Marqueur VASP : aspects méthodologiques, validation technique
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Marqueur VASP :Marqueur VASP :aspects méthodologiques,aspects méthodologiques,
validation technique validation technique
Pr L Camoin-JauPr J Sampol
Laboratoire d’Hématologie INSERM EMI 0019
Hôpital de la ConceptionMarseille*******
GEHT Paris 9 et 10 Octobre
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ADPADP ACAC PGE1PGE1
AMPcAMPc
PKAPKA
VASPVASP VASP-PVASP-P
PPPP
ActivatedActivated
IIb -IIIaIIb -IIIa
complexcomplex
Fibrinogen bindingFibrinogen binding
Activated PlateletActivated Platelet
InactivatedInactivated
IIb-IIIaIIb-IIIa complexcomplex
No FibrinogenNo Fibrinogen bindingbinding
Resting PlateletResting Platelet
++--
++--
-- ++
Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-721-7
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Platelet VASP-FCM Biocytex
Mesure de la capacité de l’ADP à inhiber
la phosphorylation de VASP
Principe
Marquage de VASP-P en immunofluorescence
indirecte après fixation et perméabilisation
Analyse en double couleur
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Principe du test
Tube 1 Tube 2 Tube 3
10 µl de PGE1 10 µl sang citraté
10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté
Vortex – Incubation 10 min
Fixation 10 µlFixation 10 µl Vortex – Incubation 5 min
Perméabilisation cellulaire et immunomarquagePerméabilisation cellulaire et immunomarquage
10 µl Ac anti-VASP-P10 µl Ac anti-VASP-P 10 µl 10 µl Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-P 10 µl10 µl Contrôle isotypiqueContrôle isotypiqueVortex – Incubation 5 min
RévélationRévélation et contre-marquage plaquettaire et contre-marquage plaquettaire
10 µl10 µl Ig polyclonal –FITC – CD61 PEDilution
Lecture (2 h)
10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté
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Analyse cytométrique
Protocole compensé
PositionnementPositionnement de la fenêtre de la fenêtre
d’analysed’analyse
Plaq
GB
Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition PGE1Condition PGE1
MFI Axe YMFI Axe Y
Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition Condition
PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y
Isotype contrôleIsotype contrôleCondition Condition
PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y
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Analyse cytométrique
Protocole Non Compensé
PositionnementPositionnement de la fenêtre de la fenêtre
d’analysed’analyse
Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition PGE1Condition PGE1
MFI Axe YMFI Axe Y
Ac anti-VASP-PAc anti-VASP-PCondition Condition
PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y
Isotype contrôleIsotype contrôleCondition Condition
PGE1 + ADPPGE1 + ADPMFI Axe YMFI Axe Y
Plaq
GB
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Calcul de l’index de réactivité des récepteurs à
l’ADP
MFIc PGE1 – MFI c (PGE1 + ADP)
MFIc PGE1 X 100
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Résultats préliminaires
AVEC compensation SANS compensation
Normaux (n=5) Plavix (n=3) Mauvais répondeurs
0
25
50
75
100
Ind
ex d
e r
éacti
vit
é
pla
qu
ett
air
e
nsns
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Essais de répétabilitéProtocole non compensé
Test 1Test 1 Test Test 22
Test Test 33
Test Test 44
Test Test 55
MoyMoy CVCV
T1 7.8 8.24 8.39 8.26 8.2
T2 2.94 2.96 2.9 3.13 2.99
T3 1.9 2.03 2.06 2.17 2.02
Index de réactivité
%
82.4 85 86.7 84.2 84.3 84.584.5 1.91.9
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Essais de répétabilitéProtocole compensé
Test 1Test 1 Test Test 22
Test Test 33
Test Test 44
Test Test 55
MoyMoy CVCV
T1 7.46 7.98 8.07 7.75 7.92
T2 2.28 2.39 2.42 2.44 2.27
T3 1.39 1.65 1.63 1.7 1.59
Index de réactivité
%
85.3 88.3 87.7 87.8 89.3 87.787.7 1.71.7
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Application clinique
Mesure de la phosphorylation de Mesure de la phosphorylation de VASP chez des patients traités par VASP chez des patients traités par thiénopyridines ayant présenté ou thiénopyridines ayant présenté ou non une thrombose artérielle sub-non une thrombose artérielle sub-aiguë après ATCPaiguë après ATCP
Groupe I (n =16): patients avecavec une thrombose de stent sub-aiguë
Groupe II (n=30) : patients sanssans complication thrombotique
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Données démographiques
Group SAT
(n=16)
Group No SAT
(n=30)
p
Fibrinemia (g/l) 4.5 1.5 3.8 1.3 ns
Platelets (G/l) 311 88 286 74 ns
Duration of thienopyridines
pretreatment (days)
4.4 1 7 7.6 7.4 ns
Eptifibatide before (%)
29.4 37.5 ns
Age 66 15 69 8 ns
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Résultats
39.80%
63.30%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
No SAT SAT
p < 0.0001p < 0.0001
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Conclusion
Trousse aujourd’hui disponible et
utilisable facilement
Indication :
suivi des traitements par
thiénopyridines
Relevance clinique reste à confirmer