Master-Biologie-fondamentale-1- fsa Agadir
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HOURRA Fatima zahra BOUDELLAH Abderrazzaq ELHASSANI Sanaa « Master Biologie fondamentale » La GFP green fluorescent protein 2016- 2017 Présenté par
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HOURRA Fatima zahra BOUDELLAH Abderrazzaq
ELHASSANI Sanaa
« Master Biologie fondamentale »
La GFPgreen fluorescent
protein
2016- 2017
Présenté par
• INTRODUCTION• Découverte • Structure du GFP• Principe • Applications possibles• Conclusion
Plan GFP
Introduction
La green fluorescent protéine (GFP) :est une protéine fluorescente verte extraite de la méduse Aequorea victoria , qui vit dans les eaux du Nord-Ouest Pacifique. Cette protéine a la particularité d’émettre de la fluorescence sous UV sans l’ajout de substrat ou de cofacteurs.
GFP
• La protéine GFP a été découverte en 1962 par Osamu Shimomura en extrayant la protéine ensemble avec son partenaire naturel Aequorinde la méduse Aequoria victoria.
• En 2008, le Prix Noble de Chimie a été attribué au japonais Osamu Shimomura et aux deux américains Martin Chalfie et Roger Tsien pour la découverte et le développement de la GFP…
Découverte GFP
La GFP consiste de 238 acides aminées en 11 « β-feuillets » et une a-hélicecentrale.L’ensemble forme un protéine de 28 kDa avec une structure appelé btonneau.N-terminus et C-terminus sont accessible à la liaison avec autres protéines
La structure ‘GFP’ GFP
Le chromophore de la GFP est constitué des trois acides aminés Ser-Tyr-Gly en position 65 à 67. Sa formation se produit après une cyclisation entre les acides aminés 65 et 67 puis une oxydation. C’est seulement après l’oxygénation que la GFP peut être fluorescente.
Fluorophore de la GFP GFP
• En présence d’oxygène, l’aequorine est une protéine dépendante du calcium couplée à la coelentérazine. La fixation de calcium provoque un changement conformationnel de l’aequorine qui induit une oxygénation de la coelentérazine. Cette réaction d’oxydation s’accompagne d’une émission de lumière bleue. Il s’établit alors un transfert d’énergie entre l’aequorine et la GFP. Ce transfert d’énergie conduit à l’émission d’une lumière verte de la GFP.
Mécanisme de la GFP GFP
O2 O2O2
*
Ca2+
O2Ca2+
Ca2+
Aequorine(coelenterazine)
Aequorine
CO2GFP
2XAequorine
(coelenteramide)
Apoaequorine
Mécanisme de la GFP GFP
• La découverte de la GFP a permis de concevoir de nombreuses applications pour l’observation du monde du vivant :
Marqueur cellulaire
Marqueur moléculaire
Gène rapporteur
Les applications de la GFP GFP
Marquage cellulaire : Insertion du gène codant la GFP dans une cellule (transfection)
Tri des cellules (transformées ou non) par cytométrix en flux
Les applications de la GFP
la GFP(Green Fluorescent Protein) consiste à intégrer dans le génome de la cellule à observer un gène de protéine fluorescente, la protéine synthétisée est alors fluorescente
• Marquage moléculaire : Synthèse d’une protéine de fusion (protéine d’intérêt/GFP)
Suivi de la protéine de fusion par microscopie à fluorescence
Les applications de la GFP
Gène rapporteur : Synthèse d’une protéine possédant une activité connue et détectable (par exemple la fluorescence).Etude de l’efficacité de promoteurs spécifiques, et les facteurs influant sur l’expression d’un gène d’intérêt
Vecteur de clonage : Expression et multiplication d’un fragment d’intérêt dans un hôte. Production à grande échelle de protéines (hormones de croissance par exemple)
Les applications de la GFP
EGFP
CMV
pUC ori
Kan
MCS
pEGFP – N1
Fragment d’intérêt
SV 40 Poly A
Les applications de la GFP
C. Elegans
C. Elegans produisant la protéine de fusion
MIAM !
Les applications de la GFP
• Après insertion de la GFP et de ses mutants au sein de différentes bactéries (Roger Tsien)
Les applications de la GFP
Exemple d’application en médecine
Cette fonction de la GFP consiste à introduire le gène codant pour la GFP à celui codant pour une autre protéine, afin d’en faciliter le traçage et suivre son comportement dans des organes internes d’un organisme vivant et de ses cellules.
Pour cela, il insère le gène de la GFP, avant le codon stop, qui met fin à la traduction de l’ARN en chaîne polypeptidique ( image 2 & 3)
La forte fluorescence émise par la GFP permet une grande visibilité et un suivi précis, et ne nécessite l’ajout d’aucun composant.
Le suivi d'une tumeur chez une souris
La GFP permet de suivre également la progression d'une tumeur maligne c’est pour cela en introduisant dans l'organisme de la souris un virus spécifique au cancer contenant dans sa séquence en nucléotides le gène codant pour la GFP. Ainsi le virus va s'introduire dans la zone tumorale et l'illuminer entièrement et spécifiquement, ce qui permettra ensuite d'observer l'évolution de la tumeur in vivo, sous lumière noire ( ou U.V ).
1ere semaine après l'insertion du virus
3 eme semaine apres insertion du virus
5eme semaine apres insertion du virus
Sur les images ci dessus, le suivi se fait à l'aide de la RFP, variante de la GFP. La souris, sans ses poils présente une tumeur du lobe pariétal droit. On observe son évolution ( voir images ci-dessous )
Conclusion
La GFP joue un rôle très important surtout dans le domaine médicale par ses principales fonctions ( fusion , Marqueur…. etc )
