Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümüdosya.marmara.edu.tr/fef/kmy/Anabilim...

Marmara Üniversitesi

Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı

Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

0




1

İçindekiler

Laboratuvar Kuralları ve Güvenlik……………………………………….....2

Deney I

Amino Asitlerin Titrasyon Eğrileri Ve İzoelektrik Nokta Tayini ……………….…....3

Deney II

Amino Asitlerin Kağıt Kromatografisi İle Ayrılmaları………………………….......7

Deney III

Amino Asitlerin Ve Proteinlerin Bazı Özelliklerinin İncelenmesi .…………………11

Deney IV Tampon Çözeltiler…………………………………………………..……..…………….19

Deney V Katekolün Oksidasyonuna Polifenol Oksidaz Enziminin Etkisi………………………...23

Deney VI Proteinlerin Saflaştırılması Ve Karakterizasyonu…………………………………….....32

Deney VII Proteinlerin Kantitatif Tayini………………………………………………...………….39

Deney VIII Proteinlerin Elektroforez İle Ayrılmaları Ve Molekül Ağırlıklarının Tayini………....…45

Deney IX Proteinlerin N- Terminal Amino Asitlerinin İnce Tabaka Kromatografisi İle Belirlenmesi……54

Deney X Memeli Dokularından DNA İzolasyonu Ve Bazı Özelliklerinin İncelenmesi………..…60

Kapak resmi: İnsan insülin parçalayıcı enziminin beta-amiloid (mavi) ile verdiği

kompleksin yapısı




2

Laboratuvar Kuralları ve Güvenlik

Biyokimya laboratuvarı güz döneminde, protein saflaştırılması ve karakterizasyonu,

enzim kinetiği ve DNA izolasyonu gibi biyokimyada yaygın olarak kullanılan tekniklerle

ilgili genel prosedürlerin tanıtılması hedeflenmektedir. Ayrıca biyokimyada sık olarak

kullanılan bazı cihazların kullanımı öğretilecektir.

Her labarotuvardan önce o gün yapılacak olan deneyi mutlaka dikkatle okuyunuz. Her

deneyden önce bir kısa sınav yapılacaktır. Bu sınav sonucunda sıfır almış olan öğrenci o

deneye alınmaz.

Laboratuvarda çalışırken laboratuvar önlüğü ve (steril olmayan) laboratuvar eldiveni

kullanılır. Önlük ve eldivenlerinizi laboratuvardan ayrılıncaya kadar çıkarmayınız. Bazı

yumuşak lensler laboratuvar kimyasalları ile tepkimeye girerek rahatsızlık

oluşturacağından, eğer mümkünse kontak lenslerinizi laboratuvara girmeden önce

çıkarınız. Deney esnasında asistanların talimatlarını dikkatle uygulayınız. Deney

bitiminde tüm cihazları kapatıp, çalıştığınız yerin temizliğini iyi bir şekilde yapınız.

Bazı kimyasallar zehirli, mutajenik, karsinojenik veya teratojenikdir (doğum kusurlarına

yol açan). Bu kimyasalların kullanımında ve atılmalarında laboratuvardaki görevlilerin

yaptığı uyarıları dikkate alınız.

Tüm öğrencilerin bir laboratuvar defteri tutmaları istenmektedir. Deney esnasında

yaptığınız her bir ölçümü, deney aşamasını, dikkatle laboratuvar defterinize not alınız.

Her deneyin tamamlanmasından sonra en geç bir sonraki deneyden bir gün önce deney

raporlarınızı ilgili asistana teslim ediniz. Bu raporlar aşağıdaki şekilde hazırlanmalıdır.

Başlık: Deneyin adı

Materyal ve Metod: Kısaca deneyin yapılışı ve kullanılan kimyasallar

Sonuçlar ve tartışma: Deney sonunda elde ettiğiniz veriler ve yorumlarınız

Çalışma Soruları: Çalışma sorularına verdiğiniz yanıtlar

Öğrenciler deneyleri gruplar halinde yapmaktadırlar ancak her bir öğrenci kendi

yorumlarını, kendi hazırladığı deney raporu ile sunmalıdır. Birbirinin aynı olan raporlar

kabul edilmez. Aynı şekilde çalışma sorularına cevap verilmemiş deney raporları da

kabul edilmez. Deneylerin değerlendirilmesinde en önem verilen kısım tartışma kısmıdır.

Mutlaka her bir deneyin neden gerçekleştiği (veya neden gerçekleşmediği) konusunda

kendi açıklamalarınızı ekleyiniz.

Her dönemde bir ara sınav yapılır. Laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney

raporlarının %20’si ve ara sınavın %70’i alınarak öğrencinin vize notu saptanır. Ara

sınavdan sonra yapılan deneyler için de laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney

raporlarının %20’si ve finalin %70’i alınarak öğrencinin final notu saptanır.

Biyokimya laboratuvarında devam zorunluluğu %80’dir. 3 kez laboratuvara gelmeyen bir

öğrenci devamsızlıktan kalmış olur ve sınavlara alınmaz.




3

DENEY I

AMİNO ASİTLERİN TİTRASYON EĞRİLERİ VE

İZOELEKTRİK NOKTA TAYİNİ

Amfoterik maddeler olan amino asitlerde iki fonksiyonel grup bulunur. Bunlar

karboksilik asit (-COOH) ve amino (-NH2) gruplarıdır. Bu fonksiyonel gruplar nötral

ortamda iç tuz oluştururlar.

Nötral Ortamda:

(İç Tuz)

Asidik Ortamda:

(Katyon)

Bazik Ortamda:

(Anyon)

Yukarıdaki denklemlerden de görülebileceği gibi amino asitlerin amino grubu hidrojen

iyonu kabul edebilir, karboksil grubu ise hidrojen verebilir. Bu sebepten dolayı amino

asitler hem asitler hem de bazlarla titre edilebilirler, yani amfoterik özellik gösterirler.

Amino asitlerde titre edilebilir en az iki grubun olması, en az iki denge sabiti (K) ve iki

iyonizasyon sabiti (Ki) olduğu anlamına gelir. İzoelektrik nokta (pI), aminoasitte

bulunan artı ve eksi yüklerin birbirine eşit olduğu, yani amino asidin net yükünün 0

olduğu pH değeridir, yani K1 ve K2’nin dengede olduğu noktadır.




4

Asit-baz titrasyonları protonların kademeli olarak eklenmesi veya uzaklaştırılmasıdır.

Aşağıdaki şekilde glisinin titrasyon eğrisi gösterilmiştir.

Şekilden glisinin iki tamponlama aralığına

sahip olduğu görülmektedir. Bunlar pH

2.34 ve pH 9.6 merkezli +/-1 pH aralığına

sahip dikdörtgen alanlar olarak

gösterilmişlerdir. Glisin bu pH

aralıklarında tampon çözelti olarak

kullanılabilir. Şekilden de görüldüğü gibi

glisinin izoelektrik noktasının teorik değeri

5.97’dir.

İyonlaşabilen yan zincire sahip amino

asitlerde ise üç bölgeli bir titrasyon grafiği

beklenmelidir.

KÂĞIT

Şekil 1.1- Glisinin titrasyon eğrisi

Şekil 1.2- Glutamik asidin titrasyon eğrisi Şekil 1.3- Histidinin titrasyon eğrisi




5

KİMYASALLAR

HCl, NaOH, Glisin.

YÖNTEM

50 mL 0.1 N Glisin çözeltisi hazırlanır. pH metrenin kalibrasyonu yapıldıktan sonra,

hazırlanan çözeltiden 20 mL’lik bir hacim bir behere aktarılarak pH metre yardımı ile pH

tayin edilir. Daha sonra 0.1N HCl ile titre edilir. Her 1 mL asit ilavesinden sonra beher

karıştırılarak pH ölçümü yapılır. İşleme pH göreceli olarak sabit kalıncaya kadar devam

edilir. pH metrenin elektrodu destile su ile yıkanır, kurulanır.

Hazırlanmış olan 0.1N Glisin çözeltisinden bir başka behere 20 mL daha alınır ve pH

metre yardımı ile pH ölçümü yapılır. Daha sonra 0.1N NaOH ile titre edilir. Her 1mL baz

ilavesinden sonra beher karıştırılarak pH ölçümü yapılır. İşleme pH göreceli olarak sabit

kalıncaya kadar devam edilir.

Elde edilen değerler veri tablosuna işlenir.

Asit titrasyonu veri tablosu:

Baz titrasyonu veri tablosu:

Eklenen

HCl (mL) 0 1

pH

Eklenen

HCl (mL)

pH

Eklenen

HCl (mL)

pH

Eklenen

HCl (mL)

pH

Eklenen Baz

(mL) 0 1

pH

Eklenen Baz

(mL)

pH

Eklenen Baz

(mL)

pH

Eklenen Baz

(mL)

pH




6

VERİLERİN KULLANIMI

Milimetrik grafik kağıdı kullanarak x eksenine eklenen asit ve eklenen baz hacmini, y

eksenine ise ölçülen pH değerlerini koyarak grafiği çiziniz ve grafikten pKa ve pKb

değerlerini ve pI değerini bulunuz. Grafik üzerinden elde ettiğiniz verileri teorik değerler

ile karşılaştırınız.

ÇALIŞMA SORULARI

1- Glutamik asit ve histidinin pI değeri nasıl hesaplanır? Aminoasitlerin farklı pI

değerlerine sahip olmalarının önemi nedir?

2- Genel amino asit denklemi kullanılarak izoelektrik noktası formülü nasıl çıkarılır?

Şekil 1.4- Glisinin asit ve bazla titrasyon eğrisi




7

DENEY II

AMİNO ASİTLERİN KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ İLE

AYRILMALARI

Kromatografi bir karışımdaki maddelerin iki faz arasında farklı dağılması esasına

dayanan bir ayırma yöntemidir. Sistemdeki fazlardan biri sabit (stasyoner) faz, diğeri ise

hareketli (mobil) faz olarak adlandırılır. Sabit faz genellikle destek ortamı oluşturmak

amacı ile kullanılırken, hareketli faz, karışımı oluşturan bileşenleri taşımak amacı ile

kullanılır. Karışımı oluşturan bileşenler hareketli ve sabit faz ile farklı oranlarda

etkileşerek farklı hızlarda yürürler. Bu esasa dayalı olarak ayırma yapan yöntemlere

kromatografik yöntemler denir ve ayırmayı sağlayan kuvvete göre adsorpsiyon, dağılım,

iyon değişim, jel geçirgenlik ve afinite (ilgi) olmak üzere beş sınıfa ayrılır.

Kromatografik yöntemler biyokimya alanında, istenen bir maddenin saflaştırılması

(örneğin bir bitki ya da bir hayvan dokusundan proteinlerin elde edilmesi), seyreltik

çözeltilerin konsantre edilmesi, bir maddenin saflığının kontrol edilmesi ve

organizmadaki metabolitlerinin belirlenmesi gibi alanlarda kullanılır.

Kâğıt kromatografisi, dağılım kromatografisinin özel bir şeklidir. Burada kullanılan

Whatman kromatografi kâğıtları saf selülozdan, herhangi bir katkı maddesi

kullanılmadan üretilmiştir ve düzgün gözenek boyutuna sahiptir. Whatman kâğıdı,

durağan faz olarak adsorplanmış su içerir. Hareketli fazın kapiler etkisiyle ayrımı

yapılacak olan maddeler Whatman kâğıdı boyunca hareketli faz ile etkileşimlerine göre

farklı hızlarda ilerlerler.

Karışımı oluşturan bileşenler renkli ise kâğıt üzerinde yürüdükleri yerlerde yuvarlağa

yakın lekeler şeklinde görülürler. Eğer renksiz iseler üzerlerine bir reaktif püskürtülerek

ya da UV ışığı altında renk göstermeleri ile görünür hale getirilirler. Leke büyüklüğü ve

renk şiddeti kullanılarak kantitatif veya semi-kantitatif analiz yapılabilir.

Retensiyon Faktörü (Rf) lekelerin merkez noktasının başlangıç noktasına uzaklığının,

çözücü sınırının başlangıç noktasına olan uzaklığına bölünmesi ile elde edilir. Rf değeri

bir karışımı oluşturan bileşenlerin tanımlanması için kullanılır. Aynı şartlarda (sabit ve

hareketli fazın cinsi, sıcaklık vb.) kromatografisi yapılan her bir maddenin karakteristik

bir Rf değeri vardır.




8

KİMYASALLAR

Asetik asit, n-butanol, ninhidrin, aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, fenilalanin,

HCl, Whatman No.1 kromatografi kâğıdı.

YÖNTEM

n-butanol: asetik asit: su (65:15:25) karışımı hareketli faz olarak hazırlanır. Kromatografi

tankına 10 mL (yaklaşık 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde) çözücü konulur ve tankın

ağzı kapatılır. Tankın çözücü buharı ile dengeye gelmesi için kromatografi kâğıdı

yerleştirilinceye kadar kapağı açılmaz.

Şekil 2.1- Amino asitlerin ninhidrin reaksiyonu mekanizması




9

Size verilen 5cm x 8cm boyutundaki Whatman No:1 Kromatografi kağıdının kısa

kenarından 1.2 cm uzaklığında kurşun kalemle bastırmadan çok hafif bir çizgi çizilir ve

bu çizgi üzerinde 1cm aralıkla 4 nokta işaretlenir.

1N HCl içinde çözünmüş aspartik asit, lösin, valin,

arjinin, prolin, fenilalanin çözeltilerinden grubunuza

verilmiş olan üçü ve amino asit karışımı bilinmeyen

örnek, ayrı ayrı işaretlenmiş 4 noktaya temiz bir

kapiler tüp yardımı ile tatbik edilir. Tatbik noktasının

çapı 4 mm’yi geçmemelidir. Birden fazla damla

tatbikinde, her damla tatbikinden sonra leke yerinin

kurutulması ve ikinci damlanın ondan sonra tatbik

edilmesi gereklidir.

Tatbik edilen noktalar kurutulduktan sonra kâğıt, bir

pens ile tutularak tatbik noktaları aşağıya gelecek

şekilde tanka yerleştirilir. Kâğıdın, tankın

kenarlarına değmemesine ve tatbik noktalarının

çözücü ile doğrudan temas etmemesine dikkat edilir.

Çözücünün ilerlemesi takip edilir ve üstten yaklaşık

0.5 cm boşluk kalıncaya kadar yürütülür (Bu işlem yaklaşık 45 dakika sürer). Çözücünün

yürüdüğü mesafe hemen kurşun kalemle işaretlenerek kâğıt etüvde kurutulur.

Etüvden çıkartılan kâğıdın üzerine çeker ocakta ninhidrin reaktifi püskürtülür ve

kurutulmak üzere yeniden etüve konulur. Oluşan mor lekelerin çevresi kurşun kalemle

işaretlenerek Rf değerleri hesaplanır ve veri tablosuna kaydedilir. Karışımda bulunan

amino asitlerin hangileri olduğu hesaplanan Rf değerleri ile karşılaştırılarak tayin edilir.

Amino Asit Lekenin Rengi Rf Değeri

Aspartik Asit

Lösin

Valin

Arjinin

Prolin

Fenilalanin

Örnek

Şekil 2.1- Kromatografi kağıdı

Şekil 2.2- Yürümesi tamamlanmış olan kromatografi kağıdı.




10

ÇALIŞMA SORULARI

1- Rf değerlerini hesapladığınız amino asitlerin yürüme hızlarının farklı olmasının

nedenlerini araştırınız. Bu amino asitlerin formülleri aşağıda yer almaktadır.

2- Glutamik asit, histidin, glisin, triptofan ve izolösinden oluşan bir amino asit

karışımı, NH3:Benzen (10:90) hareketli fazı kullanılarak kağıt kromatografisi ile

ayrılmak isteniyor. Amino asitlerin yürüme hızlarının nasıl olmasını beklersiniz?

3- Amino asitler organizmada protein yapısına katılmaktan başka hangi görevleri

yaparlar?

Şekil 2.3- Protein yapısında yaygın olarak bulunan amino asitler.




11

DENEY III

AMİNO ASİTLERİN VE PROTEİNLERİN BAZI

ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ

I- AMİNO ASİTLER

Amino asitler yapılarında en az bir karboksil ve bir amino grubu içeren organik

bileşiklerdir. Tabiatta bulunan yaklaşık 300 amino asidin 20 tanesi protein yapısına girer.

Protein yapısına giren amino asitler L, α- aminoasitlerdir. Amino asitler peptid (amid)

bağları ile bağlanarak polipeptid ve proteinleri oluştururlar. Amino asitler polar

olmayan organik çözücülerde çok az, etanolde az, suda çok çözünürler ve nötral çözeltiler

verirler.

Hem asidik, hem de bazik çözeltilerde artan

bir çözünürlüğü, yani amfoter bir karaktere

sahiptirler. Erime ve bozulma noktaları 120-

300 °C aralığındadır.

Saf bir amino asidin suda çözülmesiyle

meydana gelen çözeltinin pH değerine

izoiyonik nokta denir. Amino asitlerin ve

proteinlerin izoiyonik noktada

çözünürlükleri maksimumdur.

8 amino asidi (valin, lösin, izolösin, treonin,

metiyonin, fenilalanin, triptofan, lizin)

organizma sentezleyemez. Bunlara esansiyel

amino asitler denir. Bu amino asitlerin

diyetle dışarıdan alınması gereklidir.

II- PEPTİDLER

Bir amino asidin amino grubu, ikinci bir amino asidin

karboksil grubu ile reaksiyona girdiğinde bir molekül

su ayrılması ile dipeptid oluşur. Arada oluşan kovalent

bağa peptid bağı denir ve rezonans gösterdiği için son

derece kararlıdır. 2 amino asit bir dipeptid, 3 amino asit

bir tripeptid, 10 veya daha az sayıda amino asit bir

oligopeptid, 50-100 amino asit ise bir polipeptid

oluşturur. Peptidlerin asidik ve bazik özellikleri

zincirin iki ucundaki amino ve karboksil grupları ile

yan zincirlerde bulunan iyonlaşabilen gruplara bağlıdır.

Şekil 3.1- Alanin amino asidinin stereoizomerleri

Şekil 3.2- Peptid bağının oluşumu




12

Peptidler N-terminali (peptid zincirindeki serbest amino grubu) solda, C-terminali

(peptid zincirindeki serbest karboksil grubu) sağda kalacak şekilde yazılırlar ve bu

şekilde isimlendirilirler. Bu pentapeptid serilglisiltirozilalanillösin veya Ser–Gly–Tyr–

Ala–Leu olarak isimlendirilir.

III- PROTEİNLER

100’den fazla aminoasit içeren polipeptidlere protein adı verilir. Bazen belirli bir

biyolojik fonksiyonu gerçekleştirmek üzere, belirli bir konformasyonu almış olmak şartı

ile 100’den daha az sayıda amino asit içeren polipeptidlere de protein adı verilebilir.

Canlı hücrelerin kuru ağırlığının yarısından fazlasını proteinler oluşturur. Proteinler

organizmada enzimlerin, hormonların, reseptörlerin, bağışıklık sistemi ve pıhtılaşma

faktörlerinin yapısında bulunurlar. Yapı ve hareket sistemi içinde görev alırlar.

Amino asitler birleşerek peptid zincirini oluştururlar. Bu proteinlerin primer yapısıdır.

Peptid zincirleri daha kararlı bir hale gelmek üzere temel bir üç boyutlu yapı oluştururlar.

Buna proteinlerin sekonder yapısı denir. Bir polipeptidde birden fazla sekonder yapı bir

araya gelerek çeşitli kimyasal etkileşmeler sonucu üç boyutlu yapıda katlanırlar. Buna

tersiyer yapı denir. Birden fazla tersiyer yapıda katlanmış polipeptid zincirleri bir araya

gelerek kuaterner yapıyı oluştururlar.

Proteinin doğal yapısındaki herhangi bir değişim denatürasyon olarak adlandırılır.

Sıcaklık, asitler (HCl, trikloroasetik asit, perklorik asit vb.) organik çözücüler (etanol,

aseton vb.), çapraz bağlayıcılar (formaldehit, glutaraldehit), kaotropik ajanlar (üre 6-8 M,

guanidin klorür 6M), indirgeyici ajanlar (2-merkaptoetanol, ditiyotreitol, iyodoasetat),

Şekil 3.3- Serilglisiltirozilalanillösin pentapeptidi

Şekil 3.4- Proteinlerin yapısı




13

yüksek konsantrasyonda tuzlar (amonyum sülfat), ağır metal tuzları (cıva(II)klorür,

bakır(II)sülfat vb.) ve bazı deterjanlar (sodyumdodesilsülfat) proteinlerde denatürasyona

yol açarlar. Eğer denatüre edici faktörün ortamdan kaldırılması ile protein doğal yapısını

yeniden kazanabiliyorsa buna geri dönüşümlü denatürasyon denir. Eğer denatüre edici

faktörün ortamdan kaldırılması ile protein doğal yapısını yeniden kazanamıyorsa buna

geri dönüşümsüz denatürasyon denir.

Denatüre olan proteinlerde kuaterner, tersiyer ve kısmen sekonder yapılar bozulur ancak

primer yapı bozulmaz. Eğer polipeptid zincirinde kopmalar meydana geliyorsa buna

degradasyon adı verilir ve geri dönüşümsüzdür.

Düşük konsantrasyonlarda tuzlar proteinlerin çözünürlüğünü arttırırlar. MgCl2,

(NH4)2SO4 gibi iki değerlikli tuzlar, NaCl ve NH4Cl gibi tek değerlikli tuzlara göre daha

etkilidirler. Bu tuzların konsantrasyonları arttıkça proteinlerin çözünürlükleri azalır ve

yüksek tuz konsantrasyonlarında proteinler çöker.

KİMYASALLAR

Glisin, arjinin, glutamik asit, fenilalanin, tirozin, triptofan, histidin, sistein, sistin, kazein,

yumurta albümin, sülfat asidi, nitrat asidi, hidroklorik asit, sodyum hidroksit,

cıva(II)klorür, sodyumnitroprussiyat, bakır(II)sülfat, bakır(II)asetat, kadmiyum sülfat ve

bizmut(II)nitrat.

YÖNTEM

I- Amino Asitlerin Reaksiyonları

Amino asitlerin çözünürlüğü ve pH’sı:

4 ayrı tüpe az miktarda katı glisin, arjinin, glutamik asit ve fenilalanin alınır. Tüm

tüplere eşit miktarda destile su ilave edilir ve karıştırılır. Amino asitlerin çözünürlükleri

kaydedilir. Oluşan çözeltilerin pH’ları pH kâğıdı ile tayin edilir.

Ksantoprotein Reaksiyonu:

Fenil halkası içeren aromatik amino asitler derişik nitrat asidi ile muamele edildiklerinde

sarı renkli nitro türevlerine dönüşürler. Nitrat asidinin cilde temas etmesiyle oluşan

sararmanın sebebi budur.

Şekil 3.5- Ksantoprotein reaksiyonu




14

Tirozin, triptofan, fenilalanin, histidin ve kazein’in sulu çözeltilerinden yaklaşık olarak az

miktarda alınarak üzerine 5 damla derişik nitrat asidi konur. Reaksiyona zor giren

fenilalanin tüpüne 5 damla daha nitrat asidi ve 5 damla derişik sülfat asidi eklenir. Tüpler

su banyosunda ısıtılır ve renk değişimi kaydedilir. Daha sonra tüpler bir portüpe alınarak

soğumaya bırakılır. Tüpler oda sıcaklığına geldiğinde %10 NaOH çözeltisi, ortam bazik

oluncaya kadar eklenir. Renk değişimi kaydedilir.

Millon Reaksiyonu:

Millon Reaktifi: 15 g HgCl2, 100 mL %50 HNO3 içinde çözülerek hazırlanır.

Fenol içeren bileşikler bu reaksiyonu verir. Tirozin amino asidi fenol grubu içeren tek

amino asit olduğundan bu reaksiyon tirozine özgüdür. Önce tirozinin fenol grubu reaktif

çözeltisindeki nitrik asit tarafından nitratlanır. Daha sonra nitratlanmış tirozin molekülü

çözeltideki cıva (I) ve cıva (II) iyonları ile kırmızı renk verir.

Ayrı tüplerdeki az miktarda tirozin ve kazeinin sulu çözeltilerine birkaç damla millon

reaktifi eklenir ve tüpler kaynar su banyosunda ısıtılır. Renk oluşumu kaydedilir.

Nitroprussiyat Reaksiyonu

Sülfidril grupları içeren bileşikler ağır metaller ve sodyum nitroprussiyat ile koyu renkli

kompleksler oluştururlar. Sistein serbest –SH grupları içerdiğinden bu reaksiyonu verir.

Sistin serbest –SH grubu içermediğinden bu reaksiyonu vermez.

3 tüpe ayrı ayrı sistein, sistin ve kazein çözeltileri alınır ve üzerlerine az miktarda %10

NaOH ve aynı hacimde %2 sodyum nitroprussiyat çözeltisi eklenir. Renk değişimi

kaydedilir. Kazein tüpüne bir miktar derişik HCl eklenir ve gözlemler kaydedilir.

Şekil 3.6- Sistin oluşumu Şekil 3.7- Sodyum nitroprussiyat




15

Triptofan Reaksiyonu

İki ayrı tüpteki az miktarda triptofan ve glisin çözeltileri üzerine eşit hacimde derişik

asetik asit konulur. Bu karışımın üzerine damla damla, tabaka oluşturacak şekilde derişik

sülfat asidi ilave edilir. Turuncu-mor halka oluşumu triptofan varlığını belirtir. Bu

triptofana özgü bir denemedir.

Aminoasitlerin verdikleri genel tanınma reaksiyonları:

Reaksiyon Reaktif Amino asit Renk

Ninhidrin

Reaksiyonu Ninhidrin Serbest NH2 Grubu Mor

Biüret Alkali CuSO4 Amid Bağları Mavi

Lowry Reaksiyonu Fosfomolibdat Tirozin Mavi

Millon Reaksiyonu HNO3, HNO2, HgNO3 Tirozin Kırmızı

Ksantoprotein Kaynar HNO3 Triptofan, Tirozin,

Fenilalanin Sarı

Ehrlich Reaksiyonu Der. HCl içinde p-

dimetilamino benzaldehit Triptofan Mavi

Sakaguchi

Reaksiyonu

α- Naftol, NaOCl veya

NaOBr Arjinin Kırmızı

Nitroprussiyat

Reaksiyonu

Sodyum nitroprussiyat,

NaOH Sistein Kırmızı

Sullivan reaksiyonu Sodyum-1,2-naftokinon-4-

sülfonat ve NaHSO4 Sistein Kırmızı

Kurşun Sülfür

Reaksiyonu

NaOH, Seyreltik Kurşun

asetat Sistein Siyah

Hopkins-Cole

Reaksiyonu Glioksilik asit, Sülfürik Asit Triptofan Mor

Pauly Reaksiyonu Sülfanilik asit, HCl, Sodyum

karbonat, Sodyum nitrit Histidin, Triptofan

Histidin: Sarı

Triptofan: Mor




16

II- Proteinlerin Reaksiyonları

Proteinler ile ilgili denemelerde yumurta albümin çözeltisi kullanılacaktır. Yumurta

albümin çözeltisinin hazırlanması için bir yumurtanın akı, sarısından ayrılarak bir behere

aktarılır. Hacminin altı katı kadar su ilave edilir ve çözeltinin köpürmemesine dikkat

edilerek karıştırılır.

Proteinlerin Denatürasyonu:

Isının etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve bir süre sıcak su

banyosunda tutulur. Gözlemler kaydedilir.

Konsantre asitlerin etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve

üzerine hacminin iki katı kadar derişik nitrik asit ilave ederek gözlemler kaydedilir.

Ağır metal tuzlarının etkisi: 3 ayrı tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve

üzerlerine az miktarda ayrı ayrı bakır(II)asetat, kadmiyumsülfat ve bizmut(II)nitrat ilave

edilerek gözlemler kaydedilir.

Biüret reaksiyonu:

İki veya daha fazla peptid bağı ihtiva eden bileşikler alkali bakır sülfat ile menekşe veya

mor renkli kompleksler oluştururlar. Rengin koyuluğu proteindeki peptid bağlarının

sayısına bağlıdır. Bu test, peptid bağlarını belirlediğinden amino asitlerle reaksiyon

vermez. Bu reaksiyon ayrıca azot veya karbon atomuna bağlı iki karbonil grubu ihtiva

eden bileşiklerle de pozitif sonuç verir. Bu test proteinlerin kantitatif olarak tayini için de

kullanılmaktadır ancak bu amaçla kullanılan biüret reaktifi sodyum potasyum tartarat,

bakır sülfat ve potasyum iyodür içerir.

Üç ayrı tüpe az miktarda glisin, yumurta albümin ve kazein çözeltileri alınır. Tüplere aynı

hacimde %10 NaOH çözeltisi ve beşer damla %1 CuSO4 çözeltisi eklenir ve renk

değişimi kaydedilir.

Şekil 3.8- Biüret reaksiyonu sonucunda oluşan bakır-protein kompleksi




17




18

ÇALIŞMA SORULARI

1- Glu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly dizisine sahip peptidi çiziniz. Bu peptidin

pH 3, 8 ve 11’deki net yükü nedir? (Bir grubun pKa değerinin altında ve üstünde

net yük değişiminin nasıl olduğunu hatırlayın). Bu peptidin pI değeri ne olabilir?

2- Organizmada görev yapan önemli peptidlere birkaç örnek veriniz ve ne görev

yaptıklarını belirtiniz.

Şekil 3.9- Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının pKa değerleri




19

DENEY IV

TAMPON ÇÖZELTİLER

Zayıf bir asidin kendisini ve anyonunu (konjuge bazını) veya zayıf bir bazın kendisini ve

katyonunu (konjuge asidini) yan yana içeren çözeltilere tampon çözeltiler adı verilir.

Tampon çözeltiler az miktarda asit veya baz ilavesiyle belirgin bir pH değişimi

göstermezler. Bir çözeltinin tampon etkisini gösterebilmesi için ayrı ayrı hem H+ iyonu

veren hem de H+ iyonu alan tanecikleri yeterli konsantrasyonda içermesi gereklidir.

Tampon çözeltiler sabit pH aralıklarında çalışmak üzere hazırlanırlar.

Henderson-Hasselbalch Denklemi

(A-: Tuz / HA: Asit)

Bu denklem bir çözeltinin teorik pH değerini hesaplamak için kullanılır. Denklemden de

görülebileceği gibi tamponu oluşturan maddeler arasında oran değişiklikleri yapılarak

pH’sı farklı tamponlar elde edilebilir.

Tampon çözeltiyi oluşturan maddeler her oranda değil sadece belirli bir oranda en iyi

tampon etkisini gösterirler. A-/HA oranı bire eşit olduğunda log1 = 0 olacağından pH

değeri de pKa değerine eşit olur. Bu pH değerine tamponun optimum pH değeri denir.

Bu pH değerinin dışındaki değerlerde tamponun etkisi zayıflar. Tamponlar optimum pH

değerlerinin bir birim altı ve bir birim üstündeki pH aralıklarında en etkili olarak

kullanılabilirler.

Tamponlar biyolojik ortamların hazırlanmasında faydalanılan çözeltilerdir. Canlı

organizmalarda pH değerleri son derece küçük bir aralıkta sabittir ve bu değerler sıkı bir

şekilde kontrol altında tutulur. Çünkü pH’daki değişiklikler enzimler, hücre membranları

ve nükleik asitler gibi birçok moleküler yapının yüklü bölgelerine etki eder ve fizyolojik

aktivitelerini etkiler. pH değerlerindeki 0.5 birimlik bir değişim canlının yaşamını

tehlikeye sokar. Organizmanın farklı bölgeleri farklı pH değerlerine sahiptir. (kan: 7.4,

mide özsuyu 1.5, pankreas özsuyu 8.0, beyin omurilik sıvısı 7.4 gibi). Bu bölgelerdeki

pH farklı tampon sistemlerince korunur. Bu sistemlere örnek olarak bikarbonat/karbonik

asit (HCO3-/H2CO3), protein/proteinat, oksihemoglobin/protonlanmış oksihemoglobin

(HbO2/HHbO2) ve fosfat (HPO4-/H2PO4

-) tampon sistemleri verilebilir.

Organizma sıvılarının asit baz dengesinin asit tarafına kaymasına asidoz, alkali tarafına

kaymasına ise alkaloz denir. Asit metabolizma ürünleri artarsa, oluşan H+ iyonları HCO3

-

/CO2 tarafından tutulur ve H2CO3 meydana gelir. Bunun dissosiasyonu ile oluşan H+

iyonları diğer tamponlarca tutulur. Bir kısmı da karbondioksit ve suya dönüşür.

Karbondioksidin artması nedeniyle pH 7.4’ün altına düşer. HCO3- konsantrasyonunun

azalması ile meydana gelen bu duruma metabolizma asidozu denir. Diyabette, açlıkta ve

karbonhidratsız rejimlerde görülen asidozlar buna örnektir. HCO3- konsantrasyonunun

artması ile metabolizma alkalozu meydana gelir. Aşırı sodyum bikarbonat alınması ve

şiddetli kusma sonucu midede HCl kaybı ile oluşan alkalozlar buna örnektir.




20

KİMYASALLAR

Monopotasyum fosfat (KH2PO4), disodyum fosfat (Na2HPO4), NaOH, HCl.

YÖNTEM

Tampon çözelti hazırlama tablolarından yararlanarak 50 mL pH 7.4 Fosfat (Sørensen),

25 mL pH 6 sitrikasit/fosfat tamponlarını hazırlayınız. Hazırladığınız tamponun pH

değerini ölçünüz. Eğer pH değerleri gerekenden farklı bir değere sahip ise 1N NaOH

veya 1N HCl kullanarak pH’sını ayarlayınız.

ÇALIŞMA SORULARI

1- Bir tampon litrede 0.01 mol laktik asit (pKa=3.86) ve 0.05 mol sodyum laktat

içermektedir.

a- Tamponun pH değerini hesaplayınız.

b- 1 L tampona 5 mL 0.5 M HCl eklendiğinde pH değişimi ne olur?

2- Organizma sıvılarında pH düzenlemesinde en önemli görev üstlenen organlar

nelerdir ve bunu hangi yollarla gerçekleştirirler.




21




22




23

DENEY V

KATEKOLÜN OKSİDASYONUNA POLİFENOL

OKSİDAZ ENZİMİNİN ETKİSİ

Enzimler canlı organizmalardaki reaksiyonları katalizlerler. Laboratuvar ortamında çok

yüksek veya çok düşük basınç, pH ve sıcaklıkta oluşan kimyasal değişme ve

reaksiyonlar, canlı hücrelerin bozulmadan kalabildikleri dar basınç, pH ve sıcaklık

aralığında, ancak enzimler aracılığıyla gerçekleştirilebilirler.

Küçük bir grup katalitik RNA moleküllerinin haricinde tüm enzimler protein

yapısındadırlar. Katalitik aktiviteleri genellikle proteinin doğal yapısında olmasına

bağlıdır. Eğer bir enzim denatüre olur veya alt ünitelerine ayrılırsa katalitik aktivitesi

genellikle kaybolur.

Bazı enzimler aktivite göstermek için bir veya daha fazla anorganik iyona veya kompleks

organik veya metallorganik bileşiklere ihtiyaç gösterirler. Bu iyon ya da bileşiğe

kofaktör adı verilir. Organik bileşik enzimin protein kısmı ile çok sıkı bir şekilde

bağlanmış ise prostetik grup, çok sıkı bağlanmamış ve dissosiye olabiliyorsa koenzim

adını alır. Katalitik olarak etki gösteren tam enzime holoenzim denir. Holoenzimin

protein kısmına ise apoenzim adı verilir.

Enzimin etki ettiği bileşiğe substrat adı verilir. Enzimin katalizlediği reaksiyonu

proteinin tamamı değil, sadece “aktif bölge” adı verilen belirli bir bölgesi etkiler.

E=Enzim, S= Substrat, ES= Enzim-Substrat kompleksi ve P= Ürün olmak üzere enzim

reaksiyonu şu şekilde özetlenebilir.

Şekil 5.1- Enzim yapısı




24

Böyle bir reaksiyon genel kimyasal reaksiyon mekaniğine ve kinetiğine uyar. Diğer

katalizörlerde de olduğu gibi enzimler reaksiyonun yönünü değiştirmezler sadece

reaksiyonun hızına etki ederler. Reaksiyona ilerleyebileceği daha düşük aktivasyon

enerjili ara yollar sunarak reaksiyonu hızlandırırlar.

Şekilde ΔGEnzimsiz enzimsiz reaksiyonun aktivasyon enerjisi, ΔGEnzimli ise enzimli

reaksiyonun aktivasyon enerjisidir. ΔH Reaksiyon entalpisidir.

Reaksiyon başında substrat konsantrasyonu yüksek, ürün konsantrasyonu ise ihmal

edilecek kadar azdır. ES kompleksi büyük bir serbest enerji düşmesi ile ayrıldığından k4

ihmal edilebilir. Öyleyse ES oluşumunun net hızı, ES bozunmasının net hızına eşit

olacaktır ki denklem 1’e göre bu eşitlik;

olur.

Reaksiyonun başında [P] ihmal edilebilir olduğundan,

şeklinde yazılabilir.

Burada Km, kontrollü şartlarda reaksiyonun maksimum hızının yarısına eşit hız veren

substrat konsantrasyonudur ve Michaelis-Menten sabiti olarak adlandırılır.

Şekil 5.2- Enzimli reaksiyonun serbest enerji diyagramı




25

[E0], başlangıçtaki toplam enzim konsantrasyonu ve reaksiyonun herhangi bir anındaki

enzim konsantrasyonu [E] ise, [E] = [E0] – [ES] olur.

Denklem 3 aşağıdaki şekle dönüşür;

Maksimum hız toplam enzim konsantrasyonu ile orantılı olduğu kadar, başlangıç hızıyla

da orantılıdır. Böylece Vmaks = K3 [E0] olduğundan denklem 4’te yerine konulursa

aşağıdaki denklem elde edilir.

Denklem 5’te başlangıç hızı V0 yalnız bırakılacak olursa;

eşitliği bulunur.

Denklem 6’ya göre V0 ile [S] arasında çizilen grafik aşağıdaki gibi olur. Bu eğriye

Michaelis-Menten eğrisi denir.

Şekil 5.3- Michaelis-Menten eğrisi




26

Düşük substrat konsantrasyonlarında denklem 6’nın paydasında Km >> [S] olduğunda

[S], Km yanında ihmal edilebilir ve = Vmaks [S] / Km olur. Yüksek substrat

konsantrasyonlarında denklem 6’nın paydasında Km << [S] olacağından Km, [S] yanında

ihmal edilebilir, V0= Vmaks olur ve denklem 6’daki eşitlikle bölünerek doğru denklemi

verecek şekle dönüştürülebilir.

Y eksenine 1/V0, X eksenine de 1/[S] değerleri yerleştirilerek çizilen grafikte elde edilen

doğrunun eğimi Km/Vmaks’a ve Y eksenini kesen nokta 1/Vmaks’a eşit olur. Km değeri de

grafikte gösterildiği şekilde bulunabilir. Bu eğriye Lineweaver-Burk eğrisi adı verilir.

Eğer V0 değerine karşı V0/[S] grafiği çizilecek olursa bu eğriye Eadie-Hofstee eğrisi

elde edilir.

Km değerlerinden enzimlerin ayırt edilmesinde, ES komplekslerine ilişkin sabitlerin

bulunmasında faydalanılır Km substrat konsantrasyonu birimi cinsindendir (mol/L veya

mmol/L).

Enzim aktivitesinin ölçülmesinde çeşitli birimler kullanılır. En çok kullanılan aktivite

birimi enzim ünitesidir (aktivite).

Enzim ünitesi (U): 25°C’de 1 dakikada optimum şartlarda 1µmol substratı ürüne çeviren

enzim miktarıdır.

Spesifik aktivite (U/mg protein): 1 mg protein başına enzim ünitesidir. Enzimin saflık

derecesinin bir göstergesidir.

Molar Aktivite: Bir tek enzim molekülü tarafından birim zamanda ürüne çevrilen

substrat molekülü sayısıdır. Dönüşüm sayısı olarak da adlandırılır.

Katal: 1 saniyede 1 mol substratı reaksiyona sokan enzim miktarıdır.

Şekil 5.4- Lineweaver-Burk eğrisi Şekil 5.5- Eadie-Hofstee eğrisi




27

Enzim miktarı çok küçük olduğundan direkt olarak ölçmek zordur. Optimum şartlarda

katalizledikleri reaksiyon hızları diğer şartlar sabit kalmak üzere, enzim konsantrasyonu

ile orantılıdır. Böylece enzim konsantrasyonu hız ölçülmesi ile tayin edilebilir.

Enzimle katalizlenmiş reaksiyonların hızı inhibitör adı verilen bazı maddeler tarafından

azaltılır veya tamamen durdurulur. Buna enzim inhibisyonu denir. Enzim inhibisyonu

geri dönüşümlü veya dönüşümsüz olabilir.

Polifenol oksidaz enzimi doğada yaygın olarak bulunan, bakır içeren bir enzimdir. Meyve

ve sebzelerde hasar görmüş bölgelerin hava ile teması sonucu kararması ve cildin

esmerleşmesi (melanin sentezi) gibi reaksiyonlardan sorumludur. Enzimin aktivitesi,

fenollerin katekollere orto-hidroksilasyonu ve katekollerin orto-kinonlara oksidasyonu

olacak şekilde ikiye ayrılabilir.

Aktif merkezde substratın bağlanabileceği bir boşluk vardır ve bu merkezdeki histidin

kalıntıları bakır bağlamada görev yaparlar.

Bu denemede katekolün benzokinona enzimatik dönüşüm reaksiyonunun kinetikleri

incelenecektir.

Şekil 5.6- Polifenol oksidaz enziminin 3 boyutlu yapısı ve aktif merkezi




28

Bu reaksiyonda kullanılan katekol çözeltisi renksizdir, oluşan 1,2-benzokinon ise

kahverengidir. Böylece oluşan ürünün miktarı kolorimetrik olarak izlenebilir. 1,2-

benzokinon 480 nm dalga boyunda maksimum absorbans verdiğinden bu dalga boyunda

yapılan spektrofotometrik ölçüm yardımı ile belli bir zamanda çözeltide bulunan ürün

miktarı hesaplanabilir.

Spektrofotometrik ölçümde bir ışık kaynağı geniş bir spektrumda ışık yayar,

monokromatör belirli bir dalga boyundaki ışığı seçer ve örnek küvetine gönderir. Işık

küvetten geçerken absorblayıcı moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak bir kısmı

absorblanır ve çözeltiden geçen ışık bir dedektör tarafından ölçülür.

Şekil 5.7- Polifenol oksidaz enziminin katalizlediği oksidasyon reaksiyonunun mekanizması

Şekil 5.8- Spektrofotometrenin çalışma prensibi




29

Bu denemede amaç iki anahtar parametrenin bulunmasıdır. Bunlar maksimum hız (Vmaks)

ve Michaelis-Menten sabitidir (Km).

KİMYASALLAR

Sitrik asit-fosfat tamponu pH 6, katekol, benzokinon.

YÖNTEM

Ham enzimin hazırlanması: Patatesler soyulur ve bıçakla küçük parçalara ayrılır. Daha

sonra blender cihazı yardımıyla ve 200 mL pH 6 sitrik asit - fosfat tamponu varlığında

homojenize edilir. Enzimlerin aktivitesi sıcaklıktan etkilendiği için bu aşamadan

sonraki tüm işlemler hızlı bir şekilde ve buz üzerinde gerçekleştirilir. Elde edilen

homojenizat, bir buz banyosuna önceden yerleştirilerek soğutulmuş erlen ve huni

yardımıyla cam pamuğundan süzülür ve süzüntü deney süresince buz banyosunda tutulur.

Substrat konsantrasyonunun reaksiyon hızına etkisi: 6 adet deney tüpü aşağıdaki

tabloda gösterildiği şekilde (enzim konulmadan) hazırlanır. Enzim çözeltisi

spektrofotometrik ölçümden hemen önce konulacaktır.

Tüp

No

Substrat

Katekol

0.01 M

(mL)

Su

(mL)

Enzim

(µL)

Absorbans Grafikten

Hesaplanan

Hız 1. dk. 2. dk 3. dk 4. dk 5.dk 6.dk

1 0 10 - Sıfırlama yapılır

2 1 9 500

3 2 8 500

4 3.5 6.5 500

5 5 5 500

6 7 3 500

7 9 1 500

2-7 numaralı tüplerin dakika başına verdikleri absorbans değeri ölçülecektir. Bu işlem

şöyle yapılır;

1 numaralı tüpe 500µL enzim konulur ve tüp iyice karıştırılarak içeriği iki

spektrofotometre küvetine aktarılır. Bu çözeltiler bizim şahit çözeltilerimiz olacaktır. İki

şahit küveti kullanılarak spektrofotometre 480 nm dalga boyunda sıfırlanır. Daha sonra 2

numaralı tüpe enzim konulur ve enzim konulduğu anda kronometre çalıştırılır. İçinde

enzim bulunan 2 numaralı tüp iyice karıştırılır, içeriği bir spektrofotometre küvetine

aktarılır ve spektrofotometreye yerleştirilir.




30

Bu sırada kronometre takip edilerek ilk enzimin konulmasından tam 30 saniye sonra 3

numaralı tüpe 500 µL enzim konulur ve iyice karıştırılarak içeriği bir spektrofotometre

küvetine aktarılır ancak spektrofotometreye yerleştirilmez. Kronometre 01:00 değerini

gösterdiğinde spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir.

Spektrofotometrenin içindeki 2 numaralı çözeltiyi içeren küvet çıkarılır ve 3 numaralı

çözeltiyi içeren küvet yerleştirilir. Kronometredeki değer 01:30 değerini gösterdiğinde

spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir. Küvetler değiştirilerek her

bir küvet için dakikada bir absorbans değeri ölçülür. Her bir küvet için 6 değer alınıncaya

kadar bu işlem devam eder. Daha sonra aynı işlemler 4-5 ve 6-7 numaralı tüpler için de

tekrarlanır. Her işlemin başında spektrofotometre şahit çözeltiler kullanılarak sıfırlanır.

Ekstinksiyon sabitinin bulunması: 100 mL 0.01 M benzokinon çözeltisi hazırlanarak

480 nm dalga boyundaki absorbansı ölçülür. Benzokinon zor çözündüğünden bu

çözelti deney başladığında hazırlanır ve ölçümü deneyin sonunda yapılır.


2-7 numaralı tüpler için 480 nm’de elde edilen absorbans değerleri ayrı ayrı, zamana

karşı grafiğe çizilir.

Her grafikte, hiperbolik eğrilere teğet doğrular çizilir ve bu doğruların eğimleri

hesaplanır. Eğim = ΔA/Δt, A=ε.c.l olduğundan her bir küvet için başlangıç hızı

V = m / ε . l denkleminden hesaplanır.

2-7 numaralı tüplerin her biri için katekol konsantrasyonları hesaplanır. Bulunan

başlangıç hızları ile substrat konsantrasyonları arasında Michaelis-Menten eğrisi çizilir.

Bu hız ve substrat konsantrasyonları için Lineweaver-Burk ve Eadie-Hofstee grafikleri

çizilerek Vmaks ve Km değerleri hesaplanır.

Şekil 5.9- Absorbans- zaman grafiği




31

ÇALIŞMA SORULARI

1- Substrat ile doygun olduğu zaman 10-6

M konsantrasyonundaki karbonik anhidraz enzimi

saniyede 0.6 mol/L karbonik asit oluşumunu katalizler. Buna göre dönüşüm sayısı nedir.

2- Geri dönüşümlü enzim inhibisyonu, inhibitörün enzime bağlanmasına göre yarışmalı,

yarışmasız ve yarı-yarışmalı olmak üzere üçe ayrılabilir. Aşağıda verilen şekilleri ve

grafikleri inceleyerek her bir durum için inhibitör konsantrasyonu değişimi ile Vmaks ve

Km değerlerinin nasıl değiştiklerini yorumlayınız.

Şekil 5.10- Enzim inhibisyon mekanizmaları




32

DENEY VI

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU

I- Proteinlerin Ekstraksiyonu ve Diyaliz

Bir proteinin yapısının ve özelliklerinin araştırılabilmesi için, o proteinin saf bir şekilde

elde edilmesi gerekir. Proteinler kolaylıkla denatüre olabildiklerinden ve biyolojik

materyallerde (örneğin vücut sıvılarında ve doku ekstraktlarında) kompleks bir karışım

halinde bulunduklarından, saflaştırılmaları oldukça zordur.

Proteinlerin elde edilebildiği kaynaklar genellikle dokular ve hücrelerdir. Bir proteinin

saflaştırılmasında yapılacak ilk işlem hücrelerin parçalanarak içerdikleri proteini bir

çözeltiye almaktır. Bu çözeltiye ham ekstrakt denir. Bu ham ekstrakt istenen proteinin

yanı sıra pek çok başka protein ve molekül de içermektedir.

Daha sonra proteinlerin çözünürlük farkları, büyüklükleri, elektriksel yükleri ve

polariteleri gibi çeşitli özelliklerinden yararlanılarak protein ekstraktı fraksiyonlara

ayrılır. Bu özelliklere dayanarak proteinlerin saflaştırılması ile ilgili pek çok yöntemler

kullanılmaktadır. Bunlara örnek olarak kademeli santrifüj, tuzla çöktürme, aseton ve

alkolde soğukta çöktürme, ultrafiltrasyon ve çeşitli kromatografik yöntemler verilebilir.

Aşağıda ham ekstrakttan bir enzimin kromatografik yöntemler kullanılarak saflaştırılması

için örnek bir yöntem verilmiştir.

a- Ham ekstraktın elde edilmesi

b- Tuzla (amonyum sülfat) çöktürülmesi

c- İyon değişim kromatografisi

d- Jel geçirgenlik (moleküler elek) kromatografisi

e- Afinite (ilgi) kromatografisi.

Proteinler saflaştırma işlemi sırasında her bir basamakta çeşitli kayıplara uğrarlar ve

aktiviteleri azalır. Ancak istenilen enzim her bir basamakta daha saf hale gelir, bu

nedenle daha derişik hale gelir ve spesifik aktivitesi artar. Enzimlerle çalışıldığında

ortamın pH’sı ve sıcaklığının çok iyi bir şekilde kontrol edilmesi gerekir.

İşlem Basamağı Fraksiyon Hacmi

(mL)

Total Protein

(mg)

Aktivite

(Ünite)

Spesifik Aktivite

(Ünite/mg)

Ham Ekstrakt 1400 10000 100000 10

Tuzla Çöktürme 280 3000 96000 32

İyon Değişim 90 400 80000 200

Jel Geçirgenlik 80 100 60000 600

Afinite 6 3 45000 15000




33

İyon Değişim Kromatografisi

Şekil 6.1- İyon değişim kromatografisi




34

Jel Geçirgenlik (moleküler Elek) Kromatografisi

Şekil 6.2- Jel geçirgenlik (moleküler elek) kromatografisi




35

Afinite (İlgi) Kromatografisi

Şekil 6.3- Afinite (ilgi) kromatografisi




36

Tuzla çöktürme işlemi sonunda ortamda bulunan tuzlar saflaştırma işleminin ileri

safhalarında ve protein karakterizasyonu işlemleri sırasında deneyleri bozarlar. Bu

nedenle tuzların ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu amaçla jel filtrasyon, ultra

santrifüj ve diyaliz yöntemleri kullanılabilir. Büyüklük farkına dayanan bir ayırma

yöntemi olan diyaliz basit ve pahalı olmayan bir işlemdir.

Diyaliz işleminde yarı geçirgen selüloz membranlar kullanılır. Bu membranların gözenek

büyüklükleri bellidir ve sadece belli bir boyuttaki moleküllerin geçmesine izin verirler.

Diyaliz tamponu olarak tuz konsantrasyonu düşük olan çözeltiler kullanılır. Membranın

içindeki tuz konsantrasyonu, membranın dışındaki diyaliz tamponunun tuz

konsantrasyonundan daha fazla olduğu için membran içindeki tuzlar membran dışına

doğru hareket ederler. Proteinlerin molekül ağırlıkları tuzlar ile kıyaslandığında çok daha

büyük olduğundan membranın gözeneklerinden geçemezler ve membran içinde kalırlar.

Bu işlem diyaliz tamponu ve membran içindeki çözelti arasında bir tuz konsantrasyonu

dengesi oluşuncaya kadar devam eder. Bu dengenin oluşması yaklaşık 4–6 saat kadar

sürer. Dengeye ulaşıldığında diyaliz tamponu tazelenir, böylece denge bozulur ve tuzlar

membran dışına çıkmaya devam eder. Bu şekilde protein molekülleri tuzdan kurtarılmış

olur.

Şekil 6.4- Diyaliz




37

KİMYASALLAR

Potasyumdihidrojen fosfat, disodyumhidrojen fosfat, amonyum sülfat, üre, tiyoüre,

trishidroksimetil aminometan, diyaliz membranı.

YÖNTEM

Bu deneyde 3 farklı dokudan protein ekstraksiyonu yapılacaktır. Bu amaçla dana

karaciğeri, yumurta akı ve yumurta sarısı protein kaynakları olarak kullanılacaktır.

Liziz tamponu: 9 M üre, 0.04 M Tris ve %0.1 SDS çözeltisinden oluşur. 0.484 g Tris ve

54.63 g üre 100 mL’lik bir balonjojeye alınır ve pH 7.4 Sørensen tamponu ile hacim

tamamlanır. Daha sonra homojenizata 1 mL %10 SDS çözeltisi ilave edilir.

Homojenizasyon

Karaciğer yıkanır, parçalara ayrılır ve liziz tamponu varlığında blender cihazı

kullanılarak daha küçük parçalar haline getirilir. Daha sonra homojenizatör yardımı ile

homojenize edilir. Homojenizata 1 mL %10 SDS çözeltisi ilave edilerek karıştırılır. ve

santrifüj tüplerine alınarak santrifüj edilir. Süpernatant (tüpün üst kısmındaki sulu çözelti)

dekante edilerek bir behere alınır.

Yumurta akı ve sarısı sıvı oldukları için bu homojenizasyon basamağına gerek

duymazlar. Behere alınan yumurta akı ve sarısı üzerine liziz tamponu ve az miktarda %10

SDS ilave edilir. Köpürmemesine dikkat edilerek karıştırılır ve santrifüj edilerek

süpernatantlar ayrı ayrı bir behere toplanır.

Çöktürme

Tuzla çöktürme: Homojenize edilmiş olan çözeltilerden 10 mL alınır ve aşağıda verilmiş

olan doygunluk hesabı tablosundan yararlanılarak istenen amonyum sülfat

doygunluğunda çöktürme yapmak için gerekli olan amonyum sülfat miktarları hesaplanır.




38

Gerekli miktar tartıldıktan sonra, katı amonyum sülfat protein örneklerini içeren tüplere

eklenir, dikkatle karıştırılır ve santrifüjlenir. Santrifüj sonunda süpernatant dekante

edilerek atılır ve presipitat (çökmüş olan katı kısım) üzerinden deneye devam edilir.

Asetonla çöktürme: Homojenize edilmiş olan çözeltilerden 4 mL alınır ve üzerine 8 mL

soğuk aseton ilave edilir. Dikkatle karıştırılır ve santrifüj edilir. Santrifüj sonunda

süpernatant dekante edilerek atılır ve presipitat üzerinden deneye devam edilir.

Çözünürleştirme

Çöktürülmüş olan proteinlere az miktarda pH 7.4 Sørensen fosfat tamponu ilave edilir.

Dikkatle karıştırılarak proteinlerin mümkün olduğunca çok çözünmesi sağlanır. Daha

sonra tüpler santrifüj edilerek süpernatantlar alınır ve presipitatlar atılır.

Diyaliz

Tuzla çöktürülmüş olan proteinler daha önceden hazırlanmış olan diyaliz torbalarına,

torbanın en fazla 3/4’ü dolacak şekilde yerleştirilir ve diyaliz tamponu olarak destile su

kullanılarak diyaliz edilirler. 4 saate bir diyaliz tamponu değiştirilerek soğukta 2 gün

boyunca diyaliz edilirler. Diyaliz sona erdikten sonra diyaliz torbaları açılır ve

diyalizatlar temiz bir tüpe alınır.

Bu işlemler sonrasında elde edilen çözeltiler protein örnekleridir, proteinlerin

konsantrasyon tayini ve elektroforez denemelerinde bu çözeltiler kullanılacaktır. Bu

amaçla elde edilen protein çözeltileri hacimlere ayrılır ve -20°C soğutucuda saklanırlar.

ÇALIŞMA SORULARI

1- Günlük hayatta saflaştırılmış proteinler nerelerde kullanılmaktadır? Araştırınız.




39

DENEY VII

PROTEİNLERİN KANTİTATİF TAYİNİ

Protein saflaştırılması işleminde her basamakta elimizde bulunan protein

konsantrasyonunun bilinmesi çok önemlidir. Sonraki basamaklarda hangi yöntemlerin

kullanılacağı protein konsantrasyonuna bağlı olarak belirlenir.

Çözünür proteinlerin çözelti içindeki konsantrasyonlarının ölçümü için birçok farklı

yöntem geliştirilmiştir. Her yöntemin bazı avantaj ve dezavantajları vardır. En yaygın

kullanılan 3 yöntem; basit absorbans yöntemi, Lowry yöntemi ve Bradford

yöntemidir. Bu yöntemlerde bilinen konsantrasyonlardaki protein çözeltileri ile

hazırlanan standart kalibrasyon grafikleri kullanılarak bilinmeyen örneğin

konsantrasyonu bulunur.

Her üç yöntem de proteinlerin analizi için spektrofotometrik ölçümleri kullanır.

Basit Absorbans Yöntemi

Bu yöntem proteinlerdeki tirozin ve triptofan amino asitlerinin 280 nm’de maksimum

absorbans vermesine dayanır. Bu absorbsiyona fenilalanin amino asidi ve disülfit bağları

da az miktarda olmakla birlikte katkıda bulunur.

Çok hızlı ve ucuz bir yöntemdir, az miktarda materyale ihtiyaç gösterir ayrıca protein

örneği üzerinde herhangi bir kimyasal modifikasyon yapılmadığından örnek geri

kazanılabilir. Ancak hassasiyeti düşüktür (0.05–2 mg protein/mL). Ayrıca farklı

miktarlarda tirozin ve triptofan içeriğine sahip proteinler aynı konsantrasyonda olsalar

bile farklı absorbans verirler. Yakın bir dalga boyunda maksimum absorbans

verdiklerinden nükleik asitler ve başka kromofor gruplarda etkileşim yapabilir.

Ayrıca uzak UV alanda da (190 nm) bu yöntem uygulanabilir. Peptid bağlarına bağlı

olarak absorbans verildiğinden amino asit kompozisyonunun değişiminden bağımsızdır

ve hassasiyeti yüksektir (0.01–0.05 mg). Ancak pek çok çözelti ve tampon bu bölgede

absorbans verdiğinden girişimler de artar. Ayrıca oksijen absorbsiyonundan ötürü

özelleşmiş cihazlara ihtiyaç duyar.

Sığır serum albümin (BSA) çözeltisi bu denemede sıklıkla standart olarak kullanılır.

Lowry (Folin-Ciocalteau) Yöntemi

Bu yöntem hem biüret hem de folin reaksiyonuna dayanır. Biüret reaksiyonunda alkali

şartlarda bakır, proteinlerin peptid bağları ile reaksiyona girerek Cu+

oluşturur. Folin-

Ciocalteau reaksiyonunda ise fosfomolibdotungstat, aromatik amino asitlerin Cu katalizli

oksidasyonu ile heteropolimolibden mavisine indirgenir. Sonuçta kısmen tirozin ve

triptofan bileşimine bağlı olan, şiddetli koyu bir mavi renk elde edilir.




40

Lowry yöntemi de tirozin ve triptofan içeriğine bağlıdır ancak proteinden proteine olan

farklılıklar orta seviyededir. 0.01 mg/mL hassasiyete sahiptir ve 0.01–1 mg/mL protein

içeren çözeltiler için kullanımı uygundur.

Bu yöntemin bir dezavantajı girişimlerin fazla oluşudur. Çeşitli tamponlar, ilaç aktif

maddeler, deterjanlar, EDTA, amonyum sülfat, Glisin, merkaptoetanol, nükleik asitler ve

şekerler gibi bir grup madde deneme ile girişim gösterir. Hücre ekstraktları ve kompleks

örnekler, örneğin perkloroasetik asit/ etanol çöktürmesi gibi bir temizleme basamağına

ihtiyaç gösterebilir. Günümüzde denemenin ihtiyaçlarına göre modifiye Lowry

yöntemleri kullanılmaktadır. Reaksiyon pH bağımlıdır, pH’nın 10–10.5 arasında olması

önemlidir. İnkübasyon basamağındaki süre kritik değildir 10 dakika ile birkaç saat

arasında değişebilir. Tüplerin iyi karıştırılması çok önemlidir, çünkü folin reaktifi alkali

ortamda kararsız olduğu için kısa bir süre aktivite gösterir. Deneme yüksek

konsantrasyonlarda lineer değildir, kalibrasyon eğrisinin buna göre hazırlanması gerekir.

Bradford Yöntemi

Bradford yöntemi Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB) boyar maddesinin proteinlere

kovalent olmayan bağlanmasına dayanır. CBB’nin asidik çözeltideki proteine bağlanması

boyanın 465 nm’deki maksimum absorbsiyonunu 595 nm’ye kaydırır. 595 nm’deki

absorbsiyon doğrudan protein konsantrasyonlarına aittir.

Bu yöntem Lowry yöntemine göre daha hızlı, daha ucuz, daha kolay ve daha hassastır.

CBB’nin protein örneğine katılması ile 2 dakika gibi kısa bir zamanda renk oluşu ve bu

renk 1 saat sabit olarak kalır. 0.001 mg/mL protein ölçülebilir.

Lowry ile karşılaştırıldığında, yaygın kimyasal bileşikler ve biyolojik örneklerdeki

protein olmayan moleküllerden daha az etkilenir. Amfolitler, deterjanlar bu yöntemde

girişim yaparlar. CBB arjinin ve lizin amino asitlerine daha kolay bağlanır bu sebeple

farklı proteinler farklı renk yoğunluğu verebilirler. Bu yöntemin dezavantajlarından

biridir. CBB serbest arjinin ve lizine, 3000 kDa’dan daha küçük peptid moleküllerine

bağlanmaz.




41

Yukarıdaki tablodan da görüldüğü gibi her kantitatif protein tayin yönteminin kendine

özgü avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Bu sebeple bir protein tayini yöntemi

seçilirken yapılan çalışmanın özellikleri göz önünde bulundurulmalı ve çalışma

ortamındaki moleküllerle girişim yapmayacak, yeterli hassasiyette, ucuz ve uygulanabilir

bir yöntem seçilmelidir.

KİMYASALLAR

NaCl, Sığır Serum Albümin (BSA), Na2CO3, CuSO4·5H2O, KNaC4H4O6·4H2O, Folin

Reaktifi, Bradford Reaktifi, NaOH, Ovalbümin.




42

YÖNTEM

Basit absorbans

Serum Fizyolojik: %0.0897’lik NaCl çözeltisi hazırlanır.

BSA Stok Çözeltisi: Serum fizyolojik içinde %0.2’lik 100 ml BSA çözeltisi hazırlanır.

Aşağıdaki tabloya göre tüpler hazırlanır. Deneydeki hata oranını azaltmak ve

tekrarlanabilirliği arttırmak için tüpler çift çalışılmalıdır. Serum fizyolojik çözeltisi şahit

olarak kullanılarak her bir tüpün 280 nm’deki absorbansı ölçülür, kaydedilir ve protein

konsantrasyonları 2–5 numaralı tüpler için hesaplanır. Bu konsantrasyon verileri

kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilir. Bilinmeyen örneğin absorbansı grafik üzerine

yerleştirilerek konsantrasyonu bulunur.

Tüp no BSA Stok

(mL)

Serum

Fizyolojik

(mL)

Absorbans

(280 nm)

Protein

Konsantrasyonu

(µg/mL)

1 0 3.0

2 0.5 2.5

3 1.0 2.0

4 1.5 1.5

5 2.0 1.0

6 Bilinmeyen örnek (3.0)




43

Lowry

Kompleks oluşturucu reaktif: Stok çözeltilerden taze olarak hazırlanmalıdır. 50 mL

%2’lik Na2CO3 (Çözelti A), 10 mL %1’lik CuSO4·5H2O (Çözelti B) ve 10 mL %2’lik

KNaC4H4O6·4H2O (Çözelti C) stok çözeltileri hazırlanır. Bu çözeltiler A:B:C 100:1:1

oranında karıştırılarak hazırlanır.

Protein stok çözeltisi: Serum fizyolojik içerisinde 2 mg/mL BSA çözeltisi hazırlanır. Bu

çözelti protein stok çözeltisi olarak kullanılacaktır.

Folin reaktifi: 1N Fosfomolibdat ve fosfotungstik asit çözeltisi (Bu çözelti hazır halde

verilecektir.)

Aşağıdaki tabloya göre tüpler hazırlanır. Deneydeki hata oranını azaltmak ve

tekrarlanabilirliği arttırmak için tüpler çift çalışılmalıdır. 1 numaralı tüp şahit olarak

kullanılarak her bir tüpün 550 nm’deki absorbansı ölçülür, kaydedilir ve protein

konsantrasyonları 2-5 numaralı tüpler için hesaplanır. Bu konsantrasyon verileri

kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilir. Bilinmeyen örneğin absorbansı grafik üzerine

yerleştirilerek konsantrasyonu bulunur.

Tüp

No

Protein

Stok

Çöz.

(µL)

Serum

Fizyolojik

(µL)

%8’lik

NaOH

Çöz.(µL)

100°C

’de

10 d

k. in

kübe

edil

ir v

e oda

sıca

klı

ğın

a so

ğutu

lur

Komp.

Oluş.

Reakt.

(µL)

Kar

ıştı

rılı

r ve

10

dk. in

kübe

edil

ir

Folin

reaktifi

İyic

e kar

ıştı

rılı

r ve

30 d

k. İn

kübe

edil

ir Absorb.

(550

nm)

Protein

Kons.

(µg/mL)

1 0 500 500 1000 100

2 25 475 500 1000 100

3 50 450 500 1000 100

4 75 425 500 1000 100

5 100 400 500 1000 100

6 Bilinmeyen Örnek

(500) 500 1000 100




44

Bradford

Bradford reaktifi: Coomassie Brilliant Blue G-250 etanol içinde çözünerek hazırlanır.

(Bu çözelti hazır halde verilecektir.)

Protein stok çözeltisi: 2 mg/mL ovalbümin stok çözeltisi 0.1mg/mL olacak şekilde

seyreltilerek hazırlanır.

Tüp

No

Protein Stok Çöz.

(µL)

Destile

su (µL)

Bradford

Reaktifi (µL)

Kar

ıştı

rılı

r ve

10 d

k.

inkübe

edil

ir

Absorb.

(595

nm)

Protein Kons.

(µg/mL)

1 0 800 200

2 20 780 200

3 40 760 200

4 60 740 200

5 80 720 200

6 Örnek (2) 798 200


Bradford yöntemi kullanılarak, bir önceki denemede elde edilen tüm ekstraktların protein

konsantrasyonları tayin edilir ve µg/mL cinsinden aşağıdaki tabloya kaydedilir.

Karaciğer

%20 Tuz

Karaciğer

%80 Tuz

Yumurta

Sarısı

%50 Tuz

Yumurta

Akı

%50 Tuz

1. Grup

2. Grup

3. Grup

Yumurta Akı

Aseton

Yumurta

Sarısı Aseton

Karaciğer

Aseton

1. Grup

2. Grup

3. Grup

ÇALIŞMA SORULARI

1- Protein kimyasında Coomassie boyalarının kullanım alanları nelerdir?




45

DENEY VIII

PROTEİNLERİN ELEKTROFOREZ İLE AYRILMASI VE

MOLEKÜL AĞIRLIKLARININ TAYİNİ

Elektroforez, bir elektrik alan altındaki moleküllerin, bu alanda farklı hareket etmeleri

esasına dayanılarak yapılan bir ayırma yöntemidir. Bu elektrik alan altında pozitif yük

taşıyan proteinler katoda, negatif yük taşıyan proteinler anoda doğru göç ederler. Bu

göçün hızı çeşitli faktörlerden etkilenir;

a- Yükün büyüklüğü: Net yük arttıkça proteinlerin göç hızları da artar.

b- Molekül büyüklüğü: Proteinin büyüklüğü arttıkça göç hızı azalır. Burada

proteinin molekül ağırlığı olduğu kadar molekülün şekli de önemlidir.

c- Destek ortamının özelliği: Destek ortamındaki gözeneklerin boyutu küçüldükçe,

proteinin göç hızı azalır.

d- Elektrik alanın büyüklüğü: Voltaj arttıkça göç hızı da artar.

e- Tamponun iyonik gücü: Tamponun iyonik gücü azaldıkça göç hızı artar.

f- Sıcaklık: Sıcaklık arttıkça göç hızı artar.

Elektroforez günümüzde saflaştırılmış bir protein örneğinin saflığının kontrolünde, küçük

miktarlarda proteinin elde edilmesinde, bir örnekteki proteinlerin kalitatif ve kantitatif

analizlerinde kullanılmaktadır. Kâğıt elektroforezi, bölge elektroforezi, SDS-

Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), immüno elektroforez, DNA elektroforezi

gibi çok çeşitli elektroforez yöntemleri mevcuttur.

Günümüzde proteinlerin analitik tayinleri için en çok kullanılan yöntem poliakrilamid

jel elektroforezidir. Bu yöntemde destek maddesi olarak poliakrilamid polimerinden

yararlanılır. Poliakrilamid jel uzun polimer zincirleri oluşturan, aktive edilmiş akrilamid

moleküllerinin reaksiyonu ile oluşur. Çözeltide bu zincirler tek başlarına birleşemezler.

Jelin oluşumunda zincirlerin çapraz bağlanması için N,N′-metilenbisakrilamid

kullanılır.

Şekil 8.1- Poliakrilamid polimeri




46

Bu elektroforez yöntemi de çeşitli alt gruplara ayrılır. PAGE’de yatay, dikey kasetler ve

dikey diskler kullanılabilir. Kasetler farklı boyutlarda olabilir. Kaset boyutu

büyüdüğünde yapılan ayırmanın çözünürlüğü ve gücü artar ancak işlem süresi uzar ve

jelin çalışılması zorlaşır.

a- Doğal şartlarda PAGE: Ayırma analizlenen proteinin yük ve boyutuna göre

yapılır. Genellikle alkali (pH 8–9) tampon sistemleri kullanılır. Proteinler

denatüre olmadan yürütüldükleri için elektroforez sonunda proteinler

aktivitelerini kaybetmezler ve geri kazanılabilirler. Ancak bu sistem sadece

çözünür proteinler ve elektroforez sırasında agregat oluşturmayan proteinler için

kullanılabilir.

b- Denatüre edici şartlar altında SDS-PAGE: SDS anyonik bir deterjandır. Negatif

yüklü SDS molekülleri protein molekülünü kaplar ve proteinlerin net yükünü

maskeler. Tüm proteinler negatif yükle kaplanmış olduklarından ayırma yüke

göre değil sadece molekül boyutuna bağlıdır.

SDS-PAGE’e uygulanacak olan örnekler,

merkaptoetanol, SDS, bromfenol mavisi ve gliserol

içeren tamponla muamele edilirler. Merkaptoetanol

proteinin tersiyer yapısını bir arada tutan disülfit

bağlarını indirger. SDS proteini denatüre ederek doğal

yapısını bozar ve molekülü eksi yüklü bir kılıfla

kaplar. Farklı konsantrasyonlarda (%7.5, %10, %12.5

akrilamid/bisakrilamid konsantrasyonu içeren) jeller

kullanılarak elektroforez gerçekleştirilebilir. Düşük

konsantrasyonlu jeller büyük molekül ağırlıklı

proteinlerin, yüksek konsantrasyonlu jeller ise küçük

molekül ağırlıklı proteinleri ayırmak için kullanılır.

c- İki boyutlu PAGE: İki boyutlu poliakrilamid jel

elektroforezinde proteinler izoelektrik odaklama (IEF)

ve SDS-PAGE yöntemleri kullanılarak ayrılırlar. Bu

yöntemlerin her biri jel başına 100 bileşeni ayırma

gücüne sahipken, birleştiklerinde yaklaşık 10000

bileşenin ayrılmasını sağlarlar. IEF yönteminde pH

gradyanı oluşturan çeşitli amfolitler kullanılarak

proteinler önce izoelektrik noktalarına göre ayrılır.

Daha sonra aynı proteinler SDS-PAGE yöntemi

kullanılarak molekül büyüklüklerine göre ayrılırlar.

Şekil 8.2- SDS ile proteinlerin negatif yüklenmesi

Şekil 8.3- İki boyutlu jel elektroforezi




47

Şekilde iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi sonucunda elde edilen bir jel

gösterilmektedir. Buradaki her bir nokta bir protein veya polipeptide karşılık gelir.

KİMYASALLAR

Amonyumperoksodisülfat, akrilamid, bisakrilamid, tris, TEMED, SDS, glisin, HCl, β-

merkaptoetanol, bromfenol mavisi, metanol, asetik asit, Coomassie G250, fosforik asit,

amonyum sülfat.

YÖNTEM

Çözeltilerin hazırlanması:

Amonyumperoksodisülfat (APS): %10 (w/v) oranında taze olarak hazırlanır.

Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi: 29.2 g akrilamid ve 0.9 g bisakrilamid destile su içinde

çözülerek hacmi 100 mL’ye tamamlanır ve +4oC’de saklanır.

1.5 M Tris-HCl çözeltisi (pH 8.8): 18.15 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda

çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 8.8’e ayarlanır ve son hacmi 100 mL’ye

tamamlanarak +4 oC’de saklanır.

1 M Tris-HCl çözeltisi (pH 6.8): 12.11 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda

çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 6.8’e ayarlanır ve son hacmi 100 mL’ye

tamamlanarak +4 oC’de saklanır.

SDS çözeltisi: %10 (w/v) oranında taze olarak hazırlanır.

PAGE Tamponu: 3 g Tris baz, 15 g Glisin ve 1 g SDS bir miktar destile suda çözüldükten

sonra 1 L’ye hacmi tamamlanır (her elektroforez işleminde taze hazırlanır).

Şekil 8.4- İki boyutlu elektroforez ile elde edilmiş jel görüntüsü




48

SDS-PAGE jel kasetinin hazırlanması: İçinde jelin polimerize olacağı kuru ve temiz

cam levhalar aralarına plastik ayırıcı konularak üst üste konulur. Kıskaçlar takılarak

döküm standına yerleştirilir.

Poliakrilamid jelin hazırlanması: Aşağıdaki tabloya göre jel çözeltisi hazırlanır.

65 mL %12.5’lik Alt Jel Kompozisyonu

Akrilamid/Bisakrilamid 26 mL

Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 16.25 mL

SDS %10 (w/v) 650 µL

Destile su 21,64 mL

APS %10 (w/v) 350 µL

TEMED 70 µL

20 mL %4.5’lik Üst Jel Kompozisyonu

Akrilamid/Bisakrilamid 3 mL

Tris-HCl 1 M pH 6.8 2.5 mL

SDS %10 (w/v) 200 µL

Destile su 15 mL

APS %10 (w/v) 70 µL

TEMED 20 µL

Şekil 8.5- Jel kasetlerinin hazırlanması




49

TEMED ve APS çözeltileri polimerleşmeyi başlatacak olan çözeltiler oldukları için

jel çözeltisinin kasete dökülmesinden hemen önce ilave edilir. Hazırlanan alt jel

çözeltisi iyice karıştırılır ve jel kasetlerinin içine kasetin 4/5’i dolacak şekilde dikkatle

dökülür. Üzerine bir miktar n-butanol çözeltisi ilave edilir ve polimerleşmenin

tamamlanması beklenir.

Polimerleşme tamamlandıktan sonra n-butanol çözeltisi kasetin içinden alınır.

Hazırlanan üst jel çözeltisine TEMED ve APS ilave edilerek iyice karıştırılır ve jel

kasedine dökülür. Döküldükten hemen sonra örneklerin tatbik edileceği kuyuların

oluşması için tarak yerleştirilir ve polimerleşme tamamlanıncaya kadar beklenir.

Polimerleşme tamamlandıktan sonra tarak kuyuların bozulmamasına dikkat edilerek

çıkartılır.

PAGE Yükleme Tamponu

1 M Tris-HCl (pH 6.8) 1.0 mL

Gliserin 1.6 mL

%10 SDS (w/v) 0.2 mL

β-merkaptoetanol 0.4 mL

Destile su 8.0 mL

Bromfenol mavisi Eser miktarda

Şekil 8.6- Jellere tarağın yerleştirilmesi




50

Örneklerin yüklenmesi: Protein örneklerinin

konsantrasyonları 3 µg/µL olacak şekilde hesaplanır

ve gerekli seyreltmeler PAGE yükleme tamponu ile

yapılır. Örneklerden 100 µL alınarak ependorf

tüplere konularak 1 dakika 100°C’lık su

banyosunda ısıtılarak denatüre edilirler. Soğutulduktan sonra bir otomatik pipet yardımıyla

her kuyuya aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi 10 µL

(kuyu başına 30 µg protein düşecek şekilde) protein

tatbik edilir.

Kuyu

Numarası Yüklenen Protein

1 Karaciğer %20 Tuz

2 Karaciğer %80 Tuz

3 Yumurta Akı %50 Tuz

4 Yumurta Sarısı %50 Tuz

5 Protein Standardı

6 Karaciğer Aseton Grup 1



9 Yumurta Akı Aseton Grup 1



12 Protein Standardı

13 Yumurta Sarısı Aseton Grup 1



Şekil 8.7- Örneklerin yüklenmesi

Şekil 8.8- Jel üzerindeki kuyuların yerleşimi




51

Standart Protein Molekül Ağırlığı (kDa)

Sığır Albumin 66

Yumurta Albumin 45

Gliseraldehit-3-p-Dehidrojenaz 36

Sığır Karbonik Anhidraz 29

Tripsinojen 24

Tripsin İnhibitör 20

α-Laktalbumin 14.2

Jellerin Elektroforez Cihazına Yerleştirilmeleri: Protein tatbik edilen kuyuların üzeri

SDS-PAGE yürütme tamponu ile doldurulur ve kaset aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi

merkezi soğutma aparatına yerleştirilir. Elektroforez sırasında bu aparatın içinden geçen

su jelin fazla ısınmasını önleyerek yürümenin düzgün olmasını sağlar ve jeller için destek

görevi görür. Ayrıca jel kasetleri soğutucu aparata yerleştirildiklerinde üst tampon

haznesini oluşturur.

Merkezi soğutma aparatı tampon haznesine yerleştirilir.

PAGE Yürütme Tamponu (1.5 L için)

Tris-Baz 4.5 g

Glisin 22.5 g

%10 SDS (w/v) 1,5 mL

Taze olarak hazırlanmış 1500 mL SDS-PAGE yürütme tamponu, öncelikle üst tampon

haznesi dolacak şekilde ve platin elektrotların ıslanmamasına dikkat edilerek tampon

haznesine doldurulur. Üst tampon haznesi dolduktan sonra PAGE yürütme tamponun

kalan kısmı tampon haznesinin altında jeller ile temas edecek seviyeye kadar yükselir ve

alt tampon haznesini oluşturur. Platin elektrotların kuruluğu kontrol edildikten sonra

doğru kutupların üst üste gelmesine dikkat edilerek güç kablolarını taşıyan kapak

kapatılır. (Kapaktaki + ucun ( kırmızı) soğutma aparatındaki + uca (kırmızı) ve – ucun

(siyah) soğutma aparatındaki – uca (siyah) denk gelmesine dikkat edilir).

Şekil 8.9- Jel kasetlerinin tampon haznesine yerleştirilmesi.




52

Jellerin yürütülmesi: Soğutma aparatının su bağlantıları takılır ve elektroforez sistemi

bir güç kaynağına bağlanır. Jel başına önce 20 mA, daha sonra 30 mA verilecek şekilde

güç kaynağı ayarlanır ve elektroforez işlemine başlanır. Bu işlemin süresi ortam

sıcaklığına, jelin konsantrasyonuna ve boyutuna bağlıdır. Bizim deneyi

gerçekleştirdiğimiz şartlarda jelin tam olarak yürümesi yaklaşık 5 saat sürer.

Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel kasedi soğutma aparatından ayrılır, plastik

ayırıcılar çıkarılır ve cam levhalar açılarak jel içinde 500 mL fiksasyon çözeltisi bulunan

bir kaba alınır. Bu aşamada jelin kırılmaması ve parçalanmaması için çok dikkatli

olunmalıdır.

Jellerin boyanması:

Jel

Fiksasyon

Çözeltisi

%50 (v/v) Metanol

%10 (v/v)Asetik asit

250 mL metanol ve 50 mL asetik asit çözeltisi 500 mL’lik

bir balon jojeye konulur ve destile su ile hacim

tamamlanır.

Boya

Çözeltisi

% 0.065 (w/v)

Coomassie G250

%34 (v/v) Metanol

3% (v/v) fosforik asit

%17 (w/v)Amonyum

sülfat

A: 55 g Amonyum sülfat /220 mL destile su.

B: 0.2 g Coomassie G250/110 mL metanol + 10 mL

fosforik asit.

Boya çözeltisi, boyamadan hemen önce, karıştırılmakta

olan B çözeltisi üzerine A çözeltisi ilave edilerek

hazırlanır.

Boya

Çıkarma

Çözeltisi

%10 (v/v) Asetik Asit 100 mL asetik asit çözeltisi 1 L’lik balon jojeye alınır ve

destile su ile hacim tamamlanır.

Jel önce fiksasyon çözeltisi içinde bir gece boyunca bekletilir. Burada amaç proteinlerin

jele sabitlenerek boyama sırasında protein kayıplarının önlenmesi ve iyi bir boyamanın

sağlanmasıdır.

Fiksasyon çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra jellere boya çözeltisi ilave edilir ve 2 gün

boyunca (veya spotların görünür hale gelinceye dek) jellerin boyanması sağlanır. Bu

aşamada bir orbital çalkalayıcı kullanılarak jellerin hafifçe çalkalanması sağlanır.

Şekil 8.10- Elektroforezde kullanılan güç kaynağı ve elektroforez aparatı




53

Böylece boya çözeltisi jeldeki protein molekülleri ile bağlanır. Ancak boya jelin protein

olmayan kısımlarına da bağlanır (spesifik olmayan bağlanma).

Boya çözeltisinden çıkarılan jeller ayrı bir kaba konulurlar ve boya çıkarma çözeltisi ile

muamele edilirler. Boya çıkarma çözeltisi jel üzerindeki spesifik olarak bağlanmamış

Coomassie boyasını uzaklaştırılarak arka planın renginin koyu maviden, açık maviye

(veya şeffafa) doğru değişmesini sağlar ve protein bantlarının daha net bir şekilde

görülmesini sağlar.

Boyamaları tamamlanmış olan jellerin görüntüleri alınır ve daha sonraki işlemlerde

kullanılmak üzere saklanırlar.


5 ve 12 numaralı kuyulara tatbik edilmiş

olan protein standardı örneklerine ait

protein bandlarının her biri için Rf

değerleri hesaplanır. Rf değerleri x

eksenine ve molekül ağırlıklarının ln

değeri y eksenine gelecek şekilde bir

kalibrasyon grafiği çizilir. Bu grafikten

yararlanılarak diğer protein örneklerindeki

belirgin protein bantlarının hangi molekül

ağırlığına karşı geldiği hesaplanır.

ÇALIŞMA SORULARI

1- Proteomik (proteomics) nedir? Araştırınız.

Şekil 8.11- Boyama işlemi sonucu elde edilen jel görüntüsü

Şekil 8.12- Proteinlerin molekül ağırlığının bulunması




54

DENEY IX

PROTEİNLERİN N- TERMİNAL AMİNOASİTLERİNİN İNCE

TABAKA KROMATOGRAFİSİ İLE BELİRLENMESİ

Proteinlerin fonksiyonları amino asit dizilimlerine bağlıdır. Çünkü bir proteinin

aminoasit dizilimi (sekuansı) o proteinin hangi kimyasal özelliklere sahip olacağını ve 3

boyutlu yapısının nasıl olacağını belirler. Bu sebeplerden dolayı proteinlerin

tanımlanmasında dizi analizlerinin yapılması gerekir. Dizi analizleri farklı yöntemlerle

gerçekleştirilebilir. Bu yöntemlerden biri Edman degradasyonudur. Aşağıda bir dizi

analizi şematik olarak gösterilmiştir.

Şekil 9.1- Proteinlerin dizi analizi




55

Genel olarak bir dizi analizi çalışmasında şu basamaklar uygulanır.

1- Protein birden fazla alt birim içeriyorsa önce

alt birimlere ayrılır. Protein ve alt birimler

saflaştırılır.

2- Proteinde bulunan peptid içi (intra) ve

peptidler arası (inter) disülfit bağları 2-

merkaptoetanol, ditiyotreitol (DTT) gibi bir

ajanla indirgenir ve ortaya çıkan serbest –SH

gruplarının sonraki basamaktaki asit

hidrolizinde oksitlenmelerini engellemek için

sisteinler iyodoasetat ile S-karboksimetil-

sistein’e dönüştürülür.

Bu aşamadan sonra örnek birkaç kısma ayrılır ve

devam eden işlemler ayrı ayrı bu protein kısımlarına

uygulanırlar.

3- Protein 6N HCl ile sıcakta muamele edilerek

amino asitlerine ayrılır ve kromatografik

yöntemlerle her bir amino asitten ne miktarda

içerdiği bulunur, yani toplam amino asit

bileşimi tayin edilir.

4- Karboksil ve amino terminal analizleri

gerçekleştirilir.

5- Proteaz enzimleri kullanılarak protein belirli

bölgelerden kırılır ve Edman degradasyonu

uygulanarak her bir parçanın amino asit

dizilimi bulunur. (Edman yöntemi sadece 50-

60 aminoasitten oluşan parçaların tayinine izin

verir, daha uzun proteinlerde hata oranı

artmaya başlar)

6- Bu parçaların dizilimi, amino asit bileşimi, N-

ve C- terminal analiz bilgileri bir araya

getirilerek proteinin amino asit dizilimi

bulunur.

Şekil 9.2- Sığır insülin proteinin amino asit dizilimi




56

Yukarıda anlatıldığı gibi proteinlerin parçalara ayrılmaları için proteaz adı verilen

enzimler kullanılır. Bazı proteazlar peptid bağını sadece belli bir amino asitten sonra

(veya önce) ve bu sayede tahmin edilebilir bir şekilde kırarlar.

Proteaz veya Kimyasal Ajan Kırılan Peptid Bağı

Tripsin Lizin, Arjinin (C)

Kimotripsin Fenilalanin, Triptofan, Tirozin (C)

Pepsin Fenilalanin, Triptofan, Tirozin (N)

Termolizin Fenilalanin, Triptofan, Tirozin (C)

Submaxillarus proteaz Arjinin (C)

Endoproteinaz Lys C Lizin (C)

Siyonejen Bromür Metiyonin (C)

Karboksipeptidaz A C Terminal Aminoasit (N)

(C): C- Terminalinden kırma yapar.

(N): N- Terminalinden kırma yapar.

Şekil 9.3- Disülfit bağının indirgenmesi ve oksidasyonu




57

Örneğin; glisinilfenilalaninilalanin tripeptidi

kimotripsin ile muamele edilirse glisinilfenilalanin

ve alanin elde edilir. Eğer pepsin ile muamele

edilirse glisin ve fenilalaninilalanin elde edilir.

Proteinin C- terminalinin bulunması için, protein

karboksipeptidaz A ile muamele edilir ve kopan

amino asit kalıntısı tayin edilir. Ancak enzim

sürekli olarak C-terminalindeki amino asitleri

koparmaya devam edeceğinden reaksiyonun

istenilen basamakta kesilmesi önemlidir.

Proteinin N- terminal analizi için Sanger yöntemi kullanılır. Bu yöntemde 2,4-

dinitroflorobenzen reaktifi kullanılarak proteinin N-terminal ucundaki amino asit 2,4-

dinitrofenil türevine dönüştürülür. Daha sonra asit hidrolizi ile protein amino asitlerine

ayrılır ve bir amino asit karışımı oluşur. Bu karışımdaki N-terminal amino asidinin 2,4-

dinitrofenil türevi kromatografik yöntemler kullanılarak tanımlanır. Ancak protein

tamamen amino asitlerine parçalandığından dizi analizinde kullanılamaz.

Proteinlerin amino asit dizi analizlerinin tayini için Edman yöntemi kullanılır. Bu

yöntemde N- terminal amino asidi fenilizotiyosiyanat ile reaksiyona sokulur. Bu amino

asit feniltiyohidantoin oluşturarak peptid zincirinden ayrılır ve kromatografik yöntemlerle

tayin edilir. Her seferinde sadece N- terminalindeki amino asit ayrıldığı ve zincirin geri

kalan kısmı korunduğu için bu işlem tekrar tekrar yapılarak zincirdeki bütün amino asitler

tanımlanabilir. Edman yöntemi tamamen otomatik cihazlar yardımıyla

gerçekleştirilebilir. Ancak her bir döngüde bazı yan ürünler açığa çıktığından 50-60

amino asit sonrasında tayinde hatalar artar. Bu nedenle proteinlerin daha önceden

proteazlarla parçalanması gerekir.

Şekil 9.5- Karboksipeptidaz A enziminin mekanizması

Şekil 9.4- Glisinilfenilalaninilalanin tripeptidi




58

Günümüzde elektroforez ile saflaştırılmış proteinlerin amino asit diziliminin

bulunmasında MALDI-TOF yöntemi ve protein veri bankaları kullanılmaktadır. Bu

yöntemde proteinler tripsin kullanılarak parçalara ayrılır ve kütle spektrofotometreleri ile

her bir parçanın kütle analiz şablonları çıkarılır. Bu şablonlar internet üzerindeki veri

tabanlarındaki proteinlere ait şablonlar ile karşılaştırılarak bilinmeyen proteinin ne

olduğu ve dolayısıyla amino asit dizilimi bulunabilir. Ancak bu yöntem dolaylı bir analiz

yöntemidir, daha önceden yapısı aydınlatılmamış bir proteinin amino asit diziliminin

bulunması için kullanılamaz.

Saflaştırılmış ve amino asit dizilimi belirlenmiş olan polipeptidin 3 boyutlu yapısı x-

ışınları kristalografisi ve NMR teknikleri kullanılarak aydınlatılır. Böylece protein

saflaştırılması ve karakterizasyonu tamamlanmış olur.

Şekil 9.6- Edman ve Sanger yöntemi




59

KİMYASALLAR

Aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, sistein, sistin, glisin, Na2CO3, 2,4-

dinitroflorobenzen, HCl, kloroform, benzil alkol, glasiyel asetik asit.

YÖNTEM

50 mL’lik bir erlen içinde 20 mg amino asit %5’lik 10 mL Na2CO3 çözeltisinde çözülür.

Üzerine 0.5 mL 2,4-dinitroflorobenzen (DNFB) ilave edilir. DNFB bazı insanlarda

alerjik reaksiyonlara sebep olabileceğinden çalışma sırasında eldiven takılmalı ve

dikkatli olunmalıdır. Karışım 40°C sıcaklıkta 30 dakika devamlı karıştırılarak tutulur.

Sıcaklığın 40 °C’nin üzerine çıkmamasına dikkat edilir. Isıtma sonunda çözeltinin rengi

turuncuya döner. Reaksiyona girmemiş olan DNFB bir pipet yardımıyla uzaklaştırılır.

Daha sonra 1.5 mL derişik HCl dikkatle ilave edilir. Türev bu aşamada çöker. Eğer

çökelme olmazsa erlen buz banyosunda soğumaya bırakılır. Çökelti bir test tüpüne

alınarak az miktarda aseton içinde çözülür.

Mobil faz olarak (kloroform: benzil alkol: glasiyel asetik asit) ; (45:20:1) karışımı

kullanılır. Mobil faz 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde kromatografi tankına konulur.

Bir TLC (thin layer chromatography; ince tabaka kromatografisi) plakasına kurşun

kalemle plakayı zedelememeye dikkat ederek alttan 3 cm yükseklikte bir çizgi çekilir. 2

cm aralıkla bu çizgi üzerinde tatbik noktaları işaretlenir. Hazırlanmış olan amino asit

türevleri bu noktalara tatbik edilir. Bütün örnekler tatbik edildikten sonra TLC plakasının

kuruması beklenir ve kromatografi tankına yerleştirilir. Mobil fazın plaka üzerinde üstten

2 cm kalıncaya kadar yürümesi beklenir. Plaka tanktan çıkarılır, mobil fazın yürüme

sınırı kurşun kalem ile işaretlenir. Çeker ocakta kurutulur. Her bir aminoasidin ve

türevinin Rf değerleri hesaplanır.

ÇALIŞMA SORULARI

1- Proteinlerin 3 boyutlu yapı aydınlatılması nasıl yapılır? Araştırınız.




60

DENEY X

MEMELİ DOKULARINDAN DNA İZOLASYONU VE

BAZI ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ

DNA ve RNA nükleik asitler olarak adlandırılırlar ve nesilden nesile kalıtımsal bilginin

aktarılmasını sağlayan uzun zincirli polimerlerdir. Bu makromoleküllerin yapı taşları

nükleotidlerdir. Her nükleotid bir şeker, bir fosfat ve bir bazdan oluşur.

Nükleik asitler nükleotidlerin 3′, 5′-fosfodiester köprüleri ile bir araya gelmesinden

oluşmuştur. Bu zincirlerde fosfodiester köprüleri ile bağlanmış şeker molekülleri nükleik

asitlerin iskeletini oluşturur.

Şekil 10.1- DNA ve RNA yapısında yer alan azotlu bazların yapıları

Şekil 10.2- Deaoksinükleotid yapısı




61

Şekil 10.3- Nükleik asit yapısı

Şekil 10.4- DNA yapısında yer alan baz çiftleri




62

DNA ikili sarmalında adenin-timin (A-T) ve guanin-sitozin (G-C) bağları kurulur. DNA

ikili sarmalını bir arada tutan kuvvetler, nükleotid zincirleri arasındaki A-T ve G-C

çiftleri arasındaki hidrojen köprüleri (yatay interaksiyon) ve nükleotid zincirleri

üzerindeki bazlar arasındaki etkileşimlerdir (dikey interaksiyon).

Protein molekülünde olduğu gibi DNA

molekülünün yapısındaki herhangi bir

bozulmaya da denatürasyon denir. DNA

denatürasyonu yatay ve dikey çekici güçlerden

herhangi birindeki azalma veya kopma sonucu

olur. Yatay güçlerdeki azalma ya da kopma

sonucu olan denatürasyon DNA’nın 260

nm’deki absorbansının artması ile

belirlenebilir. Dikey güçlerdeki azalma ya da

kopma sonucu olan denatürasyon

(hipokromisite) tek başına 260 nm’de

absorbans değişikliğine sebep olmaz. Ancak

DNA’nın 210 nm civarındaki 2. pikinin

absorbansında azalma hatta tamamen yok olma

ve pikin dalga boyunun daha yüksek dalga

boylarına kayması meydana gelir.

DNA sarmalını oluşturan zincirlerin birindeki veya her ikisindeki bazlardan bir veya bir

kaçının kopması sonucu nükleotid zincirde kısalma meydana geliyorsa bu olaya

DNA’nın degradasyonu denir. Degradasyon gerçekleştiğinde 260 nm’deki absorbansta

azalma meydana gelir.

42°C’ın üzerindeki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı

arasındaki hidrojen köprüleri öncelikle A-T zengin

bölgelerde olmak üzere gevşeyip açılmaya başlar.

Kullanılan tampon çözeltiye bağlı olarak 56-80°C

arasındaki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı kendisini

oluşturan nükleotid zincirlerine ayrılır. Buna DNA’nın

erimesi denir. DNA heliksinin %50’sinin denatüre

olduğu sıcaklığa DNA’nın erime sıcaklığı (Tm) adı

verilir. Tm değeri o DNA’nın A-T/G-C oranına bağlı

olduğundan, DNA’nın tanımlanmasını sağlayan

spesifik bir değerdir (yani bir fareden alınan DNA’nın

Tm değeri, bir insandan alınan DNA’nın Tm değerinden

farklı olacaktır veya aynı bakterinin iki farklı suşunun

DNA’larının Tm değerleri farklı olacaktır). Ayrıca Tm

değeri kullanılan tampon çözeltinin iyonik şiddetine ve pH’sına da bağlıdır. Bu nedenle

Tm değeri verilirken mutlaka deneyin hangi, şartlarda yapıldığı da belirtilmelidir.

Şekil 10.5- DNA çift sarmal yapısı

Şekil 10.6- DNA‘nın erimesi




63

DNA erimesi sıcaklık 90-100 °C’nin üzerine çıkılmadığı sürece geri dönüşümlüdür. Eğer

80°C’ye ısıtılmış bir DNA çözeltisi, oda sıcaklığında yavaş yavaş soğumaya bırakılırsa

iki sarmal tekrar birleşerek DNA ikili sarmalını oluştururlar (hibridizasyon). Ancak aynı

DNA oda sıcaklığında değil de bir buz banyosunda ani soğutmaya bırakılacak olursa

DNA sarmalarında hibridizasyon gerçekleşmez ve nükleotid zincirleri birleşmezler.

Ayrıca DNA boyunda kısalmalar, yani DNA degradasyonu meydana gelebilir. Eğer

degradasyon meydana gelmediyse bu çözeltiler yeniden ısıtılıp yavaş yavaş soğumaya

bırakılırlarsa DNA ikili sarmalını yeniden oluşturabilirler.

Yukarıda anlatıldığı gibi nükleik asitler 260 nm dalga boyunda absorbans piki verirler.

Bu absorbans değeri kullanılarak nükleik asidin konsantrasyonu tayin edilebilir. 260 nm

dalga boyunda, 1 cm’lik kuartz küvetlerde 1’lik bir absorbans 50µg/mL DNA

konsantrasyonuna karşılık gelir. Tek zincirli DNA veya RNA içinse bu değer 40

µg/mL’dir.

Nükleik asitlerin saflığını tayin etmek için nükleik asit çözeltilerinin absorbanslarının

240-300 nm arasında ölçülmesi gerekir. Proteinler 280 nm’de pik verdiklerinden A260 nm/

A280 nm oranından yararlanılarak saflık tayini yapılabilir. DNA için bu oran 1.8, RNA

içinse 2.0 olmalıdır. Eğer bu verilen değerlerden daha düşük değerler elde ediliyorsa, bu

örneğin proteinlerle kontamine olduğunu gösterir. Kontaminasyon bir kimyasal karışım

içinde düşük miktarlarda (genellikle istenmeyen) başka maddelerin var olmasıdır.

Hücreler (hücre tiplerine göre farklılık göstermekle birlikte) büyük ölçüde su

içerdiklerinden, hücre organellerinin yapısal özellikleri su ile reaksiyonları sonucu ortaya

çıkar. Hücreler ve hücre organelleri yapısal özellik ve bütünlüklerini izotonik çözeltiler

içinde koruyabilirler. Hücrelerle aynı osmatik basınca sahip çözeltilere izotonik

çözeltiler denir. İzotonik çözeltilerde hücre ile etrafındaki çözelti arasındaki su alış verişi

dengededir. %0.876’lık NaCl (serum fizyolojik), %5 dekstroz (serumda kullanılır) gibi

çözeltiler yaygın olarak kullanılan izotonik çözeltilere örnek olarak verilebilirler.

Şekil 10.7- DNA’nın erimesine G-C içeriğinin etkisi




64

Her ne kadar hemen hemen tüm hücreler DNA içerseler de bazı dokularda bu miktar çok

az olduğundan bu tip dokular DNA izole etmek için iyi bir kaynak değildirler. Bazı

dokular ise yüksek deoksiribonükleaz aktivitesine sahip olduklarından DNA izolasyon

esnasında küçük parçalara ayrılır. Bu nedenle DNA elde etmek için yüksek DNA ve

düşük nükleaz aktivitesine sahip dokular tercih edilmelidir. Bu amaçla en iyi kaynaklar

timus ve lenf en iyi dokulardır. Dalak, testis ve yumurtalıklarda DNA elde etmek için

kullanılabilirler.

KİMYASALLAR

NaCl, EDTA, SDS, etanol.

YÖNTEM

Çözeltilerin hazırlanması:

Ekstraksiyon çözeltisi: 0.15 M NaCl ve 0.1 M EDTA çözeltisinden oluşur. 0,925 g

EDTA ve 2,19 g NaCl 250 mL destile su içinde çözülerek hazırlanır. Deneyde soğuk

olarak kullanılır.

2M NaCl çözeltisi: 11.7 g NaCl 100 mL destile suda çözülerek hazırlanır.

DNA’nın İzolasyonu:

DNA izolasyonunun yapılacağı dokudan yaklaşık 10 g alınır ve 100 mL ekstraksiyon

çözeltisi ilave edilir. Daha sonra kısa sürelerle ve DNA içeren çözeltinin ısınmamasına

dikkat edilerek homojenizatörde homojenize edilir. DNA’nın bozulmaması için bu

işlemler soğukta yapılmalı ve kullanılan çözeltiler önceden soğutulmuş olmalıdır. Homojenize hale getirilmiş olan çözeltiye 1 mL %10 SDS ilave edilir. Hafifçe alt üst

edilerek çözelti karıştırılır (SDS deterjan olduğundan köpürmemesine dikkat edilir). Daha

sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Üstteki çözelti (süpernatant) dikkatle alınır

ve temiz bir santrifüj tüpüne hacim 4 mL olacak şekilde aktarılır.

Süpernatant çözeltisine 8 mL soğuk 2M NaCl çözeltisi ilave edilir ve dikkatle karıştırılır.

Daha sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant yaklaşık 4 mL hacimde

olacak şekilde dikkatle temiz bir santrifüj tüpüne alınır.

Süpernatanta yaklaşık 8 mL soğuk etanol yavaş yavaş ilave edilir ve tüpteki değişim

gözlenir. Daha sonra 4000 rpm’de 1-2 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonunda üstteki

süpernatant dekante edilir ve beyaz renkli DNA presipitatı alınır. Etanol kalıntısını

uzaklaştırmak için 1-2 mL 0.1 M EDTA çözeltisi ile, karıştırılmadan kalıntılar yıkanır,

yıkama çözeltisi dekante edilerek uzaklaştırılır ve daha sonra yeterli miktarda

ekstraksiyon çözeltisinde çözülür. Çözünmeyen kısımlar santrifüj ile uzaklaştırılır. Elde

edilen DNA çözeltisi derin dondurucuda uzun süre saklanabilir.




65

DNA’nın Erimesi:

DNA çözeltisinin 260 nm ve 280 nm’deki absorbansları ölçülür ve konsantrasyonu ve

saflığı tayin edilir.

4 cam tüpe elde edilen DNA çözeltisinden yaklaşık 5’er mL alınır. Tüplerden bir tanesi

oda sıcaklığında bekletilirken diğer üçü 80°C sıcaklıktaki su banyosunda 10 dakika

bekletilir. Bu sürenin sonunda bir tüp oda sıcaklığında, bir tüp buz banyosunda ve bir tüp

de –80°C soğutucuda 5 dakika tutulur. Soğutulmuş olan tüplerin oda sıcaklığına gelmesi

beklenir ve 4 tüpün absorbans değerleri 260 nm’de ekstraksiyon çözeltisi kör olarak

kullanılarak ölçülür.

Tüp

No

Hacim

(mL)

Uygulanan

işlem

Uygulanan

işlem

Uygulanan

işlem

Absorbans

(260 nm)

Absorbans

(280 nm)

1 5

Oda

sıcaklığında

bekletilir.

Oda

sıcaklığında

bekletilir.

Oda

sıcaklığında

bekletilir.

2 5 80°C ısıtıtma

(10 dakika)

Oda

sıcaklığında

bekletilir.

Oda

sıcaklığında

bekletilir.

Ölçüm

yapılmaz


(10 dakika)

Buz

Banyosunda

Bekletilir (5

dakika)

Oda

sıcaklığında

bekletilir.


(10 dakika)

-80°C

soğutucuda

bekletilir (5

dakika)

Oda

sıcaklığında

bekletilir.

ÇALIŞMA SORULARI

1- Genomik (Genomics) nedir? Genomik çalışmalar niçin önemlidir?

2- Bilimsel araştırmalarda DNA izolasyonunda genellikle fenol ekstraksiyonu

kullanılır. Bu yöntemin nasıl yapıldığını ve prensibini araştırın.

Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümüdosya.marmara.edu.tr/fef/kmy/Anabilim...

Documents

Transcript of Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümüdosya.marmara.edu.tr/fef/kmy/Anabilim...