Materila de Estudio Libros  Alberts, Molecular Biology of the Cell  Lodish, Molecular Cell Biology

Artículos  Thomas D. Pollard, et al. Actin, a Central Player in Cell Shape and Movement. Science 326, 1208 (2009)  Thomas D. Pollard, et al. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell 112, 453–465 (2003)  Ronald D. Vale, et al. The Way Things Move: Looking Under the Hood of Molecular Motor Proteins. Science 288, 88 (2000)   Andre P. Carter. Crystal clear insights into how the dynein motor moves. Journal of Cell Science 126, 705–713 (2013)  Hancock. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology (2014)

iBioseminars JULIE THERIOT: CELL MOTILITY AND THE CYTOSKELETON Protein Polymers, Crawling Cells and Comet Tails: http://www.ibiology.org/ibioseminars/cell-biology/julie-theriot-part-1.html THOMAS POLLARD: CELL MOTILITY AND CYTOKINESIS I.  Mechanism of cell motility 1: http://www.ibiology.org/ibioseminars/thomas-pollard-part-1.html II.  Mechanism of cell motility 2: http://www.ibiology.org/ibioseminars/thomas-pollard-part-2.html

RON VALE: MOLECULAR MOTOR PROTEINS Molecular Motor Proteins: http://www.ibiology.org/ibioseminars/cell-biology/ron-vale-part-1.html

Propiedades generales del citoesqueleto

  El citoesqueleto es un sistema subcelular formado por filamentos poliméricos proteicos y proteínas accesorias   Los polímeros son de naturaleza dinámica   L o s p o l í m e r o s e n s a m b l a n estructuras de mayor orden y complejidad   Es capaz de generar trabajo mecánico   Cumple una función estructural en las células   Es esencia l para el tráf ico intracelular y la motilidad celular

microvellosidades

fibras de estrés

sarcómeros

Diferentes estructuras formadas por el citoesqueleto. Microfilamentos

Alberts et al., MBC2002

• • • • 

Diferentes estructuras formadas por el citoesqueleto. Microtúbulos

Hirokawa´s lab

vesícula

microtúbulos

Moléculas Motoras convierten la energía de la hidrólisis de ATP en fuerza mecánica que puede mover organelas a lo largo de los filamenteos

Alberts et al., MBC2002 MTs de interfase MTs del huso

axonemas

huso mitótico

célula en interfase

Microtúbulos: •  cilindros formados por tubulina •  rígidos y largos •  MTOC

Diferentes estructuras formadas por el citoesqueleto. Filamentos intermedios

Alberts et al., MBC2002

IFs de procesos gliales

IFs de células epiteliales

malla de laminas

Filamentos intermedios: •  fibras formadas por proteínas de filamentos intermedios •  resistencia mecánica •  pueden mantener juntas a las células epiteliales, ayudan en la extensión de axones

neuronales, o permiten formar uñas o pelo

Células motiles o migratorias requieren un citoesqueleto dinámico

VIDEO 10

La fagocitosis de bacterias depende del rearreglo del citoesqueleto de las células fagocíticas especializadas (macrófagos y neutrófilos)

Los procesos de motilidad celular están conservados a través de protozoarios y eucariotas

Acanthamoeba y macrófagos capturan microorganismos mediante un proceso de fagocitosis dependiente de la polimerización de actina que involucra la formación de seudópodos y la motilidad celular

https://www.youtube.com/watch?v=qBIdfJEJMK0

Los filamentos del citoesqueleto son polímeros dinámicos

Alberts et al., MBC2002

El ensamblado repetitivo de subunidades pequeñas resulta en la formación de polímeros: •  actina microfilamentos •  tubulina microtúbulos •  varias subunidades filamentos

intermedios Las subunidades se meantienen unidas en el polímero mediante interacciones no covalentes débiles Proteínas accesorias asociadas al citoesqueleto regulan la distribución espacial y el comportamiento dinámico de los filamentos La polimerización/depolimerización de los filamentos permite rápidos ajustes de la estructura del citoesqueleto y de la forma celular

La actina es una proteína globular de 375 aminoácidos (43 kDa). Sitios de unión en los monómeros de actina (G-actina) median la interacción cabeza-cola con otros dos monómeros para polimerizar filamentos de actina (F-actina). Los filamentos están formados por dos protofilamentos que se mantienen unidos a travás de contactos laterales. La orientación constante de los monómeros en los polímeros determina su polaridad estructural [extremos (+) y (-)].

Estructura cristalina del monómero de actina

(difracción de rayos X)

Filamento de actina (microscopía electrónica)

Estructura de la actina globular y filamentosa

Estudios in vitro revelan las propiedades dinámicas de los polímeros

Preparaciones de actina soluble purificadas de músculo esquelético polimerizan espontáneamente a concentraciones fisiológicas de iones. La cinética de polimerización de actina puede ser mon i to reada i n v i t r o po r v i scos ime t r í a , sedimentación, espectroscopía de fluorescencia o microscopía.

visc

osid

ad

tiempo

sin Mg2+

sin Ca2+

La fluorescencia del polímero de actina marcada con pireno es 7-10 veces más grande que la del monómero y la señal es proporcional a la concentración en masa del polímero.

tiempo

fluor

esce

ncia

Espectroscopía de fluorescencia

Viscosimetría

Cinética de polimerización de actina

Durante una fase inicial se forman pequeños núcleos (fase de nucleación) y luego la polimerización incrementa linealmente en función del tiempo (fase de elongación) hasta alcanzar un estado estacionario donde la masa del polímero permanece constante. La concentración de monómeros en el estado estacionario es la concentración crítica o Cc; concentraciones mayores o menores a la Cc inducen el aumento o disminución de la masa del polímero, respectivamente.

NUCLEACIÓN

Alberts et al., MBC2002

La tasa de adición de monómeros está dada por la constante de velocidad kon (M-1 sec-1) y la tasa de pérdida por koff (sec-1). El número de monómeros que se adicionan al polímero por segundo es proporcional a la concentración de subun idades l i b res (k onC ) , pe ro l as subunidades dejan el extremo del polímero a una velocidad constante (koff) que no depende de la concentración.

Concentración crítica A medida que el polímero crece, C cae hasta alcanzar un valor constante, concentración crítica (Cc). En este equilibrio,

konC = koff por lo tanto En un extremo del polímero, a la Cc la velocidad de adición es igual a la velocidad de depolimerización y no hay elongación neta.

Cc =koff

kon

=1K

+ polímero (con n subunidades) subunidad polímero (con n + 1 subunidades) d

kon

koff

Constantes de velocidad de adición y pérdida de monómeros

La reacción acrosomal del esperma de cangrejo extiende fascícuos de actina que sirven de núcleos para la reacción de polimerización in vitro

proceso acrosomal

(fascículos de F-actina)

Microscopía de campo claro de esperma del cangrejo Limulus no reactivo (1a) y luego de la reacción acrosomal (1b)

Los filamentos de actina son polímeros polares

La polaridad de los microfilamentos de actina puede determinarse mediante microscopía electrónica después de incubar los polímeros con fragmentos S1 de miosina.

(+) (-)

Microscopía electrónica de la polimerización de filamentos de actina en los extremos (+) y (-) de un proceso acrosomal de Limulus. Las constantes de velocidad se calculan a partir de la medida de la longitud de los fascículos de filamentos de actina.

long

itud

(μm

)

tiempo

(+)

(-)

Las constantes de velocidad de adición y pérdida de monómeros son diferentes en los extemos (+) y (-) del polímero

Pollard (1986) JCB 103: 2747-2754

Las constantes de velocidad de adición y pérdida de monómeros son diferentes en los extemos (+) y (-) del polímero

Pollard (2009) Science

La tasa de elongación en el extremo (+) es de 12 μM−1 s−1. Para actina en forma T (actina ATP-Mg) la Cc es menor en el extremo (+) (0,1 µM) que en el extremo (-) (0,6 µM). En el polímero de actina ocurre la hidrólisis irreversible de ATP y el cambio conformacional asociado es responsable de la diferencia en las tasas de asociación y disociación de los dos extremos. En el extremo (+) las subunidades de actina en forma D (actina-ADP) se disocian más rápido que las subunidades en forma T, y las dos formas de actina se disocian lentamente en el extremo (-).

La actina es una enzima con actividad ATPasa Cuando el filamento crece, en el extremo (+) la elongación es más rápida que la hidrólisis. Las subunidades del extremo (+) se encuentran en forma T. La hidrólisis es más rápida que la elongación en el extremo (-) y las subunidades terminales están en forma D. Si se considera uno solo de los extemos, el balance entre la tasa de adición y disociación se alcanza a la Cc=koff /kon. Cc

+ es menor que Cc-. En el estado estacionario la concentración de

subunidades libres será intermedia y estará por encima de Cc+ y por debajo de Cc

-.

Cc(T) es menor que Cc(D) Cc(T) < C < Cc(D) se observa treadmilling

Alberts et al., MBC2002

En el estado de treadmilling hay movimiento hacia el extremo (+) debido al flujo de subunidades a través del polímero

El treadmilling es un estado estacionario de los polímeros con adición neta de subunidades en la forma T en el extremo (+) y pérdida neta de subunidades en la forma D en el extremo (-). La longitud del polímero permanece invariable.

Lodish et al MCB2004

La polimerización de actina es capaz de generar fuerza mecánica

tiempo

dist

anci

a

fuer

za

La fuerza que genera la elongación de un fascículo de filamentos de actina puede medirse directamente usando una trampa óptica. La trampa óptica sostiene una microesfera donde se encuentran inmobilizados acrosomas de Limulus próxima a una barrera rígida. Cuando ocurre la elongación de los filamentos de actina, la distancia que se desplaza la microesfera es proporcinal a la fuerza. La elongación puede impedirse cuando se aplica una fuerza del orden del pN.

Trampas ópticas

Footer (2007) PNAS

Los objetos dieléctricos son atraídos al centro del rayo. La fuerza aplicada sobre el objeto es directamente proporcional a su desplazamiento desde el centro de la trampa

Proteínas accesorias de unión a actina

La nucleación espontánea de filamentos es desfavorable debido a la inestabilidad de los oligómeros de actina. La elongación de filamentos es favorable, especialmente en el extremo (+). La célula emplea proteínas accesorias para (i) mantener un pool de actina no polimerizada mediante proteínas de unión a los monómeros de actina, (ii) promover la nucleación (forminas y Arp2/3), (iii) restringir el largo de los filamentos, (iv) regular el ensamblado y el recilado de los filamentos, y (v) entrecruzar filamentos en fascículos o redes.

Pollard (2009) Science

El complejo Arp2/3 comprende siete subunidades de Actin Related Proteins (ARPs)

Arp2/3 se aisló de la ameba Acanthamoeba castellanii como un ligando de profilina, una proteína de unión a actina. Luego se identificó asociado a estructuras ricas en actina de levaduras. Arp2/3 purifica como un complejo de siete polipéptidos en proporciones estequiométricas en una columna de cromatografía de afinidad. Las subunidades de mayor peso molecular son actin related proteins.

La estructura cristalina de Arp2 y Arp3 revela que la cara superior de ambas es muy similar el extremo (+) de la molécula de actina. Sin embargo las diferencias en los lados y en la cara opuesta impiden que estas proteínas formen filamentos por sí mismas o se ensamblen en filamentos junto con actina.

SD

S-P

AG

E

Arp3

Arp2

Machesky (1994) JCB

Actin Related Proteins (ARPs) se comportan como agentes nucleantes de la polimerización de filamentos de actina

ARP2/3 nuclea el crecimiento de los filamentos de actina a partir del extremo menos, permitiendo la elongación rápida de los filamentos por el extremo más.

Recons t r ucc i ón 3D de imágenes de microscopía electrónica de la ramificación de filamentos de actina mediada por el complejo Arp2/3 de Acanthamoeba. Las reconstrucción de las ramificaciones de preparaciones de bovino (F) y levadura (G) son muy similares y presentan densidades electrónicas conectando los dos filamentos.

Alberts et al., MCB2002

Rouiller (2008) JCB 180(5):887-895

Rouiller (2008) JCB 180(5):887-895

Arp2 y Arp3 son las primeras dos subunidades en el nuevo filamento

La reconstrucción de la ramificación muestra que el complejo Arp2/3 interacciona con el filamento madre. La formación de la ramificación resulta en cambios conformacionales en el filamento madre y en el complejo Arp2/3. Arp2 (rojo) y Arp3 (naranja) se reorganizan como un dímero que sirve de molde para la elongación de un nuevo filamento.

(-)

(+)

vista en estéreo

La formación de una ramificación requiere de la interacción cooperativa entre Arp2/3, NPFs, un monómero de actina, y el filamento madre.

Factores promotores de la nucleación de la familia WASp de proteínas activan al complejo ARP2/3

tiempo

fluor

esce

ncia

actina

actina + Wasp

actina Arp2/3 Wasp

actina + Arp2/3

La combinación de Wasp y el comple jo Arp2/3 promueve la pol imer ización espontánea de monómeros de actina (Machesky, 1999).

Lodish et al MCB2004

La microscopía de reflexión total interna de fluorescencia permite observar la polimerización de actina marcada con rodamina en tiempo real. El complejo Arp2/3 activado se une a un filamento de actina preformado para nuclear filamentos ramificados a los lados del filamento madre.

VIDEOS 2 y 3

El complejo Arp2/3 media la formación de filamentos ramificados

L a s r a m i f i c a c i o n e s d e l filamento madre que nuclea el complejo Arp2/3 emanan a un ángulo de 70º. Sucesivas rondas de nucleación resultan en una red ramificada de filamentos de actina.

Amann (2001) PNAS

Las forminas son factores de nucleación de actina que aceleran la elongación de filamentos de actina in vitro

Las forminas forman un complejo dimérico que puede nuclear la formación de un nuevo filamento de actina y quedar asociado con el extremo más mientras ocurre la elongación. El dímero se mantine unido a una de las dos subunidades de actina expuestas en el extremo más permitiendo el ensamblado nuevas subunidades.

Lodish et al MCB2004

VIDEO 4

FH2

FH1

Las forminas posibilitan la elongación de filamentos no ramificados.

actina profilina

Higgs (2005) TiBS

Okada (2010) JCB

Las forminas + profilina aumentan la tasa de elongación en el extremo (+). Los dominios FH2 forman un dímero que rodean el extremo (+) de un filamento. Los dominios FH1 contienen sitios de unión a profilina. Profilina-actina se ensambla en el dominio FH1, luego el monómero de actina se transfiere al extremo (+) liberándose de profilina

Microscopía TIRF de la polimerización de actina en presencia de mDia y profilina.

Organización de la formina mDia

thimosyn profilin

Timosina y profilina se unen a los monómeros de actina libres para controlar la elongación de filamentos in vivo

Timosina bloquea todas las reacciones de polimerización (nucleación y elongación de los extremos (+) y (-)). Profilina inhibe la nucleación y la elongaión del extremo (-), pero no la elongación del extremo (+). La profilina compite con la timosina por la unión de monómeros y promueve el ensamblado.

Proteínas de capping se unen al extemo más de filamentos y bloquean la adición y la pérdida de subunidades en ese extremo

En una reacción de polimerización de actina in vitro, el agregado de proteínas de capping sólo permite la adición y la pérdida de subunidades por el extremo menos disminuyendo la velocidad de elongación por encima de la Cc y la velocidad a la que el filamento se acorta por debajo de la Cc.

La unión de cofilina a los filamentos de actina provoca una alteración en el giro normal del filamento, los contactos entre subunidades de actina se debilitan y en algunos casos se rompen.

ADF (actin depolymerizing factor)/cofilina induce la fragmentación de filamentos de actina

microscopía electrónica +

cofil

ina

Andrianantoandro (2006) Mol Cell

McGough (1997) JCB

VIDEO mmc3

mic

rosc

opía

TIR

F

Abs

310n

m

tiempo

Cofilina: -  aumenta la tasa de elongación en el extremo (+) -  aumenta la tasa de depolimerización desde el extremo (-) -  aumenta la Ccrit El resultado neto del agregado de cofilina es un aumento en la tasa de treadmilling.

Cofilina promueve el reciclado de monómeros de actina A

bs 31

0nm

actina

actina + cofilina

Ccrit

Carlier (1997) JCB

Cofilina se une a la forma D de actina en los filamentos

La afinidad de cofilina por la forma D es dos veces más grande que por la forma T de actina en los filamentos. Como la tasa de elongación en el extremo (+) es más grande que la tasa de hidrólisis de ATP, cofilina induce la fragmentación de filamentos a a medida que “envejecen”. Los extremos menos que se generan por acción de cofilina se acortan rápidamente para promover el reciclado de monómeros de actina. Profilina sirve de buffer de los monómeros de ADP-actina e intercambia ADP por ATP. Los monómeros de ATP-actina unidos a profilina se adicionan al extremo más o son secuestrados por timosina

Lodish et al MCB2004

Modelo de nucleación dendrítica en el frente de avance de células migratorias

Factores promotores de la nuc leac ión asoc ian a l complejo Arp2/3 con un monómero de actina en el lado de un filamento para n u c l e a r u n f i l a m e n t o ramificado. El extremo (+) del filamento crece hasta la asociación de una proteína de cap que termina la elongación. La hidrólisis del nucleót ido unido a las subunidades provoca el e n v e j e c i m i e n t o d e l filamento. Cofilina fragmenta los filamentos promoviendo la disociación de la forma D de actina desde el extremo (-). Profilina recicla las subunidades de actina a la f o r m a T q u e q u e d a n disponibles para elongar extremos (+).

Pollard (2009) Science

Las proteínas involucradas en la migración celular son las mismas que las involucradas en la endocitosis en levaduras

La endocitosis en levaduras constituye un s istema que permite estudiar con resolución espacial y temporal la hipótesis de nucleación dendrítica de actina. Los parches de actina son muy pequeños comparados con el frente de avance de una célula migratoria. En estos parches de actina los filamentos se ensamblan de novo, proveen la fuerza para formar e internalizar una vesícula endocítica desde l a m e m b r n a n a p l a s m á t i c a y s e desensamblan en un proceso autolimitado.

Wsp1 ARPC5

Sirotkin (2005) JCB

VIDEO V2

Pollard (2009) Science

En las imágenes de microscopía de fluorescencia, la intensidad es directamente proporcional al número de moléculas en un área definida, lo que permite seguir la acumulación y desaparición de proteínas en los sitios de endocitosis (“parches de actina”). La primer proteína que se detecta es clatrina, luego aparecen las proteínas adaptadoras para asociarse 1:1 con clatrina. El factor promotor de la nucleación Wsp1 (~200) precede a al complejo ARP2/3 (~300) justo antes del ensamblado de actina en una red de filamentos entecruzados (~7000 actinas, ~200 proteínas de capping, y 900 proteínas de entrecruzamiento).

Sirotkin (2010) MBoC

El modelo de nucleación dendrítica explica el ensamblado de redes dendríticas en los sitios de endocitosis

El estado de polimerización puede afectarse con drogas que unen monómeros y filamentos de actina

Algunas drogas se unen y secuestran a los monómeros no ensamblados, provocando la depolimerización de los filamentos. Otras drogas se unen a los filamentos y los estabilizan. El efecto de las drogas revela el rápido y continuo intercambio de subunidades en los polímeros.

La faloidina es una toxina del hongo Amanita phalloides. Debido a su unión selectiva a microfilamentos, derivados de faloidina conjugados a fluoróforos se usan en microscopía para visualizar F-actina en células fijadas.

ACTIN-SPECIFIC DRUGS Phalloidin binds and stabilizes filaments Cytochalasin caps filament plus ends Swinholide severs filaments Latrunculin binds subunits and prevents their polymerization

fibroblasto

DAPI faloidina

La citocalasina D se une a los extemos más de los filamentos de actina impidiendo la polimerización

-90 0 60

citocalasina D lavado

recuperación

tiempo (min)

Schulze 2014 JCS

Baum 2014 Nature Commun