 108 vzorků plazmy od  zdravých  dárců  krve.  Hodnoty  koncentrace  MBL se pohybovaly od <2 ng/mL do 4443 ng/mL. Průměr, resp. medián koncentrace MBL byly 1470 ng/mL, resp. 1190 ng/mL, se standardní odchylkou (SD) 1325 ng/mL. 18 vzorků (16,7%) mělo hodnoty <100 ng/mL, 30 vzorků (27,8%) mělo hodnoty mezi 100 ng/mL a 1000 ng/mL, a 60 vzorků (55,5%) mělo hodnoty >1000 ng/mL. 

charaKteristiKa metoDyDetekční limit: Nejnižší  koncentrace  MBL  dávající hodnoty  absorbance  větší  než  2  SD  nad  průměrné hodnoty nulového kalibrátoru  (n=8) byla 0,02 ng/mL, odpovídající sérové koncentraci 2 ng/mL ve vzorku ředěném 1/100.

reprodukovatelnost intra-assay: Za  účelem stanovení  Intra-assay  reprodukovatelnosti  bylo  10x zopakováno  měření  dvou  vzorků  sér.  Byly  získány následující výsledky (CV = koeficient variability):

reprodukovatelnost inter-assay: Pro  zjištění Inter-assay  reprodukovatelnosti  byla  měřena  stejná dvě  séra  v  dubletu  při  čtyřech  různých  stanoveních provedených dvěma laboranty v jiný den. Byly získány následující výsledky:

specificita: Testováním  plazmy  nebo  plazmatických frakcí Western Blotem nebyly zjištěny vazby s  jinými protilátkami  než  protilátkami  proti  MBL.  Absence křížových  reakcí  s  ostatními  komponentami  plazmy je  podporována  tím,  že  absorbance  blízké  nule  jsou získávány  od  některých  MBL  deficitních,  ale  jinak normálních dárců.

omezeníPro in vitro  použití  pouze  ve  vybraných  zemích. Informaci ohledně dostupnosti ve vaší zemi naleznete na www.bioporto.com.  Tato  souprava  je  určena  pouze  k  in  vitro stanovení mannan-vázajícího lektinu v lidském séru nebo plazmě.  Souprava je určena k používání pouze kvalifiko-vaným  personálem  provádějícím  výzkum  nebo  jiné diagnostické aktivity.  Jestliže  příjemce  této  soupravy  předává  tuto soupravu  jakýmkoli  způsobem  třetí  osobě,  musí  být informace o  tom přiloženy a příjemci  sděleno,  že by měl  v  zájmu BioPorto Diagnostics A/S  dodržovat  na vlastní odpovědnost všechna omezení a závazky zde uvedené.  BioPorto  Diagnostics  A/S  nebude  odpovědný za  jakékoliv  poškození  nebo  ztráty  vzniklé  užíváním soupravy  jakkoliv  jinak,  než  je  výslovně  uvedeno v těchto instrukcích.  Plnění  závazků  BioPorto  Diagnostics  A/S v  žádném  případě  nepřekročí  komerční  hodnotu soupravy.   BioPorto  Diagnostics  A/S  za  žádných  okolností nezodpovídá  za  vedlejší,  zvláštní  nebo  následné poškození, včetně (ovšem nikoliv výlučně) zisků a ztrát.

revision: mo2010-07-en-cz

Sérum 1 Sérum 2

Střední  koncentrace MBL 2279 ng/mL 28,4 ng/mL

SD 81,2 1,07

CV 3,6% 3,8%

Sérum 1 Sérum 2

Střední  koncentrace MBL 2310 ng/mL 29,7 ng/mL

SD 212 1,28

CV 9,2% 4,3%

CZ

Page 74: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

74

MBL Oligomer ELISA Kit

REFERENCESLITERATURRÉFÉRENCESBIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFÍAREFERENCERREFERENSERoDKazy

1. Turner MW (1998) Mannose-binding lectin (MBL) in health and disease. Immunobiology 199:327-339.

2. Koch A, Melbye M, Sorensen P, Homoe P, Madsen HO, Mølbak K, Hansen CH, Andersen LH, Hahn GW, Garred P (2001) Acute respira-tory tract infections and mannose-binding lectin insufficiency during early childhood. JAMA 285:1316-1321.

3. Peterslund NA, Koch C, Jensenius JC, Thiel S (2001) Association between deficiency of mannose-binding lectin and severe infections after chemotherapy. Lancet 358:637-638.

4. Garred P, Voss A, Madsen HO, Junker P (2001) Association of mannose-binding lectin gene variation with disease severity and infections in a population-based cohort of systemic lupus erythematosus patients. Genes Immun 2:442-450.

5. Saevarsdottir S, Vikingsdottir T, Vikingsson A, Manfredsdottir V, Geirsson AJ, Valdimarsson H (2001) Low mannose binding lectin predicts poor prognosis in patients with early rheuma-toid arthritis. A prospective study. J Rheumatol 28:728-734.

6. Garred P, Pressler T, Madsen HO, Frederiksen B, Svejgaard A, Hoiby N, Schwartz M, Koch C (1999) Association of mannose-binding lectin gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J Clin Invest 104:431-437.

7. Steffensen R, Thiel S, Varming K, Jersild C, Jensenius JC (2000) Detection of structural gene mutations and promoter polymorphisms in the mannan-binding lectin (MBL) gene by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. J Immunol Methods 241:33-42.

Page 75: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

75

MBL Oligomer ELISA Kit

REF

Page 76: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

76

MBL Oligomer ELISA Kit

Catalogue number BestellnummerRéférence du catalogueNumero di catalogoNúmero de catálogoKatalognummerKatalognummerKatalogové číslo

In vitro diagnostic medical deviceIn-Vitro-DiagnostikumDispositif médical de diagnostic in vitroDispositivo medico-diagnostico in vitroProducto sanitario para diagnóstico in vitroMedicinsk udstyr til in vitro-diagnostikMedicintekniska produkter för in vitro diagnostik In Vitro diagnostický zdravotnický prostředek

Batch code ChargenbezeichnungCode du lotCodice del lottoCódigo de loteLotnummer Lot nummer Číslo šarže

Valid version of instructionsGültige Version der AnleitungVersion valide des instructionsVersione valida delle istruzioniVersión válida de las instruccionesGældende udgave af instruktionenGilttiga versionen av anvisningar Platná verze návodu

Consult instructions for useGebrauchsanweisung beachtenConsulter les instructions d’utilisationConsultare le istruzioni per l’usoConsulte las instrucciones de usoSe brugsanvisningSe handhavandebeskrivningen Viz návod k použití

European ConformityCE-KonformitätskennzeichungConformité aux normes européennesConformità europeaConformidad europeaEuropæisk overensstemmelseEuropeisk översensstämmelseEvropská shoda

Use byVerwendbar bisUtiliser jusqueUtilizzare entroFecha de caducidadAnvend førAnvänd förePoužitelné do

ManufacturerHerstellerFabricantFabbricanteFabricanteFabrikantTillverkareVýrobce

Keep away from sunlightVor Sonnenlicht schützenNe pas exposer aux rayons solairesEvitare l’esposizione alla luce del soleMantener fuera de la luz solarMå ikke udsættes for sollysUtsätts ej för direkt solljusChraňte před slunečním svĕtlem

Temperature limitation TemperaturbegrenzungLimites de températureLimiti di temperaturaLímite de temperaturaTemperaturbegrænsningTemperaturbegränsningTeplotní rozmezí od do

REF

IVD

LOT

IFU

2˚C

8˚C

Page 77: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

77

MBL Oligomer ELISA Kit

WASH SOLUTION 25X

Do not reuseNicht zur wiederverwendungNe pas réutiliserNon riutilizzareNo reutilizarMå ikke genbrugesÅteranvänd ejPro jednorázové použití

Caution, consult accompanying documentsAchtung, Begleitdokumente beachtenAttention, voir notice d’instructionsAttenzione, vedere le istruzioni per l’usoAtención, ver instrucciones de usoForsigtig, se brugsanvisningFörsiktighet, se handhavandebeskrivningenUpozomĕní viz přiložená dokumentace

Biological riskBiogefährdungRisques biologiquesRischio biologicoRiesgo biológicoBiologisk fareBiologisk riskBiologicky nebezpečné

Do not use if package is damagedInhalt beschädigter Packung nicht verwendenNe pas utiliser si l’emballage est endommagéNon utilizzare se la confezione è danneggiataNo usar si el paquete está dañadoMå ikke anvendes hvis emballagen er beskadigetAnvänd inte om förpackningen är skadadNepoužívejte, je-li obal poškozen

Concentrated Wash Solution. Dilute before use. Konzentrierte Waschlösung. Vor Gebrauch verdünnen.Solution de bain concentrée. Diluer avant usage. Soluzione di lavaggio concentrata. Diluire prima dell’uso.Tampón de lavado concentrado. Diluir antes de usar. Vaskeopløsningskoncentrat. Fortyndes før anvendelse.Koncentrerad tvättlösning. Späd före användning. Koncentrat promyvaciho roztoku. Pred pouzitim zredte.

Page 78: MBL Oligomer ELISA Kit EN MBL Oligomer DE ELISA Kit - …ngal.com/media/75463/kit_029_ifu_ivd.pdf · MBL Oligomer ELISA Kit IVD KIT 029 Diagnostics EN DE FR IT ES DA SE CZ. 2 Please

MBL Oligomer ELISA Kit

1005

0/03

2014

/E ·

Rev

isio

n 20

14-0

3

MBL Oligomer ELISA Kit

BioPorto Diagnostics A/STuborg Havnevej 15, st.DK-2900 HellerupDenmark

Phone (+45) 4529 0000Fax (+45) 4529 0001E-mail [email protected] www.bioporto.com

Diagnostics