MAS ( Selección Asistida por Marcadores)agro.unc.edu.ar/~mejogeve/MolMarc.pdfEsta técnica sirve...

Mejoramiento genético

MAS ( SelecciónAsistida por Marcadores)

5- Mejoramiento genético

3- Diversidad

1° - Mutación

1960

2 ° - Recombinaciónnatural (ó dirigida)

4- Selección

- Variación

- Hibridación

MAS: ( SelecciónAsistida porMarcadores)

- Enzimas de restricción

- Recombinaciónartificial:

Ingeniería genética:

(Construcciones genéticas: ADN recombinante)

- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

replicación “in vitro”

Biol. (Mgter) Laura Torres

- Genéticos

- Moleculares

Gen de interés agronómico

Locus “marcador”

* Marcadores genéticos*


Huellas……. Huellitas……

.

Marcador genético

- Herencia mendeliana clásica- Polimórfico - Codominante - No epistático - Sin influencia ambiental

Características deseables de un marcador


Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)

Marcadores Genéticos y Moleculares



Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección

Hibridación con “sondas”

RFLPs

Amplificación por PCR

- Morfológicos

- Isoenzimáticos

Secuencias nucleotídicas “codificantes”

- Moleculares Secuencias nucleotídicas “codificantes” y “no codificantes”

Cebada

sex1 1cM ms 9

sex1 ms 9

Y 5 cM ms1

Y ms1

MaízMarcadores Morfológicos

- loci de expresión temprana

Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC

Loci marcador:Endosperma blanco Loci de interés:

Androesterilidad (ms1)

Loci marcador:Endosperma arrugado

Loci de interés:Androesterilidad (ms9)



Marcadores morfológicos: controlados por un solo loci y presentan expresión temprana

a) En Brassica:

Loci marcador: primera hoja vellosa

b) En maíz:

Loci marcador: raíz primaria ó coleoptilo púrpura

Loci con carácter de interés:

Haploidía


Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)

Mapa genético(Marcadores morfológicos)

enanoalto

pubescenteliso

normal

moteadaonormal

necrosisnormal

Infloresc compInfl. simple

Lycopersicum esculentum (2n= 24)


Detección de marcadores

MetodologíaElectroforesisEquipoTecnología de los marcadores Interpretación de las combinaciones de bandasVentajas y desventajas

Tratamiento del material vegetal

Electroforesis en geles de almidón, de acrilamida ó capilar (cromatógrafos)

Tinción histoquímica, química, fluorocromos

Análisis de los patrones de bandas ó cromatogramasBiol. (Mgter) Laura Torres

MARCADORES Isoenzimáticos :

- Polimorfismo a nivel del producto génico (polipéptido o proteína)

MARCADORES Isoenzimáticos :

Biol.(Mgter) Laura Torres.

Ventajas

- Técnica consistente, reproducible y bajo costo- Co dominantes- Estudios de

diversidad parámetros poblacionales mapas genéticos

Desventajas

- Bajo número de sistemas de tinción para detectar enzimas- Análisis basado en el fenotipo- Inapropiados para MAS (ej: Tomate: el loci Mi controla la resistencia nemátodes está ligado al loci de la fosfatasa ácida

El loci para androesterilidadestá ligado a una fosfatasaBiol. (Mgter) Laura Torres

- Genética de poblaciones - Conservación ex situde germoplasma- Evolución de especies cultivadas (evaluar la diversidad genética de las poblaciones locales de Allium sp, mediante isoenzimas)- Evaluación y caracterización de germoplasma (evaluar la diversidad genética y la estructura de una colección de base de Arachis spp)- Erosión genética- Flujo de genes - Estabilidad genética en bancos de germoplasma (evaluar la diversidad genética de las entradas de semilla de ….spp,conservadas y suministradas por jardines botánicos europeos

Aplicaciones



Marcadores




Hibridación con “sondas”:

RFLPs

Amplificación por PCR

- Morfológicos

- Isoenzimáticos


- Moleculares Secuencias nucleotídicas

“no codificantes” y “codificantes”


Mejoramiento genético: Marcadores Moleculares

- Microsatélites ó SSR:

Simple Sequence Repeats

- CAPS:

Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

- SCARs:

Sequence Characterised Amplified Region

- STSs:

Sequence-Tagged Sites

- ESTs:

Espressed Sequence Tags

- EST - SSRs:

Espressed Sequence Tags of SSRs

- SNPs:

Single Nucleotide Polymorphism

Información previa de la secuencia: NO

- RAPDs:

Random Amplified Polymorphic DNA

- RFLP:

Restriction Fragment Lenght Polymorphism

- AFLPs:

Amplified Fragment Lenght Polymorphism

- SAMPLs:

Selective Amplification of M icrosatellite Polymorphism

- ISSRs: Inter-Simple Sequence Repeats

- Minisatélites ó VNTRs

Información previa de la secuencia:

SI



Enzimas de restricción:

Digestión (ó corte) de la doble cadena de ADN

Endonucleasas: enzimas de restricción

AluIArthrobacter luteus: AG´CT

TC´GA Sitio de restricción (palíndromo)

BamHIBacillus amyloliquefaciens: G´GATCC

CCTAG´GSitio de restricción (palíndromo)


Marcador molecular de tipo:

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)

1- Digestión

2- Electroforesis

3- Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa)

4- Hibridación con “sondas marcadas”

5- Lavados

6- Revelado


1- Basados en la amplificación del ADN (PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa)

(Numerosos sistemas)

2- Basados en la digestión con endonucleasas (enzimas de restricción) :

RFLPs (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricciòn)

*MARCADORES MOLECULARES - Polimorfismo genético a nivel del DNA


Marcador molecular

RFLPs (RestrictionFragmentLenghtPolymorphisms)


5’…ATAAAAAGTTATACTATTCCAAATGATTGTCCTGTGGTATGTAATTCTATTCCTCGTAAACCTAACTTATCTTTGATGTTTATTAGAGCAATATTAGTTATTATGTTAATTAAAGATTATAGTGAAATTAAAGAAACACCAATTTATCAGCAACAACTTGAATTAGAAGATCCTGCGCGCAACGCCTGTCTTGTAACTGATAGTGGAATTCGAACTGAGCTGCAAAATGAACCAGTTACTGTACCAGTAACTCTTCCAACTTTGCCGACTTTTTCAAGTCCTAAAAATTAATCCTGTTAATTCATGTCAATTACGCGATTGCATAAGATGAGTTGTTTTAATGGATAGTGAGCGCCACTATGAATATGGTTCGTATTCAAACTCTCATGGCATTGAATTTGATCCAAATCACCCTTACATTGATTTGATTAACGATGATTTCGATGAAAATGATTATCTTGATCTCGAGACGTTAAATCTTGAAGCTGATTATGATGATGTTGAAAGTTTAGCTCTTAGGCTTAAAAATGCTCCTGACTACACTACTGAGATATTCGAGAAAATAGATAGAATACCAAACTTTGCGAGTTACAGATACTTCAGATGAGTTTTATACTTTAAGTTCGATGTTAACCGAGCATATGCAATCAATAATTACATTGCTTCCCAGTATACTATGGCCAATGGTCAGTCAGTTAACCAAATCTAATGTATTTCAAGCTGCAGACGATGTTAATATTACTAATTATTGGCGTTTGATGGACAGAAGATGGGATTTTATCGATGAACAGTTGAGAGTTCAATTTATTTTTAGAGCTTATGACTTGCGAGCGTATCAAAACGAGCGTGTGTCTCAAATTCTTTCTAGCAGTTTATTATTTGCTGGATTAAATCTAAT

TGG……….3'

pb

900

692

208

secuencia de ADN de 900 pb

Eco RI : (1 sitio de corte)

GAATTC

- Enzima EcoRI

- Buffer

- H2O


Enzimas de restricción

Segregación Mendeliana de alelos marcadores de tipo molecular (Ej. RFLP, SSR)



Marcadores Genéticos




Basados en hibridación con sondas: RFLPs

Basados en la amplificación por PCR

- Morfológicos

- Isoenzimáticos


- Moleculares Secuencias nucleotídicas

“no codificantes” y “codificantes”

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)


Replicación “in vivo” del DNA

* Helicasa

* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)

* Topoisomerasa ADN girasa

* Iniciación de la síntesis

* ADN polimerasa III

* Primasa, ARN polimerasa

* ADN ligasa.

* Corrección : polimerasas I y III


Replicación natural del ADN


REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA

Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR….(Replicación “in vitro” de un fragmento de ADN ó ARN)


Cebador



NucleótidosAgua

Enzima Taq-polimerasa

Cebadores Buffer y Mg+ +

ADN molde

Muestra de tejido

Extracción de ADN

Termociclador

Millones de copias (10 6)de un fragmento de ADN

Electroforesis: visualización del fragmento de ADN amplificado a partir de los cebadores

Biol. (Mgter) Laura TorresBiol. (Mgter) Laura Torres

Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR (Polimerase Chain Reaction)


Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado

Condiciones de amplificación del DNA

1º Etapa:Desnaturalización

94ºC 30s a 2 min

2º Etapa:Hibridación de cebadores

35-60 ºC 15-120seg

3º Etapa:Polimerización

68-72ºC 30-150seg

Etapas 1 a 3: 25-45 ciclos ó repeticiones

Polimerización Final:5min

68-72ºC

Desnaturalización Inicial:5min95ºC

Termociclador



Etapas para la reacción de PCR

Los pasos 2 a 4 se repiten 30-35 veces e incrementan más de 106 veces el fragmento de DNA de interés


RAPDs(Random Amplified Polymorphic DNAs)

Base genética


Base genética de marcadores tipo RAPDs

Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC

-

+


Variedades de olivo : Frantoio y Oblonga ¿Sinonimia?

Electroforesis de marcadores RAPDs


MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR

(Replicación “in vitro” del DNA )

5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´

Microsatélites (SSR: Single Sequence Repeat)

Cebador 1

Cebador 2

Cebador 3

Cebador 1

Cebador 2

Cebador 3

Región de longitud variable (microsatélite)

Región de secuencia conservada

Región de secuencia conservada

5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´

5´- CGAT CGAT CGAT CGAT– 3´



Base genética de marcadores tipo Microsatélite ó SSRs (Simple Sequence Repeats)

1 2 1 x 2


Marcadores tipo SSRs (Microsatélites)

Dinucleótidos: (AT AT ATAT) – (AT)23

Trinucleótidos: ATC ATC ATC (ATC)16

Tetranucleótidos: ACGGACGG ACGG (ACGG)22


-

+

Sinonimia: electroforesis de marcadores tipo SSRs en las variedades de olivo Frantoio y Oblonga


Fingerprinting: Variedad “Arbequina” de Olivo

oli 11 oli 12 oli 17 oli 22

1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4

MPM (pb)

500

400

300

200

100


Fingerprinting (huella genética)

Autoincompatibilidad en cerezo Prunus avium L.


MPM (pb)

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

Electroforesis en gel de agarosa 3%

1- Empeltre de referencia(CSIC, España);

2- Empeltre LP;

3- Manzanilla de referencia(CSIC, España);

4-Manzanilla EC;

5- Manzanilla 4S;

6- Manzanilla gigante 4S;

7- Picual de referencia;

8- Nevadillo EC;

9- Nevadillo 4S;

M: 100 pb. DNA ladder (Sigma).


IAS oli 12

IAS oli 17

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Análisis de diversidad

Mejoramiento genético:

SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)

Plantas con genotipo aa

Selección: plantas homocigotas m/m”

Análisis por PCR: cebadores para el loci M/ m

Extracción de ADN

Loci A/a(genotipo de interés: aa).

LocimarcadorM/m

Genotipo mm Mm MM mm MM

Cebador

Cebador

M m

A a


Peritaje forense



Electroforesis capilar: resolución de marcadores microsatélites (SSRs): tamaño en pares de bases

1000750

1 2 3 4 5 6 7

870 pb

M M1 M2 M3 M4 TE TS

Detección del agente causal del “maize bushy stunt”

Microfotografía electrónica de fitoplasmas

Planta sintomática de maíz

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

1- Amplificación por PCR

2- Digestión con enzimas de restricción

3- Electroforesis


HaeIII RsaI

Figura 1. RFLP analysis of 1.2-kb PCR products (R16F2/R16R2 primers) of 16S rRNA genedigested with HaeIII (A) y RsaI (B) restriction enzymes S, 100 bp.ladder (Promega), fragment size (bp) from

Regiones genómicas evolutivamente conservadas

AluI

Figura 3. AluI restriction profile of a phytoplasmal tuf gene fragment amplified with primer pair fTufAy/rTufAy . Phytoplasma strain abreviations : AAY (American aster yellows), ACLLcba, ACLLctes y ACLLjun (Argentinian catharanthus little leaf), ChamAY (Chamomilla aster yellows), MBS (Maize bushy stunt) y DauAY (Daucus aster yellows). S, 100 bp ladder (Promega).

Taxonomía y filogenia de Fitoplasmas

Regiones genómicas mas variables

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence


NlaIII

RsaI

Tsp509I

TaqI

MseI

(CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence


AY1 (16SrI-B)

Maryland aster yellows (16SrI-B)

SAY (16SrI-B)

MBS (16SrI-B)

PRIVC (16SrI-B)

AV2192 (16SrI-L)

IOWB (16SrI-N)

OAY (Ca. Phytoplasma ateris)

PaWB (16SrI-D)

AVUT (16SrI-M)

RapePh (16SrI-C)

Valeriana rrnA (16SrI-M)

ACLLcbaI

ACLLctes

ACLLcbaII

ChamAY

Soybean purple stem (16SrI-O)

SPS (16SrI-O)

ChLL (16SrI-Q)

Valeriana rrnB (16SrI-M)

Alfalfa stunt (16SrI-B)

THP Ca. Phytoplasma licopersicy

STRAWBERY multiplier (16SrI-K)

BBS3 (16SrI-E)

Blueberry stunt (16SrI-E)

Carrot proliferation (16SrI-A)

Oat proliferation (16SrI-A)

HYDP (16SrI-A)

BB (16SrI-A)

STRAWBERY phylloid fruit (16SrI-R)

CPh rrnA (16SrI-C)

KVG (16SrI-C)

CPh rrnB (16SrI-C)

KVE (16SrI-C)

ACLR AY 16SrI-F

CVB (16SrI-F)

MPV

JHP (Ca. Phytoplasma japonicum)

AusGY (Ca. Phytoplasma australiense)

Stolbur

A laidlawi

A palmae

96

81

69

100

100

99

74

63

48

95

65

90

73

72

65

59

57

55

42

10036

2238

17

32

21

6

3

0 .001

Figura 6. Phylogenetic tree constructed by the neighbour-joining method of 16S rRNA gene sequences from 31 phytoplasmas 16SrI -aster yellows representative subgroups strains, other related 16Sr phytoplasmas groups, and A. palmae y A. laidlawi as the outgroup. The numbers on the branches are bootsatrap (confidence) values. GenBank accessions numbers of phytoplasmal 16S rRNA gene sequences: AY1 (Maryland aster yellows) AF322644; SAY (Severe aster yellows) M86340; MBS (Maize bushy stunt) AY265208 ; PRIVC (Primose virescence) AY265210; AV2192 (Aster yellows phytoplasma) AY180957; IOWB (Ipomea obscura witche´s -broom) AY265205; OAY (Ca. Phytoplasma asteris) M30790; PaWB (Paulownia witche´s -broom) AY265206; AVUT (Aster yellows phytoplasma) AY265209, *, strains sequenced in this study. Bar represents 1 substitution in

1000 nt.


Análisis filogenético

Marcador SCARS

Sequence Characterized Amplified Regions


En tomate:Marcador asociado a resistencia a Verticillium (loci Ve/ve).

SNPs (SingleNucleotidePolimorphism)

Biol. Mgter. Laura Torres

AFLPs RFLPs RAPDs SSRs (Microsatélites)

Ensayo de de detección

Rápido Lento Rápido Rápido

Reproducibilidad Alta Alta Baja Alta

Tipo de marcador Co-dominante ó dominante*

Co-dominante Dominante Co-dominante

Información sobre la secuencia

No No No Si

* según el análisis se realice mediante softwere o visualmente



1: valor mas bajo5: valor mas altoDom: dominanciaCod: codominancia

Utilidad de los marcadores genéticos y moleculares1- Fingerprinting (huella genética: Identidad)

2- Conservación y Uso de Recursos Genéticos:

- Construcción de colecciones nucleares (bancos de germoplasma)

- Relaciones filogenéticas

- Identificación de germoplasma elite

3- Mapas Genéticos

3- Diversidad y Estructura Genética:

- Nivel de heterocigosidad

- Frecuencias génicas y genotípicas

4- Diagnóstico: salud humana, animal, fitopatología

6- Agroindustria

7- Peritajes forenses



7- Conocimiento y Uso del Sistema Reproductivo:

- Grado de alogamia.

- Sistema de incompatibilidad.

- Identificación temprana del sexo del organismo.

8- MAS (Selección Asistida por Marcadores):

Resistencias a factores bióticos yabióticos

- Grado de introgresión

- Desarrollo de líneas puras.

- Protección legal: obtenciones de genotipos de propagación agámica . Mejora de caracteres cuantitativos (QTLs: Quantitative trait loci

Métodos de selección: (detección de genotipos superiores)

Convencional Vs ¿…?

Asistida por marcadores (MAS)

Costo - beneficio

-Fácil identificación de fenotipos segregantes

- Esquemas de retrocruzamientos: observación visual de fenotipos a campo y análisis de tejidos en laboratorio.

- Expresión tardía del carácter de interés.

- Proyecto privado o público? Tiempo de retorno.

- Costo de implementación: en disminución.

- Efectividad: en incremento. Influenciada por factores ambientales y epigenéticos.

- Esquemas de retrocruzamientos: rápida y certera identificación de individuos con el genoma recurrente.

↑ grado de precisión

↑ tasa de progreso

↓ tiempo de obtención del producto.

- MAS no es la “LA” solución …….

Convencional

y ¿…?Asistida por marcadores (MAS) Mayor evidencia empírica


Empresas biotecnológicas

Agricultura:

Caracterización de genotipos

Diagnóstico de patógenos

Análisis del control genético de caracteres cuanti y cualitativos

Mejora genética

Identificar MM ligados a caracteres de interés

Retrocruzamientos asistidos por MM

Cadena Agro-alimentaria:cuantificación y seguimiento de materia prima en productos elaborados

Cs. Biológicas:

Desarrollos tecnológicos para detección de variaciones cuanticualitativas de ADN y proteínas

Empresas producción y servicios agropecuarios

Empresas de servicios para industria agro-alimentaria

Perspectiva de los Marcadores Moleculares


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