Materias primas utilizadas y análisis físico-químico

CAPITULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

Materias primas utilizadas y análisis físico-químico

1.- Materias primas analizadas Se procedió a la obtención y análisis de materias primas de origen animal y vegetal

de fácil acceso en el mercado local y nacional.

1.1.- Materias primas de origen animal Se usaron las siguientes materias primas de origen animal: a) Harina de lombriz

(Eisenia andrei) [HLF] fabricada en el Laboratorio de Bromatología del

Departamento de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de

la ULA, Mérida; El cultivo de lombrices y obtención de esta harina se detalla mas

adelante; Harina de lombriz Trujillo [HLT], adquirida de un productor de lombrices

del estado Trujillo. b) Harina de pescado Cumaná [HPC], suministrada por las

empresas procesadoras de harina de pescado del estado Sucre, mediante la

colaboración del INIA; .c) Harina de carne y hueso [HCH], adquirida de la Empresa,

Frigorífico Industrial Los Andes, C.A. (F.I.L.A.C.A.), ubicada en el Sector Mucujepe

del estado Mérida, Harina de pescado Perú [HPP], suministrada por la Universidad

La Molina, de Lima Perú.

1.2.- Materias primas de origen vegetal Como materias primas vegetales se utilizaron: a) Harina de maíz amarillo (Zea mays

L.) [HMA]; b) Harina de afrecho de trigo (Triticum aestivum (L.)Thell ) [HAT] y c)

Harina de hojas de leucaena (Leucaena leucocephala) [HHL]. Las dos primeras

101

fueron obtenidas del mercado local y la ultima por medio del INIA-Mérida. También

se realizo el análisis de tres productos comerciales (Alimentos comerciales

“Trucharinas”), dos nacionales (A y B) y uno importado C.

2.- Sistema de producción de lombrices y Obtención de harina

2.1.- Montaje del sistema de lombricultivo Para el montaje del lombricultivo se ubico un área acorde con las necesidades de

cría de las lombrices, la misma fue acondicionada con fuente de agua, luz y

mesones de concreto adecuados.

2.1.1.- Condiciones de cría de las lombrices

Se efectuó el cultivo de lombrices (lombricultivo o vermicultivo) en el umbráculo

ubicado en el área del jardín de plantas medicinales del herbario “Luís Ruiz Terán”

de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes, bajo la

asesoría del Dr. Marcel Bouché (Alcaldía de Combaillaux, Montpellier, Francia) y

los Ingenieros Juan Carmona (ULA, Mérida) y Patricio Soto (Agropolis Internacional,

Alcaldía de Combaillaux, Montpellier, Francia), mediante un sistema de alimentación

masiva. Este sistema consistió en la obtención de desechos orgánicos [residuos del

procesamiento vegetal, de zanahoria (Daucus carota L.) y guayaba (Psidium

guajava L.)], de la planta piloto del Departamento de Ciencia de Alimentos de la

Facultad de Farmacia y Bioanálisis e incorporación de afrecho de trigo (T. aestivum

(L.)Thell ) obtenido del mercado local de Mérida.

2.1.2.- Preparación del compost (residuos orgánicos) para la alimentación de las lombrices

Las lombrices fueron alimentadas a base de un compostaje de desechos orgánicos

[zanahoria (D. carota L.) y guayaba (P. guajava L.)] los cuales fueron licuados en

licuadora industrial marca F.B: Lehmann, Maschinenfabrik GMBH, Aalen-Wiirt,

Alemania, N.- 0224, tipo FDA, de la planta piloto del laboratorio de Ciencias de los

102

Alimentos. Este compostaje se dejó una semana fermentando en tobos plásticos

tomando en consideración el control de pH y temperatura. El material compostado

se combino con afrecho de trigo según recomendación de los especialistas

franceses, con la finalidad de nutrir y al mismo tiempo favorecer la textura de la

mezcla. La frecuencia de alimentación fue una vez a la semana al inicio del cultivo y

luego al aumentar la población de lombrices se efectuó dos veces por semana.

2.1.3.- Montaje del cultivo

El cultivo se instaló usando envases plásticos multiuso Premium de 68 Litros de

capacidad con dimensiones de 47 cm de largo y 38 cm de altura. Estos envases

fueron perforados en la parte inferior para favorecer el drenaje y salida del agua.

También fueron cubiertos en su interior con una malla de tull negra, con la finalidad

de evitar la salida de las lombrices y el mejor manejo a la hora de la extracción del

sustrato con las lombrices.

Luego de acondicionar los envases, se procedió al llenado de los mismos con turba

orgánica, con materiales sólidos de madera en descomposición, en capas de

aproximadamente 30 cm de espesor por envase, se les suministro el primer riego a

capacidad de campo (incorporación de agua hasta lograr humedecer bien el

sustrato sin producir mucho drenaje de liquido).

Posteriormente se distribuyeron por cada envase 200 lombrices de la especie

Eisenia andrei., y se les suministro la primera alimentación en base a 500 g de la

mezcla de residuo orgánico (zanahoria o guayaba) y afrecho de trigo. Durante el

transcurso del cultivo se controló la humedad, el pH y la temperatura. Diariamente

se verifico la humedad de los envases y se le aplicó agua corriente cada vez que

fuera necesario con una regadera de jardín. La temperatura se mantuvo entre 21-22

°C en la parte inferior y 24-25 °C en la parte superior del sustrato, durante los 3

meses de cultivo. Para el control de pH se utilizó papel tornasol que indicó que el

cultivo estaba entre pH 6-7. Bajo estas condiciones de pH, temperatura y humedad

el cultivo de las lombrices fue óptimo. En la Figura 5, se puede observar el

103

lombricultivo ubicado en el Jardín de Plantas Medicinales de la Facultad de

Farmacia y Bioanálisis.

Figura 6.- Lombricultivo ubicado en el Jardín de Plantas Medicinales de la

Facultad de Farmacia y Bioanálisis.

2.1.4.- Extracción de las lombrices

Luego de trascurridos los tres meses de cultivo, se procedió a la extracción manual

de las lombrices adultas, con una longitud y peso promedio de 7,0 cm y 0,49 gramos

respectivamente (Figura 6). Para ello fue necesario trasladar el sustrato que

contenía las lombrices a otro envase de mayor capacidad para hacer más fácil la

separación y obtención de mismas, luego se procedió a las operaciones

correspondientes de lavado previo, para posteriormente proceder a secar el material

beneficiado.

104

Figura 7.- Lombriz de tierra de la especie Eisenia andrei

2.2.- Procedimiento para la obtención de la harina de lombriz

2.2.1.- Operaciones previas al secado Las lombrices separadas de su sustrato se lavaron abundantemente con agua

corriente, luego se conservaron durante 24 horas en un recipiente plástico

contentivo de agua e insuflación de aire a temperatura ambiente (Velásquez, 1986 I

parte), mediante el empleo de un compresor de aire de 2,0 HP marca DOMOSA,

este tratamiento tiene como finalidad que las lombrices evacuen completamente el

contenido de su tubo digestivo. Finalizado este proceso se lavaron nuevamente las

lombrices hasta retirar completamente los desechos eliminados. Las lombrices

previamente lavadas, fueron escaldadas a 100 ºC por 5 min (beneficio de las

lombrices), según tratamiento propuesto por Stafford y Tacon (1984).

2.2.2.- Secado de la lombriz

Después del beneficio se lavaron con abundante agua hasta eliminar residuos, se

colocaron en papel absorbente para descartar el exceso de agua y luego se

105

colocaron en bolsas plásticas rotuladas para su trasporte el Laboratorio de

Operaciones Unitarias de la Facultad de Ingeniería, de la Universidad de Los Andes

(ULA), donde seguidamente se distribuyeron en bandejas perforadas en capas de

menos de un (1) cm de altura para luego ser trasladadas para su secado en una

estufa ventilada (Diseño propio de la ULA-Mérida) a 60 °C durante 4 horas.

2.2.3.- Molido de la lombriz secada en estufa

Finalmente las lombrices secas fueron separadas de las bandejas y sometidas a

molienda mediante el uso de un procesador de alimentos Osterizer Clásico marca

Oster, una vez pulverizada la harina, esta fue llevada a bolsas plásticas previamente

rotuladas y conservada bajo refrigeración a 2 ºC previo a su uso. La figura 7,

muestra la harina de lombriz obtenida y la Figura 8 el esquema tecnológico de

beneficio y fabricación de la harina de lombriz.

Figura 8. Harina de lombriz (Eisenia andrei) fabricada en la Facultad de

Farmacia y Bioanálisis de la ULA.

106

Primer baño de agua para la eliminación

de desechos contaminantes

Incorporación de aire en el agua por

18 horas

Segundo baño para la eliminación de

desechos intestinales

Escaldado 100 ºC por 5 min

Secado en papel absorbente

Distribución en las bandejas de

secado

Secado en la estufa a 60 ºC por 4 horas

Extracción de lombrices del sustrato

de cría

Primer baño de agua para la eliminación

de desechos contaminantes

Incorporación de aire en el agua por

18 horas

Segundo baño para la eliminación de

desechos intestinales

Escaldado 100 ºC por 5 min

Secado en papel absorbente

Distribución en las bandejas de

secado

Secado en la estufa a 60 ºC por 4 horas

Extracción de lombrices del sustrato

de cría

Figura 9.- Esquema de beneficio y secado de la lombriz de tierra obtenida en la

Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes.

107

A todas las muestras, de origen animal y vegetal seleccionadas, se les realizaron los

análisis físico-químicos (% de humedad, % de cenizas, % de proteína bruta, % de

grasa bruta, y % de Extractos no nitrogenados [ENN] por diferencia. Para los casos

del % de proteína y % de grasa se usaron dos metodologías diferentes, al inicio

métodos convencionales manuales y luego equipos semi-automáticos para el

procesamiento de muestras.

3.- Análisis Físico-Químicos de las muestras

El análisis proximal o bromatológico permite determinar el contenido físico-químico

de las materias primas y alimentos que consume el hombre y los animales (Sinay,

2002).

Los análisis comprendidos dentro de este grupo se aplican en primer lugar a las

materias primas que se usarán para formular una dieta, se determinaran proteína y

lipidos de los alimentos terminados, como un control para verificar que cumplan con

las especificaciones o requerimientos establecidos durante la formulación. Estos

análisis nos indicarán el contenido de humedad, proteína cruda (nitrógeno total),

fibra cruda, lípidos crudos, ceniza y extracto libre de nitrógeno en la muestra

(Osborne y Voogt, 1978; MAFF, 1982; AOAC, 1984).

En este trabajo de grado se utilizaron los siguientes métodos oficiales de análisis de

alimentos:

3.1.- Determinación de la humedad por el método de la estufa (Método oficial AOAC, 1990)

El componente más abundante y que esta presente en todos los alimentos es el

agua. La determinación del contenido de humedad de los alimentos es una de las

determinaciones más importantes y ampliamente usadas en el proceso y control de

los alimentos ya que indica la cantidad de agua involucrada en la composición de

los mismos.

108

3.1.1.- Fundamento

El método gravimétrico de determinación de humedad se fundamenta en la

evaporación del agua contenida en la muestra de peso conocido, para luego pesar

el residuo. El método se basa en el secado de una muestra en un horno y su

determinación por diferencia de peso entre el material seco y húmedo (Olvera,

1993).

Para fines de esta investigación se efectuó el análisis de humedad por le método

gravimétrico de desecación por estufa a 105 ºC a presión normal.

3.1.2.- Procedimiento

Se tomaron capsulas de Petri de vidrio de 1 cm ancho x 6 cm de diámetro, limpias,

secas, vacías y rotuladas, manejadas en todo momento con pinzas metálicas para

evitar alteraciones del peso, se colocaron en la estufa marca MEMMERT a 105 ºC

por dos horas, luego se llevaron al desecador y se enfriaron por 30 min, se pesaron

con una balanza analítica de precisión 10-3 g marca OHAUS® (P0).

Se pesaron por triplicado, en las capsulas antes mencionadas, 3 g de cada muestra

a ser analizada, se distribuyeron en las mismas uniformemente y se volvieron a

pesar con una precisión de 10-3 g (P1).

Seguidamente, las capsulas fueron llevadas a la estufa de desecación previamente

calentada a 100-105 ºC, por un periodo de tiempo de 24 horas. Transcurrido el

tiempo reglamentario, las capsulas fueron extraídas de la estufa y colocadas en un

desecador para enfriarlas por 1 hora, posteriormente estas fueron pesadas con

precisión 10-3 g (P2) hasta lograr peso constante, y por diferencia de pesos se

obtuvo el % de humedad de las muestras aplicando la siguiente formula:

100)()(

%01

21 xPPPP

Humedad−−

=

109

Donde:

P0: Peso de la capsula vacía, en gramos

P1: Peso de la capsula conteniendo la muestra húmeda antes de desecarla, en

gramos

P2: Peso de la capsula y la muestra después de desecarla, en gramos

El resultado final consistió en el promedio aritmético de los triplicados de las

muestras, a los cuales también se les calculo su desviación estándar.

3.2.- Determinación de cenizas (Método Oficial, AOAC 1990)

Las cenizas corresponden al residuo que se obtiene por incineración de las

muestras en estudio, y representan la fracción inorgánica o mineral del material

original. Se considera como el contenido de minerales totales o material inorgánico

en la muestra (Olvera et al., 1993).

Los datos de macro y microelementos en las tablas de composición de alimentos,

son escasos. Luego del tratamiento para la obtención de cenizas, se obtienen los

minerales de forma concentrada, debido a que se logro la destrucción de todo el

material orgánico, de tal forma que los elementos presentes se pueden medir sin

ninguna interferencia (Osborne y Voogt, 1986.

3.2.1.- Principio del ensayo

Consiste en mantener la muestra del material a ensayar en un ambiente oxidante, a

un a temperatura de 550 ºC a 600 ºC hasta la combustión completa de toda su

materia orgánica, quedando el residuo mineral.


Se precalentó la mufla de incineración marca LINDBERG/BLUE, a una temperatura

de entre 550 ºC y 600 ºC, se colocaron los crisoles de porcelana previamente

110

lavados e identificados, durante unos 20 min, se retiraron, se dejaron enfriar en el

desecador hasta alcanzar la temperatura ambiente y se pesaron con una balanza

analítica OHAUS® de precisión 10-3 g (P0).

Se efectuaron los análisis por triplicado, efectuando el pesado de 3 gramos de cada

muestra, se distribuyeron en el fondo del crisol uniformemente y se pesaron de

nuevo con precisión de 10-3 g (P1).

Seguidamente los crisoles fueron colocados en un triangulo de arcilla, y sometidos a

combustión completa con ayuda de un mechero de gas, para la calcinación de la

muestra, cuando la combustión termino, la cual se evidencio por el cese del humo

de la muestra, se trasladaron los crisoles al horno (Mufla) precalentado entre 550 y

600 ºC y se dejo allí hasta que su contenido carbonizado se convirtió en cenizas por

un periodo de 24 horas. Finalmente las muestras se extrajeron y se llevaron al

desecador por 1 hora, para ser pesadas en una balanza analítica OHAUS® de

precisión 10-3 g hasta peso constante (P2).

El porcentaje de cenizas se calculó separadamente para cada muestra mediante el

uso de la siguiente formula:

100)()(

%01

02 xPPPP

Cenizas−−

=

Donde:

P0: Peso del crisol vacío, en gramos

P1: Peso del crisol conteniendo la muestra, en gramos

P2: Peso del crisol y cenizas, en gramos

Los valores por triplicado obtenidos de cada muestra se promediaron y se calculo

del mismo modo su desviación estándar.

111

3.3.- Cuantificación del Nitrógeno total y determinación del contenido de proteína

El nitrógeno es el elemento químico que permite diferenciar las proteínas de otros

compuestos, particularmente de grasas y carbohidratos. Sin embargo, la fracción de

proteína del sistema biológico no es la única fuente de nitrógeno ya que puede

derivarse también de pépticos, aminoácidos libres y compuestos nitrogenados de

naturaleza no proteica (generalmente presentes en menor proporción). Por ello al

determinar el contenido de nitrógeno en un sistema biológico se califica de nitrógeno

total y al utilizar este dato para calcular el porcentaje de proteína del sistema se

califica de “cruda o bruta”. La determinación del nitrógeno sigue siendo el método

analítico más útil para cuantificar la fracción de proteínas sin interferencias de

carbohidratos y lípidos (Medina, 2007).

Para conocer el porcentaje de proteína, se determina el contenido de nitrógeno total

en la muestra a objeto de estudio, luego se precipita la fracción de proteínas y se

cuantifica el nitrógeno no proteico del sobrenadante. La diferencia con el contenido

de nitrógeno total permite establecer el contenido de nitrógeno proteico (Medina,

2007).

Para calcular el contenido de proteína cruda en función al contenido de nitrógeno

total, se recurre al factor de conversión, definido en función del tipo de alimento. El

factor representa el contenido de nitrógeno por 100 g de proteínas en ese sistema.

Para casos generales se toma el factor 6,25, sin embargo, para determinadas

proteínas de otros alimentos se utilizan otros factores específicos, por ejemplo 6,38

para leche, 5,7 para trigo, 5,71 para soya y 5,83 para la avena (Codoy et al., 1993).

En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los

alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El

nitrógeno orgánico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se

neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácido bórico.

Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se

convierte en el nitrógeno de la muestra. El resultado del análisis representa el

112

contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de

componentes no protéicos.

Por su costo, este es el nutriente más importante en la dieta en una operación

comercial; su adecuada evaluación permitirá controlar la calidad de los insumos

proteicos que son adquiridos o del alimento que se está suministrando (Olvera et al.,

1993).

3.3.1.- Fundamento del Método de Kjeldahl

El método de Kjeldahl se basa en la digestión o hidrólisis ácida de la materia

orgánica de la muestra por calentamiento con ácido sulfúrico concentrado y sulfato

de potasio en presencia de un ión metálico que actúa como catalizador (Cu)

presente en el sulfato de cobre, para convertir el nitrógeno de los productos

nitrogenados de la muestra en ión amonio. El nitrógeno se reduce en la sal sulfato

de amonio, de la cual se libera con hidróxido de amonio en la forma de amoniaco y

se destila. El destilado se valora con una solución patrón de ácido clorhídrico o

sulfúrico (Osborne y Voogt, 1986; Medina, 2007).

3.3.2.- Equipos

Se usaron los siguientes equipos: Balanza analítica METTLER Modelo B13240, con

1x10-4 de precisión; Digestor micro Kjeldahl marca LABCONCO; Destilador y

cámara interna de destilación, gerenador de vapor y bureta de 50 mL de capacidad,

erlenmeyer de 125 mL, espátulas de metal.

3.3.3.- Reactivos

Para este análisis se utilizaron los siguientes reactivos: Acido sulfúrico (H2SO4) al

95,97% marca FLUKA RIEDEL-DE HAËN, SIGMA ALDRICH CHEMIC; Acido

Clorhídrico (HCl) min 37%, PM = 36,46 g mol-1, marca RIEDEL-DE HAËN; Acido

Bórico (H3BO3) PM = 61,83, marca I & G; Sulfato de cobre (Cu SO4.5H2O) M =

249,68 g/mol marca MERCK REAGENZIEN; Sulfato de sodio (SO4 Na2), M = 142,04

113

g/mol REIDEL-DE HAËN; solución indicadora; y mezcla catalizadora [NaOH-

Na2S2O3 (60 g NaOH + 5 g Na2S2O3 / 100 mL)]

3.3.4.- Procedimiento para la determinación de proteínas por el método de MicroKjeldahl (Método Oficial, AOAC 1990)

Se pesaron 0,1 gramos de cada muestra homogénea por triplicado, en pequeños

trozos de papel encerado, y se transfirieron dentro del papel a balones limpios y

secos de micro Kjeldahl de 30 mL de capacidad contentivo de 3 perlas de vidrio,

evitando que quedara muestra en el cuello del balón. Luego a cada balón se le

agregó un (1) gramo de sulfato de sodio (Na2SO4), 0,01 gramo de sulfato de cobre

(Cu2SO4) y 2 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Posteriormente se

colocaron los balones con las muestras en el aparato de digestión y se calentó la

mezcla de digestión a temperatura baja hasta que cesara la formación de espuma.

Se aumentó luego progresivamente la temperatura de la hornilla (no permitiendo

que escapara ácido del balón por exceso de calor; puesto que se pudieran producir

pérdidas de nitrógeno por volatilización de las sales de amonio). Al finalizar la fase

de digestión el digerido paso de un color negro a un color verde claro transparente,

y una vez enfriadas las muestras a temperatura ambiente, se disolvieron con 10 mL

de agua destilada para realizar la destilación.

La destilación se efectuó colocando a la salida del destilador un enlenmeyer de 100

mL de capacidad, conteniendo 5 mL de solución de ácido bórico (H3BO3) al 4 % y 3

gotas de solución indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2 % + 1 parte de azul

de metilo al 0,2 %, ambas alcohólicas), de modo que la punta del refrigerante

quedara sumergida en la solución que contenía el ácido bórico conjuntamente con el

indicador. Seguidamente, se transfirió el digerido ya diluido con agua destilada, a la

cámara interna de destilación y luego se hicieron de 5-6 lavados sucesivos con

porciones de 2 mL de agua destilada. A continuación, se adicionó 10 mL de

solución de NaOH-Na2S2O3 (60 g NaOH + 5 g Na2S2O3 / 100 mL), se lavó

ligeramente el embudo con agua destilada y se cerraron las llaves de vidrio del

equipo de destilación. Finalmente se encendió el generador de vapor y se destiló

hasta recoger 50 mL de muestra y luego se tituló con acido clorhídrico (HCl) 0,02 N,

114

empleando una bureta graduada, hasta lograr la neutralización de la muestra y que

se observara el cambio de color característico (de verde claro a rosado). El

porcentaje de nitrógeno se calculó de acuerdo a la siguiente formula:

a 10VNE N % =

Donde:

V: Cantidad de HCl 0,02 N gastado durante la titulación

N: concentración del HCl (0,02N)

E: Equivalente del nitrógeno

a: peso de la muestra, en gramos

El porcentaje de proteína de muestras de origen animal fue calculado aplicando el

factor 6,25 al porcentaje de nitrógeno, para las muestras vegetales se utilizo como

factor 5,7 que es el factor de conversión para el trigo. Los porcentajes de proteína

obtenidos por triplicado, por cada muestra, fueron promediados y del mismo modo

se les calculo su desviación estándar.

3.3.5- Método automático de determinación de proteína estandarizado en el INRA, Saint Pée sur Nivelle, Francia

3.3.5.1.- Principio

Determinar el contenido de proteína de muestras según el método de Kjeldahl,

donde el nitrógeno orgánico de la muestra es oxidado por el acido sulfúrico

concentrado, en caliente y en presencia de un catalizador, esta reacción provoca

un desprendimiento de CO2 y H2O. El nitrógeno es fijado bajo la forma de

(NH4)2SO4 por el acido sulfúrico.

2NH3 + H2SO4 (NH4)2 SO4

115

El amoniaco, liberado por una solución de sosa cáustica, es extraído por una

corriente de vapor de agua a fin de ser recuperado en una solución tampón de

acido bórico, y luego se realiza la titulación por una solución de acido sulfúrico

de concentración conocida (0,025 M).

3.3.5.2.- Procedimiento

La muestra de masa conocida (± 0,4 g) fue colocada en un matraz por triplicado,

se utilizaron también 4 matraces sin muestra para la preparación de los blancos,

después a cada matraz se les adiciono una (1) pastilla de catalizador Kjeltabs

S3.5 y 5 mL de acido sulfúrico concentrado, los matraces ubicados en un porta

matraz metálico fueron transportados a un bloque de mineralización (Digestor

2040), y fueron sometidos a un programa de diferentes tratamientos de

temperatura y tiempo:

a) 15 min a 100 °C d) 60 min a 320 °C

b) 15 min a 150°C e) 90 min a 440 °C

c) 30 min a 220 °C

Existe una bomba especial que aspira los vapores del acido liberados durante la

digestión de las muestras en estudio. Luego enfriados los matraces fueron agitados

por un Vortex para mezclar bien su contenido y trasladados al equipo Kjeltec 2300

donde se efectúo el análisis respectivo por destilación. La masa calculada

previamente de la muestra fue introducida al equipo y activado para la

determinación respectiva automática del porcentaje de proteína de cada materia

prima y alimento evaluados.

116

3.4.- Determinación de lípidos por el método de Soxhlet (Método Oficial, AOAC 1990)

3.4.1.- Principio

Consiste en extraer el extracto etéreo o grasa de una muestra, mediante su

tratamiento con éter de petróleo, o cualquier otro solvente orgánico apropiado, en un

equipo especial, hasta el agotamiento, y luego evaporar después el solvente, en un

recipiente ya tarado, el solvente. El residuo que queda en el recipiente corresponde

al extracto que contenía la muestra problema.

3.4.2.- Equipos

Se utilizaron como equipos: Balanza analítica METTLER de precisión 10-3, modelo

B13240; equipo de Soxleht y mantas electrotérmicas Serie CM marca ESSEX, SS2

SPH, balones de 250 mL, beakers de 40 mL, espátulas de metal, dedales Soxleht,

algodón.

3.4.3.- Reactivos

Se utilizó como reactivo o solvente de extracción el éter de petróleo certificado

marca RIEDEL-DE HAËN, de intervalo de ebullición entre 40-60 ºC.


En los dedales para Soxhlet (25x80 mm, diámetro 25 mm) marca MFS ADVANTEC

INC, previamente tarados, se pesaron 3 gramos de cada muestra por triplicado, a

los cuales luego se coloco un trocito de algodón para evitar perdidas de la muestra

durante el proceso de extracción. Los dedales preparados se colocaron en el interior

(cuerpo intermedio) del sistema de extracción Soxhlet, y luego estos se adaptaron a

los balones de 250 mL secos previamente rotulados y pesados, los cuales fueron

colocados en las planchas eléctricas, con reóstato para regulación de la temperatura

de calentamiento. Seguidamente se agregaron lentamente 150 mL de éter de

117

petróleo al extractor, específicamente en la parte superior del sistema extractor con

el sistema refrigerante, hasta lograr que sifonée por el tubo lateral completando el

volumen total antes mencionado, se abrió la llave del agua para el sistema

refrigerante y se coloco el equipo a reflujo hasta el agotamiento total de la materia

grasa. En el proceso al iniciarse la ebullición del éter, sus vapores ascendieron por

la cámara de extracción hasta la parte superior, y al llegar al área del refrigerante

este condensó y luego volvió a caer sobre el dedal donde se ubicó la muestra

disolviendo la grasa presente en la misma.

Finalizada la extracción, las muestras fueron destiladas para evaporar y recuperar el

éter y obtener el extracto etéreo, que quedó adherido a las paredes de balón de 250

mL, los cuales se llevaron a la estufa marca MERMMErT a 100ºC por unos 5 min,

luego se dejaron enfriar por una (1) hora en el desecador y se procedió a tomar el

peso de los balones con grasa.

La grasa obtenida se obtuvo por diferencia de peso de los balones mediante la

siguiente formula:

100)(

%0

12 xP

PPGrasa

−=

Donde:

P0: Peso de la muestra, en gramos

P1: Peso del balón vació, en gramos

P2: Peso del balón mas el extracto graso, después del secado, en gramos

Los resultados obtenidos de cada muestra por triplicado fueron promediados y se

les calculo la desviación estándar respectiva.

118

3.5.- Método de extracción de grasa automático Soxleht VELP®

3.5.1- Fundamento

Este es un método que utiliza un sistema de extracción cíclica de los componentes

de una muestra solubles en éter que se encuentran en un alimento, para determinar

la concentración de materia grasa ó extracto etéreo (AOAC, 1990).

3.5.2.- Equipos y materiales

Se utilizaron los siguientes equipo: Balanza analítica Aventurer® de precisión (10-4)

marca OHAUS, Extractor Soxhlet (se utiliza equipo Soxhlet automático marca VELP

Científica, Serie 140 Extractor de Solvente, estufa de desecación MEMMERT,

cartuchos Soxhlet de algodón desgrasado, copas de extracción marca VELP, Perlas

de vidrio, Pinzas metálicas, Algodón y Guantes

3.5.3.- Reactivos

Se utilizó como reactivo o solvente de extracción el éter de petróleo certificado

marca RIEDEL-DE HAËN, de intervalo de ebullición entre 40-60 ºC.

3.5.4.- Procedimiento Se pesó (P0) una cantidad de muestra preparada directamente en el cartucho de

algodón (celulosa), normalmente se pesan 1 g para muestras liofilizadas y 3 g para

muestras frescas. Luego se pesaron las copas de extracción con perlas de vidrio

(previamente limpias, rotuladas y taradas) (P1).

El siguiente paso consistió en abrir un poco el paso de agua al equipo,

inmediatamente se enchufo, se subió el breaker y se encendió el mismo, se abrió un

poco más el paso del agua y se colocó el programa establecido (en este caso el Nº

3) y estandarizado el cual tiene programado lo siguiente:

119

Colocar las bandas de Vitón con el punto de ebullición entre 30-80ºC

Ubicar la temperatura del plato para éter de petróleo en 110ºC.

Poner un tiempo de inmersión de 40 mim

Colocar el tiempo de lavado en 60 min

Situar el tiempo de recuperación teórico de 45 min, sin embargo, este

dependerá de la muestra y osciló de 20 min a 45 min.

Seguidamente, se procedió a montar las muestras en el equipo, conectando los

adaptadores metálicos a los cartuchos de algodón y colocándolos en la parte

imantada, según se rotularon, se orientaron las palancas frontales en posición de

inmersión, e inmediatamente se agregaron 50 mL de éter de petróleo a las copas de

extracción y se colocaron centradas en el plato correspondiente según se rotularon.

Se cerró el sistema con la palanca de sellado, se procedió a iniciar el programa con

la tecla Star/Stop, y se comenzó el tiempo de inmersión (40 min) de la muestra. Al

terminar el tiempo de inmersión el equipo produjo una alarma y se procedió a bajar

las palancas frontales y colocar en equipo en lavado (60 min) presionando botón

enter. Al terminar el tiempo de lavado el equipo nuevamente aviso y se procedió a

colocar las palancas frontales en recuperación (± 45 min) y dando un giro hacia la

derecha de las llaves para recuperar el solvente presionando botón enter. Finalizada

la recolección del solvente que dependió del tiempo de acuerdo a la muestra, se

abrió el sistema de sellado hermético llevando las copas de extracción a la estufa

100ºC por unos 10 a 15min, luego estas fueron colocadas en un desecador por un

tiempo de 30 min mínimo antes de proceder a pesar (P2) y obtener el extracto

graso. Posteriormente se apago el equipo, se recupero el solvente colocando unos

beakers centrados y extrayendo poco a poco el éter, se cerró la llave de paso de

agua.

Para la obtención del % de grasa o lípido, se utilizo la siguiente formula:

100xP

)PP(Grasas%

0

12 −=

120

Donde:

P1 = peso copa extracción vacía (previamente limpias, rotuladas y tarada)

P2 = peso copa extracción con grasa extraída

P0 = peso de la muestra

Para la obtención del % grasa cruda en base seca, se aplicara la siguiente formula:

Humedad%100100Grasa%

−=

Las muestras fueron procesadas por triplicado, y los valores obtenidos fueron

usados para calcular promedios y desviaciones estándar.

3.6.- Determinación de los extractos no nitrogenados (ENN)

Dentro de este concepto se agrupan todos los nutrientes no evaluados con los

métodos señalados anteriormente dentro del análisis proximal, constituido

principalmente por carbohidratos digeribles, así como también vitaminas y demás

compuestos orgánicos solubles no nitrogenados; debido a que se obtiene como la

resultante de restar a 100 los porcentajes calculados para cada nutriente, los errores

cometidos en su respectiva evaluación repercutirán en el cómputo final (Olvera et

al., 1993).

La determinación de extractos no nitrogenados se calcula mediante la siguiente

formula:

)Grasa%oteinaPr%Cenizas%humedad(%100ENN% +++−=

121

3.7.- Análisis estadístico

Las muestras se analizaron por triplicado, y se utilizó un análisis estadístico de

MANOVA (Análisis de varianza múltiple), con un nivel de significancia de P < 0,001.

También se aplicó la prueba de rango múltiple de Duncan con α = 0,05, para la

determinación de subconjuntos homogéneos o no. Estos cálculos se efectuaron

utilizando el programa estadístico SPSS (Statistical Product and Service Solutions)

versión 13, para Windows.

4.- Análisis de macroelementos, microelementos y metales pesados

Se efectuó la determinación de minerales o micro-nutrientes, divididos en

macroelementos (Ca, Na, Mg, K), microelementos o trazas (Cu, Fe, Zn, Ni) y

elementos de contaminación (As, Pb, Se, Cd). Estos fueron procesados en el

Laboratorio Regional de Servicios Analíticos (LARSA) de la Facultad de Ciencias,

Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.

4.1.- Muestras analizadas

Se analizaron materias primas de origen animal [harina de lombriz Farmacia (HLF),

harina de lombriz Trujillo (HLT), harina de pescado Cumana (HPC) y harina de

carne-hueso (HCH)], de origen vegetal [afrecho de trigo: Triticum aestivum (AFT),

harina de maíz (Zea mays) amarillo (HMA) y harina de hoja de leucaena: Leucaena

Leucocephala (HHL)], y tres productos comerciales, dos nacionales (A y B) y uno

importado (C).

4.2.- Equipos

Para la preparación de las muestras (digestión acida) se utilizo una plancha de

calentamiento marca PMC Serie 502. balanza analítica Aventurer® de precisión 10-4

marca OHAUS, beakers de 40 mL, espátulas de metal, pipetas graduadas de 10

mL.

122

Se utilizó un espectrómetro de emisión atómica con fuente de plasma

inductivamente acoplado ICP Liberty AX Serie II, con nebulizador concéntrico de

vidrio tipo Meinhard y una cámara de nebulización ciclónica como sistema de

introducción de muestra, además de una antorcha de pieza única dispuesta de un

tubo inyector de 2,3 mm de diámetro interno marca VARIAN para la detección y

cuantificación de los analitos.

4.3.- Reactivos

Para la preparación de las muestras se utilizó agua milli-Q, acido sulfúrico al 95,97%

marca FLUKA RIEDEL-DE HAËN, SIGMA ALDRICH CHEMIC y acido nítrico min

65% para análisis, marca RIEDEL-DE HAËN.

Se utilizaron soluciones certificadas; unielementales de 1.000 ppm para el caso del

calcio (Ca), sodio (Na), hierro (Fe), potasio (K) y magnesio (Mg) y multielemental de

50 ppm para los analitos cromo (Cr), cobre (Cu), zinc (Zn), níquel (Ni), selenio (Se),

cadmio (Cd), plomo (Pb) y arsénico (As) de VARIAN; estas se emplearon para la

preparación de soluciones de trabajo diluidas, en agua doblemente desionizada con

18 MΩcm, proveniente de un sistema Millipore Milli-Q Plus y acidificadas al 1% con

Ácido Nítrico (HNO3 65%) de Fluca.

4.4.- Preparación de la muestra y condiciones de trabajo del equipo usado para el análisis

Se efectuó el procesamiento de la muestra mediante una digestión total ácida, para

ello a 0,5 g de la misma, se le realizó un tratamiento con ácido nítrico (5,6 mL) y

ácido sulfúrico (2,5 mL), en caliente (50 ºC) por una (1) hora y veinte (20) min,

posteriormente se realizó un filtrado y se transfirió a un balón de 25 mL aforado

completando dicho volumen con agua Milli-Q.

Todo el material empleado fue previamente expuesto en HNO3 al 20% v/v durante

48 h y luego lavado con agua desionizada 10 veces antes de ser utilizado. Después

de optimizar los parámetros instrumentales tales como: potencia de RF aplicada,

123

presión del gas de nebulización, cantidad de solución suministrada al nebulizador

por la bomba peristáltica y seleccionadas las longitudes de onda de trabajo para

cada uno de los analitos en estudio, se procedió a la determinación de las medidas

de intensidades de emisión de las soluciones patrón, estableciéndose la robustez

del plasma y la cuantificación de las muestras problemas.


Cada muestra se analizó por triplicado, y se utilizó un análisis estadístico de

MANOVA (Análisis de varianza múltiple), con un nivel de significancia de P < 0,001.

También se aplicó la prueba de rango múltiple de Duncan con α = 0,05, para la

determinación de subconjuntos homogéneos o no. Estos cálculos se efectuaron

utilizando el programa estadístico SPSS (Statistical Product and Service Solutions)

versión 13, para Windows.

Análisis microbiológico 5.- Análisis microbiológico 5.1.- Muestras analizadas

Para el análisis microbiológico se utilizaron las siguientes materias primas: de origen

animal (Harina de lombriz (Eisenia andrei) [HLF]; Harina de pescado Cumaná

[HPC]; Harina de carne y hueso [HCH]), y de origen vegetal (Harina de maíz

amarillo (Zea mays L.) [HMA]; Harina de afrecho de trigo (Triticum aestivum

(L.)Thell ) [HAT] y Harina de hojas de leucaena (Leucaena leucocephala) [HHL]).

5.2.- Equipos

Se utilizaron como equipos: Balanza analítica marca THELCO con precisión 1x10-4,

incubadora marca THELCO, Contador de colonias marca Memmmert, lector de

Placas PetrifilmTM 3M TM

124

5.3.- Reactivos

Como reactivos se utilizó: Peptona de caseína marca BIOQUISA C.A.; Caldo

lactosado Boltimor Biological Laborat; Bismuto sulfito agar, marca HIMEDIA; Agar

Salmonella-Shigella (SS) Microbiologie; Hektoen Enterico Agar marca BECTON

DICKINSON; Medio de Cisteina Selenito marca HIMEDIA; Tetrationato caldo base,

marca DIGFO Laboratorios. Kit de Pruebas Bioquímicas API E-20 para identificación

de Salmonella.

5.4.- Preparación de diluciones decimales

Se efectuó la preparación de diluciones decimales de las muestras HLF, HPC, HCH,

HAT, HMA y HHL. Para ello se tomaron 10 g de cada muestra y se trasfirieron a

frascos de dilución conteniendo 90 mL de agua peptonada al 0,1 %, y de esta

manera se obtiene la dilución 10-1, de este luego se tomó 1 mL y se trasfirió a un

tubo de ensayo estéril con 9 mL de agua peptonada al 0,1 %, para obtener la

dilución 10-2, y así sucesivamente hasta preparar las diluciones 10-4, 10-5, 10-6, 10-7,

10-8 y 10-9. Luego de preparadas todas las diluciones se procedió a inocular con 1

mL de cada dilución a las respectivas láminas de petrifilm específicas a cada

microorganismo o a medios convencionales para otros análisis clásicos.

Se efectuó la preparación de la muestra de acuerdo a lo especificado en la norma

COVENIN 1126 (1989), lo cual consistió en efectuar la identificación completa de la

misma (fecha de toma de la muestra, nombre y tipo de producto, fabricante, entre

otros), asignándole la fecha de recepción y numero para el análisis, además de la

codificación de identificación respectiva. Por tratarse de muestras sólidas se

procedió a efectuar una homogenización previa para la dilución 10-1, es decir, se

tomaron 10 g de la muestra con 90 mL de la solución diluyente (agua peptonada al

0,1 %) y se homogeneizaron por 60 segundos en un procesador de alimentos

Osterizer marca OSTER.

125

5.5.- Principio del ensayo del uso de laminas Petrifilm Este método consiste en inocular un (1) mL de la muestra o diluciones de la misma

en placas de Petrifilm de aproximadamente 20 cm2 de superficie, las cuales

contienen una película deshidratada de un medio de cultivo adecuado. Después del

periodo de incubación, se determina el numero de unidades formadoras de colonias

(UFC) del microorganismo que se este determinando (Norma COVENIN, 3338,

1997).

5.6.- Determinación de aerobios mesófilos (COVENIN 3338, 1997)

Se utilizaron placas Petrifilm® para aerobios mesófilos (AM), cubiertas del medio

agar estándar (Plate Count Agar) y un agente gelificante soluble en agua fría. La

película superior hecha de polipropileno recubierta con agentes gelificantes y el

indicador 2,3,5 Cloruro de Trifenil-Tetrazolium (Norma COVENIN, 3338, 1997).

Para la determinación de AM, se procedió a colocar las láminas de Petrifilm

especificas previamente identificadas sobre una superficie plana y estéril. Se levanto

la película superior y con una pipeta colocada perpendicularmente a la placa se

transfirió un (1) mL de la dilución de la muestra en el centro del circulo que contiene

el medio deshidratado, ubicado en la película inferior. Luego se deslizo con cuidado

la película superior sobre la inferior, tratando de no formar burbujas, e

inmediatamente después se distribuyo el inoculo sobre el área del medio de cultivo

deshidratado usando una lamina plástica fijadora, con la cara plana hacia arriba, y

efectuando presión suave solo hasta que la muestra alcanzara los bordes del

circulo. Seguidamente se retiro la lamina plástica fijadora evitando movimientos

circulares y se dejo en reposo la lamina un (1) min, para lograr solidificación del

agente gelificante (Norma COVENIN, 3338, 1997).

La incubación de las laminas de Petrifilm para aerobios mesófilos fue a 32 ºC ± 1 ºC,

por 24-48 horas. Para ello se utilizo una incubadora marca THELCO, ajustada a la

temperatura necesaria. Las láminas se mantuvieron de forma horizontal, con la

película transparente hacia arriba sin invertir.

126

Finalizado el periodo de incubación, se efectuó con ayuda de un contador de

colonias (lector de Placas PetrifilmTM 3M TM), el recuento de UFC donde se hubieran

obtenido entre 30 y 300 colonias para productos alimenticios. Las colonias típicas de

aerobios mesófilos son de color rojo, sin importar la intensidad del color y tamaño

(Norma COVENIN, 3338, 1997).

El recuento de aerobios corresponde a la suma de sus colonias rojas, y se expresa

como UFC/g, en los casos donde no hubo formación de colonias el resultado se

expreso como “menos de 1” (Norma COVENIN, 3338, 1997).

5.7.- Determinación de mohos y levaduras

Para el análisis de mohos y levaduras se utilizaron placas PetrifilmTM cubiertas de

del medio contiene nutrientes “Sabhi”, con dos antibióticos (clorotetraciclina y

cloramfenicol), indicador de fosfatos (BCIP) y un agente gelificante soluble en agua

fría. Se complementa en la parte superior con otra lámina de polipropileno que

contiene igualmente los dos antibióticos (clorotetraciclina y cloramfenicol), el

indicador BCIP y esta recubierta con agentes gelificantes y como indicador un tinte

de color rojo permitiendo un mayor contraste de las colonias (3M Petrifilm, 2003).

Para la determinación de microorganismos mohos y levaduras, se procedió a

colocar las láminas de Petrifilm específicas, previamente identificadas sobre una

superficie plana y estéril. Se levanto la película superior y con una pipeta colocada

perpendicularmente a la placa se transfirió un (1) mL de la dilución respectiva de la

muestra en el centro del circulo que contiene el medio deshidratado, ubicado en la

película inferior.

Luego se deslizo con cuidado la película superior sobre la inferior, tratando de no

formar burbujas, e inmediatamente después se distribuyo el inoculo sobre el área

del medio de cultivo deshidratado usando una lamina plástica fijadora, con la cara

plana hacia arriba, y efectuando presión suave solo hasta que la muestra alcanzara

los bordes del circulo. Seguidamente se retiro la lamina plástica fijadora evitando

127

movimientos circulares y se dejo en reposo la lamina un (1) min, para lograr

solidificación del agente gelificante (3M Petrifilm, 2003).

La incubación de las laminas de Petrifilm para mohos y levaduras fue a 25 ºC ± 1

ºC, por 3-5 días. Para ello se dejaron las láminas a temperatura ambiente. Las

láminas se mantuvieron de forma horizontal, con la película transparente hacia

arriba sin invertir.


colonias (lector de Placas PetrifilmTM 3M TM), el recuento de UFC donde se hubieran

obtenido entre 10 y 100 colonias, para productos alimenticios, típicas de mohos y

levaduras (3M Petrifilm, 2003).

El recuento de mohos y levaduras corresponde a la suma de sus colonias

características (Las levaduras son típicamente colonias azules, pequeñas y con

bordes definidos, pero también van en tonos beige o crema hasta azul verdoso,

logran también tener tonos rosas, pueden ser colonias de apariencia abultada, es

decir, con una tercera dimensión (convexas), de color uniforme, no difusas. Mientras

los mohos se reconocen por ser colonias grandes, de colores variables (café, beige,

naranja, azul verdoso, negro), colonias de apariencia plana, con centro oscuro que

se expanden alrededor del mismo y forma difusa) y se expresa como UFC/g, en los

casos donde no hubo formación de colonias el resultado se expreso como “menos

de 1” (3M Petrifim, 2003).

5.8.- Determinación de enterobacterias

La placas PetrifilmMR para Recuento de Enterobacteriaceae es un sistema de medio

de cultivo listo para ser usado, que contiene los nutrientes de medio AVRB (Agar

Violeta Rojo Bilis) modificado, un agente gelificante soluble en agua fría y un

indicador que facilita la enumeración de colonias. Pueden ser usadas para la

enumeración de enterobacterias en alimentos diversos así como para el monitoreo

ambiental y superficial en áreas de procesamiento y manipuladores (3M Petrifilm,

2003).

128

Las Enterobacterias son de gran importancia, ya que son organismos involucrados

en la degradación de los alimentos; son indicadores de contaminación fecal en los

alimentos y algunos son patógenos de origen alimentario (3M Petrifilm, 2003).

Las Placas PetrifilmMR para recuento de Enterobacterias enumeran todos los

organismos Coliformes, además de los patógenos potenciales como Salmonella,

Shigella y Yersinia, lo que proporciona una figura más detallada de la contaminación

potencial. Estos organismos sensibles al calor y a la higienización deberían ser

monitoreados, tanto en ambientes secos como húmedos (3M Petrifilm, 2003).

La placa PetrifilmMR para Recuento de Enterobacteriaceae está compuesta por una

lámina de papel con una cuadrícula impresa recubierta de polipropileno conteniendo

nutrientes del medio AVRB, y un indicador de pH (el área donde se desarrollarán los

microorganismos está definida por una película intermedia de espuma). Se

complementa en la parte superior con otra lámina de polipropileno que contiene gel

soluble en agua fría y tricloruro de trifenil tetrazolio (ó TTC) (3M Petrifilm, 2003).

Un tinte indicador rojo provee un mejor contraste para facilitar el conteo de las

colonias. Se deben contar todas las colonias rojas con halos amarillos o pálidos y

que estén asociadas o no a una burbuja de gas (3M Petrifilm, 2003).

Para la determinación de enterobacterias, se procedió a colocar las láminas de

Petrifilm especificas previamente identificadas sobre una superficie plana y estéril.

Se levanto la película superior y con una pipeta colocada perpendicularmente a la

placa se transfirió un (1) mL de la dilución de la muestra en el centro del circulo que

contiene el medio deshidratado, ubicado en la película inferior.






129



La incubación de las laminas de Petrifilm para enterobacterias fue a 35 ºC ± 1 ºC o

37 ºC ± 1 ºC , por 24 ± 2 horas. Las láminas se mantuvieron de forma horizontal,

con la película transparente hacia arriba sin invertir.


colonias (lector de Placas PetrifilmTM 3M TM), el recuento de UFC donde se hayan

obtenido entre 15 y 100 colonias, para productos alimenticios (3M Petrifim, 2003).

El recuento de enterobacterias corresponde a la suma de todas sus colonias

características y se expresa como UFC/g, en los casos donde no hubo formación de

colonias el resultado se expreso como “menos de 1” (3M Petrifim, 2003).

5.9.- Determinación de coliformes totales y fecales

Las Placas PetrifilmMR para el Recuento de E. coli y Coliformes Totales contienen

nutrientes de Bilis Rojo Violeta (VRB), un agente gelificante soluble en agua fría, un

indicador de actividad Glucoronidasa y un tinte indicador que facilita la enumeración

de las colonias. Aproximadamente el 97% de las colonias de E. coli producen beta

glucoronidasa la que a su vez forma un precipitado azul asociado a la colonia. La

película superior atrapa el gas producido por la fermentación de la lactosa por parte

de los Coliformes y E. coli. Cerca del 95% de las E. coli producen gas, representado

por colonias entre azules y rojo azuladas asociadas con el gas atrapado en la Placa

PetrifilmMR EC (dentro del diámetro aproximado de una colonia) (3M Petrifim, 2003).

La AOAC internacional y el Manual de Bacteriología Analítica (BAM) de la US FDA

(Food and Drug Administration) define Coliformes como bacilos Gram negativos que

producen ácido y gas de la fermentación metabólica de la lactosa. Las colonias de

Coliformes en las Placas PetrifilmMR EC durante su crecimiento van generando

ácido, por lo que el indicador de pH va oscureciendo o profundizando el color del

130

gel. El gas queda atrapado alrededor de la colonia confirmando la presencia de un

coliforme (3M Petrifim, 2003).

El rango de conteo para la población total de Coliformes en la Placa PetrifilmMR CC

es de 15 – 150. No deben contarse las colonias que han crecido en la zona de hule

espuma por cuanto han sido removidas de la influencia del medio (3M Petrifim,

2003).

Para la determinación de coliformes totales y fecales, se procedió a colocar las

láminas de Petrifilm especificas previamente identificadas sobre una superficie plana

y estéril. Se levanto la película superior y con una pipeta colocada

perpendicularmente a la placa se transfirió un (1) mL de la dilución de la muestra en

el centro del circulo que contiene el medio deshidratado, ubicado en la película

inferior.








La incubación de las laminas de Petrifilm para el grupo coliformes fue a 32 ºC ± 1 ºC

(Para coliformes totales) y 44 ºC ± 1 ºC (Para coliformes fecales), por 24 ± 2 horas.

Las láminas se mantuvieron de forma horizontal, con la película transparente hacia

arriba sin invertir. Finalizado el periodo de incubación, se efectuó con ayuda de un

contador de colonias (lector de Placas PetrifilmTM 3M TM), el recuento de UFC donde

se hayan obtenido entre 15 y 150 colonias, para productos alimenticios. El recuento

de coliformes totales y fecales corresponde a la suma de todas sus colonias

características y se expresa como UFC/g, en los casos donde no hubo formación de

colonias el resultado se expreso como “menos de 1” (3M Petrifim, 2003).

131

5.10.- Determinación de Salmonella sp.

Se tomaron 25 g de muestra de cada materia prima en estudio, donde se detectaron

bacterias del grupo coliformes fecales y se resuspendieron en 225 mL de caldo

lactosado (caldo de pre-enriquecimiento), se ajustó el pH a 6,8 y se efectuó la

incubación a 37 ºC por 24 horas (Holt, 1994).

Luego se tomo un (1) mL del caldo de pre-enriquecimiento y se llevo a tubos de

ensayo con dos caldos de enriquecimiento (caldo tetrationato y caldo selenito),

estos se incubaron a 37 ºC por 24 horas. Finalizado este periodo de incubación, se

realizaron pruebas de selectividad, utilizando los medios: Agar Sulfito Bismuto (SB),

agar Hektoen Enterico (HE) y agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD), donde se

sembró un mL proveniente de los caldos de enriquecimiento, que luego se

incubaron a 37 ºC por 24 horas (Holt, 1994).

Finalmente para determinar si las bacterias sospechosas eran realmente las

pertenecientes al género Salmonella, se efectuaron pruebas bioquímicas como:

reacciones a la Urea, pruebas de oxidasa, agar lisina hierro (LIA), Motilidad, pruebas

de fermentación de la glucosa y lactosa, producción de H2S, reacción de oxido-

fermentación (OF) y prueba de tinción Gram. Para el caso de las cepas de

Salmonella sp, las pruebas bioquímicas típicas deben tener como resultado: Urea

(-), Oxidasa (+), LIA (+), Motilidad (+), Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (+), OF (+) y

Gram (-) (Holt, 1994).

5.11.- Determinación de especie de Salmonella.

Se efectuó la determinación de la especie de Salmonella, mediante la técnica del

Test API-20E (Sistema de identificación multipruebas). La batería de pruebas API-

20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia

Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram (-). Básicamente consta de 21 tests

bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este sistema

presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas

a la vez. Cada tira de API-20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos

132

sustratos (medios) deshidratados (Tabla 12). Cada tubo es una prueba bioquímica

distinta. La prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.

Tabla 12.- Pruebas bioquímicas presentes en este sistema API-20E

Prueba Reacción / Enzimas

ONPG Beta-galactosidasa

ADH Arginina deshidrolasa

LDC Lisina descarboxilasa

ODC Ornitina descarboxilasa

CIT Utilización del citrato

H2S Producción de H2S

URE Ureasa

TDA Triptófano desaminasa

IND Producción de indol

VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer)

GEL Gelatinasa

GLU Fermentación/oxidación de glucosa

MAN Fermentación/oxidación de manitol

INO Fermentación/oxidación de inositol

SOR Fermentación/oxidación de sorbitol

RHA Fermentación/oxidación de ramnosa

SAC Fermentación/oxidación de sacarosa

MEL Fermentación/oxidación de melobiosa

AMY Fermentación/oxidación de amigdalina

ARA Fermentación/oxidación de arabinosa

OX Citocromo oxidasa

A partir de una colonia bien aislada del microorganismo a ser identificado, se

efectuó una suspensión en 5 mL de solución salina (1 % de NaCl), siguiendo las

instrucciones del fabricante del sistema de identificación multipruebas).

133

134

Se lleno con la suspensión bacteriana preparada, con ayuda de una pipeta estéril,

los tubos, no la cúpula (cada pocillo posee un tubo y una cúpula, parte aerobia) de

todos los pocillos. Se lleno la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión

de bacterias. Luego se cubrió con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC,

ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.

Posteriormente, se colocó la tira del Kit API-20E, en su propia cámara húmeda de

incubación. Previamente se colocó agua en los alvéolos de la cámara para

proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación a 37ºC durante 18-24

horas.

Tras la incubación se anotaron los resultados inmediatos y la interpretación de los

resultados se llevó a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de

las tablas de lectura (Tabla 13), anotando el resultado como positivo o negativo

según el caso. Luego, del conjunto de reacciones y resultados se obtuvo un perfil

numérico de 7 cifras. Los pocillos están separados en grupos de tres: en total

tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test número 21 corresponde al test de

la oxidasa).

Para la obtención del perfil numérico de 7 cifras, a cada pocillo se le asignó el valor

0, 1, 2 ó 4, de acuerdo a los siguientes criterios:

a) Si la reacción fue negativa se le asigno el valor de cero (0).

b) Si la reacción fue positiva se le asignó: uno (1) si es el primer pocillo de un

triplete, dos (2) si es el segundo, y cuatro (4) si es el tercero, y así sucesivamente se

le da su valoración especifica.

c) Se sumaron los valores de cada triplete, y con las sumas de los siete tripletes se

obtuvo un código de 7 cifras. Con este código se buscó en la tabla de identificación

la especie de que se trata (Tabla 14).

Tabla 13.- Tabla de resultados positivos y negativos del sistema de identificación multipruebas API-20E

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo

ADH Arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja

LDC Lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

CIT Utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa

H2S Producción de H2S sin precipitado negro precipitado negro

URE Ureasa amarillo rojo o naranja

TDA Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo

IND Producción de indol amarillo color rosa o anillo rosa-rojo

VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo

GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento

GLU Fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo

MAN Fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo

135

Tabla 13.- Tabla de resultados positivos y negativos del sistema de identificación multipruebas API-20E (Continuación).

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo INO Fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo

SOR Fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo

RHA Fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo

SAC Fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo

MEL Fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo

AMY Fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo

ARA Fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo

OX Citocromo oxidasa

136

Tabla 14.- Identificación de especies de bacterias según su perfil numérico (Sistema de Identificación “API-20E”)

Perfil # Especie Perfil # Especie

0104140 Shigella flexneri 0776000 Proteus mirabilis

0104452 Salmonella paratyphi A 1000004 Pasteurella sp.

0104504 Pasteurella multocida 1014743 Klebsiella ozaenae

0104521 Yersinia enterocolitica 1104112 Shigella sonnei

0140004 Pasteurella multocida 1214012 Yersinia pseudotuberculosis

0144042 Shigella boydii 1214773 Klebsiella pneumoniae

0206042 Acinetobacter calcoaceticus 2206004 Pseudomonas aeruginosa

0210004 Achromobacter sp. 2504752 Salmonella spp.

0210004 Alcaligenes faecalis 3005573 Enterobacter cloacae

0210004 Alcaligenes sp. 3246527 Aeromonas hydrophilia

0314000 Proteus mirabilis 4004550 Salmonella cholerasuis

0504512 Salmonella paratyphi A 4004550 Salmonella typhi

0676001 Proteus vulgaris 4104100 Salmonella gallinarun

3005573 Enterobacter cloacae 4104100 Salmonella gallinarun

3246527 Aeromonas hydrophilia 4357106 Vibrio parahemolyticus

4004550 Salmonella cholerasuis 4404112 Salmonella gallinarum

4004550 Salmonella typhi 4404510 Salmonella cholerasuis

4104100 Salmonella gallinarun 4404540 Salmonella tiphy

5.12.- Análisis estadístico.

Cada muestra fue analizada por triplicado, se les determinó la media y desviación

estándar

137

Propiedades Funcionales 6.- Estudios de solubilidad de proteínas de materias primas

6.1.- Muestras analizadas

Se usaron las siguientes materias primas: de origen animal (Harina de lombriz

(Eisenia andrei) [HLF]; Harina de pescado Cumaná [HPC]; Harina de pescado Perú

[HPP]; Harina de pescado importada [HPI]; Harina de Pescado a base de trucha de

descarte (HPT); Harina de carne y hueso [HCH]; y Caseína nativa de leche [CN]), y

de origen vegetal (Harina de maíz amarillo (Zea mays L.) [HMA]; Harina de afrecho

de trigo (Triticum aestivum (L.)Thell [HAT] y Harina de hojas de leucaena (Leucaena

leucocephala) [HHL]).

6.2.- Equipos

Se utilizaron los siguientes equipos: Balanza analítica OHAUS®; Bio-destilador de

agua Modelo LY marca KALSTEIN; Granizador de hielo marca SCOTSMAN;

Desmembrenador sonicador marca FISHER SCIENTIFIC, Modelo 500, punta de

sonicación BRANSON Modelo 1020; Centrifuga marca HETTICH; pH-metro-

conductímetro marca DENVER Modelo 220; Plancha de agitación automática,

Modelo 205, marca VWR SCIENTIFIC; Espectronic UV/Visible marca GENESYS 10

UV; Micropipeta de 2-1000 μL marca DAIGGER®, Jeringa para HPLC de 0-100 μL

marca VARIAN, beakers de 40, 400 y 1000 mL, Balones aforados de 25, 500, 1000

y 2000 mL, espátulas metálicas, tubos plásticos FALCON de 50 mL.

6.3.- Reactivos

Se utilizaron los siguientes reactivos: Soluciones de NaOH y HCl 0,1 N y 0,5 N;

preparadas a partir de NaOH en pastillas marca RIEDEL-DE HAËN Sigma Aldrich

Laborchemikalien y HCl min. 37% M=36,46 g/mol, marca RIEDEL-DE HAËN Sigma

Aldrich chemic; agua milliQ pH 7,02; Folin & Ciocateu´s, Fenol Reagent, marca

138

SIGMA; tartraro de sodio potasico (COOK (CHOH)2 COONa-4H2O), PM = 282,23

g/mol marca RB; carbonato de sodio (Na2CO3) marca J.T. Baker; hidróxido de sodio

(NaOH) min 99%, M = 40 g/mol marca REIDEL-DE HAËN; sulfato de cobre (CuSO4

5H2O) M = 249,68 g/mol marca MERCK

6.4.- Valoración de proteínas por el método de lowry

6.4.1.- Fundamento teórico

El método de Lowry et al. (1951) es un método colorimétrico de valoración

cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un

complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color de la disolución

resultante proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de

Lambert-Beer.

Para la determinación de la concentración de proteínas de las muestras problema

se construyó una curva patrón o de calibrado a partir de una solución patrón

(Albúmina de huevo a 20 mg/ml), y la concentración proteica de las muestras se

determinó por interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón. El

tubo 1, que sólo contenía agua destilada y los reactivos, sirvió de blanco para el

ajuste del colorímetro a cero de absorbancia.


A partir de los valores en concentración de proteínas de las muestras

seleccionadas, se procedió mediante una hoja de cálculo Excel a calcular las

cantidades necesarias para preparar las soluciones madres al 2% de proteína

(Tabla 15). Luego las cantidades calculadas fueron colocadas en tubos Falcón

plásticos de 50 mL de capacidad, se les adicionó 100 µL del cocktail de inhibidores

de proteasas y se llevo a un volumen de 10 mL. Seguidamente las muestras dentro

del tubo Falcón fueron ubicadas en el interior de otro beakers de 250 mL contentivo

de hielo granizado para protección del proceso y evitar daños por calentamiento de

139

la muestra, se sonicaron por 3 min con intervalos de 10 seg de proceso y 10 seg de

descanso. Finalizado el proceso de rompimiento de membrana, las muestras fueron

centrifugadas a 3500 rpm por un periodo de 15 min. Se recupero el sobrenadante y

se llevo a balones aforados de 100 mL, luego se completo el aforo y se trasvaso la

muestra a frascos plásticos previamente rotulados, de este modo se obtuvieron las

soluciones madres al 2%, es decir con una concentración proteica de 20 mg/mL.

Las muestras se mantuvieron bajo refrigeración a 4ºC en baño de hielo antes de su

procesamiento.

De cada solución madre al 2%, se tomaron 10 mL que fueron trasvasados a beakers

de 40 mL, y a este volumen se les ajusto el pH (con soluciones de HCl y NaOH al

0,1 M y 0,5 M) en un rango de 3 a 7. Esta metodología se realizó según protocolo

de Medina (1992) pero con algunas modificaciones.

Tabla 15.- Porcentajes de proteína de las muestras analizadas y cantidades de de muestra a pesar para preparación de soluciones madres al 2% de proteína.

Muestra % de Proteína Cantidad de Muestra (g) HLF 67,48 2,964

HPC 59,29 3,373

HPP 70,02 2,856

HPI 68,00 2,941

HCH 47,73 4,190

HCA 100,00 2,000

HMA 7,63 26,212

HAT 16,77 11,926

HHL 23,13 8,647

HLF: Harina de lombriz (Eisenia andrei); HPC: Harina de pescado Cumaná; HPP: Harina de pescado Perú; HPI: Harina de pescado importada; HCH: Harina de carne y hueso; HCA: Harina de Caseína; HMA: Harina de maíz amarillo (Zea mays L.); HAT: Harina de afrecho de trigo (Triticum aestivum (L.)Thell; HHL: Harina de hojas de leucaena (Leucaena leucocephala)

140

Todas las muestras fueron mantenidas en frío durante el proceso, y llevadas a

balones aforados de 25 mL, se completo el aforo con agua destilada pH 7,02, se

agitaron los balones y el volumen resultante se centrifugo a 4000 rpm por 15 min, se

recupero el sobrenadante y cada solución procesada de acuerdo a la gama de pH

con intervalos de 0,5; fueron trasvasados a tubos eppendorf previamente rotulados y

llevados a congelación a -20ºC, para posteriormente ser utilizados en el análisis y

construcción de la curva de índice de solubilidad.

Se preparo una curva para el calculo de la concentración de la proteína soluble,

usando la albúmina de huevo como patrón, y esta se construyo con volúmenes de 0,

5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 microlitros (µL); y se completo el volumen de cada

tubo hasta 600 µL, seguidamente se les adicionó 3 mL de Solución C y 0,3 µL de

solución de Folin. Para el caso de las muestras (con rango de pH de 3 a 7) se

manejaron volúmenes de 80 y 160 µL, y se completo en volumen con 520 y 440 µL

de agua destilada, para llegar a los 600 µL necesarios para el análisis. Luego se les

adiciono 3 ml de solución C y 0,3 µL de solución de Folin.

Las soluciones necesarias para el análisis fueron: a) La solución A de CO3Na2 al

dos (2) % en NaOH 0,1 N. Para ello se tomaron veinte (20) g de CO3Na2 se

disolvieron en 100 mL del NaOH 0,1 N y se llevaron a un balón aforado de 1000 mL,

donde se completo el aforo con la solución de NaOH 0,1 N; b) La solución B1,

correspondió a una preparación de CuSO4. 5H2O al uno (1) % en agua destilada,

para ello se pesaron dos (2) g del reactivo y se colocó en un balón aforado de 200

mL, se le adicionó un volumen de 25 mL de agua destilada y se completo el aforo

hasta 100 mL; y c) La solución B2, de tartrato de sodio potasico al dos (2) % en

agua, para ello se tomaron 4 g del reactivo y se llevaron a un balón aforado de 200

mL de agua destilada, se le adiciono un poco de agua y se completo el aforo con

agua destilada hasta los 200 mL.

Se preparo el reactivo C, a partir de las soluciones A, B1 y B2; de la siguiente

manera: se multiplico el volumen requerido de solución C (3 mL) por el numero de

tubos totales (9 de la curva patrón + 18 del rango de pH de la muestra + 2 de la

solución madre inicial = 29 tubos) lo cual dio un total de 87 mL necesarios de

141

Solución C, luego se dividió este valor de 87 entre 100 para obtener la cantidad a

adicionar de solución B1 y B2, en este caso 0,87 mL (870 µL) de solución B1 y 0,87

mL (870 µL) de B2; luego al adicionarle esta solución, tanto a los tubos de la curva

patrón como de las muestras (rango de pH), estos fueron sometidos a agitación con

la ayuda de un Vortex Genie® marca DAIGGER, y luego se dejaron en reposo por

un periodo de tiempo de 10 min. Transcurrido este tiempo, se adicionó a cada tubo

el reactivo de Folin (diluido a la mitad), para ello se efectuó del mismo modo el

calculo necesario, es decir, se multiplico el volumen requerido (0,3 mL) del reactivo

por el numero de tubos totales (29) lo cual dio un total de 8,7 mL, este valor se

dividió entre 2 para el calculo de la dilución (1/2), y dio un total de 4,35 mL, por lo

cual para la preparación de la solución se necesitó 4,35 mL del reactivo de Folin +

4,35 mL de agua milli-Q pH 7,02. Al adicionar a los tubos la solución de Folin, del

mismo modo se agitó cada tubo con el vortex y luego estos se colocaron en

oscuridad por un lapso de tiempo de 30 min, para que se desarrolle completamente

la reacción coloreada (gama de transparente a color azul claro y oscuro

dependiendo de la concentración de proteína de la muestra).

Finalizado el tiempo reglamentario, se llevaron los tubos al equipo Espectronic

UV/Visible marca GENESYS 10 UV Termo electrón corporation, encendido media

hora antes de cada determinación, para efectuar la lectura correspondiente a 650

nm. Durante este proceso se montó primeramente el tubo 1, contentivo con el

blanco sin muestra, y se calibró el quipo a 0,000 Abs. Posteriormente se fue

incorporando cada tubo de la solución correspondiente a la curva de calibración

(soluciones con diferentes concentraciones de albúmina de huevo) y seguidamente

se comenzaron las lecturas de las muestras en estudio a los diferentes valores de

pH.

Se efectuó la determinación del índice de solubilidad (%), mediante la siguiente

formula:

100x)mL/mg(muestraladeproteicaiónConcentrac

)mL/mg(tesobrenadandelproteicaiónConcentrac(%)ilidadlubSodeÍndice =

142

Con los valores obtenidos de solubilidad se construyeron curvas para evaluar el

comportamiento de las proteínas de cada muestra por efecto de la variación del pH.

Para el estudio de solubilidad de las materias primas, se construyeron curvas para

evaluar el efecto del pH sobre el índice de solubilidad (%). 7.- Capacidad de Absorción de agua y grasa Se analizó la capacidad de absorción de agua de las mismas materias primas

evaluadas en el estudio de solubilidad, exceptuando la caseína.

7.1.- Capacidad de absorción de agua.

Se preparó una suspensión acuosa del concentrado proteico seco (10% p/v), para

ello se pesaron 2,5 g de muestra en un tubo Falcón de 50 mL, y se llevaron a 25 mL

con agua destilada, se agitó durante 30 seg en un agitador Vortex y luego 30 min en

un agitador reciprocante a 25°C. La preparación se centrifugó (12.000g/20 min)

descartándose el sobrenadante. La diferencia entre el peso húmedo del sedimento y

el peso seco inicial proporcionó la cantidad de agua absorbida, expresándose los

resultados como g agua/g proteína (Pacheco y Rivas, 1992).

7.2.- Capacidad de absorción de grasa

Se mezclaron 4 mL de aceite de maíz con 0,5 g de la muestra en un tubo de

centrífuga Falcón de 50 mL. La mezcla se dejó reposar durante 30 min a 25°C y

seguidamente se centrifugó (12.000 g/25 min) descartándose el sobrenadante. La

diferencia entre el peso del sedimento obtenido y el peso seco inicial proporcionó la

cantidad de aceite retenido, expresándose los resultados como g aceite/g proteína

(Otero et al., 2000).


Para los análisis de capacidad de absorción de agua y aceite de las materias

primas, se efectuaron medias con sus respectivas desviaciones estándar.

143

Técnicas especiales 8.- Evaluación del peso molecular de las proteínas de materias primas

nacionales y alimentos comerciales (dos nacionales y un importado) en geles de poliacrilamida SDS-Page.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS-PAGE y mercaptoetanol, ha sido

una herramienta útil, para la caracterización de proteínas en determinados

alimentos.

La importancia que se le ha dado a este método para aplicarlo en la industria

alimentaría, se debe a que a través de él, se pueden separar e identificar proteínas,

las cuales podrían tener características tecnofuncionales importantes para

incorporarlas en algunos alimentos, de allí el interés de estudiar las proteínas de las

materias primas, incluida la lombriz de tierra, para ver su posible utilización en la

formulación de alimentos concentrados para peces.

Para la determinación del peso molecular de las proteínas, es más comúnmente

utilizado la técnica SDS-electroforesis de geles de poliacrilamida (PAGE-SDS),

donde las proteínas son separadas básicamente en función de su geometría, masa

molecular y forma (Linden, 1991; Bollag y Rozycky, 1994).

8.1.- Equipos

Se trabajo con los siguientes equipos: Balanza analítica OHAUS®; Bio-destilador de

agua modelo LY marca KALSTEIN; Plancha de agitación automática, Modelo 205,

marca VWR SCIENTIFIC; Granizador de hielo marca SCOTSMAN;

Desmembrenador sonicador marca FISHER SCIENTIFIC Modelo 500, con punta

BRANSON Modelo 1020; Centrifuga marca HETTICH; pH-metro y conductímetro

marca DENVER, Modelo 220; Fuente de Poder marca EC 105, marca THERMO

ELECTROM CORPORATION; Mini equipo electroforesis vertical EC 120 (Mini

Vertical Gel System) marca Termo EC. Baño María (110ºC) marca PROLABCA.

144

Tras iluminador marca SPECTROLINE BIO-VISIONTM, Escáner marca EPSON

Perfection 3490 Photo.

8.2.- Reactivos

8.2.1.- Cocktail de inhibidores de proteasas

Se utilizo un cocktail de inhibidor de proteasas Numero P8340, marca SIGMA

P8340- 1 mL. Los extractos celulares crudos contienen un gran número de enzimas

endógenas, como proteasas y fosfatasas, que son capaces de degradar proteínas

en los extractos acuosos.

Las propiedades inhibitorias específicas de sus componentes son:

AEBSF – [4-(2-Aminoethil) benceno sulfonil fluoruro hidrocloridre – Serian

proteasa.

Aprotinina – Serina proteasa

Hidrocloridro de Bestatina – Aminopeptidasa

E-64 – [N-(Trans-Epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida] - cisteína

proteasa.

Sal de hemisulfato de leupeptina, ambas proteasas de serina y cisteína

Pestatina A, proteasas acidas.

8.2.2.- Patrón de peso molecular

Se uso el estándar de peso molecular Invitrogen Corporation NuPAGE® NOVEX Bis-

Tris 4-12 % de Gel, con un rango de valores de pesos moleculares expresados en

Kilo-daltons (KDa) de 250 a 4.

Las diez (10) bandas presentes en este patrón de peso molecular corresponden a la

Miosina, fosforilasa, albúmina de suero bovino (BSA), glutámico deshidrogenada,

alcohol deshidrogenasa, carbónica anhidrasa, mioglobina roja, lisozima, aprotinina e

insulina cadena B, cuyos valores en KDa se muestran en la figura 9.

145

Figura 10.- Bandas proteicas del patrón de peso molecular Invitrogen

Corporation, con sus pesos en Kilo-daltons (KDa).

8.2.3.- Reactivos para preparación de soluciones Para el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, se utilizaron

los siguientes reactivos:

Acrilamida grado reactivo al 98 %. PM = 71,08 g mol-1 Marca REIDEL-DE

HAËN

Sódio Tiosulfato Pentahidratado, PM = 248,18 g mol-1, grado reactivo, marca

SCHARLAU CHEMIE S.A.

146

Glicina, 75,07 g mol-1, Ultra pura Bioreagent, marca J.T. BAKER

TRIS [Tris (hidroximetil)-aminometano] (C4H11NO3) sustancia tampón, grado

reactivo, M = 121,14 g mol-1. Marca MERCK

Glicerol PM = 92.09382 UMA, marca DIDACTA C.A.

Dodecil sulfato de sódio (SDS) o Sódio Laurilsulfato Extra puro, 95 %. PM =

288,38 g mol-1; Marca SCHARLAU CHEMIE S.A.

Azul Brillante Coomassie R 250, M.=825,99 g mol-1; para microscopia, marca

RIEDEL-DE HAËN

Azul de bromofenol, M = 669,97 g mol-1; marca REIDEL-DE HAËN

N,N´-Metilen diacrilamida o Bis-acrilamida, marca REIDEL-DE HAËN,

SEELZE-HANNOVER

Peroxodisulfato de amonio, grado analítico, PM = 228,20 g mol-1. Marca

MERCK

Acido acético, 99, 8%; marca FLUKA, REIDEL-DE HAËN, Sigma Aldrich

Chimie

β-mercaptoetanol, PM = 78.13 AMU

Acido Tricloroacetico, min 99,5 %, PM = 163,39 g mol-1, MARCA REIDEL-DE

HAËN, Sigma Aldrich Chimie.

8.3.- Procedimiento de preparación de soluciones estándar usadas en el análisis de proteínas por electroforesis SDS-PAGE

Las soluciones estándar utilizadas en el análisis electroforético, se prepararon de

acuerdo a la Tabla 16 (Manual práctico del Laboratorio de Enzimología, Escuela de

Biología, Facultad de Ciencias, ULA-Mérida).

147

Tabla 16.- Soluciones estándar utilizadas en el análisis electroforético SDS-PAGE

Solución Preparación

Acriilamida-Bisacrilamida, 36:1

Se disolvieron 58,42 g de acrilamida y

1,59 g de bis-acrilamida en 100 mL de

agua destilada, se enrasaron en un

balón aforado hasta 200 mL, y la

solución obtenida se colocó en un frasco

de color ámbar y se almacenó a 4º C.

Buffer de muestra, pH 6,8 Se disolvieron 1,52 g de Tris, 20 mL

glicerol, 4,60 g de SDS en 100 mL de

agua destilada. Se ajustó a pH 6,8 con

HCl 12 N y luego se agregaron 10 mL de

2-mercaptoetanol. Se enraso en un

balón aforado hasta 200 mL. Y la

solución se almacenó en frasco de color

ámbar a 4º C.

Buffer de Corrida, pH 8,3 Se disolvieron 14,26 g de glicina, 3,03 g

de Tris y 1 g de SDS en 600 mL de agua

destilada, y se enraso en un balón

aforado hasta 1000 mL. La solución

obtenida se almacenó a 4º C.

148

Tabla 16.- Soluciones estándar utilizadas en el análisis electroforético SDS-PAGE (Continuación).

Solución Preparación

Buffer Lower, pH 8,8

Se disolvieron 91 g de Tris y 2 g de SDS

en 300 mL de agua destilada, se ajusto

el pH a 8,8 con HCl 12 N y se enraso en

un balón aforado hasta 500 mL, luego se

almacenó a 4º C.

Buffer Upper, pH 6,8 Se disolvieron 12 g de Tris y 0,8 g de

SDS en 100 mL de agua destilada, se

ajusto el pH a 6,8 con HCl 12 N y se

enraso en un balón aforado hasta 200

mL, luego se almacenó a 4º C.

Solución Colorante Se utilizo 0,1% (p/v) de azul brillante

Coomassie R-250, 50% (v/v) de metanol,

2% (p/v) TCA, y 100 mL con agua

destilada.

Solución Decolorante Se uso 30 % (v/v) de metanol, 7,5 %

(v/v) csp 100 mL con agua destilada.

8.3.1.- Tratamiento de la muestra y preparación de lisados

proteicos de las muestras

Se efectuó la determinación del porcentaje de proteína de cada muestra y según su

contenido se pesaron las siguientes cantidades: 0,325 g HLF; 0,425 g HLT; 0,351 g

HCH; 0,371 g HPC; 0,752 g HHL; 1,174 g HMA; 0,620 g HAT y 0,476; 0,418 y 0,381

g de las dietas comerciales A, B y C, respectivamente, para obtener soluciones de

149

proteína al 1%. Estas fueron transferidas en tubos de centrifuga de 50 mL de

capacidad y se adiciono 5 μL de un cocktail de inhibidor de proteasas marca

SIGMA y 10 mL de agua destilada. A continuación estas fueron colocadas en baño

de hielo y sonicadas por 3 min. con intervalos de proceso de 10 seg. de encendido

(ON) y 10 seg. de descanso (OFF) en un equipo Sonic Dismembrator Fisher

Scientific Modelo 500. Posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 3500 rpm

durante 15 min. Estas muestras fueron utilizadas para el análisis en geles de

concentración estándar (8 cm de ancho por 7,5 cm de largo).

8.3.2.- Preparación de las muestras utilizadas en electroforesis SDS-PAGE

La preparación de muestras se efectuó de la siguiente manera: se midió 50 μL de

cada lisado proteico, y se transfirió a tubos de eppendorf junto con 25 μL de buffer

de muestra (Tabla 16) y 5 μL de solución de azul de bromofenol. Estos lisados

proteicos fueron calentados a 100 ° C durante 5 minutos y conservados en

congelación a -20 ºC.

8.4.- Condiciones de la corrida electroforética de las muestras analizadas.

En la caracterización de las proteínas presentes en las muestras analizadas (HLF,

HLT, HCH, HPC, HHL, HMA, HAT y dietas A, B y C) se prepararon geles de

poliacrilamida al 12,5 % usando como medio desnaturalizante SDS-2-

mercaptoetanol según metodología de Laemmli (1970) y un estándar de peso

molecular Invitroven Corporation NuPAGE® NOVEX (250-4 KDa) como referencia.

La migración se realizó en un equipo de electroforesis vertical EC 120 Mini Vertical

Gel System marca Termo EC a 20 mA durante 15 min y luego 40 mA durante 1

hora en un buffer Tris-glicina-SDS a pH 8,3 utilizando una fuente de poder EC 105

marca Termo EC. Los electroforogramas fueron fijados y coloreados usando

solución de azul brillante Coomassie R-250 al 0,1 % (p/v) con ácido tricloroacético

(TCA) y decolorados según protocolo de Girardet et al., 1991.

150

8.5.- Determinación del peso molecular de los lisados proteicos en geles de poliacrilamida

Para la determinación de los pesos moleculares de las proteínas de los lisados

proteicos, se prepararon geles usando un porcentaje de acrilamida de 12,5 %, de

acuerdo al rango de peso molecular de las proteínas que se quieren determinar

(Tabla 17) (Manual de métodos del Laboratorio de Enzimología, Escuela de

Biología, Facultad de Ciencias, ULA-Mérida). Las cantidades de cada reactivo para

la preparación de los geles de pre-concentración y separación se muestran en la

Tabla 18.

Para la preparación de los geles, se procedió inicialmente al ajuste de los vidrios del

equipo, efectuando el montaje de los mismos en el soporte respectivo, luego se

procedió a marcar, con la ayuda de los peines, la distancia (1/2 cm) entre los geles

de separación y preconcentración, para posteriormente iniciar la preparación del gel

de separación (Tabla 18). Se adicionó el volumen necesario entre los vidrios, se

ajustó con agua destilada para alinear el gel en la parte superior y se esperó a que

ocurriera la polimerización. Una vez polimerizado, se extrajo el agua de los vidrios y

se inicio la preparación del segundo gel de preconcentración (Tabla 18), se coloco la

solución respectiva dentro de los vidrios y se ubico los peines responsables de la

formación de los pozos, luego se espero a su polimerización completa.

Una vez preparados los geles, se procedió a transferir los vidrios al soporte de

conexión del campo eléctrico, se introdujo seguidamente en la cámara

electroforética, y se le adicionó el buffer de corrida pH 8,3 (Tabla 16) en el centro del

soporte de vidrios hasta llenar completamente los pozos. El siguiente paso fue

inyectar en cada pozo 30 μL de los lisados proteicos preparados y 5 μL de patrón

de peso molecular. Para este análisis de SDS-PAGE, se utilizó un estándar de

rango de peso molecular de 4 a 250 Kilodaltons (SIGMA) como referencia.

151

Tabla 17.- Rango de peso molecular de las proteínas estándares para su separación por electroforesis SDS-PAGE, de acuerdo al porcentaje de acrilamida

Rango de peso molecular

(Kilodaltons)

1 2 (mL)

3 (mL)

4 (mL)

5

(μL)

6

(μL)

200 - 70 5 9,3 4 2,7 40 20

150 - 40 7,5 8,0 4 4,0 30 15

100 - 20 10 6,7 4 5,3 25 12,5

70 - 10 12,5 5,3 4 6,7 20 10

50 - 8 15 4,0 4 8,0 15 10

1 = % de Acrilamida; 2 = Agua destilada; 3 = Buffer Lower pH 8,8; 4= 30 % de Acrilamida; 5 = 10 % de persulfato de Amonio; 6 = Temed (μL).

Para la cuantificación de los pesos moleculares de las proteínas usando SDS-PAGE

se realizó una curva patrón para cada uno de los geles obtenidos. La elaboración de

esta curva fue obtenida midiendo los Rf (distancia en cm recorrida por la proteína

entre la distancia total del gel de separación) tanto para el patrón como para las

muestras (Hammes y Rickwood, 1990).

A partir de los valores de Rf del patrón, con los respectivos valores conocidos de

pesos moleculares, en KDa, de sus proteínas, se construyo la curva, que sirvió de

base para calcular los pesos moleculares de las bandas proteicas de las muestras

en estudio.

152

Tabla 18.- Metodología para la preparación de los geles en electroforesis SDS-PAGE

Gel Preparación

Gel de Separación Se pipetearon 2,65 mL de agua destilada y se colocaron

en un beakers de 40 mL, luego se le adicionaron 2 mL

de buffer Lower pH 8,8; 3,35 mL de solución de

acrilamida al 30 %; 2 mg de persulfato de amonio, este

se agito hasta disolver completamente e

inmediatamente se le adiciono 10 μL de TEMED, se

agito rápidamente por unos segundos.

Gel de Preconcentración Se pipetearon 2,95 mL de agua destilada y se

trasvasaron a un beakers de 40 mL, luego se le

adicionaron 1,25 mL de buffer Upper pH 6,8; 0,8 mL de

solución de acrilamida al 30 %; 2 mg de persulfato de

amonio, este se agito hasta disolver completamente e

inmediatamente se le adicionaron 5 μL de TEMED, se

agito rápidamente por unos segundos.

9.- Análisis de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas

9.1.- Materias primas

Se analizaron las materias primas de origen animal: a) Harina de lombriz (Eisenia

andrei) [HLF] fabricada en el Laboratorio de Bromatología del Departamento de

Ciencias de Alimentos de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la ULA, Mérida;

b) Harina de pescado Cumaná [HPC], suministrada por las empresas procesadoras

de harina de pescado del estado Sucre, mediante la colaboración del Instituto

Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA); c) Harina de pescado a base de

153

trucha de descarte [HPT] suministrada por la estación experimental del INIA-Mérida;

d) Harina de carne y hueso [HCH], adquirida de la Empresa, Frigorífico Industrial

Los Andes, C.A. (F.I.L.A.C.A.), ubicada en el Sector Mucujepe del estado Mérida; e)

Harina de pescado Perú [HPP], suministrada por la Universidad La Molina, de Lima

Perú. Las materias primas de origen vegetal evaluadas fueron: a) Harina de maíz

amarillo (Z. mays L.) [HMA]; b) Harina de afrecho de trigo (T. aestivum (L.)Thell )

[HAT] y c) Harina de hojas de leucaena (L. leucocephala) [HHL]. Las dos primeras

fueron obtenidas del mercado local y la ultima por medio del INIA-Mérida.

Se estudiaron tres (3) productos alimenticios comerciales (Trucharinas), dos de

estos nacionales (A y B) y uno importado (C), y cuatro (4) dietas experimentales

elaboradas en el Laboratorio de Bromatología de la Facultad de Farmacia y

Bioanálisis de la ULA-Mérida. La composición de estas se muestra en el capitulo III

estudios biológicos de alimentación de Trucha arco iris.

9.2.- Reactivos

Los reactivos utilizados fueron: Éter de petróleo Riedel-de Haën extra puro;

Diclorometano (CH2Cl2) extra puro, marca FISHER SCIENTIFIC; Metanol al 99,8%

marca FLUKA RIEDEL-DE HAËN, SIGMA ALDRICH CHEMIE; Tierra de diatomeas

Nº C48C57 marca J.T. BAKER; Heptano grado HPLC, PM = 100,21 g mol-1,

RIEDEL-DE HAËN; Cloruro de sodio RIEDEL-DE HAËN, SIGMA ALDRICH;

estándares de ácidos grasos metilados marca ALLTECH [Methyl Cis-9-12-

Octadecadienoato (Linoleato) (18:2) catalogo 6231820; Methyl Cis-9-Octadecenoato

(Oleato) (18:1) catalogo 6231810; Methyl Cis-5,8,11,14-Eicosatetraenoato

(Araquidonato) (20:4) catalogo 623204; Methyl tetradecanoato (Miristato) (14:0)

catalogo 623140; Methyl hexadecanoato (Palmitato) (16:0) catalogo 623160; Metil

Octadecanoato (Estearato) Catalogo 623180; y los ácidos grasos libres comerciales

cristalizados marca ALLTECH [Acido dodecanoico (Laurico) (12:0); Acido

eicosanoico (Araquidico) (20:0); Acido heptadecanoico (Margarico) (17:0), Hidróxido

de sodio (NaOH) en pastillas marca RIEDEL-DE HAËN, Nitrosometilurea y

Diazometano producidos en el Laboratorio de Química y Productos Naturales del

154

Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la

Universidad de Los Andes, ULA-Mérida.

9.3.- Equipos Se utilizo una balanza analítica Aventurer marca OHAUS, homogeneizador marca

OSTER, rota evaporador y baño de rota evaporador marca EYELA modelos Nº 1001

y SB-1000, respectivamente, desecador al vacío marca LABCONCO, Bomba de

vacío.

Para el análisis cromatográfico se utilizo un cromatógrafo de gases marca Hewlett

Packard modelo 6890 Plus equipado con detector selectivo de masas modelo HP-

5973. Se utilizó una columna cromatográfica marca Hewlett Packard de 30 metros

de largo, 0,25 mm de diámetro y 0,25 μ de espesor de película. Para la

identificación de los ácidos grasos de las muestras, se utilizó la base de datos Wiley

(6ª Ed.).

9.4.- Extracción de lípidos de las muestras estudiadas

Se pesaron por triplicado 2 gramos de cada muestra seleccionada, luego la harina

fue desgrasada por el método de Folch, et al., 1957 (Metodología detallada en el

Capitulo III). La grasa obtenida de las muestras se diluyó en éter de petróleo hasta

lograr una dilución que permitió por cada mL obtener una cantidad de grasa entre 5

y 10 mg y se transfirió a un frasco color ámbar de 10 mL de capacidad.

9.5.- Obtención del diazometano (Blatt, 1957) y metilación de ácidos grasos

Se ubicó un matraz de fondo redondo de 500 mL de capacidad, en una base de

corcho y se colocó en una balanza analítica de precisión marca METTLER, se le

coloco un embudo y se taro, luego se pesaron aproximadamente 20,6 g (0,2 de mol)

de Nitroso-Methil-Urea, seguidamente se le adicionó 250 mL de éter dietílico, luego

el matraz se colocó en el sistema de destilación previamente montado y se dejo en

155

baño de hielo a 5ºC por unos minutos con la finalidad de que la reacción se

produzca lentamente, luego se le adiciono 60 mL de Hidróxido de potasio (KOH) al

50%, se dejo por unos segundos y se cambio a un baño con agua caliente para

acelerar la reacción. La indicación de que la reacción ocurrió se evidencio por la

formación de una coloración amarilla en la solución, la cual se va destilando y se va

recuperando al extremo inferior del refrigerante donde se colocó una largadera que

pasa por un tapón de goma biperforado el cual se introdujo por debajo de la

superficie un erlenmeyer de 200 mL el cual contiene unos 40 mL de éter dietílico.

Los gases desprendidos pasan por una segunda porción de otros 40 mL de éter,

enfriado así mismo por debajo de 0 º C. El matraz de la reacción se colocó en un

baño a 50 º C y se lleva hasta un punto de ebullición del éter, agitando de vez en

cuando. Se destiló el éter hasta que pasó a incoloro, lo que suele suceder después

de haber pasado los dos tercios del disolvente. En ningún caso debe destilarse todo

el éter. Las disoluciones etéreas reunidas en los matraces colectores contienen

entre 5,3 y 5,9 gramos de diazometano (63-70 % de la cantidad teórica), que es

cantidad suficiente para las mayorías de las metilaciones de las muestras.

Debido a su baja volatilidad, los ácidos grasos, se convirtieron previamente en sus

ésteres metílicos a través de una reacción de esterificación con diazometano (Blatt,

1957) que se detalla a continuación:

R-COOH + CH2N2 R-COO-CH3

9.6.- Reacción de esterificación del ácido graso con diazometano (March, 1977).

La esterificación se efectuó colocando 7 mL de solución de diazometano en los

frascos ámbar contentivos de los pesos de grasa de las muestras en el rango de 5 a

10 mg, y se tapó la boca del frasco con un trozo de papel de aluminio provisto de

algunos orificios para facilitar la volatilización del éter etílico. Posteriormente la

156

reacción se dejó durante 24 horas a temperatura ambiente y los ácidos grasos

esterificados se obtuvieron por diferencia de peso.

9.7.- Preparación de la solución patrón del acido laurico

Se transfirieron 95,5 mg de patrón del éster etílico del ácido laurico, en un

erlenmeyer de 50 mL, y se metilaron con diazometano, luego después de 24 horas,

se disolvió la grasa metilada con 10 mL de heptano y se trasvasó a un balón aforado

de 25 mL, con la ayuda de una pipeta pasteur, se completo el aforo con heptano. La

concentración final del patrón fue estimada en 3,82 mg/mL. A cada muestra se le

adicionó 0,025 mL (25 µL) del patrón de acido laurico, con la ayuda de una jeringa

marca VARIAN. Es decir, que se adicionó a cada vial (capacidad de 2 mL) 1 mL de

la muestra y 0,025 mL del estándar interno (0,0955 mg del acido laurico). La adición

de este patrón interno a las muestras permitió la cuantificación de los ácidos grasos.

Este compuesto se encontraban ausente de la mezcla problema y su pico estaba

completamente resuelto con relación a los ácidos grasos de las muestras.

9.8.- Preparación de las muestras

Los ácidos grasos esterificados con diazometano, fueron dejados en campana de

extracción hasta la evaporación completa del agente metilante, luego fueron

disueltos en 1 mL de heptano grado HPLC y finalmente se les adicionó 25 μL de la

solución patrón del acido laurico esterificado. Un (1) mL de esta mezcla se transfirió

a un vial de 2 mL de capacidad y se colocó en el bloque de inyección del

cromatógrafo para el análisis correspondiente.

9.9.- Condiciones cromatográficas

Gas portador: He; Velocidad de flujo: 0,9 mL/min; Inyección: 1.0 μL. Modo Split:

25:1; Temperatura del inyector: 200 ºC; Programación de temperatura del horno:

temperatura inicial: 150º C, aumento de temperatura 5 º C/min hasta 300 ºC;

157

Temperatura de la Interfase: 250 º C; Modo Scan de barrido: cromatograma de

iones totales; Voltaje: 70 EV (electrón voltios); Tiempo de análisis: 30 minutos. Las

condiciones de operación del GC-MS se mantuvieron constantes para todas las

corridas cromatográficas.

9.10.- Cuantificación de ácidos grasos Los ácidos grasos fueron cuantificados tomando en consideración el porcentaje de

área de cada ácido graso presente en la muestra y el porcentaje de área del patrón

interno.

10.- Análisis de ácidos grasos de carne de lombriz (Eisenia andrei) cruda y harina, en el INRA, Saint Pée sur Nivelle, Francia

10.1.- Principio

Consiste en una trans-esterificación de lípidos por acción del metanol en presencia

de un catalizador el Trifluoruro de boro (BF3), bajo la acción del calor que permite la

formación de esteres metilicos.

10.2.- Procedimiento

Extracción inicial de lípidos totales por el método de Folch et al, 1957, luego de

saponificación, se hace un cálculo para obtener más o menos 100 mg de lípidos

totales en 0,5-1 mL de diclorometano. Luego se adiciona la potasa alcohólica a 0,5

M: 1,5 mL para 25 mg de lípidos, se coloco la mezcla dentro de frascos ámbar y se

traslado dentro de un envase metálico cerrado en la estufa a 103 °C por 10 min, se

dejo enfriar en el mesón por unos 5 min y se coloco en un baño de hielo para

detener la reacción.

Luego se realizo la metilación, se adiciono BF3 metanol al 14% (1 mL para 10 mg de

lípidos), se coloco nuevamente el frasco dentro del recipiente metálico cerrado y se

lleva nuevamente a la estufa a 103 °C por 30-40 min, se agitan de vez en cuando

158

teniendo precaución porque pueden causar explosión, se dejan enfriar y se colocan

en baño de hielo, se coloco el contenido en tubos de centrifuga, se adiciono el

mismo volumen de agua que de BF3 después 5 mL de hexano, se agitaron y se

centrifugaron a 3000 t por 5 min. Se transfirió el contenido en un embudo de

decantación y se tomo el volumen residual del tubo con 2 mL de hexano, para

recuperar todo el lípido metilado, se deja decantar de 5 a 10 min y se elimino la fase

inferior. Se recupero la fase hexanica superior y se filtro con sulfato de sodio anhidro

en un frasco, se limpia el embudo con un (1) mL de hexano y el frasco con dos (2)

mL del reactivo. El lípido recuperado se conservo bajo refrigeración a 4 °C. El

volumen final de hexano debe ser tal que permita una concentración final de 10

mg/mL.

Los ácidos grasos metilados fueron posteriormente analizados con un Cromatógrafo

de gases CPG 3800 equipado con un carrusel para la inyección automática de las

muestras. Las muestras analizadas fueron carne de lombriz fresca y harina de

lombriz (Eisenia andrei).

11.- Análisis de deformación de huesos mediante la técnica de tinción de cartílagos y huesos

11.1.- Principio

Consiste en la tinción de cartílagos y huesos de peces con el fin de observar, bajo

lupa estereoscópica, la presencia de deformaciones en la columna vertebral de los

mismos, y enunciar una hipótesis de las causas probables de los defectos presente.

11.2.- Procedimiento

Inicialmente se realizo la conservación de las muestras de alevines en formol al 10%

por un (1) mes aproximadamente, bajo condiciones de oscuridad. Luego se

realizaron dos lavados por 20 minutos con agua destilada, y se procedió a colorear

los cartílagos, por 48 horas, con una solución de azul de alcian previamente

preparada.

159

Transcurrido el tiempo de coloración inicial, se procedió a la rehidratación con baños

a base de soluciones de alcohol bajos las siguientes condiciones:

2 horas en alcohol al 95 %





2 horas en agua destilada

Luego el siguiente paso fue el blanqueado con una solución de agua oxigenada al

3% y KOH al 1% (1V: 9V) con una duración de 12 horas. En vista de que ocurre la

incorporación de oxigeno dentro del cuerpo del pez, es necesario extraer el O2 del

mismo con ayuda de una jeringa de insulina, para evitar que floten en la solución.

Seguidamente se realizó una “digestión de la proteína” con una solución a base de 7

volúmenes de agua destilada, 3 volúmenes de solución saturada de Borato de sodio

y de 0,3 a 0,5 g de Tripsina (enzima pancreática que digiere las proteínas) por 48

horas.

Posteriormente se realizo la coloración de huesos por 48 horas con una solución a

base de KOH al 1% y unas gotas del colorante Rojo de Alizarina. Se lavaron luego

de la tinción con agua destilada por 20 minutos y se sumergieron en un baño de

KOH al 1% por 20 min. Finalmente los peces fueron tratados por un (1) día en una

mezcla de 40% de glicerina y 60% de KOH al 1%; uno (1) a dos (2) días en una

mezcla de 70% glicerina y 30 % KOH al 1% y uno (1) a dos (2) días en glicerina al

100% mas un (1) gramo de Thymol.

El paso siguiente consistió en hacer el montaje para observar las características

presentes de cartílagos y huesos de los peces en estudio y la toma de fotografías

necesarias.

160

Estudios Biológicos

12.- Estudios biológicos de utilización de la harina de lombriz (Eisenia andrei) en la alimentación de trucha arco iris, efectuado en el INRA (Saint Pée sur Nivelle, Francia).


Se utilizo como materias primas: harina de lombriz (Eisenia andrei) [HLF] procesada

en la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes. Mérida,

harina de pescado Cumaná [HPC] suministrada por el INIA (Instituto de

Investigaciones Agropecuarias) Cumaná, elaborada a partir de desechos de

pescado de fábricas ubicadas en el estado Sucre, Venezuela.

Las otras materias primas europeas utilizadas fueron suministradas por el INRA

Saint Pee sur Nivelle, las mismas fueron harina de pescado noruego [HPN], harina

de maíz entero [HME], harina de afrecho de trigo [HAT], además de otros

ingredientes como: aceite de pescado, mezclas de vitaminas, mezcla de minerales y

alginato de sodio. Todas adquiridas de proveedores oficiales del INRA.

12.2.- Análisis proximal de materias primas

Se realizo el análisis proximal [materia seca (MS), humedad (H), proteína bruta

(PB), grasa bruta (GB), energía (E), cenizas (C) y por diferencia entre todos,

excluyendo la E y MS, se obtuvo el contenido de extractos no nitrogenados brutos

(ENNB)] de materias primas venezolanas [harina de lombriz (HLF) y harina de

pescado Cumaná (HPC)]; y materias primas europeas [harina de pescado noruega

(HPN), harina de maíz entero (HME) y harina de afrecho de trigo (HAT)], la HPC por

contener una composición heterogénea de materiales (partículas de diferentes

tamaños) fue necesario someterla a molido inicial para tener uniformidad en los

análisis posteriores, para ello se utilizo un equipo de molido mecánico, marca

MADO, modelo: PRIMUS MEW 613-82/2. Todos los análisis fueron realizados en el

161

Laboratorio de Análisis Físico-químicos, de acuerdo al manual de laboratorio del

INRA, Saint Pee sur Nivelle, Francia.

12.2.1.- Equipos utilizados

Los equipos usados en los análisis fueron: Estufa MEMMERT, 03P144906,

calibrada a 110 ºC (Análisis de Humedad); Equipo de vació para desecador KNF

NEUBERGER, modelo LABOPORT (Análisis de Humedad, Ceniza, Grasa); Kjeltec

Analyzer Unit, modelo 2300, FOSS TECATOR. 98P115265; Digestor FOSS, modelo

2040, BASED TECATORTM Technology; Zoster automatic, marca GERHARDT,

92P071262 (Análisis de Proteína); Baño de Maria GALLENKAMP REGOL,

9222785033420 (Análisis de Fósforo); Sauerstoff Füllstation C48; Calorimeter IKA,

modelo C 4000, adiabatic (Fósforo), IKA® –ANALYSENTECHNIK HEITERSHEIM,

92P071259 (Análisis de Energía); Termo Haake K10, 01P135440; Termo Haake DC

10; Balanza EM-3000 (3 kg x 1 g), Matfer; Balance Analitical, Sartorius BP2215 max.

220 g d= 0.1 mg, 01P132217, Espectrofotómetro UV-1205, UV-Visible, marca

SHIMADZU (Análisis de fósforo), Liofilizador Serial CS5-0,4 marca SY.

La determinación de la composición centesimal (humedad, materia seca, cenizas,

proteína y lípidos) se efectuó en base a la metodología antes descrita (Capitulo

2.1). Adicionalmente se realizaron otras determinaciones (extracción de lípidos por

el método de Folch et al., 1957; determinación la energía (KJ/g); lípidos neutros y

polares; análisis de fósforo, cuyos procedimientos se describen a continuación:

12.2.2.- Método de extracción de lípidos por Folch et al., 1957.

12.2.2.1.- Principio

Este se basa en la extracción de lípidos totales según el método descrito por Folch

et al, 1957, utilizando una mezcla de solventes específicos.

162


Se realizo el pesaje (3-4 g) de la muestra fresca o seca, dependiendo del origen, se

procedió a homogenizarla tres (3) veces por un (1) minuto, con la ayuda de un

equipo de molienda y homogenización en un Ultra-Turrax, con un volumen de 40 mL

de la mezcla Folch (Diclorometano/etanol en proporción de 2V/1V), se filtro en un

matraz conectado con un sistema de filtrado al vacío, se utilizó un filtro de papel

especial Whatman Nº 4 de 55 mm doble y adición de una cucharada de Sílice para

protección del papel de filtro. El volumen filtrado fue recuperado para luego realizar

la decantación. El filtrado fue transferido dentro de un embudo de decantación de

250 mL, se le adiciono un volumen de 37,5 mL de solución salina a 0,73 %, para

eliminar los contaminantes acuosos. Las proporciones de Diclorometano

(CH2CL2)/Metanol (CH3OH)/Agua(H2O), 8/4/3, V/V/V, también obtenido permite ver

una solubilización total del etanol en el agua, la unión finalmente se decanto toda la

noche. Después de la decantación se obtuvieron dos fases:

Una fase acuosa superior conteniendo el metanol, la solución salina y

las impurezas hidrosolubles.

Y una fase orgánica inferior conteniendo los lípidos totales solubles

en el diclorometano.

La fase inferior fue recuperada en un balón de 250 mL previamente

pesado, y la fase superior es eliminada.

Evaporación del solvente: El siguiente paso consistió en la evaporación del

diclorometano mediante el uso de un rotaevaporador Büchi, los balones fueron

posteriormente colocados en un desecador al vacío por 24 horas, y posteriormente

pesados. Formula empleada:

100%0

12 ×−

=m

mmtotaleslipidosde

163

Donde:

m2 = masa del balón con los lípidos en g

m1 = masa del balón vacío en g

m0 = masa de la muestra en g

12.2.3.- Determinación de la energía


El objetivo de este análisis se basa en determinar la energía bruta de una muestra,

gracias a la combustión de una capsula especial dentro de una bomba calorimétrica,

se realizo la medición de la elevación de la temperatura provocada por esa

combustión afín de determinar la energía calórica de la muestra.


En un recipiente metálico de masa conocida (m0 hasta 10-4 g aproximadamente), se

introdujo cierta cantidad (300 a 400 mg) de muestra (m1 hasta 10-4 g

aproximadamente), en la capsula de gelatina (Fiche G001) transparente especial de

combustión conocida, y se trasladó hasta la bomba calorimétrica en contacto con los

electrodos. Entre dos electrodos se sujetó un filamento de níquel (Fiche N002) de 5

cm y en el medio del mismo se sujetó un filamento de algodón (Fiche C006) de 9 cm

plegado en 2, ese filamento de algodón luego es puesto dentro de la capsula en

contacto directo con la muestra. La unión anterior fue colocada en el interior de la

bomba calorimétrica, cerrada y adicionándole una presión de oxigeno de 20 bars. La

bomba fue luego introducida en el interior de un embase metálico conteniendo 1800

g de agua a 25 °C. Luego se cerró lentamente la tapa superior del equipo para

iniciar el proceso.

El equipo posee un sistema calorimétrico adiabático que permite equilibrar la

temperatura del agua que esta alrededor de la bomba calorimétrica y el agua de

circulación ubicada dentro del equipo mediante el sistema eléctrico de electrodos

164

que controlan todo el sistema. Inicialmente se obtiene una lectura de combustión de

la capsula o pastilla usada, luego se obtiene otra segunda lectura de la combustión

de la muestra. Finalmente se obtiene el valor de la energía en Kj/g utilizando la

siguiente ecuación:

msQQXxT

gKJcalóricaEnergia 21)()/(

−−Δ=

Donde:

X (KJ) = Constante de la bomba determinada previamente, usando el acido

benzoico donde obtenemos una combustión de calor conocida. Esta varía cada vez

que existe un inconveniente con el equipo hay que recalcularla y ajustarla.

Representa la cantidad de calor necesaria para elevar la temperatura de la bomba

de 1 °C. X = 8.98 KJ (valor mas actual calculado).

Q1 (KJ) = Cantidad de calor generado por los filamentos de níquel y algodón

empleados en la combustión. Y = 0.076 KJ

Q2 (KJ) = Cantidad de calor generado por la capsula vacía: masa de la capsula (g) x

constante (18.7 KJ)

ΔT: Representa la elevación de la temperatura que se obtiene por la diferencia entre

las dos lecturas suministradas por la combustión en el equipo (2da lectura – 1ra

lectura)

ms = Corresponde a la masa en gramos obtenida de la diferencia entre el peso de la

capsula vacía (m0) y el peso de la capsula con la muestra (m1), es decir, ms = m1 –

m0 (g).

165

12.2.4.- Separación de lípidos neutros y polares


Consiste en la elusión de lípidos totales provenientes de la extracción Folch et al,

1957. por la acción de dos solventes, uno apolar (Diclorometano) para los lípidos

neutros y otro solvente polar (Metanol) para los lípidos polares.


Se realizo la extracción inicial de lípidos totales por el método de Folch et al, 1957,

de dos muestras de lombriz fresca y harina. Luego se tomaron los lípidos obtenidos

por un recalculo de la concentración de manera de trabajar con un valor aproximado

a 80 mg de lípidos como máximo y un mínimo de 30 mg. Esto se realizo haciendo

una dilución de la cantidad de lípidos obtenidos por Folch. Se pesaron los balones

identificados con los lípidos a ser extraídos, neutros (m0 para LN) y polares (m1 para

LP).

Se preparo la instalación del sistema de elusión, colocando una columna Sep-Pak

Cartridges (para fase de extracción sólida) de sílice marca Waters sobre un sistema

de sujeción y debajo se coloco el primer balón identificado para lípidos neutros (LN),

se humedeció la columna con 2 mL de diclorometano y se depositaron 500 μL de

los lípidos diluidos dentro de la columna lentamente, luego con ayuda de una jeringa

de 3,0 mL se eluyeron los lípidos adicionando 3,0 mL de diclorometano, permitiendo

de esta manera la separación de lípidos neutros, luego se extrajo la jeringa y se

tomo con la misma aire y se hizo presión de aire para extraer todo el diclorometano

residual presente en la columna. Se extrajo el balón de LN y se coloco el balón de

lípidos polares (LP), se adicionaron 3,0 mL de metanol y se recuperaron los lípidos

polares de la muestra. Finalmente se evaporaron los solventes por medio de un

rota-evaporador, se colocaron a desecación por 24 horas y se tomaron los pesos

respectivos (m2 para LN y m3 para LP), para luego realizar los cálculos:

166

m2 - m0 = mg de lípidos neutros (LN)

m3 - m1 = mg de lípidos polares (LP)

mg LN + mg LP = Lípidos Totales (LT)

LT100xLNmgLN% =

LT100xLPmgLP% =

12.2.5.- Análisis de fósforo


Consiste en la mineralización de las muestras por vía húmeda y calentamiento a

230 °C, por un proceso de oxidación, con acido sulfúrico y agua oxigenada, quien

conduce a las sustancias minerales y que permiten la determinación de ortofosfatos.

El complejo del fosfomolibdato reducido por el acido ascórbico en medio sulfúrico

caliente puede ser determinado posteriormente con una absorción máxima de 820

nm.


Se pesaron 250 mg (m1) de muestra por triplicado y se depositaron en matraces

aforados de 75 mL, luego se tomo el peso del papel (m0), para así obtener el valor

exacto de muestra analizada, se utilizaron tres (3) matraces como blancos.

Normalmente las muestras se procesan en dos mineralizaciones diferentes para

obtener un valor más confiable.

Mineralización: se adicionan a todos los matraces 10 mL de acido sulfúrico

concentrado con la ayuda de un dispensador, se dejan toda la noche para que se

origine la degradación de la materia orgánica por el acido.

167

Primera mineralización: al siguiente día se adicionan 5 mL de agua oxigenada con

una pipeta de 5 mL, esto produce una reacción violenta que hace que las muestras

tiendan a desbordarse, por lo que debe adicionarse lentamente, y se aplican otros 5

mL de agua oxigenada al terminar el ultimo tubo, se reinicia con el primero. Cuando

el contenido del matraz es de color transparente incoloro se coloca en el bloque de

mineralización (Digestor 2040) a 230 °C por 2 horas. Se vigiló inicialmente el

proceso para evitar el desbordamiento de la muestra por reacción violenta con el

agua oxigenada, luego de finalizadas las dos horas, se dejan enfriar los matraces y

si el color es transparente finalizo el proceso, sino es necesario realizar una

segunda adición de agua oxigenada y mineralizar por segunda vez. Normalmente

las muestras se someten a tres mineralizaciones de forma de garantizar totalmente

la oxidación de las mismas.

Finalizada la mineralización se sacan los matraces del bloque de mineralización, se

dejan enfriar, se adiciona el volumen necesario de agua destilada hasta completar el

aforo, se tapan y se agitan tres (3) veces hasta lograr una mezcla completa de la

solución. Se prepara consecutivamente la curva patrón, de acuerdo a las

especificaciones del manual. Seguidamente en tubos de ensayo rotulados se coloco

100 μL del contenido de cada matraz, curva, blanco y muestras. Se les adiciono a

los tubos 10 mL del reactivo de coloración, se colocaron todos los tubos en baño

Maria a 75 °C por 30 min, se sacaron posteriormente los tubos y se colocaron a

temperatura ambiente, se agitaron los tubos con un vortex y seguidamente se

colocaron en las cubas del equipo de lectura de absorbancia (Espectrofotómetro

UV) para su posterior lectura a 830 nm. Para los cálculos se utilizo la siguiente

ecuación:

g)mm(xg/mg1000100xmL75x)BlancodelPdeL/mgmuestraladeL/mg(P%

01 −−=

m1 = masa de la muestra, en mg

m0 = masa del papel vacío en mg

168

12.2.6.- Formulación de alimentos

Luego de obtener los datos del análisis proximal, se procedió al diseño de una hoja

de calculo Excel para la determinación de la composición porcentual de cada

ingrediente, y obtener la receta de preparación de los alimentos (Tabla 19) y su

composición química teórica (Tabla 20) de acuerdo al porcentaje de sustitución de

las materias primas en estudio, en este caso HLF; HPC, y la HPN, fijando los

valores porcentuales de los demás ingredientes [Harina de maíz entero (HME),

harina de afrecho de trigo (HAT), aceite de pescado, mezcla de vitaminas, mezcla

de minerales y alginato de sodio].

Tabla 19. Formulación alimenticia en porcentaje (g/100g)

Alimentos Materias Primas 06-FI-01 06-FI-02 06-FI-03 06-FI-04

Harina Pescado Cumaná 0 0 60 40

Harina de Pescado Noruego 60 40 0 0

Harina de lombriz Farmacia 0 20 0 20

Aceite de pescado Europeo 12 12 12 12

Afrecho de trigo Europeo 8 8 8 8

Maíz entero Europeo 16 16 16 16

Mezcla Mineral 1 1 1 1

Mezcla Vitamínica 1 1 1 1

Alginato de sodio 2 2 2 2

Total 100 100 100 100

06-FI-01: Alimento 1, Fernando Isea, 2006; 06-FI-02: Alimento 2, Fernando Isea, 2006 06-FI-03: Alimento 3, Fernando Isea, 2006; 06-FI-04: Alimento 4, Fernando Isea, 2006

169

Tabla 20.- Composición teórica de los alimentos.

Alimentos Humedad %

Proteína %

Lípidos %

ENN %

Cenizas %

Energía kJ /g

06-FI-01 8,5 42,5 19,1 19,4 10,5 20,2

06-FI-02 7,6 42,6 18,6 30,1 9,0 20,7

06-FI-03 6,3 39,5 16,2 37,0 20,9 19,7

06-FI-04 6,4 38,4 15,7 38,5 16,0 19,0

06-FI-01: Dieta 1, Fernando Isea, 2006; 06-FI-02: Dieta 2, Fernando Isea, 2006 06-FI-03: Dieta 3, Fernando Isea, 2006; 06-FI-04: Dieta 4, Fernando Isea, 2006 ENN: Extractos no nitrogenados

12.2.7.- Preparación de alimentos

Para la preparación de los alimentos identificados como (06-FI-01; 06-FI-02; 06-FI-

03 y 06-FI-04) se utilizo la hoja de registro de componentes de los mismos (Tabla

19), se procedió a realizar el pesaje de las materias primas en una balanza, se

coloco el envase de mezclado de acero inoxidable, se taro y se coloco el primer

ingrediente, seguidamente, se volvió a tarar y se coloco el segundo ingrediente, y

así sucesivamente hasta incorporar todos los componentes de la formula, en total se

preparo 1 kg de alimento por cada dieta experimental. Posteriormente se llevo el

envase a un equipo de mezclado industrial y se comenzó la incorporación del agua

(300 mL) poco a poco para facilitar la formación de la masa adecuada, que se

establece como consecuencia de la combinación del ligante (Alginato de sodio) con

el agua, Al tacto la mezcla debe permanecer bien unida cuando se hace presión con

la mano indicando una buena acción del agente ligante. En este ensayo fue

necesaria la adición de un poco mas de agua para obtener la masa adecuada de

todos los alimentos (400 mL, 400 mL, 500 mL y 500 mL, respectivamente), Al

obtener la consistencia adecuada, se procedió a llevar la preparación a otro equipo

para la fabricación de los gránulos (pellets) marca DELCOUPE, Modelo: HE 82, este

equipo consta de un sistema de alimentación, que luego que entra al mismo, por

ayuda de un tornillo giratorio hace presión hacia el exterior y con una hojilla

incorporada produce el corte de los fideos a una longitud fijada, El siguiente paso

170

consistió en colocar los fideos preparados sobre una bandeja previamente

acondicionada con papel, identificada con el código correspondiente del alimento y

trasladada a una estufa ventilada, a una temperatura de 40 ºC por 24 horas,

Durante la preparación de los fideos, se pudo recuperar una cantidad de la mezcla

que quedo adherida en el interior del equipo para los análisis de la composición

proximal practica de los alimentos, para ello se tomo una bandeja de aluminio

rotulada y se coloco el resto de mezcla para su secado en la estufa,

Trascurrido el tiempo de secado de los fideos, se procede al molido y tamizado de

los mismos, para ello se usaron tamices de diferentes tamaños de poro, obteniendo

diámetros de partículas adecuados para la alimentación de los alevines. Durante

este proceso se obtuvieron cuatro tamaños diferentes de partículas, partículas de

diámetros mayores a 1,25 mm; mayores 830 μm y menores 1,25 mm, mayores a

630 μm y menores de 830 μm y finalmente menores de 630 μm. De todas estas

partículas, las aprovechables para el ensayo estuvieron ubicadas por encima de las

partículas mayores a 630 μm y menores de 830 μm, las más finas menores de 630

μm, no son aprovechables por tener un tamaño muy difícil de asimilar por los peces.

Luego del tamizado, las diferentes proporciones fueron colocadas en bandejas de

aluminio y bolsas plásticas previamente identificadas con el nombre del alimento, la

granulometría de acuerdo al tamizado y la fecha de elaboración, llevadas a la cava

refrigerada y trasladadas posteriormente a la piscicultura donde se montó

posteriormente el ensayo biológico.

12.2.8.- Análisis de alimentos formulados

Luego de obtenida la muestra seca de los alimentos, se procedió a su molido para

tener un tamaño de partícula uniforme, este procedimiento se realizo con el equipo

de molienda mecánica marca MADO, modelo: PRIMUS MEW 613-82/2,

posteriormente las muestras fueron envasadas e identificadas para proceder luego a

su análisis proximal de rutina [materia seca (MS), humedad (H), proteína bruta (PB),

grasa bruta (GB), energía (E), cenizas (C) y por diferencia entre todos, excluyendo

la E y MS, se obtuvo el contenido de extractos no nitrogenados brutos (ENNB)] y de

esta manera obtener los valores reales de las dietas, incluyendo otro análisis

171

importante como la determinación de fósforo. Todos estos análisis fueron realizados

en los Laboratorios de Análisis fisicoquímicos del INRA Saint pee sur Nivelle.

12.2.9.- Montaje del ensayo biológico y condiciones experimentales

Esta fue realizada en las instalaciones de la Piscicultura del INRA, Donsacp,

ubicada en Landes 40360, Francia, para ello se usaron un total de 1200 alevines de

trucha, los cuales se obtuvieron del lote ATF061A, cuya reproducción fue realizada

en hembras el 25/11/05 y eclosionaron el 25/12/05, la entrada a la piscicultura fue el

19/01/06, El ensayo fue montado el 23/01/06, con una duración de 42 días, para ello

se decidió colocar 100 alevines/tanque, colectándolos y pesándolos en una balanza

analítica, para obtener su peso inicial, seguidamente estos fueron colocados en el

tanque correspondiente, previamente identificado (Figura 11), para así

proporcionarles el primer alimento, se le suministraría este alimento y a los diez (10)

días se volvería a tomar el peso en “pool” total de los alevines, y así sucesivamente

hasta tener el peso final de los mismos a las seis (6) semanas. Durante el

transcurso de este ensayo se tomaron datos del % de mortalidad de los alevines,

cantidad de alimento consumido, peso de alevines. Se tomo una muestra inicial de

100 g de alevines, la cual fue sometida a un tratamiento anestésico y trasvasado en

una bolsa plástica hermética rotulada y conservado a -20ºC, para posteriormente

hacer los análisis iniciales de su composición.

Se evaluaron cuatro (4) alimentos con o sin la incorporación de la HLF, HPC y HPN,

con tres (3) repeticiones, para un total de 12 grupos de alevines, los cuales al final

del ensayo fueron anestesiados y conservados a -20 ºC para posteriormente ser

molidos, liofilizados y realizar el análisis de su composición proximal, fósforo y

metales pesados.

172

Figura 11.- Tanques usados en el estudio nutricional del uso de la harina de lombriz en la alimentación de alevines de trucha arco iris

12.2.10.- Liofilización de alevines y preparación de muestra para análisis

Los alevines provenientes del ensayo zootécnico-nutricional fueron sometidos

congelación a -20 ºC, posteriormente se molieron en un procesador de alimentos

marca MOULINETTE, para formar una pasta, y seguidamente dispuestos

uniformemente en bandejas metálicas rectangulares, en capas de 1 cm, luego estas

bandejas con la muestra fueron congeladas a -20 ºC por 24 horas, posteriormente

173

fueron cubiertas por papel bond fuerte y sujetadas con liga de goma, el papel fue

perforado con una pinza fina para favorecer el secado de la muestra, luego se

trasladaron las bandejas al equipo de liofilización marca SY Serial CS5-0,4 por un

periodo de 24 horas. Transcurrido el tiempo las muestras fueron extraídas del

equipo, sometidas a molido en el procesador de alimentos MOULINETTE y

colocadas en envases plásticos limpios y rotulados, las muestras se mantuvieron en

refrigeración a 4 ºC para posteriormente ser sometidas a los análisis respectivos

(proximal).

12.2.11.- Diseño de hoja de calculo Excel para registro de datos y análisis zootécnico y de composición proximal de las dietas

Los datos obtenidos fueron registrados en la hoja de cálculo previamente elaborada

para evaluar todos los parámetros zootécnicos que den respuesta al

comportamiento de los alevines sobre el tipo de alimento consumido, así como la

evaluación de la composición del mismo.

Los parámetros evaluados fueron: Promedio de peso inicial, Promedio de Peso

Final, Eficiencia Alimenticia, Coeficiente de utilización proteica (C.U.P), Índice de

consumo (IC), Tasa de crecimiento especifico (TCE), Retención de Nitrógeno, lípido

y fósforo.

Los pesos promedios inicial y final se calcularon tomando los pesos totales del pool

de alevines, inicial y final, y dividirlos entre el total (100) de alevines evaluados. Los

demás parámetros se calcularon con las siguientes formulas:

)g(SecoentolimAdeCantidad)g(totalMasadeGananciaenticialimAEficiencia =

InicialMasaFinalMasa)g(totalFrescaMasadeGanancia −=

174

SecaMateria%x)g(entolimAdeCantidadSecoentolimAdeCantidad =

( ) ( )InicialoteínaPr%xInicialPesoFinaloteinaPr%xFinalPesooteicaPrGanancia −=

oteinaPrde%xSecoentolimAdeCantidadIngeridaoteinaPr =

IngeridaoteínaProteicaPrGananciaP.U.C =

)g(TotalFrescaMasadeGanancia)g(SecoentolimAdeCantidadConsumodeÍndice =

( ))días(Duración

)omedioPrInicialPeso(LnomedioPrFinalPesoLnE.C.T −=

La retención de nitrógeno, lípido y fósforo se efectuó mediante la hoja de cálculo

diseñada previamente. Así mismo se construyeron curvas de crecimiento y

mortalidad de los alevines evaluados.

13.- Estudio de la digestibilidad aparente de la harina de lombriz (Eisenia

andrei) en la alimentación de trucha arco iris


Para este otro estudio experimental se utilizaron las siguientes materias primas:

harina de lombriz (Eisenia andrei) [HLF], y otras materias primas europeas como la

harina de pescado noruego [HPN], harina de afrecho de trigo [HAT], harina de torta

de soya [HTS] harina de maíz entero [HME], además de otros aditivos como: aceite

de pescado, mezclas de vitaminas, mezcla de minerales y alginato de sodio. Estas

últimas fueron adquiridas de proveedores oficiales del INRA.

175

13.2.- Análisis proximal de materias primas


(PB), grasa bruta (GB), energía (E), cenizas (C) y por diferencia entre todos,

excluyendo la E y MS, se obtuvo el contenido de extractos no nitrogenados brutos

(ENNB)] de materias primas (HLF) (HAT) (HTS) y (HPN). Todos los análisis fueron

realizados en el Laboratorio de Análisis Físico-químicos, de acuerdo al manual de

laboratorio del INRA, Saint Pee sur Nivelle, Francia.

13.3.- Equipos utilizados

Equipos usados en los análisis fueron: Estufa Memmert, 03P144906, calibrada a

110 ºC (Análisis de Humedad); Equipo de vació para desecador KNF Neuberger,

modelo LABOPORT (Análisis de Humedad, Ceniza, Grasa); Kjeltec Analyzer Unit,

modelo 2300, Foss Tecator. 98P115265; Digestor FOSS, modelo 2040, Based

TecatorTM Technology; Zoster automatic, marca Gerhardt, 92P071262 (Proteína);

Sauerstoff Füllstation C48; Calorimeter IKA, modelo C 4000, adiabatic, IKA® –

Analysentechnik Heitersheim, 92P071259 (Energía); Termo Haake K10,

01P135440; Termo Haake DC 10; Balanza EM-3000 (3 kg x 1 g), Matfer; Balance

Analitical, Sartorius BP2215 max. 220 g d= 0.1 mg, 01P132217, Espectrofotómetro

UV-visible, 160 A, SHIMADZU (Análisis de Cr2O3).

13.4.- Análisis de laboratorio

13.4.1.- Análisis proximal

Se efectuó el análisis proximal siguiendo la misma metodología efectuada para las

materias primas del primer ensayo experimental zootécnico-nutricional, sin

embargo, adicionalmente se efectuó la determinación del oxido de cromo (Cr2O3),

en los alimentos preparados y heces de truchas sometidas a regimenes alimenticios

a base de los preparados obtenidos.

176

13.4.2.- Análisis de Oxido de Cromo


La oxidación de muestras conteniendo el oxido de cromo (Cr2O3) verde, por el

reactivo de Bolin (H2SO4/Molibdato de sodio) permite obtener el cromato

correspondiente (Cr2O7), amarillo. La intensidad de la coloración es proporcional a la

concentración de cromato presente, la medida de esta intensidad es medida a 440

nm en un espectrofotómetro UV-visible, 160 A, Shimadzu.


Se pesaron 0,300 g de muestra por triplicado y se anoto la masa (m1)

correspondiente (10-4 g aproximadamente), se coloco la muestra lentamente en un

matraz aforado de 75 mL, luego se peso la masa del papel usado (m0).

Se tomaron dos (2) matraces y a cada uno se le adiciono 0.05 g de Cr2O3 (m2) y del

mismo modo se peso el papel empleado para el peso de la masa (m0). Se utilizaron

3 matraces vacíos para la preparación de blancos.

Oxidación: Se adiciono a cada matraz un volumen de 7 mL del reactivo de Bolin, se

llevaron los matraces preparados al bloque de mineralización (Digestor 2040), se les

colocó la tapa especial de extracción de vapor, se encendió el equipo

programándolo a las siguientes condiciones de tiempo y temperatura:

Segmento 6: 15 min a 150 °C Segmento 8: 10 min a 220 °C

Segmento 7: 10 min a 190 °C Segmento 9: 25 min a 240 °C

Se colocó un cronometro cuando la temperatura llego a los 150 °C, y se contabilizan

50 minutos, si al cabo de ese tiempo los matraces con la muestra tienen un color

amarillo y los matraces con Cr2O3 un color marrón, es indicativo que finalizo la

mineralización y se puede apagar el equipo, sino se dejan hasta los 60 min

177

necesarios. Luego se dejan enfriar los tubos a temperatura ambiente, se aforan con

agua destilada, se tapan y se agitan bien, la solución resultante se filtra con papel

de filtro Whattman Nº 4 y el volumen se recupera en tubos de ensayo rotulados.

De los tubos preparados con Cr2O3, se selecciona uno primero y se tomo la masa

del mismo (curva uno), de este se extraen 0,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 y 15,0 mL, y se

colocan en balones aforados de 25 mL, el volumen de estos se completa con la

mezcla de los blancos preparados (manteniendo las mismas condiciones de pH de

las muestras). Luego se coloco un volumen de la preparación en las cubas del

equipo de lectura (Espectrofotómetro), manteniendo una posición definida de las

mismas de acuerdo a una flecha indicadora presente.

Se encendió el equipo, se le dio las especificaciones necesarias: λ = 440 nm, hacer

un auto cero con agua para corrección, se ajusta la concentración en μg/mL. Se

calculo la concentración de la curva patrón en μg/mL, mediante la siguiente formula:

)g(1xmL25xmL75)g(1000x)mL(PatróndelVolumenxOCrde)g(masa1Patrón 32 μ

=

La masa de Cr2O3 expresada en mg.

Los volúmenes del patrón son: 0,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 y 15,0 mL

Luego de calcular la concentración de la curva, acondicionamos el equipo y se hizo

una nueva curva, se le dan los valores obtenidos y si la curva es lineal se utiliza

para realizar las lecturas de las muestras. La absorbancia de las muestras es

obtenida directamente del equipo y expresadas en μg/mL.

Calculo de la concentración del Cr2O3:

)genmm(x)g/g(1000100xmL75x)mL/g(equipoelenLeida.ConcOCrde%

2132 −μ

μ=

178

Donde:

m1 = masa del papel con el Cr2O3 en mg

m1= masa de la muestra en g

m2 = masa del Cr2O3 en g

13.4.3.- Formulación de dietas y preparación de alimentos

Se sometieron a evaluación cuatro (4) alimentos, tres (3) de ellos con diferentes

materias primas (harina de lombriz [HLF], harina de afrecho de trigo [HAT] y harina

de torta de soja [HTS]) sustituyendo un 30 % de la composición del alimento de

referencia (Alimento preparado a base de harina de pescado Noruego [HPN]), ver

Tabla 21. Para ello se tomo un 70 % del alimento base con previa adición del

marcador Oxido de cromo III (Cr2O3) al 1,5 % (para efectos de medir la digestibilidad

aparente), al cual se le complemento un 30% de cada materia prima en estudio.

Tabla 21.- Formulación (g/100g) del alimento de referencia

Ingrediente Alimento Referencia Harina de pescado noruego 60

Aceite de pescado 7

Almidón gelatinizado 27,5

Mezcla de vitaminas 1

Mezcla de minerales 1

Ligante (Alginato de sodio) 2

Oxido de cromo 1,5

Harina de lombriz 0

Torta de soja 0

Afrecho de trigo 0

Total 100

Luego de definir la cantidad de cada componente, se procedió a la preparación de

las dietas en la sala de fabricación de alimentos del INRA Saint Pee sur Nivelle,

179

donde se preparo la mezcla de ingredientes, se procedió a la fabricación de

gránulos que posteriormente fueron secados y conservados bajo refrigeración (4° C)

hasta su utilización posterior. De estos gránulos se tomo una muestra representativa

(50 g) para realizar el análisis proximal que permite conocer los valores prácticos de

la composición química de los mismos, y la determinación del contenido de oxido de

cromo, necesario para determinar la digestibilidad aparente de cada componente de

las dietas evaluadas.

13.4.4.- Análisis de alimentos formulados



de molienda mecánica marca MADO, modelo: PRIMUS MEW 613-82/2,

posteriormente las muestras fueron envasadas e identificadas para proceder luego a

su análisis proximal de rutina [materia seca (MS), humedad (H), proteína bruta (PB),

grasa bruta (GB), energía (E), cenizas (C) y por diferencia entre todos, excluyendo

la E y MS, se obtuvo el contenido de extractos no nitrogenados brutos (ENNB)] y de

esta manera obtener los valores reales de la experiencia a realizar, incluyendo otro

análisis importante como la determinación del oxido de cromo. Todos estos análisis

fueron realizados en los Laboratorios de Análisis fisicoquímicos del INRA Saint pee

sur Nivelle.

13.4.5.- Montaje del ensayo biológico y condiciones experimentales

El presente trabajo se realizo en la Sala de Digestibilidad, donde se encuentra el

sistema de colección de heces automatizado, específicamente en las Instalaciones

de la Piscicultura del INRA, Saint Pee sur Nivelle, Quartier Ibarron, Francia. Las

materias primas e instalaciones necesarias para el montaje de esta experiencia

fueron suministradas por el laboratorio antes mencionado.

Se utilizaron ejemplares de trucha arco iris de un peso promedio de 100 g, en total

quince (15) truchas por tanque. Los tratamientos se evaluaron por duplicado. En

180

este trabajo se emplearon ocho (8) tanques cilíndricos plásticos de 40 cm de

diámetro y de base cónica, ubicados en la Sala de digestibilidad (Figura 12), con

una capacidad volumétrica de 60 L, alimentados con volúmenes de agua filtrada de

4 L/min, con una temperatura promedio de 17 °C. Estos tanques estuvieron

conectados al sistema de colección de heces automático que permitió la obtención

de muestras.

13.4.6.- Alimentación y recolección de heces

Antes de comenzar con la evaluación de los peces, estos fueron sometidos a una

adaptación previa de una semana, con el objeto de vaciar completamente el sistema

digestivo y al mismo tiempo lograr la adaptación de estos al nuevo sistema de cría

cilíndrico, favoreciendo la toma de alimentos durante el ensayo. La alimentación fue

manual “ad-libitum”, se inicio el 27 de marzo de 2006, efectuada dos veces por día

(9 am y 4 pm) los siete días de la semana, con una duración de 2 semanas. Durante

la alimentación se cuido de que todo el alimento suministrado fuera consumido para

evitar una posible contaminación de las heces con el alimento no consumido. Las

heces fueron colectadas cada día en la mañana, congeladas y liofilizadas para

posteriormente realizar análisis respectivos.

a) Tanques cilíndricos b) Sistema de colección de heces

Figura 12.- Sala de digestibilidad INRA, Saint Pée sur Nivelle

181

13.4.7.- Evaluación del Coeficiente de Digestibilidad Aparente (CDa)

Para el cálculo de CDa (% Materia seca), CDa de nutrientes (%) y CDa

energía (KJ/g) de los alimentos, se emplearon las ecuaciones extraídas del

trabajo de Maynard y Loosly (1969):

CDa MS (%) = 100 x [1-(% Cr2O3 del alimento/% Cr2O3 de las heces)]

CDa Nutriente = 100 x [1- (% Cr2O3 del alimento/% Cr2O3 de las heces) x (%

Nutriente de las heces/% Nutriente del Alimento)]

Para el cálculo de CDa (Materia seca, nutrientes y energía) de las materias

primas (MP) se emplearon las ecuaciones extraídas del trabajo de Sugiura

et al., 1998.

CDa de materia seca de MP (%) = (CDa Alimento teste – 0,7 x CDa alimento de

referencia)/0,3

CDa de nutriente y energía de MP (%) = [concentración de nutriente o energía

alimento teste x CDa nutriente o energía

del alimento teste) – (0,7 x nutriente o

energía del alimento de referencia x CDa

de nutriente o energía del alimento de

referencia)]/ (0,3 x concentración de

nutriente o energía de la MP).

Todos los datos de la composición química (proximal y % de oxido de cromo) fueron

registrados en una hoja de cálculo Excel diseñada previamente, para posteriormente

calcular los coeficientes de digestibilidad aparente de cada alimento y materia prima

con las ecuaciones antes mencionadas.

182

14.- Estudio biológico de utilización de la harina de lombriz (Eisenia andrei) en la alimentación de trucha arco iris (Mérida, Venezuela).

14.1.- Materias Primas

Se utilizo como materias primas: harina de lombriz (Eisenia andrei) [HLF] y harina

de pescado a base de truchas de descarte [HPT] procesadas en la Facultad de

Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes Mérida (Figura 13).; harina

de pescado Cumaná [HPC] suministrada por el INIA (Instituto de Investigaciones

Agropecuarias) Cumana, elaborada a partir de desechos de pescado de fábricas

ubicadas en el estado Sucre, Venezuela; harina de afrecho de trigo [HAT] y harina

de maíz amarillo [HMA] adquirido del mercado local. También se usaron otros

ingredientes como: aceite de pescado, mezclas de vitaminas, mezcla de minerales y

carboximetil celulosa [CMC] (agente ligante).


(PB), grasa bruta (GB), cenizas (C) y por diferencia entre todos, excluyendo la MS,

se obtuvo el contenido de extractos no nitrogenados brutos (ENNB)] de las materias

primas: harina de lombriz (HLF), harina de pescado trucha (HPT), harina de

pescado Cumaná (HPC), harina de afrecho de trigo (HAT) y harina de maíz amarillo

(HMA). Los equipos y métodos utilizados corresponden a los mencionados en los

análisis de materias primas al inicio de este capitulo.

14.2.- Diseño de hoja de cálculo para la formulación alimenticia

Luego de obtener los datos del análisis proximal, se procedió al diseño de una hoja

de calculo Excel para la determinación de la composición porcentual de cada

ingrediente, y obtener la receta de preparación de los alimentos (Tabla 22) y su

composición química teórica (Tabla 23) de acuerdo al porcentaje de sustitución de

las materias primas en estudio, en este caso HLF; HPC, y la HPT, fijando los valores

porcentuales de los demás ingredientes [Harina de maíz amarillo (HMA), harina de

afrecho de trigo (HAT), aceite de pescado, mezcla de vitaminas, mezcla de

minerales y carboximetil celulosa (CMC)].

183

Evisceración y lavado del pescado

con agua de corriente

Cortes del pescado en 4 o mas secciones

Traslado en envase de malla de acero

inoxidable

Cocción del pescado en Marmita a 100 ºC por 30 min

Extracción del pescado cocido

Prensado y eliminación de exceso de agua

Secado en estufa ventilada a 60 ºC por 4

horas

Recepción del pescado (Trucha de

descarte)

Molido

(Obtención de la harina)

Envasado y conservación a 4ºC

Evisceración y lavado del pescado

con agua de corriente

Cortes del pescado en 4 o mas secciones

Traslado en envase de malla de acero

inoxidable

Cocción del pescado en Marmita a 100 ºC por 30 min

Extracción del pescado cocido

Prensado y eliminación de exceso de agua

Secado en estufa ventilada a 60 ºC por 4

horas

Recepción del pescado (Trucha de

descarte)

Molido

(Obtención de la harina)

Envasado y conservación a 4ºC

Figura 13.- Esquema de elaboración de harina de pescado a base de trucha de descarte (ULA-Mérida)

184

La mezcla de minerales se preparo en el laboratorio a partir de reactivos del mismo,

siguiendo las especificaciones de cantidades presentes en la tabla C.16., ejemplo

de mezcla mineral para peces (Kaushik y Cuzon, 1999), presente en el libro

“Nutrición y alimentación de peces y crustáceos” (Guillaume, et al., 1999). Para el

caso de mezcla de vitaminas, del mismo modo se baso en las recomendaciones

presentes en la tabla C.15 Ejemplo de mezcla de vitaminas para peces (Kaushik y

Cuzon, 1999), presente en los anexos de necesidades nutricionales, formulas, tipos,

tablas de racionamiento y diversas fuentes del libro “Nutrición y alimentación de

peces y crustáceos” (Guillaume, et al., 1999). Usando como base un producto

comercial denominado Aminovival (Polivitaminas y aminoácidos) marca

VALMORCA, incorporándole las vitaminas faltantes mediante el uso de Vitamina E

60, capsulas blandas de 400 mg marca PLUSANDES, Vitamina C (en forma de

ascorbato de sodio) de 500 mg marca LETISAN y Vitamina A cristalina Alfa-Mon

marca BIOTECH.

Tabla 22.- Formulación alimenticia en porcentaje (g/100g)

Alimentos Materias Primas 08-FI-01 08-FI-02 08-FI-03 08-FI-04

Harina Pescado Trucha 70 30 0 0

Harina de Pescado Cumana 0 0 70 30

Harina de Lombriz Farmacia 0 40 0 40

Aceite de pescado 10 10 10 10

Harina de afrecho de trigo 6 6 6 6

Harina de maíz amarillo 10 10 10 10

Mezcla Mineral 1 1 1 1

Mezcla Vitamínica 1 1 1 1

CMC 2 2 2 2

Total 100 100 100 100

08-FI-01: Alimento 1, Fernando Isea, 2008; 08-FI-02: Alimento 2, Fernando Isea, 2008 08-FI-03: Alimento 3, Fernando Isea, 2008; 08-FI-04: Alimento 4, Fernando Isea, 2008

185

Tabla 23.- Composición teórica de los alimentos

Alimentos Humedad % Proteína % Lípidos % ENN % Cenizas % 08-FI-01 3,4 44,7 30,2 15,3 6,4

08-FI-02 5,8 47,2 21,8 19,8 5,5

08-FI-03 1,9 43,3 20,2 21,4 13,2

08-FI-04 5,1 46,5 17,5 22,4 8,4

08-FI-01: Alimento 1, Fernando Isea, 2008; 08-FI-02: Alimento 2, Fernando Isea, 2008 08-FI-03: Alimento 3, Fernando Isea, 2008; 08-FI-04: Alimento 4, Fernando Isea, 2008 ENN: Extractos no nitrogenados

14.3.- Preparación de los alimentos (Dietas)

Para la preparación de los alimentos identificados como (08-FI-01; 08-FI-02; 08-FI-

03 y 08-FI-04) se utilizo la hoja de registro de componentes de los mismos (Tabla

22), se procedió a realizar el pesaje de las materias primas en una balanza, se

coloco el envase de mezclado plástico, se taro y se coloco el primer ingrediente,

seguidamente, se volvió a tarar y se coloco el segundo ingrediente, y así

sucesivamente hasta incorporar todos los componentes de la formula, en total se

prepararon 2 kg de alimento por cada dieta experimental. Posteriormente se llevo el

envase a un equipo de mezclado y se comenzó la incorporación del agua (500 mL)

poco a poco para facilitar la formación de la masa adecuada, que se establece como

consecuencia de la combinación del ligante (CMC) con el agua, Al tacto la mezcla

debe permanecer bien unida cuando se hace presión con la mano indicando una

buena acción del agente ligante. En este ensayo fue necesaria la adición de un poco

mas de agua para obtener la masa adecuada de todos los alimentos (200 mL, 200

mL, 300 mL y 300 mL, respectivamente), Al obtener la consistencia adecuada, se

procedió a llevar la preparación a otro equipo [procesador de carne] para la

fabricación de los gránulos (pellets) marca C.A.F Modelo 10, este equipo consta de

un sistema de alimentación, que luego que entra al mismo, por ayuda de un tornillo

giratorio hace presión hacia el exterior y con una hojilla incorporada produce el corte

de los fideos a una longitud fijada. El siguiente paso consistió en colocar los fideos

preparados en un envase plástico y transportados hacia el Laboratorio de

186

Operaciones Unitarias de la Facultad de Ingeniería de la ULA-Mérida, donde

posteriormente fueron colocados en bandejas previamente acondicionada con papel

encerado, identificadas con el código correspondiente del alimento y trasladada a

una estufa ventilada, a una temperatura de 60 ºC por 24 horas. Durante la

preparación de los fideos, se pudo recuperar una cantidad de la mezcla que quedo

adherida en el interior del equipo para los análisis de la composición proximal

practica de los alimentos, para ello se tomo una bandeja de aluminio rotulada y se

coloco el resto de mezcla para su secado en la estufa.

Trascurrido el tiempo de secado de los fideos, se procede al molido de los mismos y

el producto obtenido fue llevado a la nevera refrigerada y trasladados

posteriormente a la “Estación Experimental Truchícola” del Instituto de

Investigaciones Agropecuarias (INIA) del estado Mérida, donde se montó

posteriormente el ensayo biológico.

14.4.- Análisis de los alimentos formulados



de procesamiento de alimentos marca Oster, posteriormente las muestras fueron

envasadas e identificadas para proceder luego a su análisis proximal de rutina

[materia seca (MS), humedad (H), proteína bruta (PB), grasa bruta (GB), cenizas (C)

y por diferencia entre todos, excluyendo la MS, se obtuvo el contenido de extractos

no nitrogenados brutos (ENNB)] y de esta manera obtener los valores prácticos de

la experiencia a realizar. Todos estos análisis fueron realizados en el Laboratorio de

Bromatología I del Departamento de Ciencia de Alimentos de la Facultad de

Farmacia y Bioanálisis, de la ULA.

14.5.- Ubicación y montaje del ensayo biológico de valorización de la harina de lombriz (Eisenia andrei).

Esta experiencia fue realizada en las instalaciones de la Estación Experimental

Truchícola INIA, La Mucuy, ubicada en el Parque nacional Sierra Nevada del estado

187

Mérida, Venezuela, a una altitud de 2300 msnm, latitud norte 8º 40´ y longitud oeste

71º 5´. El agua utilizada para mantener los alevines de trucha es de origen glacial,

naciente de la Sierra Nevada a 4200 msnm.

En este estudio, se utilizaron un total de 1500 alevines de trucha, los cuales se

obtuvieron en la estación de un lote cuya fecha de incubación fue el 03/10/2007,

fecha de eclosión 01/11/2007, su primera alimentación fue el 19/11/2007. El ensayo

fue montado el 07/01/08 (Es decir, alevines de 2 meses de eclosionados), para ello

se decidió colocar 100 alevines/tanque, colectándolos y pesándolos en una balanza

analítica marca Adventurer® marca OHAUS de precisión 10-4, para obtener su peso

(g) inicial en pool, seguidamente estos fueron colocados en el tanque

correspondiente, previamente identificado, para así proporcionarles el primer

alimento, consecutivamente se le suministraría el alimento y a los treinta (30) días

se volvería a tomar el peso en pool total de los alevines.

El agua usada en esta investigación presentó las siguientes características: 12,70 ±

0,300 ºC de temperatura promedio; pH promedio de 7,27 ± 0,203; conductividad

promedio de 0,057 ± 0,013 ms/s y 10,63 ± 0,166 mg/mL de oxígeno disuelto

promedio.

Durante el transcurso de este ensayo se tomaron datos diarios del % de mortalidad

de los alevines, cantidad de alimento consumido (g), peso de alevines (g). Se tomó

una muestra inicial de 300 g de alevines, la cual fue sometida a un tratamiento de

sacrificio y trasvasado en una bolsa plástica hermética rotulada y conservado a -

20ºC, para posteriormente liofilizarla y hacerle los análisis de su composición (valor

de referencia inicial de composición del lote de alevines).

Se evaluaron cinco (5) alimentos con o sin la incorporación de la HLF, HPT, o HPC,

y uno comercial (Trucharina) con tres (3) repeticiones, para un total de 15 grupos de

alevines, los cuales al final del ensayo fueron pesados con una balanza analítica

marca Adventurer® marca OHAUS de precisión 10-4.

188

En esta experiencia se efectuó la medición de la talla (longitud) y peso, con un

alevinometro (equipo de medición de talla de alevines) marca TESOVI (Figura 13), y

una balanza analítica de precisión 1x10-4 Aventurer® marca OHAUS,

respectivamente, de 6 alevines/repetición/alimento aleatoriamente, al inicio y al final

del ensayo.

Figura 14.- Alevinometro de medición de talla (longitud) en cm de alevines de trucha arco iris (Mérida-Venezuela).

14.6.- Preparación de las muestras de alevines obtenidas al final del ensayo y liofilización de las mismas

Los alevines provenientes del ensayo zootécnico fueron sacrificados, colocados en

bolsas plásticas previamente rotuladas, e introducidos en una cava con hielo

granizado, para luego ser transportados al Laboratorio de Bromatología I del

Departamento de Ciencia de Alimentos de la ULA-Mérida, y conservados a -20 ºC

para posteriormente ser molidos en un procesador de alimentos Osterizer Clásico

marca OSTER, del molido obtenido se obtuvo una pasta la cual se coloco en las

189

190

paredes de tubos plásticos marca Falcón de 50 mL, con la finalidad de obtener una

capa fina que favorezca su secado, estos tubos con la muestra fueron congelados a

-20 ºC, luego fueron atados con una cinta de pabilo e introducidos en un termo

especial contentivo de nitrógeno liquido proveniente del Centro de Estudios

Semiconductores de la Facultad de Ciencias de la ULA-Mérida. Luego de ser

sometidos al nitrógeno líquido los tubos fueron colocados en una cava con hielo

granizado y transportados al Instituto de Inmunología Clínica (IDIC) ubicado en el

edificio Louis Pasteur de la ULA-Mérida, para luego colocarle a cada tubo una tapa

de papel toallin suave, atada con liga de goma, y ubicarlos seguidamente en el

interior de tubos de liofilización de vidrio (cámara de liofilización) los cuales fueron

sellados con sus tapas plásticas de goma, luego se conectaron al equipo de

liofilización marca LABCONCO Freeze Dryer 3 (encendido 5 horas antes), se les

efectuó el vacío correspondiente, las cámaras de liofilización fueron cubiertas

externamente con bolsas de hielo preparadas y se dejaron liofilizar por un periodo

de tiempo de 24 horas. Trascurrido el tiempo necesario, los tubos fueron extraídos

del equipo, se les quito su tapa de papel y se les coloco su tapa de plástico, para

luego ser trasportados en bolsas plásticas rotuladas al Laboratorio de Bromatología

I, del Departamento de Ciencia de Alimentos de la ULA-Mérida, donde se extrajo el

contenido de cada tubo y fue colocado en el interior del envase del procesador de

alimentos Osterizer Clásico marca OSTER, para su molido, envasado en frascos

plásticos previamente rotulados, conservación a 4 ºC, y posterior análisis proximal

correspondiente.

14.7.- Diseño de hoja de calculo Excel para registro de datos y análisis zootécnico y de composición proximal de las dietas

Los datos obtenidos fueron registrados en una hoja de cálculo previamente

elaborada para evaluar todos los parámetros zootécnicos que den respuesta al

comportamiento de los alevines sobre el tipo de alimento consumido, así como la

evaluación de la composición del mismo. Se utilizaron los mismos parámetros para

evaluar el valor biológico nutricional de la harina de lombriz del estudio efectuado en

el INRA, Saint Pée sur Nivelle, Francia.

CAPITULO III

RESULTADOS Y DISCUSION

Análisis proximal de materias primas animales, vegetales y formulas alimenticias comerciales 1.- Análisis físico-químico 1.1.- Composición Centesimal Se presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0,001) para todos los

parámetros (humedad, proteína, ceniza, grasa y extractos no nitrogenados) en las

diferentes muestras de origen animal y vegetal. La prueba de Rango múltiple de

Duncan, mostró igualmente, que existen diferencias (p< 0,05) entre las diferentes

muestras evaluadas.

En la Tabla 24, se muestran los valores medios del análisis proximal de materias

primas nacionales de origen animal. La HLF presentó un contenido de humedad

(7,72 %) que entran dentro del rango obtenido por Velásquez et al; (1986) y Vielma

(2004), valor que fue superado por la HLT con un contenido de humedad promedio

de 17,86 %, muy por encima de los valores de referencia de ambos investigadores

con 7,3 y 13,5 %, respectivamente. Con respecto al contenido de proteína, la HLF

tuvo un valor de 61,51 % y la HLT 47,04 %, la primera entró dentro del rango

reportado por Núñez (1995) con 57,7 %; Tacon et al; (1983) con 58,78 % y Vielma

(2004) con 62,3 %, mientras que la segunda estuvo por debajo de los datos

obtenidos por estos investigadores, posiblemente debido al tipo de procesamiento

de la misma, la cual al poseer un alto porcentaje de humedad determina una

disminución sustancial de la proteína. Los valores medios de grasa para la HLF

(10,65 %) y la HLT (9,47 %) se ubicaron dentro de los valores reportados por Tacon

191

et al; (1983), Medina y Araque (1999), Núñez (1995) y Vielma (2004), quienes

obtuvieron valores de 9,04; 9,75; 10,50 % y 11,10 %, respectivamente. En cuanto al

contenido de cenizas la HLF presentó un valor medio (4,76 %) inferior a los

reportados por Medina y Araque (1999) y Velásquez et al; (1986), que fueron de

6,35 y 8,4 %, respectivamente, mientras que la HLT (14,45 %) obtuvo el valor más

elevado, que se aproxima al reportado por Tacon et al; (1983) con un valor de

ceniza de 17,24 %, éste resultado podría estar asociado al tipo de preparación de la

harina en la cual quedarían algunos componentes o impurezas de la misma,

favoreciéndose un incremento en su composición mineral. Los valores medios de

extractos no nitrogenados para ambas muestras HLF (15,36 %) y HLT (11,18 %)

estuvieron por encima de los valores conseguidos por Vielma (2004), cuyos

resultados oscilaron entre 3,90 y 8,30 % para harinas de lombriz liofilizadas y

secadas en estufa.

Tabla 24.- Composición nutricional de muestras de harinas nacionales de

origen animal (g/100 g).

Análisis Proximal en porcentaje (%)

Muestra Humedad Proteína Grasa Ceniza ENN

HLF 7,72b ± 0,269 61,51d ± 0,368 10,65c ± 0,01 4,76a ± 0,057 15,36d*

HLT 17,86d ± 0,050 47,04a ± 0,000 9,47a ± 0,240 14,45b ± 1,584 11,18c*

HPC 8,78c ± 0,045 61,37c ± 1,810 10,31b ± 0,075 15,64c ± 0,803 3,90b*

HCH 3,52ª ± 0,184 47,73b ± 0,403 13,80d ± 0,141 31,34d ± 0,028 3,61a*

* ENN: Extractos no nitrogenados: Valor obtenido por diferencia • HLF: Harina de lombriz Farmacia • HLT: Harina de lombriz Trujillo • HPC: Harina de pescado Cumaná • HCH: Harina de carne y hueso

Según lo establecido en la Norma COVENIN 1482-79 (Alimento para animales:

Harina de pescado), el contenido de humedad de la HPC (8,78 %) entró dentro de la

192

especificación establecida, que es del orden del 10 %. En lo referente al contenido

de proteínas la HPC (61,37 %) se ubicó en el rango de contenido proteico exigido

que va de 55 a 65 %. Con respecto al contenido de grasa, la HPC (10,31 %) cumplió

con las especificaciones de la norma que va desde 10 % hasta un máximo del 13 %,

lo cual puede ser ventajoso dependiendo del tipo de ácidos grasos presentes en la

muestra analizada. La HPC en cuanto a la ceniza (15,64 %) se encontró que estaba

por debajo de lo exigido en la norma (18-20 %). No existe en la normativa puntos de

comparación para contenido de extractos no nitrogenados, sin embargo, la HPC

mostró un 3,90 % de extractos no nitrogenados. Según los resultados obtenidos, la

HPC cumple con las especificaciones de macronutrientes exigidos por COVENIN

1482-79 (Alimento para animales: Harina de pescado), sin embargo, se deben

evaluar otros factores como: el aspecto microbiológico y la presencia de aminas

biogenas o toxinas bacterianas, para descartar los factores que en otras

investigaciones han causado problemas de enfermedad en las truchas, y de esta

manera valorar finalmente este subproducto de la industria conservera de la sardina

y el atún en Venezuela.

Los valores promedios de humedad (3,52 %), proteína (47,73 %), grasa (13,80 %) y

ceniza (31,34 %) para la HCH se ubicaron entre los rangos exigidos por la Norma

COVENIN 1418:1999 (Alimentos para animales: harina de carne y hueso), la cual

establece en cada caso valores de 5-6 % de humedad, 46-50 % de proteína, 15%

de grasa y 32 % de ceniza.

El análisis proximal de materias primas vegetales nacionales se muestra en la Tabla

25. El contenido de humedad (13,32 %) y proteína (16,12 %) del AFT coincidió con

los valores presentados en la tabla de composición de alimentos (1999), que son de

13,2 y 16,3 %, respectivamente, pero su valor en grasa 3,13 % fue similar al

obtenido por Núñez (1995), pero menor al reportado (4,5 %) en la tabla de

composición, su media en extractos no nitrogenados fue de 61,56% que supera al

establecido (59,9 %) en este manual de alimentos, pero estuvo por debajo de lo

obtenido (66,9 %) por Núñez (1995).

193

La HMA presentó contenidos de humedad, de 13,23 % y 2,34 %, respectivamente,

según el INN (1999), los valores de humedad fueron altos porque superan el 9,9 %

de la tabla de composición de alimentos, tuvo un menor contenido graso cuando se

compara al 3,5 % establecido. Mientras que en ceniza (1,37 %) presentó un valor

cercano al reportado (1,1 %) por INN (1999) y por Blanco et al., 2000, con 1,3 % de

ceniza. Con respecto a la proteína (8,53 %) y extractos no nitrogenados (74,53), la

HMA estuvo un poco por encima del valor de referencia del INN (1999), que son de

7,3 % y 78,2 %, respectivamente. Según Blanco et al., (2000), la proteína de la

Harina de maíz (9,7 %), se ubico por encima del valor obtenido en esta investigación

(8,53 %).

Tabla 25.- Composición nutricional de muestras de harinas nacionales de origen vegetal (g/100 g).



AFT 13,32c ± 0,002 16,12b ± 0,000 3,13b ± 0,028 5,87c ± 0,233 61,56b*

HMA 13,23b ± 0,060 8,53a ± 0,380 2,34a ± 0,054 1,37a ± 0,060 74,53c*

HHL 3,72a ± 0,035 26,60c ± 0,040 8,59c ± 0,640 4,40b ± 0,070 56,69a*

* ENN: Extractos no nitrogenados: Valor obtenido por diferencia AFT: Afrecho de trigo; HMA: Harina de maíz amarillo; HAL: Harina de hoja de Leucaena

Para el caso específico de la HHL los valores de proteína (26,60 %) se ubicaron por

encima del contenido proteico reportado por Maurelo (2003) de 24,9 %, pero son

similares a los obtenidos por Jones (1979) con 25, 9% de proteína. Por su parte,

Narváez y Lascano, obtuvieron un valor de proteína superior (35,9 %) en hojas

jóvenes y maduras de esta leguminosa. Con relación a las cenizas (4,40 %) esta

harina presento un menor valor al compararlo con el obtenido por Maurelo (2003) y

Jones (1979) quienes lograron contenidos de ceniza de 7,3 % y 11,0 %,

respectivamente. No existen referencias de la composición de grasa y extractos no

nitrogenados, sin embargo en la HHL estos valores fueron de 8,59 % y 56,69 %,

respectivamente. Estos valores de grasa son superiores a los reportados por Tacon

(1986) con un 6,8 % de grasa en semillas de leucaena y para el caso de los

194

extractos no nitrogenados estos están por encima del valor referido por Tacon

(1986) de 37,2 %.

En la Tabla 26, se muestra el análisis proximal de muestras de alimentos

concentrados para truchas. Los contenidos de humedad de las harinas evaluadas

presentaron medias, que se ajustan a lo establecido en la norma COVENIN 1885:85

(Alimento completo para peces) que es de 12 %, los valores obtenidos son de 10,05

% (A), 12,53 % (B) y 9,37 % (C). Con respecto al contenido de proteína, todas las

muestras analizadas (A, B y C) cumplieron con las especificaciones exigidas para la

etapa de iniciación de peces, que es del 42% como límite máximo según esta

norma, ya que los valores obtenidos fueron de 42,06 % (A), 47,90 % (B) y 52,50 %

(C). Las formulaciones comerciales A y C presentaron valores en grasa de 9,25 y

13,56 %, respectivamente, que se ubican por encima de lo exigido en la norma (8

%), exceptuando la muestra B con el menor valor (7 %). No existe en esta norma

COVENIN 1885:85, (Alimento completo para peces), rangos de comparación con

respecto a los contenidos de ceniza y extractos no nitrogenados, sin embargo, los

valores fluctuaron entre 7,38 y 7,70 % de ceniza y entre 17,14 y 30,94 % de

extractos no nitrogenados.

Tabla 26.- Composición nutricional de formulaciones comerciales (g/100g)



A 10,05b ± 0,120 42,06a ± 1,683 9,25b ± 0,255 7,70a ± 0,092 30,94c*

B 12,53c ± 0,000 47,90b ± 1,018 7,00a ± 0,184 7,38b ± 0,2121 25,19b*

C 9,37a ± 0,424 52,50c ± 0,000 13,56c ± 0,382 7,43c ± 0,000 17,14a*

* ENN: Extractos no nitrogenados: Valor obtenido por diferencia. A y B: formulaciones alimenticias comerciales nacionales y C: formulación alimenticia comercial importada.

Los valores nutritivos de materias primas usadas en la alimentación de truchas

obtenidos por la NRC (1.993), se presentan en la Tabla 27. Podemos observar que

las materias primas nacionales que más se acercan a los valores de contenido de

195

proteína (65,40 %) presentes en el pescado y reseñados por la NRC son la HPC

(61,37 %) y la HLF (61,51 %). Con relación al contenido de grasa todas las materias

primas de origen animal nacionales analizadas en este trabajo poseen cantidades

superiores al obtenido en la harina de pescado (7,60 %). Las muestras de HLF y

HPC, fueron las que presentaron valores más cercanos en el parámetro de

humedad. Los requerimientos de los alimentos para truchas en cuanto a humedad

tienen un límite del 8,0 %. Los valores de las HLF y HPC son de 7,72 y 8,78 %,

respectivamente. En ceniza la HLT (14,45 %) y HPC (15,64%), se ubican en valores

similares a los presentes en el pescado (14,30 %), con respecto al contenido de

extractos no nitrogenados las materias primas mas cercanas al valor medio

recomendado (4,70 %) son la HCH (3,61 %) y la HPC (3,90 %). Al comparar el

análisis proximal de la Harinilla de trigo reportado por la NRC (1993), presentadas

en la tabla 4, con los de la muestra de AFT se observa valores de proteína (16,12

%), grasa (3,13 %) y extractos no nitrogenados (61,56 %) son inferiores a los

valores del ingrediente mas usado. En cuanto al contenido de humedad (13,32 %) y

ceniza (5,87 %), los valores encontrados son superiores a los presentes en la

materia prima de referencia. De las otras materias primas evaluadas, la HMA fue la

que presento el menor valor en contenido de proteína, a diferencia de la HHL que

obtuvo el mayor valor (26,60 %), por lo cual podría recomendarse el empleo de este

tipo de materia prima como fuente de proteína en formulaciones alimenticias.

Según Nuñez (1995), los valores de referencia de los requerimientos nutricionales

de la trucha arco iris en la etapa de iniciación (alevines), que es la etapa de mayor

exigencia de macronutrientes, van entre 45-50% en proteína, para grasa 5-8 % y

carbohidratos valores menores al 9 %. Según lo antes mencionado en relación al

contenido proteico todas las muestras de harina de origen animal (HLF, HLT, HPC y

HCH), cumplen con este requisito por poseer porcentajes de proteína que superan

el límite superior, cuyo rango varía entre 47,04 y 61,51 %. Sin embargo, hay que

considerar que la HPC a pesar de poseer un alto porcentaje de proteína, esta no es

una materia prima de calidad debido a que no hay almacenamiento en frió de la

misma antes de su proceso, ocurriendo cambios en su composición, producción de

aminas biogenas y otras sustancias toxicas que son perjudiciales para la cría de

peces.

196

Tabla 27.- Valores nutritivos de materias primas usadas en la alimentación de truchas (g/100 g).


Insumo Humedad Proteína Grasa Ceniza ENN

Harina de pescado 8,00 65,40 7,60 14,3 4,70*

Torta de Soya 10,00 48,50 0,90 5,80 34,80*

Harinilla de Trigo 11,00 17,00 4,30 4,60 63,10*

Melaza 6,00 9,60 0,80 12,50 71,10*

* ENN: Extractos no nitrogenados: Valor obtenido por diferencia Fuente: National Research Council (NRC), 1993.

Del mismo modo, en cuanto al contenido graso todas las materias primas de origen

animal cumplen con los requerimientos de los alevines. Para el caso de los

extractos no nitrogenados, solo cumple dentro de lo exigido, la HPC. Las muestras

de HLT y HLF, poseen mayores valores de 11,18 y 15,36 %, respectivamente,

superando al límite superior exigido en la formulación alimenticia.

Desde el punto de vista nutritivo, los macronutrientes más importantes en la

alimentación de peces son los niveles de proteína y grasa. De acuerdo a esto, todas

las materias primas de origen animal nacionales (HLF, HLT, HPC y HCH) evaluadas

poseen cantidades adecuadas de estos componentes, sin embargo, deben

efectuarse estudios de composición en aminoácidos y ácidos grasos, para evaluar

su valor biológico. Las muestras vegetales poseen cantidades inferiores de proteína

y grasa, no obstante, estas pueden combinarse con las de origen animal para

complementar otros ingredientes necesarios como la fibra y carbohidratos.

1.2.- Composición de minerales

La composición mineral (hierro, potasio, magnesio, sodio, cinc, calcio, cobre y

níquel) de muestras animales y vegetales se presenta en la Tabla 28. El análisis

estadístico (MANOVA) de estos mostró la existencia de diferencias significativas

(p<0,001) entre las muestras; se aplicó asimismo, una prueba de rango múltiple de

197

198

Duncan para observar donde se encontraban las diferencias, obteniéndose

diferencias significativas (p< 0,05) con relación a todas las muestras analizadas.

Para la comparación de los resultados obtenidos con otros autores, fue necesario en

algunos casos la transformación de los resultados de mg/Kg a mg/100g* o g/100g**.

En la HLF y HLT los valores de hierro fueron de 223,36 mg/Kg (22,34 mg/100g*) y

408,80 m/Kg (40,88 mg/100g*), respectivamente. Estos valores quedaron por

debajo de los reportados por Vielma et al., (2007) quienes obtuvieron 103,83

mg/100 g y 104,99 mg/100g, en muestras de harinas de lombriz secada en estufa y

liofilizadas. La HPC y HCH, presentaron valores de hierro de 289,15 mg/Kg y 313,24

mg/Kg.

El AFT presento un contenido de hierro de 125,73 mg/Kg (12,57 mg/100g*) valor

cercano al establecido en el INN (1999) para el hierro, que es de 11,9 mg/100g.

Para la HMA el contenido de hierro fue de 154,46 mg/Kg (15,45 mg/100g*), valor

que supera los contenidos reportados por INN (1999) y Maldonado & Sammán

(2000) que son de 1,80 mg/100g y 8,91 mg/100g, respectivamente. La HHL tuvo un

valor de hierro de 115,67 mg/Kg, valor inferior al reportado por Espinoza et al.,

(1998) que obtuvo 266 mg/Kg de este metal.

La HLF y HLT presentaron valores de potasio de 4545,08 mg/Kg (454,51 mg/100*) y

5275,18 mg/Kg (527,52 mg/100g*), valores inferiores a los obtenidos por Vielma et

al., (2007) quienes reportan contenidos de potasio de 654,17 mg/100g y 941,67

mg/100, para harina de lombriz secada en estufa y otra harina liofilizada. La HPC y

HCH mostraron valores de potasio de 3159,94 mg/Kg y 3381,09 mg/Kg.

El potasio presente en el AFT fue de 7237,30 mg/Kg (723,73 mg/100*) valor inferior

al reportado en las tablas de composición de alimentos del INN (1999), quien

establece el contenido de potasio en 867 mg/100g. La HMA presento un valor de

potasio de 2375,36 mg/Kg (237,54 mg/100g*). En la HHL el potasio fue de 7724,56

mg/Kg (7,72 g/100g**), valor que supera al contenido de este mineral reportado por

Espinoza et al. (1998) que fue de 1,9 g/100g.

Tabla 28.- Composición mineral de materias primas nacionales de origen animal y vegetal

Concentraciones en mg/kg

Muestras Hierro Potasio Magnesio Sodio Cinc Calcio Cobre Níquel

HLF 223,36c ± 0,820 4545,08d ± 0,992 4257,91b ± 0,995 7342,49e ± 0,895 93,99f ± 1,959 1309,97c ± 0,250 29,10f ± 0,451 ND

HLT 408,80f ± 0,382 5275,18e ± 0,749 8690,58f ± 1,901 3868,96c ± 0,581 82,70e ± 0,042 3957,44d ± 0,626 10,67d ± 0,096 ND

HPC 289,15d ± 0,036 3159,94b ± 0,397 7800,60d ± 1,580 5477,80d ± 0,909 91,19f ± 0,011 29975,0h ± 0,028 5,29a ± 0,104 ND

HCH 313,24e ± 0,396 3381,09c ± 0,408 6042,50c ± 0,40 3676,86b ± 0,43 52,38c ± 0,233 29206,47g ± 1,038 ND ND

AFT 125,73a ± 0,403 7237,3g ± 0,620 17653,05h ± 2,487 ND 60,42d ± 0,269 666,79b ± 0,078 8,76c ± 0,04 ND

HMA 154,46b ± 0,375 2375,36a ± 0,118 3463,46a ± 0,704 ND 20,95a ± 0,042 131,42a ± 0,033 ND ND

HHL 115,67a ± 0,033 7724,56h ± 1,013 9382,84g ± 1,544 ND 26,42b ± 0,008 5002,82e ± 0,539 6,03b ± 0,012 ND

FCN 340,34e ± 0,031 7096,16g ± 0,828 8373,95e ± 2,487 2807,02a ± 0,254 95,79f ± 0,022 20260,44f ± 2,014 13,99e ± 0,248 ND

ND: no detectables al límite de detección del método analítico del metal; HPC: Harina de pescado Cumana; HLF: Harina de lombriz Farmacia; HLT: Harina de lombriz Trujillo; HCH: Harina de Carne y Hueso; AFT: Afrechote trigo; HHL: Harina de hojas de Leucaena; HMA: Harina de maíz amarillo y FCN: Alimento balanceado comercial

199

En las HLF y HLT los contenidos de magnesio fueron de 4257,91 mg/Kg (425,79

mg/100g*) y 8690,58 mg/Kg (869,06 mg/100g*), valores ubicados muy por encima

de los reportados por Vielma et al., (2007) en harinas secadas en estufa (92,32

mg/100g) y harinas liofilizadas (91,70 mg/100g) de lombriz de la especie Eisenia

foetida. El magnesio presento valores de 7800,60 mg/Kg para la HPC y 6042,50

mg/Kg para HCH. Estos dos últimos sin valores de referencia para comparar.

Para el caso del magnesio en el AFT, este presento un valor de 17653,05 mg/Kg

(1765,31 mg/100g*), el cual esta muy por encima del establecido en el INN (1999)

que fija un contenido de 522 mg/100g. La HMA presento un contenido de magnesio

de 3463,46 mg/Kg (346,35 mg/100g*). El magnesio en la HHL fue de 9382,84

mg/Kg (9,38 g/100g**) valor que supera al 0,87 g/100g reportado por Espinoza et

al., (1998).

Para el caso del sodio, en las harinas vegetales no fue detectada la presencia de

este mineral, mientras que en las muestras de origen animal los valores estuvieron

comprendidos entre 3676,86 y 7342,49 mg/Kg. La formulación comercial analizada

tuvo un valor inferior de 2807,02 mg/Kg. La HLF y HPC obtuvieron los mayores

valores con 7342,49 y 5477,80 mg/Kg. Cabe destacar que la HLF fue obtenida por

un proceso de beneficio de lombrices donde se incluyo una solución de ClNa al 6%,

incrementado de esta manera la concentración de sodio en la harina.

En la HLF y HLT el contenido de sodio 7342,49 mg/Kg (734,25 mg/100g*) y 3868,96

mg/Kg (386,90 m/100g*) se ubica por debajo de los valores de referencia de Vielma

y col., (2007) quienes detectaron niveles de sodio de 1070,83 mg/100g y 631,67

mg/100g de este mineral en las muestras de harinas de lombriz secada a la estufa y

liofilizada, respectivamente. La HCH presento una cantidad de sodio de 367,8

mg/Kg (37,69 mg/100g*), valor inferior al 0,70 mg/100 g obtenido por Ross (1996).

El sodio en el AFT y HMA no fue detectado, sin embargo, el libro de composición de

alimentos fija un valor de 9 mg/100g para el afrecho de trigo, no reporta valor para la

harina de maíz amarillo. En la HHL no fue detectado, no obstante, Espinoza et al.,

reportan valores de sodio que van entre 0,07 y 0,15 g/100g de sodio.

200

La HLF y la HPC fueron las materias primas con mayores contenidos en cinc con

93,99 y 91,19 m/Kg, respectivamente. Las concentraciones de cinc de la HLF y HLT

fueron de 93,99 mg/Kg (9,40 mg/100g) y 82,70 mg/Kg (8,27 mg/100g),

respectivamente, cantidades que se ubican por encima de los reportados por Vielma

et al., (2007), quienes detectaron niveles de 4,35 mg/100g y 4,39 m/100g, de este

metal en las harinas de lombriz, secada a la estufa y liofilizadas. La HCH presento

un valor en cinc de 52,38 mg/Kg, inferior al contenido (93 mg/100g) determinado por

Ross, 1996.

El cinc en el AFT fue de 60,42 mg/Kg (6,04 mg/100g*) valor cercano al establecido

en el libro del INN (1999) que muestra un contenido de 7,50 mg/100g. En la HMA el

cinc fue de 20,95 mg/Kg (2,10 mg/100g*) el cual, es similar al obtenido por

Maldonado y Sammán (2000), que reportaron 2,99 mg/100g de cinc. La HHL

presento contenidos de cinc en 26,42 mg/Kg, valor inferior al reportado por Espinoza

et al., (1998) que determinaron contenidos de cinc de 37 mg/Kg.

La HCH por su naturaleza evidentemente presento una alta proporción de calcio

(29206,47 mg/kg), seguida de la HHL con 5002,82 mg/Kg. El calcio en la HLF fue de

1390,97 mg/Kg (130,99 mg/100g*), valor inferior a los obtenidos por Vielma y col.,

(2007) de 202,44 mg/100g (harina de lombriz secada en estufa) y 211,26 mg/100g

(harina de lombriz liofilizada). Mientras que el valor en calcio de la HLT fue de

3957,44 mg/Kg (395,74 mg/100g*) que se ubica por encima de los contenidos de

referencia. En la HCH, el calcio fue de 29206,47 mg/Kg (290,65 mg/100g) superior

al resultado obtenido por Ross (1996), con 10,30 mg/Kg.

El calcio en el AFT fue de 666,79 mg/Kg (66,68 mg/100g*) valor ubicado por debajo

del establecido por el INN (1999) que fija 8,0 mg/100g de calcio en afrecho de trigo.

La HMA presento niveles de calcio de 131,42 mg/Kg (13,14 mg/100g*), superando

al contenido que reseña el INN (1999) de 6,0 mg/100g. Para la HHL el calcio se

ubico en 5002,82 mg/Kg (5,01 g/100g**), valor superior al reportado por Jones

(1979), Espinoza et al., (1998) y Narváez & Lascano, quienes reportaron

concentraciones de calcio de 2,36 g/100g; 2,40 g/100g y 0,33 g/100g,

respectivamente, de calcio.

201

Se detectaron contenidos de cobre solo en las muestras animales de HLF y HLT

con 29,10 mg/Kg y 10,67 mg/Kg, cada una en las muestras vegetales de AFT y HHL

se determinaron concentraciones de 8,76 mg/Kg y 6,03 mg/Kg, respectivamente. La

formula comercial tuvo un 13,99 mg/Kg de este mineral.

Los niveles de cobre de las HLF y HLT fueron de 29,10 mg/Kg (2,91 mg/100g*) y

10,7 mg/kg (1,07 mg/100g*), respectivamente, valores cercanos a los obtenidos por

Vielma et al., (2007) con 2,02 mg/100g para la harina de lombriz secada en estufa y

1,90 mg/100g para la harina de lombriz liofilizada. En las muestras de HPC y HCH

no se detecto el cobre por tener cantidades no detectables con el método analítico

del metal.

El contenido de cobre en el AFT fue de 8,76 mg/Kg (0,88 mg/100g*) ubicándose

este por encima del valor de referencia (0,50 mg/100g) del libro de composición de

alimentos del INN (1999). En la HHL el cobre fue de 6,03 mg/Kg, el cual, es muy

inferior al ser comparado con el valor de referencia (16 mg/Kg*) reportado por

Espinoza et al. (1998). Para el caso de la HMA no se detecto la presencia de cobre,

sin embargo, Maldonado y Sammán (2000) reportan 0,98 mg/100g de este metal.

No se detecto la presencia de Níquel en ninguna de las muestras (de origen animal

y vegetal) analizadas, porque poseían valores no detectables al límite de detección

del método analítico del metal.

En general, las materias primas de origen animal y vegetal poseen cantidades

adecuadas de minerales, los cuales cubren las necesidades establecidas para la

trucha, de acuerdo a lo establecido en la tabla de niveles de nutrientes

recomendados para peces de la FAO (Tacon, 1989). Solo se presentaron niveles

bajos de cinc en las muestras de HMA y HHL. Y se presentaron niveles de cobre

adecuados en las muestras de HLF, HLT, AFT y HHL, por lo que se pueden

complementar en la preparación de dietas balanceadas.

202

1.3.- Composición en metales pesados La Tabla 29, contiene los resultados obtenidos de la composición en metales

pesados (arsénico, cadmio, plomo y selenio) de las muestras de origen animal y

vegetal examinadas. El análisis estadístico (MANOVA) aplicado determino

diferencias significativas (p< 0,001) entre todas las muestras estudiadas. La prueba

de rango múltiple de Duncan, detecto diferencias significativas (p< 0,05) entre

algunos parámetros evaluados.

En las harinas vegetales el arsénico fluctuó entre 3,6 y 9,79 mg/Kg, mientras que

en las harinas de origen animal estuvo comprendido entre 1,30 y 7,32 mg/Kg. La

dieta comercial presento para este elemento un valor de 8,75 mg/kg. Las mayores

concentraciones de este metal se presentaron en las muestras de HCH (7,32 m/Kg)

y HMA (9,79 mg/Kg). De acuerdo a lo establecido en la Asociación Americana de

Control Oficial de Alimentos (AAFCO: Association of American Feed Control

Officials) de 1996, todas las materias primas entran dentro de la norma por tener

valores inferiores a los niveles de tolerancia permitidos para animales que es de 50

mg/Kg, sin embargo, la mayoría de las materias primas y la formulación comercial,

exceptuando a la HPC (1,30 mg/Kg) no cumplen con la legislación europea, de

1988, que exige como contenido máximo 2 mg/Kg de arsénico (Méndez, 2001).

Para la Agencia de Protección Medio ambiental de Estados Unidos (EPA) los

problemas de arsénico para humanos están asociados con aguas y pescados, pero

raramente con productos de animales domésticos. Este metal se acumula

lentamente, pues si bien la absorción es elevada, a su vez este se excreta en la

orina (Méndez, 2001).

Para el caso del cadmio, este solo fue detectado en las harinas de HPC y HLF con

0,09 y 5,85 mg/Kg, respectivamente. Del mismo modo estas materias primas

cumplen con la AAFCO, por tener valores inferiores al máximo permitido de 10

mg/kg, sin embargo, se presenta el mismo resultado, no cumplen con lo establecido

en la legislación europea que exige un valor muy por debajo entre 0,5 y 1,0 mg/kg

(Méndez, 2001). Según Underwood y Suttle (1999), la absorción del cadmio por los

203

animales es baja, donde los porcentajes de absorción no sobrepasan el 1%, pero la

retención en el organismo es elevada, particularmente en los riñones.

Tabla 29.- Composición en metales pesados de materias primas nacionales de origen animal y vegetal.

Concentraciones en mg/kg

Muestras Arsénico Cadmio Plomo Selenio

HPC 1,30ª ± 0,809 0,09 ± 0,028 0,46a ± 0,071 3,16b ± 0,218

HLF 3,75d ± 1,478 5,85 ± 0,165 3,06e ± 0,412 10,59c ± 0,572

HLT 2,30b ± 0,453 ND 2,06c ± 0,087 9,96c ± 0,705

HCH 7,32f ± 1,117 ND 2,10c ± 0,085 9,55c ± 0,205

AFT 3,66c ± 0,389 ND 0,93b ± 0,09 1,30a ± 0,001

HHL 4,82e ± 0,198 ND 1,14b ± 0,105 1,98a ± 0,750

HMA 9,79h ± 0,371 ND 1,88b ± 0,115 4,73b ± 0,001

FCN 8,75g ± 0,020 ND 2,62d ± 0.379 3,48b ± 0.410

ND: no detectables al límite de detección del método analítico del metal HPC: Harina de pescado Cumana; HLF: Harina de lombriz Farmacia; HLT: Harina de lombriz Trujillo; HCH: Harina de Carne y Hueso; AFT: Afrechote trigo; HHL: Harina de hojas de Leucaena; HMA: Harina de maíz amarillo; FCN: Alimento balanceado comercial El plomo en las harinas de origen animal fluctuó entre 0,46 y 2,10 mg/Kg. En las

harinas vegetales estuvo entre 0,93 y 1,88 mg/Kg y la dieta comercial tuvo un valor

de 2,62 mg/Kg. Según lo exigido por la AAFCO (1996) el límite máximo permitido

para el plomo es de 40 mg/kg, por lo que todas las materias primas y la formulación

comercial cumplen con la normativa americana. Y en este caso particular también

cumplen con lo exigido por la legislación europea cuyo nivel crítico es de 5 mg/Kg

(Méndez, 2001), cabe destacar que la absorción de plomo por los animales es baja,

inferior al 1% (Underwood y Suttle, 1999). Cuando se formulan alimentos con estas

materias primas siempre se considera una mezcla, luego el porcentaje de

sustitución con todas las materias primas utilizadas nunca corresponderá un 100%

de uso de un solo ingrediente, reduciendo aun más el aporte de estos elementos.

204

Con respecto a la concentración de selenio este varió entre 3,1 mg/Kg y 10,59

mg/Kg en las muestras de origen animal, mientras que en las harinas vegetales

estuvo comprendido entre 1,30 y 4,73 mg/Kg. La formulación comercial obtuvo una

concentración de 3,48 mg/Kg. De acuerdo a la AAFCO los niveles de selenio de

todas las materias primas vegetales, la HPC y la dieta comercial están por debajo

del limite máximo permitido (10 mg/Kg), mientras que la HCH, HLT y HLF, poseen

valores 9,55; 9,96 y 10,59 muy cercanos al limite critico (Méndez, 2001), sin

embargo las incorporaciones de estas materias primas a las formulaciones

alimenticias son menores del 100%, van entre un 10 y un 30%, por lo cual los

niveles que se aportan a la dieta formulada son menores.

Las materias primas de origen animal y vegetal evaluadas, poseen niveles de

contaminantes (As, Cd, Pb y Se) dentro de los limites exigidos por la Asociación

Americana de Control Oficial de Alimentos (AAFCO: Association of American Feed

Control Officials) de 1996. Por otro lado, la legislación europea de 1988, exige

niveles críticos mas bajos, y por ende mas estrictos, determinando que algunas

materias primas como por ejemplo, la HLF presenten niveles de metales como es el

caso del arsénico (3,75 mg/Kg) que sobrepasan el limite permitido de 2,0 mg/Kg,

sin embargo, esta fuente proteica nunca será utilizada a un 100%, y sus cantidades

recomendadas son de un 20 % a un 30%, por lo que la incorporación final de este

metal a la dieta estará en proporciones de 0,75 mg/Kg y 1,13 mg/Kg,

respectivamente, cumpliendo en este caso con la norma europea.

1.4.- Conclusiones La mayoría de las materias primas nacionales de origen animal poseen contenidos

de proteína que superan a los contenidos presentes en las formulaciones

comerciales, exceptuando la HLT.

Otro de los componentes esenciales en la nutrición de truchas es el contenido de

grasa presente en la formula alimenticia, y todas las materias primas nacionales de

origen animal poseen contenidos muy cercanos o que superan a las marcas

205

comerciales. Sin embargo, se necesita conocer su valor biológico en función de la

presencia de ácidos grasos esenciales.

Con respecto al contenido de extractos no nitrogenados todas las muestras

vegetales analizadas sirven para incorporar este componente como fuente de

energía al poseer valores que lógicamente superan al contenido presente en las

marcas comerciales.

Las muestras analizadas poseen contenidos de micronutrientes que cubren con las

necesidades de los peces y poseen cantidades de metales pesados que cumplen

con los niveles permitidos por la normativa de la Asociación Americana de Control

Oficial de Alimentos de 1996.

Análisis microbiológico de materias primas

2.- Análisis de recuentos de agobios mesófilos, coliformes totales, coliformes fecales, enterobacterias, mohos, levaduras y salmonella spp, en materias primas.

Los resultados del análisis microbiológico de las materias primas de origen animal y

vegetal se muestran en las tablas 30 y 31. Todas las harinas de origen animal (HPC,

HLF y HCH) y la HHL (origen vegetal), son consideradas aptas para el uso en la

alimentación animal y humana, dado a que no se evidenció la presencia de

bacterias patógenas y los niveles de los indicadores microbiológicos (aerobios

mesófilos) están dentro del rango de bacteria permitido para este tipo de producto

según las normas COVENIN [1482 (1979), 1607 (1980) y 1418 (1999)], y para la

HHL se comparó con la 2135 (1996) de harina de maíz precocida.

De acuerdo a la ICMSF (1981), la Normativa de Control Oficial y Seguridad

Alimentaría (1991) y las Normas microbiológicas de los alimentos (Moragas y De

Pablo, 2007) de España, para productos de la Pesca y derivados, la HPC cumple

con el límite permitido por tener un recuento de bacterias aerobias mesófilas inferior

al exigido que va para pescado fresco y congelado de 106 a 107 ufc/g para la ICMSF

206

y de 105 ufc/g para las otras normas españolas antes mencionadas, además de la

ausencia de enterobacterias y Salmonella.

Tabla 30.- Análisis microbiológico (ufc/g) de materias primas nacionales de origen animal

Muestra BAM CT CF E M L Salmonella

sp.

HLF 1,13x103 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 Ausente

HCH <1,0x10 4,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 Ausente

HPC 1,22x104 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 Ausente

HLF: Harina de lombriz Farmacia; HCH: Harina de Carne y Hueso; HPC: Harina de Pescado Cumaná; BAM: Bacterias aeróbicas mesófilas; CT: Coliformes Totales; CF: Coliformes Fecales; E: Enterobacterias; M: Mohos; L: Levaduras

Tabla 31.-Análisis microbiológico (ufc/g) de materias primas de origen vegetal

Muestra

BAM CT CF E M L Salmonell

a sp.

HMA 4,8x104 4,0x103 1,9x103 5,3x102 >6,4x106

>6,4x106

Presente

HHL 1,34x103

<1,0x1

0

<1,0x1

0

<1,0x1

0

<1,0x10 <1,0x10 Ausente

HAT 1,7x104 1,1x104 <1,0x1

0

3,0x103 1,2x103 3,1x103 Ausente

HMA: Harina de Maíz Amarillo; HHL: Harina de Hoja de Leucaena; HAT: Harina de Afrecho de Trigo; BAM: Bacterias aeróbias mesófilas; CT: Coliformes Totales; CF: Coliformes Fecales; E: Enterobacterias; M: Mohos; L: Levaduras

Del mismo modo la HLF, al compararse con la normativa para carnes y derivados

cárnicos cumple con lo exigido por estar exenta de bacterias del grupo coliformes,

enterobacterias y Salmonella. Los valores obtenidos de BAM para la HLF

(1,13x103), son muy cercanos a los obtenidos por Segovia en 1992 (1,6x103 ufc/g),

207

e inferiores a los reportados por Vielma (2004), (7,5x 104 ufc/g) para la harina de

lombriz secada en estufa, y Velásquez et al., 1986a quien halló 8x106 ufc/g de

BAM. La HCH, presentó ausencia en la mayoría de los microorganismos estudiados,

y solo se detectaron 4 ufc/g de bacterias coliformes, que se ubican muy por debajo

del limite de tolerancia exigido (< 103 ufc/g) por las normas del FEDNA (2003).

Por tanto, los resultados obtenidos señalan que desde el punto de vista

microbiológico, la HMA no es apta para el consumo animal y/o humano, de acuerdo

a lo exigido por la norma COVENIN 2135 (1996), debido a que según las pruebas

bioquímicas (Tabla 32) se detectó la presencia de la bacteria patógena Salmonella

sp. y por las pruebas API E-20 (Tabla 33), se identificaron las especie Salmonella

paratyphi A, S. choleraesuis, y dos cepas positivas del genero Salmonella spp,

además de altos recuentos en los coliformes totales y fecales, lo que indicó la

contaminación cruzada fecal del producto a nivel del lugar del expendio (mercado).

De igual manera, los altos valores obtenidos para los mohos y levaduras sugieren

que este producto ha iniciado un deterioro organoléptico. Los valores de BAM

(4,8x104 ufc/g) de esta materia prima se ubican por debajo de lo exigido (106 ufc/g

en harinas y sémolas) por el FEDNA (2003) y la Norma microbiológica y parámetros

físico-químicos relacionados de España (Moragas y De Pablo, 2007).

Tabla 32.- Resultados de las pruebas bioquímicas en la detección del genero Salmonella en la harina de maíz amarillo.

Análisis Bioquímico

Urea (+) Motilidad (+) H2S (+)

Oxidasa (+) Glucosa (+) OF (+)

LIA (+) Lactosa (-) Gram (-)

LIA: Agar Hierro Lisina OF: Reacción oxido-fermentación 3.- Determinación de la especie de Salmonella

208

De las colonias bacterianas aisladas de la HMA, con resultado positivo en las pruebas

bioquímicas previas, se realizo la identificación de dos especies de Salmonella y unos

géneros sin llegar a la identificación de especie.

Tabla 33.- Pruebas del sistema API-20E de Identificación de Salmonella sp. Prueba Salmonella

choleraesuis Salmonella

choleraesuisSalmonella Paratyphi A

Salmonella spp

Salmonella spp

ONPG - - - - -

ADH - - + + +

LDC + + - + +

ODC + + + + +

CIT - - - + +

H2S - - - + +

URE - + - - -

TDA - - - - -

IND - - - - -

VP - - - - -

GEL - - - - -

GLU + + + + +

MAN + + + + +

INO - - - - +

SOR + + + + +

RHA - + + + +

SAC - - - - -

MEL - - + + +

AMY - - - - -

ARA - - - + +

OX - - - - -

Código 410450057 411451057 210455257 670455257 670475257

ID (%) 96,5 99,0 94,0 89,0 99,9

ID: Índice de determinación ONPG: Beta-galactosidasa; ADH: Arginina deshidrolasa; LDC: Lisina descarboxilasa; ODC: Ornitina descarboxilasa; CIT: Utilización del citrato; H2S: Producción de H2S; URE: Ureasa; TDA: Triptófano desaminasa; IND: Producción de indol; VP: Producción de acetoína (Voges-

209

Proskauer); GEL: Gelatinasa; GLU: Fermentación/oxidación de glucosa; MAN: Fermentación/oxidación de manitol; INO: Fermentación/oxidación de inositol; SOR: Fermentación/oxidación de sorbitol; RHA: Fermentación/oxidación de ramnosa; SAC: Fermentación/oxidación de sacarosa; MEL: Fermentación/oxidación de melodiosa; AMY: Fermentación/oxidación de amigdalina; ARA: Fermentación/oxidación de arabinosa; OX: Citocromo oxidasa. Los resultados del sistema de identificación multiprueba API E-20 usada en la

identificación de la especie de las cepas de la bacteria Salmonella detectadas en los

análisis de la muestra de maíz amarillo (HMA) (Tabla 33), mostró dos codificaciones

finales características de 410450057 y 411451057, en dos de sus cepas, típica de la

bacteria Salmonella choleraesuis que obtuvo un 96,5 % y 99,0 % de índice de

determinación (ID); se presentó del mismo modo en otra colonia bacteriana la

especie Salmonella paratyphi A, con 94,0 % de ID y la codificación 210455257;

Finalmente en dos cepas aisladas de la HMA solo se logro identificar el genero

Salmonella spp con los ID de 89,0 %; 99,9 %; y las codificaciones respectivas de

670455257 y 670475257.

En la identificación de las cepas y especies de Salmonella, se usaron

adicionalmente otras pruebas bioquímicas complementarias como NO2; N2; MOB;

MsC (Agar Mac Conkey); OF-O (Oxido/Fermentativa-Oxidativa) y OF-F

(Oxido/Fermentativo-Fermentativo), y sus resultados en todos los casos fue

respectivamente de: (+), (-), (+), (+), (+), (+).

El género Salmonella esta constituido por bacilos cortos gram negativos no

esporoformadores, anaerobios facultativos, estrechamente relacionados morfológica

y fisiológicamente con los otros géneros de la familia enterobacteriacea a la que

pertenecen (Miller y Pegues, 2000; Leminor, 1992).

Los reservorios de Salmonella más comúnmente notificados incluyen animales

domésticos y silvestres de diversos tipos, incluidos porcinos, bovinos, aves

silvestres y de corral, roedores, iguanas, tortugas, perros y gatos (Acha y Szyfres,

2001; Rodrígue et al., 1990; Refsum et al., 2002). En reservorios secundarios como

aguas de pozos, suelo, camas para crianza y carcasas los microorganismos

sobreviven durante períodos muy largos, pero no se multiplican normalmente como

en los sistemas digestivos de sus hospederos potenciales (Vadillo et al., 2002; Acha

210

y Szyfres, 2001). Estas bacterias pueden resistir la deshidratación durante un

tiempo muy prolongado, tanto en las heces como en los alimentos para consumo

humano o animal. Asimismo, pueden sobrevivir en productos con elevadas cargas

de proteína y grasas, por ejemplo en salchichas saladas (Crosa et al., 1973). Los

humanos enfermos con frecuencia son portadores convalecientes, en especial en

casos no identificados en los que actúan como reservorios. El estado de portador

crónico es más común en animales que en seres humanos (Acha y Szyfres, 2001;

Pegues et al., 2002).

Los animales son portadores de Salmonella spp, debido a factores tales como el

consumo de pastos regados con aguas contaminadas por este microorganismo; las

aves y animales silvestres pueden a través de sus heces contaminar los alimentos

de uso animal, tales como harina de pescado, harina de sangre y hueso, los cuales

pasan a ser importantes vehículos de transmisión de la bacteria a los animales

domésticos y productos de consumo humano. Por otra parte, las personas

portadoras de Salmonella, pueden transmitir la bacteria a otras personas al

manipular los alimentos de manera inadecuada (Insunza y Soto, 1998).

Del Pozo et al., 2001, efectuaron un estudio de detección de salmonella, obteniendo

un 13,6% de muestras positivas de un total de 140 muestras de alimentos y

materias primas, siendo la harina de soya y harina de trigo las de mayor porcentaje

de contaminación, con un 29,1 % y 20,8 % respectivamente. Estudios efectuados en

USA, indican que la contaminación de piensos por Salmonella es consecuencia de

una recontaminación, pues existen ciertos serotipos (S. senftenberg, S. montevideo,

S. cerro y S. enteritidis) evaluados que no aparecen normalmente en los alimentos

procesados.

La infección de origen alimentario por Salmonella spp., es una de las causas más

importantes de gastroenteritis en seres humanos. Los principales reservorios de

estos microorganismos son animales portadores asintomáticos y las fuentes de

infección más frecuente son los alimentos o los productos derivados de estos. El

aumento de la incidencia de Salmonella spp., es de gran impacto tanto en salud

pública como en salud animal y se ha relacionado con un incremento de la

211

diseminación de los microorganismos a través de las cadenas productivas animales

(bovinos, cerdos, pollos asaderos y en especial gallinas ponedoras) (Uribe y Suarez,

2006).

El incremento de la presencia de Salmonella spp y de otras serovariedades de esta,

es el resultado de una combinación de factores que se relacionan con el desarrollo

en la industrialización en todas las fases de producción de alimentos, cambios en

las prácticas de manejo, almacenamiento, distribución y preparación de los mismos.

Estas variaciones han tenido como consecuencia nuevos problemas en la higiene

de los alimentos al originar una fácil diseminación de Salmonella spp., así como de

otros gérmenes patógenos (Acha y Cifres, 2001).

La bacteria Salmonella paratyphi A, es uno de los serotipos del genero Salmonella

que son de tipo enterico, caracterizados por colonizar sólo a humanos y las fuentes

principales de S. paratyphi A son el agua contaminada con excreciones humanas y

alimentos manipulados por portadores asintomático (Hook, 1990), y junto al otro

serotipo S. typhi son las causantes de la fiebre entérica (Marín et al., 2006).

La Salmonella choleraesuis, es otro serotipo de Salmonella que puede del mismo

modo contaminar alimentos y posteriormente a los animales y al hombre. Sus

fuentes de contaminación son hombres y animales enfermos y materias primas

contaminadas (Darwich et al., 1999). Por lo antes expuesto pudiera asociarse una

contaminación cruzada del maíz a nivel de mercado.

En la HAT no se detectó la presencia de la bacteria patógena Salmonella sp, sin

embargo, esta harina presentó altos valores en los indicadores de bacterias

aerobias mesófilas, coliformes totales, mohos y levaduras, lo que sugiere problemas

de conservación y almacenamiento del producto, a nivel de mercado. Según la

Normativa de Control Oficial y Seguridad Alimentaría de España (1987), para

Harinas y derivados de cereales, la HMA esta por encima del límite microbiológico

permitido, el cual es para aerobios mesófilos de 104 ufc/g, bacterias coliformes

fecales (E. coli) ausentes/g, ausencia de Salmonella sp en 25 g y recuentos de

mohos y levaduras con un máximo de 102 ufc/g. Para el caso de la HAT, esta

212

cumple con la normativa española de 1984, que exige límites microbiológicos por

encima de los obtenidos en esta materia prima, con valores para aerobios mesófilos

de 106 ufc/g y mohos de 104 ufc/g, Según la norma COVENIN 1878 (1983), la HAT

cumple con la normativa ya que solo exige para este producto ausencia de bacterias

del genero Salmonella. De acuerdo al FEDNA (2003), la HAT, cumple con las

especificaciones para BAM, sin embargo, presenta valores de coliformes totales que

superan el limite de tolerancia permitido (<103 ufc/g).

4.- Conclusiones Las muestras de origen animal cumplen con las exigencias de calidad

microbiológica exigidas por las normas venezolanas COVENIN e internacionales.

Se detectó la presencia de la bacteria patógena Salmonella paratyphi, Salmonella

choleraesuis, y 2 cepas mas del genero Salmonella sin identificación de especie en

la muestra de harina de maíz amarillo.

El afrecho de trigo presentó recuentos altos de bacterias aerobias mesófilas,

coliformes totales, mohos y levaduras.

A nivel de mercado local, existe una contaminación cruzada de las harinas

vegetales, que determina la presencia de altos recuentos de bacterias, mohos y

levaduras, incluso bacterias patógenas como Salmonella.

Propiedades Funcionales 5.- Análisis del índice de solubilidad (%) de materias primas

5.1.- Índice de solubilidad de la caseína

La caseína presentó su mínimo de solubilidad a pH 4,5 (Figura 15), es decir, al pH

en la cual esta llega a su punto isoeléctrico, donde las cargas positivas y negativas

213

se igualan, y la carga neta es nula, perdiendo su solubilidad (Miller, 2001). En este

punto de pH las atracciones electrostáticas son máximas, la molécula es muy

compacta y replegada. La mayor solubilidad de esta proteína se ubica en la región

de pH de 3,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0; debido a que en estos valores de pH su estado de

asociación es mas débil que en el pH isoeléctrico, la molécula de proteína esta por

tanto mas abierta y sus moléculas están mas desplegadas bajo el efecto de las

repulsiones electrostáticas (Medina, 1992).

El índice de solubilidad se define como el volumen de solvente requerido para

disolver un peso especifico en solución (Alder-Nissen, 1976). La solubilidad facilita

la difusión de la proteína hacia la interfase aire-agua y aceite-agua, confiriéndole

con esto, una buena actividad de superficie, pero no es siempre correcto afirmar que

las proteínas deben tener una solubilidad inicial elevada para manifestar otras

importantes propiedades funcionales (Medina 1992). Esta propiedad funcional

influye en la calidad y atractivo del alimento (Miller 2001).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e S

olub

ilida

d (%

)

Figura 15.- Curva de solubilidad proteica de la caseína.

5.2.- Índice de solubilidad (%) de la harina de lombriz (Eisenia andrei) Farmacia

214

En la Figura 16, se muestra la influencia del pH sobre la solubilidad de la harina de

lombriz Farmacia (HLF), esta evidentemente no presenta una curva típica de

solubilidad como la que posee la caseína, donde se visualiza el mínimo de

solubilidad a pH 4,5. Esto se debe a que la HLF esta compuesta por un grupo

complejo de diferentes proteínas, como se evidencio en el estudio electroforético

previo (Ver Figura 25, Pág. 231). Para esta materia prima, no convencional, se pudo

determinar que en el estudio sobre el porcentaje del índice de solubilidad se

reportan como mínimos de solubilidad las regiones de pH 3,5 (67,6 %); 5,0 (74,5 %);

y 7,0 (68,3 %). En la curva los incrementos de solubilidad ocurren a pH 3,0; 4,0 y

5,5, luego descienden. Su máximo de solubilidad llega en la región del pH 5,5 (81,7

%).

Estos resultados son similares a los obtenidos por Vielma y Medina (2006) quienes

obtuvieron en harina de lombriz liofilizada (E. foetida) [HLL] una menor solubilidad a

pH 3,5; pero difiere en que no detectaron solubilidades menores a los pH 5,0 y 7,0.

Por otro lado, en muestras de harina de lombriz secada en estufa de la misma

especie [HLSE], Vielma y Medina (2006) encontraron los mínimos de solubilidad a

pH 3,5; 4,5 y 7,0. De acuerdo a esto, la muestra de HLF analizada solo coincide en

los puntos de menor solubilidad 3,5 y 7,0; pero difiere del área de solubilidad 4,5;

que se mantiene con una solubilidad casi constante entre el área de pH de 4,0 a 4,5,

con valores de solubilidad de 75,7 % y 75,8 %, respectivamente.

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

Índi

ce d

e S

olub

ilida

d (%

)

pH

215

Figura 16.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de lombriz

Farmacia (HLF). Cabe destacar, que las harinas fabricadas por Vielma y Medina (2006), difieren en

su proceso de fabricación con respecto a la muestra evaluada en esta investigación,

Vielma y Medina (2006) prepararon una liofilizada [HLL] y la otra secada en estufa

[HLSE] pero con previo tratamiento de schok osmótico de NaCl al 4 %, y la especie

de lombriz utilizada también fue diferente.

Otros investigadores como Velásquez et al., 1990 y Medina & Araque (1999)

también obtuvieron buenos % de solubilidades con relación al pH en la harina de

lombriz (Eisenia foetida).

5.3.- Índice de solubilidad (%) de la harina de carne y hueso La harina de carne y hueso (HCH) (Figura 17) presentó su menor valor de índice de

solubilidad a pH 3,5 (67,4 % de solubilidad) y 7,0 (76,8 %), seguidos de otras áreas

de mayor solubilidad a pH 4,5 (80,9 %) y 6,0 (80,3 %), sin embargo, los porcentajes

de solubilidad siguen siendo altos en estos últimos rangos de pH.

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e S

olub

ilida

d (%

)

216

Figura 17.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de carne y hueso

(HCH). Si comparamos estos resultados con los obtenidos por Vielma y Medina (2006) para

la harina de lombriz secada en estufa (HLSE), se observan similitudes en los puntos

de menor solubilidad a pH 4,5 y 7,0. Sin embargo, para esta materia prima (HCH),

sus solubilidades fueron más elevadas al ser comparada con la HLSE. Mora-

Cornejo et al. (2000) obtuvo en harina de carne diferentes % de solubilidad (entre

86,51 % y 92,02 %) al tratar la muestra con diferentes tiempos de calentamiento, y

estos valores difieren de los obtenidos en la HCH.

En la carne, la solubilidad de las proteínas está determinada por los aminoácidos

presentes en la superficie de la molécula y por el balance entre las interacciones

energéticas dentro de la proteína, así como entre las proteínas y el agua (solvente).

La superficie de la proteína soluble en el agua esta cubierta por aminoácidos

polares que favorecen la interacción con el agua; y las proteínas insolubles en agua

tienen mas grupos hidrofobicos en la superficie (Creighton, 1993).

Una buena solubilidad facilita la difusión de la proteína hacia la interfase aire-agua y

aceite agua, confiriéndole también una buena actividad de superficie, pero no es

siempre correcto afirmar que las proteínas deben tener una solubilidad inicial

elevada para manifestar otras importantes propiedades funcionales (Medina, 1992).

Así mismo, al pH isoeléctrico, solamente la proteínas desnaturalizadas que no están

estabilizadas en su estructura espacial por puentes disulfuro precipitan (Linden y

Lorient, 1994).

5.4.- Índice de solubilidad (%) de la harina de pescado Cumaná

La Figura 18, muestra los resultados de evaluación de la solubilidad de la harina de

pescado Cumaná (HPC). Esta mostró una menor solubilidad (17,4 %) a pH 5,5;

donde se puede ubicar el punto isoeléctrico de una de las proteínas constituyentes;

otras bajas solubilidades se observaron a pH 4,0 (31,5 %) y 6,5 (31,8 %). En

217

general, esta materia prima presentó una baja solubilidad proteica (por debajo del

40 %) en comparación con las otras materias primas (Caseína, HLF, HCH)

evaluadas. Estos resultados son similares a los obtenidos por Bélen et al. (2007), en

el perfil de solubilidad de hidrolizados proteicos del pez caribe colorado

(Pygocentrus cariba, Humboldt, 1821), donde sus porcentajes de solubilidad no

superaron el 40 % en la muestra correspondiente al tratamiento control a pH 8,0; sin

tratamiento especial de hidrólisis.

Chalmers y Synge (1954) observaron que la solubilidad es la que determina la

degradabilidad de algunas proteínas. Sin embargo, actualmente se ha demostrado

que la solubilidad es un buen estimador cuando la fracción degradable es

únicamente la soluble, pero no cuando hay una fracción no soluble y degradable.

Estudios recientes han aclarado que la fracción soluble puede degradarse rápida o

lentamente, y que la fracción insoluble se degrada a diferentes velocidades, por eso

la solubilidad no puede considerarse sinónimo de degradabilidad (Stern et al., 1997).

Por tanto, para la materia prima HPC podría considerarse limitante su baja

solubilidad proteica durante su utilización en la nutrición de alevines de trucha arco

iris.

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e So

lubi

lidad

(%)

218

Figura 18.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de pescado Cumaná (HPC).

5.5.- Índice de solubilidad (%) de la harina de pescado importada

En las proteínas de la harina de pescado importada (HPI) (Figura 19), se pudo

observar, que su menor solubilidad ocurre en la región de pH 3,0 (39,7 %), y

vuelven a observarse caídas de solubilidad a pH 5,5 (53,4 %) y pH 6,5 (49,3 %). Su

mayor solubilidad se presentó a pH 7,0 (69,9 %). Del mismo modo, se muestra una

curva diferente a la observada en la HPC, donde la mayoría de sus solubilidades

están por encima del 40 %.

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e So

lubi

lidad

(%)

Figura 19.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de pescado

importada (HPI).

Según lo obtenido por Bélen et al. (2007), el punto isoeléctrico es característico al

tipo de proteína de la especie de pez con el cual se este trabajando, en el caso del

P. cariba (pez caribe colorado) el punto isoeléctrico es de 4,5; y este no varia incluso

en otras muestras sometidas a hidrólisis proteica con diferente pH, mientras que

para los casos de la HPC y HPI, los puntos isoeléctricos mas resaltantes obtenidos

219

fueron diferentes de 5,5 y 6,5, respectivamente, observándose una disminución de

la solubilidad en ambas materias primas a pH 5,5.

5.6.- Índice de solubilidad (%) de la harina de pescado de Perú La figura 20, muestra el perfil de solubilidad de la harina de pescado Perú (HPP). Se

observa claramente el menor punto de solubilidad de esta materia prima a pH 6,5

(74,26 %), seguido de otros puntos de menor solubilidad a pH 3,0 (94,34 %) y 5,0

(94,01 %). En general la solubilidad de esta materia prima es superior del 90 %,

prácticamente en todos los rangos de pH.

Figura 20.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de pescado Perú

(HPP).

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e So

lubi

lidad

(%)

Estos valores de solubilidad difieren de los obtenidos por Ariyawansa (2000), quien

reporta para harinas de pescado de arenque (< del 25 %), y para capelín y pescado

azul índices de solubilidad mucho menores a 15 %. Souissi et al. (2007),

determinaron que la solubilidad de la carne de sardina y los hidrolizados proteicos

de la misma se ubican en el rango de pH de 3,0 a 10,0. Las proteínas de pescado

220

no digeridas son menos solubles que los hidrolizados de la misma, el índice de

solubilidad es de 4 % y de 50 % a pH 3,0 y 10,0, respectivamente. Mientras que en

los hidrolizados de la carne de sardina, el menor valor de solubilidad a pH 3,0 se

incrementó por encima del 50 %, luego cuando el pH aumentó se incrementaron los

potenciales de hidrógeno y el hidrolizado alcanza su mayor solubilidad (100 %) a

pH=6,0; siendo esto similar a lo obtenido para la HPP a pH 6,0 y 7,0; y esta

propiedad podría ser explicada por el hecho que la hidrólisis expone a algunos

grupos hidrófobos a la superficie.

El incremento de solubilidad de hidrolizados proteicos de pescado, se asocia a los

compuestos originados por el rompimiento de los enlaces peptídicos, lo cual

produce péptidos de menor tamaño molecular en comparación con la proteína

nativa, exponiendo los grupos amino y carboxilos ionizables de los aminoácidos que

los conforman, favoreciendo la repulsión electrostática entre las moléculas e iones

con un efecto neto de aumento de la hidrofilicidad y, por lo tanto, mayor solubilidad

(Shahidi et al., 1995; Lin y Park, 1996; Benjakull y Morrissey, 1997; Jasra et al.,

2001). Así mismo, este aumento en el índice de solubilidad esta relacionado con el

balance de elementos hidrofóbicos e hidrofílicos presentes; donde los pépticos

menores provenientes de la proteína miofibrilar poseen mas residuos de

aminoácidos polares que incrementan la hidrofilicidad al favorecer la formación de

puentes de hidrogeno con el agua (Sathivel, et al., 2005). La diferencia en la

solubilidad de hidrolizados puede ser debida a la longitud del péptido y la proporción

de péptidos hidrófilos/hidrófobos (Souissi et al., 2007).

Los estudios enfocados a la mejoría de las propiedades funcionales de proteínas

alimenticias requieren mayor participación por parte de los investigadores, dado

que, tales proteínas poseen una amplia aplicación tecnológica en la industria de

alimentos; agregando a los productos características reológicas interesantes. Las

propiedades funcionales de las proteínas son influenciadas por diversos factores,

entre ellos, las condiciones del medio circundante, la presencia de iones y de otros

compuestos (McClementes, 1999).

221

Existen varios trabajos que están siendo desarrollados en busca de mejorar las

propiedades funcionales de proteínas tales como: proteínas del suero lácteo

(Turgeoni et al., 1992), globulina bovina (Ornellas et al., 2001), y también se está

trabajando en la evaluación de las diferentes propiedades funcionales de las

proteínas a través de variables composicionales y su potencial de aplicación en la

industria de alimentos (Silva et al., 1997; Solórzano Lemos et al., 1997; Anton y

Gandemer, 1997; Duarte et al., 1998; Ven Der Van et. al., 2001; Ornellas et al.,

2003).

5.7.- Índice de solubilidad (%) de la harina de pescado de trucha de descarte

La curva de solubilidad proteica de la harina de pescado a base de trucha de

descarte (HPT) se muestra en la Figura 21, donde se obtuvo que la misma presenta

su menor índice de solubilidad a pH 3,5 (38,7 %), y su mayor índice se presenta en

la región de pH 3,0 (42,9 %). Estos resultados difieren de los obtenidos por

Ariyawansa (2000), quien en harinas de otras especies de peces como el capelín y

pescado azul encontró una solubilidad del 15 %, mientras que para el arenque logra

valores menores del 25 %.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e So

lubi

lidad

(%)

222

Figura 21.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de pescado a base de trucha (HPT) de descarte.

Por su parte, Bélen et al. (2007), efectuó análisis proteicos del pez caribe colorado

(Pygocentrus cariba, Humboldt, 1821) y la solubilidad de su hidrolizados proteicos,

no superó el 40 % en la carne sin tratamiento hidrolítico, lo cual es similar a lo

encontrado para la HPT, por presentar un rango de solubilidad muy cercano entre

38,7 % (pH 3,5) y 42,9% (pH 3,0), con variaciones casi inexistentes entre sus

valores máximos y mínimos.

5.8.- Índice de solubilidad de la harina de maíz amarillo

La harina de maíz amarillo (HMA) presentó un índice de solubilidad (Figura 22) cuyo

rango esta entre 40,3 % (pH 3,0) y 50,3 % (pH 3,5), con las menores solubilidades

en las áreas de pH de 3,0 (40,3 %) y 4,5 (44,2 %).

Índice de solubilidad (%) de la harina de maíz amarillo

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e So

lubi

lidad

(%)

Figura 22.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de maíz amarillo

223

Estos resultados difieren de los reportados por Flores, et al. (2002), quienes

obtuvieron para harinas de maíz nixtamizado de 3 empresas diferentes, porcentajes

de solubilidad menores a 12 % y 16 %, en diferentes muestreos y obtenidas

después de que las muestras fueron sometidas a diferentes tratamientos térmicos

(60, 70 y 80 ºC). Por su parte, Torres y Guerra (2003) obtuvieron para harina de

maíz 5,2 % de índice de solubilidad en agua. El índice de solubilidad en agua indica

la cantidad de sólidos disueltos por el agua cuando la muestra de harina se somete

a un exceso de este líquido; y para este estudio indicó el grado de cocción que tuvo

el grano con que se preparó la harina y que afectó su solubilidad final (González et

al., 1991).

5.9.- Índice de solubilidad de la harina de afrecho de trigo Se determinó según lo observado en la figura 23, que la mínima solubilidad presente

en la harina de afrecho de trigo (HAT) es a pH 5,0; con incrementos de solubilidad

que ocurrieron a pH 4,5 (47,18 %) y 7,0 (48,59 %), sin embargo, en general su

solubilidad se ubica entre 40 y 50 %.

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e so

lubi

lidad

(%)

224

Figura 23.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de afrecho de trigo

Hay investigadores que afirman que las proteínas del gluten de trigo son las

proteínas de reserva de mayor cantidad existentes en la casi todos los cereales, y

se caracteriza por su solubilidad en agua (típicamente 60-70 % v/v) (Torres y

Pacheco, 2007).

En esta investigación para la HAT, sin embargo, los resultados obtenidos superan a

los porcentajes de solubilidad proteica reportados por Adeyeye y Aye (2005), que

fueron inferiores al 10 % para otra especie de trigo (Triticum durum), coincidiendo

solo en su punto isoeléctrico mas marcado a pH 5,0.

5.10.- Índice de solubilidad de la harina de hoja de Leucaena

La figura 24, presenta la curva de solubilidad proteica de la harina de hoja de

leucaena (HHL), donde se observa que su menor solubilidad ocurrió a pH 6,0 (49,57

%); pH 7,0 (52,10 %) y pH 3,0 (52,45 %). A pH 5,5 se observo su mayor índice de

solubilidad proteica (56,19 %).

0

20

40

60

80

100

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Índi

ce d

e so

lubi

lidad

(%)

225

Figura 24.- Curva de solubilidad de las proteínas de la harina de hoja de leucaena

Estos resultados son similares a los obtenidos por Sangronis et al. (2004), en

harinas de granos de leguminosas (caraota blanca) Phaseolus vulgaris var blanca y

(quinchoncho) Cajanus cajan, quienes observaron solubilidades proteicas de ambas

especies con un máximo de 50 % y 67 %, respectivamente; sin embargo, en ambas

muestras sus mínimas solubilidades se presentaron a pH 4,0, con 16,8 % (harina de

caraota blanca) y 18,9 % (harina de quinchoncho). Esto difiere con lo obtenido en la

HHL, por poseer 49,57% de solubilidad a pH 6,0.

Los estudios de solubilidad proteica son importantes, ya que dependiendo de esta

propiedad se conoce la aplicabilidad de las materias primas como agente

enriquecedor de las fórmulas alimenticias. Esta propiedad funcional puede ser

alterada por tratamientos ácidos o básicos del entorno donde se encuentran las

proteínas (Abtahi y Aminlari, 1997).

La menor solubilidad de las proteínas de las materias primas de origen animal

(HPC, HPI) y vegetal (HMA, HAT y HHL), pudo ser afectada por el uso de

tratamientos térmicos durante el secado, provocando disminución de esta propiedad

(Linden y Lorient, 1994) como consecuencia de la desnaturalización de las

proteínas (Lawhon et al.,1972; Ahenkora et al., 1999; Wang y Johnson 2001).

5.11.- Conclusiones

Todas las materias primas evaluadas se caracterizaron por presentar curvas de

solubilidad proteica diferentes a la obtenida en la caseína.

Las mayores solubilidades proteicas se obtuvieron en las materias primas HPP (100

%), HCH (84,8 %) y HLF (81,7%).

226

Las materias primas HPI y HPC, presentaron los menores rangos de solubilidad

proteica de 39,7 % - 69,9 % y 17,4 % - 38,8 %; respectivamente.

El tipo de pez usado en las fabricaciones de harinas de pescado [HPP (Arenque);

HPC (Desechos de sardina), HPT (Trucha de descarte)], determina diferencias entre

los índices de solubilidad de los productos finales.

La HHL fue la materia prima de origen vegetal que obtuvo un mayor rango de

solubilidad entre 49,57 % y 56,19 %; seguida de la HMA con 41,64 % y 48,58 %; y

la HAT (41,64 % y 48,58 %).

De todas las materias primas evaluadas la HPC fue la que presentó la menor

solubilidad proteica.

6.- Análisis de la capacidad de absorción de agua y aceite de materias primas

6.1.- Capacidad de absorción de agua (CAA)

En la Tabla 34, se muestra la capacidad de absorción de agua de las materias

primas de origen animal evaluadas, los valores se encuentran entre los rangos de

valores que van entre 2,99 y 5,51 g de agua/g de muestra; las mismas

corresponden a las muestras de HCH y HLF, respectivamente, de estas las harinas

de pescado analizadas (HPC, HPI, HPP, HPT) estuvieron entre 3,27 y 4,73. Estos

resultados se acercan a los obtenidos por Bélen et al. (2007) quien obtuvo en harian

de pescado y sus hidrolizados rangos de CAA de 1,2 y 4,0 mL de agua /g de

muestra. La CAA de la HLF es similar a la de la harina de maíz (5,2 g de agua/g de

muestra) Torres y Guerra (2003), pero inferior a la presente en el aislado de soya

(6,68 g de agua/g de muestra) obtenido por Cori et al. (2006); 7,1 y 11,7 g agua/g de

proteína del aislado de soya sin fosforilación y fosforilado (Sung et al., 1983).

Para las harinas de origen vegetal la capacidad de absorción de agua fue de 6,28

(HMA), 6,51 (HAT) y 14,09 (HHL). Para la HMA estos resultados difieren de los

obtenidos por Flores et al. (2002), quienes consiguieron para harinas de maíz

nixtamalizado (tipo de masa de maíz preparada con cal, para que suelte el hollejo,

227

usada principalmente para la elaboración de tortillas) comerciales índices de

absorción de agua menores entre 2,70 y 3,80 (g agua/g de harina).

Por su parte Torres & Guerra (2003) obtuvo valores mas altos (4,8) de absorción de

agua en harina de maíz, sin embargo este valor es inferior al determinado en esta

investigación para la HMA (6,28).

La HHL presentó el mayor valor (14,09 g agua/g de materia prima) en capacidad de

absorción de agua (Tabla 34), superando el valor (9,52 g agua/g de materia prima)

reseñado por Martínez et al. (2007) para harina de hojas de Canavalia ensiformis, y

los 7,1 y 11,7; g de agua/g de materia prima reportados por Sung et al. (1983) para

aislado de soya sin fosforilar y fosforilado, respectivamente. El aumento de la

capacidad de absorción de agua puede deberse a la introducción de grupos fosfato

a las cadenas polipeptídicas, lo que posiblemente causa cambios de

conformacionales y estructurales debido a un aumento en las fuerzas de repulsión

(Pacheco y Sgarbieri, 1998).

Tabla 34.- Capacidad de absorción de agua y aceite de materias primas de origen animal y vegetal

Materia Prima Capacidad de Absorción

de agua*

Capacidad de absorción

de aceite**

HLF 5,51 ± 0,415 0,94 ± 0,016

HCH 2,99 ± 0,161 0,80 ± 0,057

HPC 3,27 ± 0,030 0,84 ± 0,039

HPI 4,73 ± 0,138 0,92 ± 0,038

HPP 3,81 ± 0,063 0,82 ± 0,021

HPT 3,55 ± 0,084 0,88 ± 0,093

HMA 6,28 ± 0,027 0,85 ± 0,025

HAT 6,51 ± 0,152 1,39 ± 0,016

HHL 14,09 ± 0,147 1,35 ± 0,046

* Expresado en g agua/ g de materia prima; ** Expresado en g de aceite/g de materia prima

228

HLF: harina de lombriz Farmacia; HCH: harina de carne y hueso; HPC: harina de pescado cumaná; HPI: harina de pescado importada; HPP: harina de pescado Perú; HPT: harina de pescado de Trucha; HMA: harina de maíz amarillo; HAT: harina afrecho de trigo; HHL: harina hoja de leucaena. Enwere et al. (1998) demostraron que el tratamiento térmico húmedo desnaturaliza

las proteínas, principalmente a las albúminas, no afectando considerablemente las

globulinas. Esta desnaturalización incrementa el contacto con dicha proteína y en

consecuencia a los aminoácidos polares, los cuales tienen una gran afinidad por el

agua, produciéndose un incremento en la capacidad para absorber agua.

Adicionalmente, el alimento es una matriz compleja, donde los carbohidratos, por su

naturaleza hidrofílica, la gelatinización del almidón y el hinchamiento de la fibra

dietética también contribuyen a este incremento en la capacidad para absorber

agua, lo cual determina que las materias primas de origen vegetal posean por

consiguiente las que manifiesten mas capacidad de absorber agua que las de origen

animal.

Padmashere et al. (1987) al estudiar el efecto de la cocción, tostado, horneado,

germinación y fermentación sobre la capacidad para absorber agua y grasa,

encontraron que todos los procesamientos aplicados incrementaron la capacidad de

absorción de agua.

Por otro lado, la capacidad de absorción de agua es de gran utilidad en la

identificación del uso potencial de las proteínas modificadas, principalmente si van a

ser empleadas en sistemas donde se requiere de una buena interacción con el

agua, como en el caso de sopas, salsas, masas y otros (Granito et al., 2004). En

base a esto podemos afirmar que la HLF y las harinas de origen vegetal,

principalmente HHL, son las materias primas que poseen más afinidad con el agua,

y que poseen potencial desde el punto de vista tecnológico como ingrediente en

otros tipos de alimentos.

Generalmente, se le ha puesto poco interés a la evaluación de la capacidad de

retención de agua del alimento y al efecto que esto tiene sobre su textura, su

consumo y su digestibilidad. Foster (1972) al evaluar diferentes aglutinantes en el

camarón Palaemon serratus, reporta que los alimentos tipo gel, a pesar de tener

229

menores digestibilidades, daban mejores crecimientos del animal, que alimentos en

pasta y que alimentos peletizados secos. Teshima & Kanazawa (1983) al evaluar

alimentos microparticulados con carrageninas encontraron que a mayor contenido

de humedad en los alimentos había mayor palatabilidad y consumo que con

alimentos secos.

6.2.- Capacidad de absorción de aceite

Para la capacidad de absorción de aceite (Tabla 34), las materias primas de origen

animal presentaron rangos entre 0,80 g aceite/g de harina (HCH) y 0,94 g aceite/g

de harina (HLF), las fuentes de harina de pescado obtuvieron valores comprendidos

entre 0,82 (HPP) y 0,92 (HPI). Estos resultados son inferiores a los obtenidos por

Bélen et al. (2007) en hidrolizados proteicos de pescado con un máximo de 2,4 mL

de aceite/g de producto para el control sin hidrolizar.

Las harinas de origen vegetal mostraron valores entre 0,85 g aceite/g de harina

(HMA) y 1,39 g aceite/g de harina (HAT). Estos difieren de los obtenidos en aislado

de soya (1,52 g aceite/g de harina) obtenido por Cori et al. (2006), y en granos

crudos de caraota negra, quinchoncho y caraota blanca, con valores de absorción

de grasa de 1,8; 2,6 y 2,7 g aceite/g de muestra (Sangronis et al. (2004). Nagmani y

Prakash (1997), encontraron valores de absorción de grasa entre 2,46 y 2,72 g de

aceite/g de muestra para harinas de leguminosas crudas (Bengal, Black gram y

lentejas).

La capacidad de absorción de aceite es producto del atrapamiento físico de las

grasas por parte de las proteínas, a través de la formación de estructuras

denominadas micelas. La capacidad de absorción de grasa está determinada por la

estructura de la matríz proteica, la disposición de los aminoácidos dentro de la

estructura proteica, lo cual a su vez determina las interacciones hidrofóbicas

proteína-grasa, por el tipo de grasa y por la presencia de almidones (Kinsella, 1976).

La capacidad de absorber grasa es una propiedad funcional útil en la preparación de

alimentos destinados a frituras, donde esta característica permite la retención de

230

sabores y disminuye la rancidez oxidativa (Kristinson y Rasco, 2000; Granito et al.,

2004).

6.3.- Conclusiones

Las materias primas de origen vegetal presentaron los mayores valores en

capacidad de absorción de agua.

La HLF fue la materia de prima de origen animal con el mayor valor en capacidad de

absorción de agua y grasa.

La HAT y HHL fueron las materias primas con mayor valor en capacidad de

absorción de grasa.

Técnicas Especiales

7.- Determinación del perfil proteico y de los pesos moleculares de las materias primas y alimentos comerciales

7.1.- Electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida La figura 26, representa la curva de calibración del estándar de proteínas (Patrón de

peso molecular) marca Invitroven Corporation NuPAGE® NOVEX, que va de 4 a

250 Kilodaltons (KDa) y esta compuesta por 10 bandas de proteínas [Miosina (250

KDa), Fosforilasa (148 KDa), Suero de albúmina bovina (98 KDa), Deshidrogenasa

glutamica (64 KDa), Alcohol deshidrogenasa (50 KDa), Anhidrasa carbónica (36

KDa), Mioglobina roja (22 KDa) Lisozima (16 KDa), Aprotinina (6 KDa) y Insulina de

cadena B (4 KDa)]. Esta curva se construyo con los valores que se muestran en la

231

Tabla 35, obtenida a partir del gel de corrida de la Figura 25 usando un buffer de

corrida Tris-Glicina.

KDa250148

98

64

50

36

22

16

64

(-)

(+)

HLF PPM HLT HMA HAT HHL HCH HCP

KDa250148

98

64

50

36

22

16

64

(-)

(+)

HLF PPM HLT HMA HAT HHL HCH HCP

Figura 25.- Electroforesis SDS–PAGE de harinas de origen animal (HLF, HLT, HCH, HPC), harinas de origen vegetal (HMA, HHL, HAT) Patrón de peso molecular (PPM) de las proteínas [Miosina (250 KDa), Fosforilasa (148 KDa), Suero de albúmina bovina (98 KDa), Deshidrogenasa glutamica (64 KDa), Alcohol deshidrogenasa (50 KDa), Anhidrasa carbónica (36 KDa), Mioglobina roja (22 KDa) Lisozima (16 KDa), Aprotinina (6 KDa) y Insulina de cadena B (4 KDa)]

232

y = -63,078Ln(x) - 16,315R2 = 0,9024

0

2550

75

100

125150

175

200

225250

275

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Rf (cm)

Peso

s m

olec

ular

es (K

Da)

Figura 26.- Curva de calibración de proteínas estándares obtenida a partir del gel SDS-PAGE de corrida de muestras de origen animal y vegetal.

Las Figuras 25 y 27 muestra el perfil electroforético de los lisados proteicos

pertenecientes a las muestras de harina de origen animal-vegetal y los alimentos

concentrados comerciales (A, B y C), a través de los cuales se pudieron calcular los

pesos moleculares correspondientes (Tablas 36, 37 y 38).

En la figura 25, se distinguieron aproximadamente 13 bandas proteicas para las

muestras HLF y HLT, 4 para la HCH y 3 para la HPC. Todas estas bandas proteicas

233

fueron comparadas con el Patrón de Peso Molecular, de manera de poder calcular

los pesos moleculares de cada una de las bandas. Se pudo observar un rango

general de peso molecular entre 31,1 y 234,1 KDa (Tabla 36). Dos bandas proteicas

de peso molecular de 103,0 y 190,4 KDa se encontraron presentes en la mayoría de

las muestras analizadas. La muestra de HLT presentó un paquete de manchas lo

cual impide conocer cuantas bandas pueden existir.

Tabla 35.- Valores de Rf (cm) de proteínas del patrón de peso molecular en el gel de electroforesis SDS-PAGE, calculado a partir de la figura 25

Peso Molecular (Kilodaltons) Rf (cm)

250 0,034

148 0,051

98 0,119

64 0,186

50 0,254

36 0,407

22 0,576

16 0,712

6 0,847

4 0,915

Las muestras HCH y HPC, fueron las que presentaron el menor número de bandas

proteicas, lo cual se podría atribuir a una posible desnaturalización proteica durante

el proceso de secado para la obtención de estas harinas (Ahenkora et al., 1999).

234

Tabla 36. Peso moleculares (KDa) de las proteínas de origen animal (HLF, HLT, HCH, HPC) en gel de electroforesis SDS-PAGE (calculados a partir de las figura 25).

HLF HLT HCH HPC

234,1 234,1 190,4 190,4

164,8 190,4 103,0 103,0

132,6 139,2 77,4 95,5

121,1 121,1 55,4

130,0 111,4

95,5 103,0

82,9 88,9

72,3 74,8

67,7 72,3

63,3 59,2

55,4 53,6

50,1 50,1

45,2 31,1

HLF: Harina de Lombriz Facultad de Farmacia ULA-Mérida HLT: Harina de Lombriz Trujillo; HCH: Harina de carne y Hueso HPC: Harina de Pescado Cumana

Las muestras de HLF y HLT difieren en el numero de bandas proteicas obtenidas

por Vielma (2004) donde 24 bandas proteicas fueron detectadas en la lombriz cruda

(Eisenia foetida) y 17 bandas proteicas en Harina de lombriz secada en estufa. Sin

embargo, se obtuvieron pesos moleculares de 31,1; 45,2; 55,4; 67,7; 88,9; 95,5;

103,0; 121,1 y 139,2 que están muy próximos a los encontrados por Vielma (2004).

También se obtuvo una proteína de peso molecular de 234,1 KDa (Tabla 36)

acercándose al peso de la subunidad S-globulina de 250 KDa en la harina de soya

reportada por Wu et al. (1998). Algunas de las bandas proteicas de las muestras de

HLF, HLT, HPC se ubicaron muy cercana en la región de 98; 64 y 50 KDa

235

correspondientes a los pesos moleculares de las bandas proteicas de la albúmina

sérica bovina (BSA), deshidrogenada glutamica y alcohol deshidrogenada

respectivamente (PPM).

Con respecto a las muestras de origen vegetal (HMA, HAT y HHL) se presentaron

15, 14 y 5 bandas proteicas respectivamente. En este caso se obtuvo un rango de

peso molecular entre 36,3 y 190,4 KDa (Tabla 37), y tres bandas proteicas de peso

molecular de 82,9; 88,9 y 190,4 KDa, las cuales se encontraron presentes en las

tres materias primas analizadas.

La HHL fue la que presento el menor número de bandas proteicas, y esto podría

atribuirse al proceso de fabricación. Ciertas bandas proteicas de las muestras de

HMA y HAT se hallaron muy próximas en la región de 148, 98, 64, 50 y 36 KDa

correspondientes a los pesos moleculares de las bandas proteicas de la fosforilasa

sérica, albúmina sérica bovina (BSA), deshidrogenada glutamica, alcohol

deshidrogenada y Anhidrasa carbónica respectivamente.

En las muestras HMA y HAT se presentaron paquetes de proteínas (manchas) de

difícil identificación por encontrarse muy unidas sus bandas. Díaz et al., (2006),

analizaron mediante SDS-PAGE 22, genotipos de trigos uruguayos, y el uso de esta

técnica permitió separar las diferentes fracciones de proteínas en base a su tamaño,

logrando la identificación de 14 bandas diferentes representadas por 10

combinaciones alélicas, este numero de bandas coincide con las detectadas en la

HAT.

236

Tabla 37.- Peso moleculares (KDa) de las proteínas de origen vegetal (HMA, HAT, HHL) en gel de electroforesis SDS-PAGE (calculados a partir de las Fig. 25).

HMA HAT HHL

190,4 190,4 190,4

146,7 146,7 88,9

132,6 121,1 82,9

121,1 111,4 55,4

111,4 103,0 48,4

103,0 95,5

95,5 88,9

88,9 82,9

82,9 72,33

77,4 63,3

67,4 59,2

63,3 55,4

59,2 48,4

51,8 36,3

45,2

HMA: Harina de Maíz Amarillo HAT: Harina de Afrecho de Trigo HHL: Harina de Hoja de Leucaena

7.2.- Electroforesis SDS-PAGE de alimentos comerciales

En la figura 27, se muestran los perfiles electroforeticos de los lisados proteicos de

dos alimentos comerciales nacionales (A y B), y uno importado (C) y el PPM, donde

237

se observan siete, cinco y cuatro bandas proteicas para los alimentos A, B y C,

respectivamente. Sus pesos moleculares obtenidos (Tabla 38) fluctuaron entre

4,281 y 95,685 KDa.

KDa25014898

64

50

36

22

16

6

4

(-)

(+)

PPM A B C1

KDa25014898

64

50

36

22

16

6

4

(-)

(+)

PPM A B C1

Figura 27.- Electroforesis SDS–PAGE de harinas de alimentos comerciales: nacionales (A y B), e importado (C) y Patrón de peso molecular (PPM) de las proteínas [Miosina (250 KDa), Fosforilasa (148 KDa), Suero de albúmina bovina (98 KDa), Deshidrogenasa glutamica (64 KDa), Alcohol deshidrogenasa (50 KDa), Anhidrasa carbónica (36 KDa), Mioglobina roja (22 KDa) Lisozima (16 KDa), Aprotinina (6 KDa) y Insulina de cadena B (4 KDa)]

238

Para el alimento A, B y C, se detectaron siete (7), cinco (5) y cuatro (4) bandas,

respectivamente, de estas en el alimento B se distinguieron dos bandas proteicas

(4,281 y 47,751 KDa); cinco en el alimento A (12,860; 32,320; 47,751; 67,645 y

95,685) y cuatro en el C (14,177; 19,712; 32,320 y 49,947) que se aproximaron a las

proteínas estándares del Patrón utilizado. Al comparar las materias primas de origen

animal y vegetal (Tabla 36 y 37) analizadas con las dietas comerciales (Tabla 38) se

pudo inferir que el mayor número de bandas proteicas obtenidas se presentaron en

las muestras de las materias primas HMA, HAT, HLF y HLT.

y = -69,153Ln(x) - 31,044R2 = 0,8767

0255075

100125150175200225250275

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Rf (cm)

Peso

s m

olec

ular

es (K

Da)

Figura 28.- Curva de calibración de proteínas estándares obtenida a partir del

gel SDS-PAGE de corrida de alimentos comerciales (A, B y C).

La figura 28, representa la curva de calibración del estándar de proteínas (Patrón de

peso molecular) marca Invitroven Corporation NuPAGE® NOVEX, que va de 4 a

250 Kilodaltons (KDa), de acuerdo a lo mostrado en la tabla 39, obtenida a partir del

gel de corrida de la figura 27 usando un buffer de corrida Tris-Glicina.

239

Tabla 38.- Valores de Rf (cm) de proteínas del patrón de peso molecular en el gel de electroforesis SDS-PAGE, calculado a partir de la figura 27

Peso Molecular (Kilodaltons) Rf (cm)

250 0,040

148 0,060

98 0,110

64 0,160

50 0,220

36 0,320

22 0,470

16 0,580

6 0,740

4 0,820

Tabla 39.- Pesos moleculares (KDa) de las proteínas de las dietas comerciales: Nacionales (A y B), importada (C) en gel de electroforesis SDS-PAGE (calculados a partir de las Figura 27).

A B C

95,685 47,751 49,947

80,253 32,320 32,320

67,645 28,946 19,712

47,751 11,567 14,177

32,320 4,281

28,946

12,860

240

Materias primas utilizadas y análisis físico-químico

Documents

Transcript of Materias primas utilizadas y análisis físico-químico