Martina volfova jednocasticova elektronova mikroskopie

JEDNOČÁSTICOVÁ

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE

Martina Volfová

Biofyzika

2009

Osnova

Úvod

Příprava vzorků

Jednočásticová EM

Rozlišení v jednočásticových analýzách

Nejnovější poznatky v jednočásticové EM

Flexibilita velkých proteinových komplexů

Analýzy prováděné bez čisticích kroků

Úvod

EM je široce aplikovatelnou technikou ve studiu

proteinových a membránových struktur

přestože je méně vhodná než RTG difrakce (získání vhodných

krystalů řešením 3D proteinových struktur), má ve srovnání s

ní 2 výhody:

• silnější interakce elektronů s materiálem (10 000x) – vhodná

technika pro zobrazování jednovrstevných 2D krystalů a

jednotlivých proteinových molekul (v RTG difrakci silnější vzorky -

µm)

• poskytuje přímé informace ve formě obrázků

Úvod

potíže se zobrazováním biologických molekul – vysoký šum

v elektronových mikrofotografiích

vynalezení technik obrázkové analýzy - zdokonalení poměru

signál-šum se provádí průměrováním stovek nebo tisíců 2D

projekcí – 2 základní metody:

• krystalografická - založena na filtrování obrázků dobře

uspořádaných velkých 2D krystalů (µm) – obtížné pěstování

• jednočásticová (nekrystalografická) – řeší náhodně orientované

jednotlivé molekuly velkých proteinů, virů a proteinů, které obtížně

krystalizují, také ale proteiny malých velikostí, i proteiny s nízkou

čistotou

Příprava vzorků

negativní barvení

• kontrast zesílen ukotvením biomolekul v roztoku soli těžkého kovu

• sušením sůl kovu vyplní dutiny a prostor kolem molekuly, ale nepronikne dovnitř – velmi dobrý kontrast proteinových obálek

kryo-EM

• chlazením tenké vrstvy vodného roztoku makromolekul na mřížce EM se vytvoří vrstva ledu, ve které jsou objekty viditelné bez barvicího činidla

• kontrast je způsoben rozdílem hustoty mezi ledem a proteinem –nižší ve srovnání s negativním barvením

• vhodná pro velké symetrické molekuly virů a průhledné vzorky

kryo-negativní barvení

• ukotvení vzorku v plně zledovatělé vrstvě barviva dává zřetelnější signál


cílem jednočásticové EM je stanovení struktur makromolekul

z jednotlivých částic nebo z jednočásticových projekcí

izolované makromolekuly vykazují širokou škálu orientací a

rozdíly ve výsledných projekcích, aby bylo možné projekce

průměrovat, je nezbytné je nejprve uspořádat do

odpovídajících si pozic – rotační a translační posuny

superkomplex trimerického PSI cyanobakterie

Synechococcus obklopený anténním proteinem IsiA (kruh

18-ti kopií) poskytuje sadu 5000 jednočásticových projekcí

– negativně barvený vzorek

• se zvyšujícím se počtem

projekcí dochází ke snížení šumu


sčítání projekcí je však bezvýznamné v případě, že se

objevují v odlišných orientacích k rovině – data musí být

zpracována multivariační statistickou analýzou spolu s

automatizovanou klasifikací

po těchto krocích jsou nejvíce si podobné obrázky seskupeny

dohromady – výsledkem jsou třídy skupin homogenních

projekcí

z velkého množství sad projekcí pod různými úhly lze získat

3D rekonstrukce (v případě PSI-IsiA nebylo možné rozlišit

větší detaily – zploštělý objekt)

3D informace je významnější pro sférické objekty (ribozomy

a molekuly virů)


v letech 1980 a 1990 bylo provádění jednočásticových analýz

náročně, v současné době dochází k velkému vývoji ve směru

automatizace všech kroků – např. CCD kamery mohou být

programovány k záznamu stovek obrázků semi-

automatizovanou cestou

v blízké budoucnosti se očekává, že CCD kamery budou

nahrazeny přímými čítači elektronů, a že stanovení struktur

bude prováděno během několika hodin

Zernike fázový kontrastní mikroskop umožní získání vyššího

kontrastu nebarvených vzorků

speciální vydání časopisu strukturní biologie v r. 2007 se

věnovalo softwarovým nástrojům v makromolekulární EM,

zejména softwarovým balíčkům EMAN a SPIDER


v současné době je možné získat vysoké rozlišení pro velké,

stabilní, ve vodě rozpustné proteinové komplexy

bylo navrhnuto, že pro řešení vysokého rozlišení

nesymetrických objektů je potřeba více než 1000 000 částic –

ještě neprovedeno – u vysoce symetrických částic bylo takové

rozlišení již získáno

první řešený protein – protein viru (rotavir DLP) – k analýze

potřeba 8400 projekcí

méně symetrický protein GroEL – rozlišení 4 Å - rozlišen Cα

AK řetězce přímo z kryo-EM rekonstrukce

při středním rozlišení (pod 10 Å) byly stanoveny sekundární

struktury, např. α-helixy


metodou kryo-EM lze dosáhnout lepšího rozlišení než

metodou negativního barvení, nevýhodou však je nízký

kontrast, který vede ke snížené viditelnosti částic

jaderný ribonukleoprotein (snRNP) o velikosti 240kDa,

stanovený při 10 Å, je jednou z nejmenších částic určených

bez kontrastního činidla

vzhledem k vysokému kontrastu není metoda negativního

barvení ještě překonána – v krystalu katalázy zachovává

strukturní informace při rozlišení 4 Å (široce přijatý názor, že

tato metoda umožňuje rozlišení jen kolem 20-25 Å)

kryo-EM bylo u tohoto krystalu dosaženo rozlišení 2,8 Å


ve 2D mapách a 3D rekonstrukcích bylo dosaženo metodou

negativního barvení rozlišení 8-9 Å

kryo-negativně barvené struktury pod 10 Å byly získány z

GroEL a SF3b

ne všechny proteinové komplexy jsou vhodné pro stanovení

vysokého rozlišení – nevýhodou je, že udržují monodisperzi v

roztoku detergentu, který způsobuje, že projekce jsou na

okrajích nejasné


příklad jednočásticové

analýzy velkého, ve vodě

rozpustného proteinu

žížaly Lumbricus Terrestris

skládajícího se ze 180

podjednotek hemoglobinu

b) 11 Å, negativní barvení,

sečtení 1024 častic

c,d) 13 Å, 3D rekonstrukce

e,f) model vysoce rozlišené

RTG struktury – 3,5 Å


jednočásticová EM je nejúčinnější při řešení velkých, mnoho-

podjednotkových struktur, které nemohou snadno

krystalizovat, buď v 3D (RTG krystalografie) nebo ve 2D

(elektronová krystalografie)

v oblasti fotosyntézy jsou velmi důležité 2D mapy

fotosyntetických membránových proteinů, které jsou užitečné

v analýzách obvodových anténních komplexů, přestože

mnoho komplexů nebylo analyzováno pod 10-15 Å

velmi užitečné jsou zde aplikace při středním rozlišení, které

jsou kombinací EM a RTG struktur


použití rapidního zmrazování v kryo-EM umožňuje studovat

konformační změny v proteinových komplexech během

katalýzy v řádu milisekund (nejlépe prostudováno u

ribosomu)

dalším příkladem použití kombinace EM a RTG struktur je

hemoglobin žížaly, který byl krystalizován před více než 60

lety, v době, kdy krystalizace byla pouze metodou k čištění

proteinů

EM má schopnost pracovat s částečně čištěnými nebo vůbec

nečištěnými částicemi z rozpuštěných membrán – pro

konečné určení jsou nezbytné biochemické techniky a

hmotnostní spektrofotometrické analýzy


jednočásticová EM umožňuje získat představu o flexibilitě

mnoho-podjednotkových komplexů

zkoumána na příkladu superkomplexu PSI-IsiA, který se v

cyanobakteriích vytváří jako odpověď na stresové podmínky

přes velké množství zpracovaných projekcí bylo v

projekčních mapách PSI-IsiA rozlišeno relativně málo detailů

a) superkomplex skládající se z

trimerického PSI a kruhu z 18 kopií IsiA

b,c) monomerické PSI s kruhy ze 14 a 21

kopií IsiA, neostrost je způsobena

rotační flexibilitou (v průměru 2-3 ) mezi

kruhy

d,e) monomerické PSI s nekompletním

vnitřním a vnějším kruhem, vnitřní kruh

se skládá z 6 (1/3), vnější z 6-7 kopií

IsiA

f) monomerické PSI s nekompletním

vnitřním a vnějším kruhem s velkým

množstvím IsiA kopií - neostré


dalším studovaným komplexem je superkomplex C2S2M2 z

PSII, který se skládá z dimerického C2 jádra a dvou LHCII S-

trimerů a M-trimerů

projekční mapy (13 Å) ukazují, že M-trimer je v pozici hůře

fixován než S-trimer

• při pokusu o zaostření

středu komplexu a S-

trimeru byly značně

rozostřeny okraje

komplexu, což jasně

indikuje, že komplex

není vůbec rigidní


izolované fotosyntetické membrány mohou být rozpuštěny a

kompletní sady proteinů mohou být použity pro EM

po jednočásticové analýze mohou být větší membránové

proteinové projekce setříděny a průměrovány

některé získané projekce mohou být jednoduše určeny podle

tvaru a velikosti (PSI, PSII a ATP syntáza)

galerie 2D projekčních map rozpuštěných membránových

komplexů cyanobakterií Thermosynechoccus elongatus a

Synechocystis PCC 6803 je na následujícím slidu

strategie „nečištění“ byla také úspěšně aplikována na

superkomplex PSI-LHCII Arabidopsis thaliana, který je

obtížné čistit


a) NDH-1 z T. elongatus, boční pohled, extra

hustota na hydrofóbním rameni

b) NDH-1 z T. elongatus, horní pohled

c) čištěné NDH-1 z Synechocystis, detergent

dodecyl maltoside – ztráta specifické

podjednotky

d) dimerický komplex PSII z Synechocystis

e) dvojitý dimerický komplex PSII z

Synechocystis

f) tyčinkovitý proteinový komplex neznámého

původu a funkce z T. elongatus

g,h) ve vodě rozpustné šestiúhelníkové částice

i) cyanobakteriální fragment s trimerickou

symetrií

j) trimerický PSI komplex

k) proton komplexu ATP syntázy

l) GroEL-GroES superkomplex

Použitá literatura

BOEKEMA, E. J., FOLEA, M., KOUŘIL, R., 2009:

Single particle electron microscopy, In Photosynthesis

Research: s. 189 – 196.

Děkuji za pozornost!

Martina volfova jednocasticova elektronova mikroskopie

Documents

Transcript of Martina volfova jednocasticova elektronova mikroskopie