Transponierbare Elemente: Ty-Elemente in S. cerevisiae

Marlen BeerDatum: 15.01.2013

Modul 13/14 - Prof. Dr. König Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Mikrobiologisches Seminar im WS 2012/13

Definition transponierbarer Elemente

engl. transposable elements to transpose: versetzen, umsetzen

mobile genetische Elemente, die Fähigkeit zur Transposition besitzen

Transposition: Vorgang, bei dem eine DNA-Sequenz innerhalb des Wirtsgenoms

an eine andere Stelle versetzt (transponiert) wird → „Jumping Genes“

allgegenwärtig in Pro- und Eukaryoten → “Genom-Parasiten”

Bedeutung transponierbarer Elemente

erstmals beschrieben von Barbara McClintock (1916-1992) während ihrer Untersuchungen zur Genetik von Maispflanzen

→ Nobelpreis für Medizin (1983)

galten lange als funktionslos→ „Junk-DNA“

werden inzwischen als evolutionär notwendiger Bestandteil genomischer Flexibilität gesehen Vergrößerung des Genoms chromosomale Umstrukturierungen durch

Rekombination: Duplikationen, Insertionen, Inversionen, Deletionen, Translokationen

Einteilung transponierbarer Elemente

DNA-Sequenzen, die ohne RNA- Zwischenstufe ihren Lokus im Genom verändern können

Transpositions-Mechanismus:

konservativ „cut and paste“▪ werden direkt aus Donor-Stelle ausgeschnitten und an

einer anderen Stelle im Wirtsgenom wieder eingefügt

replikativ „copy and paste“▪ alte Sequenz bleibt an Donor-Stelle erhalten und Kopie

wird an einer anderen Stelle im Wirtsgenom eingefügt

DNA-Sequenzen, die mittels RNA-Zwischenstufe ihren Lokus im Genom verändern können

Transpositions-Mechanismus:

Retrotransposition

DNA-Transposons Retroelemente

Abb.1: Schematischer Mechanismus der konservativen bzw. replikativen TranspositionAbb.2: Schematischer Mechanismus der Retrotransposition

Retroelemente

Einteilung nach: Fähigkeit zur Retrotransposition aus eigener Kraft Vorhandensein von flankierenden, repititiven Sequenzen

Nicht-autonome Retroelemente

kodieren für keine Proteine und können sich nur mit Hilfe jener der autonomen Elemente bewegen

Autonome Retroelemente

kodieren selbst für die Proteine, die für ihre Mobilität verantwortlich sind

LTR-freie-Retroelemente

Long Terminal Repeat (LTR)-Retroelemente

Retroviren

• mit funktionsfähigem env-Gen für Proteinhülle

Retrotranspositions-Mechanismus

• Transkription des integrierten DNA-Elements in mRNA

• Translation der Transkripte: Synthese der Enzyme, die für Transposition notwendig sind

• Reverse Transkription der mRNA zurück in DNA durch Reverse Transkriptase

• Integration der kopierten cDNA-Moleküle an beliebigen neuen Stellen ins Wirtsgnom Abb.3: Transkriptionszyklus eines Retrotransposons

Genomweite Untersuchung von Organisation und Vielfalt der Ty-Elemente von S. cerevisiae

engl. Ty = transposons in yeast

Hefe Saccharomyces cerevisiae

wichtiger Modellorganismus zur Erforschung der Biologie von LTR-Retrotransposons

→ gesamte Nukleotid-Sequenz verfügbar

• Auswertung organisatorischer und evolutionärer Tendenzen von Ty-Insertionen auf genomischer Ebene

Klassifikation von Ty-Elementen

Ty3/gypsy-Superfamilie

Organisation der pol-Gene: Integrase liegt hinter Reverser Transkriptase

Vertreter: Ty3-Elemente

Ty1/copia-Superfamilie

Organisation der pol-Gene: Integrase liegt vor Reverser Transkriptase

Vertreter : Ty1-, Ty2-, Ty4- und Ty5-Elemente

Abb.4: Schematische Darstellung des grundlegenden Aufbaus von Elementen der Ty1/copia- bzw. Ty3/gypsy-Familie

Struktur von Ty-Elementen

Ty1-, Ty2, Ty3- und Ty4-Elemente• Proteine der ORFs werden über Frameshift-Mechanismus exprimiert

→ Bildung 2er Protein, die weiterer Reifung unterliegenTy5-Elemente

• benutzen keinen Frameshift-Mechanismus→ durchgehenden langer ORF für Gag-Pol

funktionsfähige, mobile Ty-Elemente benötigen 2 terminale LTRs

ORF(s) der internen Region kodieren für: gag-Strukturprotein: 'gruppen-spezifisches

Antigen‘ pol-Polyprotein mit funktionellen Domänen für:

Reverse Transkriptase: Retrotranskription (RT) Ribonuklease H (RH) Protease: Prozessierung des Polyproteins (PR) Integrase: Einlagerung der DNA-Kopien ins Genom (IN)

Abb.5: Struktur von Ty1-, Ty2-, Ty3-, Ty4- und Ty5-Elementen

Identifikation von Ty-Elementen

Methode:Screening der Genomsequenz mit Ty1- bis Ty5-LTR-Eingabesequenzen

Ergebnis:331 identifizierte Ty-Insertionen• 15% komplette Elemente• 85% LTR-Fragmente oder solo-LTR

Tab.1: Chromosomale Verteilung von Ty-Elementen

Phylogenetische Analyse aller vollständigern Ty1- und Ty2-LTRs

Methode:Alignment aller vollständigen Ty1- und Ty2-LTRs und Konstruktion eines neighbor-joining Baumes

interamiliäre Verwandschaftsbeziehungen: Ty2-Elemente ausschließlich in LTR-Sequenz-Cluster 3+4 Insertion bzw. Deletion eines einzelnen Basenpaares

unterscheidet fast identische Ty1- und Ty2-LTRs→ Ty2-Elemente können als Ty1-Subfamilie gesehen werden→ unabhängige Evolution

intrafamiliäre LTR-Sequenzdiversität: bei Ty1-, Ty2- und Ty5-Elementen hoch

→ bestehen seit langer Zeit bei Ty3- und Ty4-Elementen gering

→ relativ neu hinzugekommen

Abb.6: Neighbour-joining Baum vollständiger Ty1- und Ty2-LTRs

Analyse der kodierenden Sequenzen vollständiger Ty1- und Ty2-Elemente

POL stärker konserviert als GAG

Methode: Alignment der AS-Sequenzen von GAG und POL

Ty2-Elemente besitzen weniger invariante AS→ sind sich ähnlicher als Ty1-Elemente

Tab.2: AS-Sequenzidentität von Ty1- und Ty2-Elementen

intrafamiliäre AS-Sequenzunterschiede in GAG besonders bei Ty1-Elementen (73.9% invariante AS)

Identifikation einer Ty1-Subfamile (Ty18)

Methode:

Phylogenetische Analyse aller GAG-Nukleotidsequenzen von vollständigen Ty1-Elementen

Ergebnis:

3 Elemente größtenteils verantwortlich für Heterogenität

GAG-Sequenzen scheinen sich unabhängig entwickelt zu haben

nach Ausschluss bei Sequenzvergleichen stieg Anteil invarianter AS zwischen übrigen GAG-Sequenzen auf 94,1%

Abb.7: Neighbor-joining Baum der GAG-Nukleotidsequenzen von Ty1- und Ty2-Elementen

Chromosomales Verteilungsmuster von Ty-Elementen im Genom von S. cerevisiae

machen insg. >377 kb des 12.1 Mb Genoms aus = 3,1%

Anteil Ty-Elemente/Chr: 0.63% - 4.3%

Inserionsdichte/kb DNA variiert < 4-fach zwischen untersch. Chr

geringfügig höher für kleinere Chr→ zusätzliche Sequenzen stabilisieren

3 kleinsten Chr ~ 1 Insertion/25.2 kb DNA 3 größten Chr:~ 1 Insertion/39.4 kb DNA

einigen größeren Bereichen fehlen Ty-Insertionen komplett, z.B. 416-kb lange Region auf Chr XIV

Chromosomales Verteilungsmuster ist nicht zufällig…Abb.8: Chromosomales Verteilungsmuster von Ty-Elementen

Regionale Zielsequenzpräferenz von Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elementen• ausschlaggebender Faktor für chromosomales

Verteilungsmuster sind tRNA-Gene→ tRNA-Gen-gerichtete Integration

Methode:Bestimmung der Lage aller Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elemente relativ zu tRNA-Genen

Ergebnis:• 90.4% sind mit Klasse-III-Genen assoziiert, d.h.

integrieren bevorzugt im Bereich von 750 Basen in der Nachbarschaft von tRNA-Genen oder anderen Klasse-III-Genen, die durch RNA-Pol-III transkribiert werden

• 66% der tRNA-Gene sind im Umkreis von 750-Basen mit Ty-Insertionen assoziiert

• durchschnittlich 1.2 Insertion/tRNA-Gen (einige sind Integrations-Hotspots)

Tab.3: Chromosomale Organisation von Ty-Elementen

Regionale Zielsequenzpräferenz von Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elementen

Abb.8: Lage aller Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elemente relativ zu tRNA-Genen auf Chr III und V

Ty5-Elemente integrieren hingegen bevorzugt in der Nähe von Telomeren

Konsensus-Sequenzen der Zielorte von Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elementen

Target site duplications (TSD)

meist 5 bp lange gleichgerichtete Duplikationen der Zielsequenz an Flanken des Transposons

Entstehen durch versetzte Schnittstellen

nach Integration werden Einzelstränge durch Reparaturenzyme wieder aufgefüllt und ligiert

Methode:Bestimmung der Konsensus-Sequenzen der Zielorte von 118 Ty1–Ty4 LTRs, die flankiert waren von perfekten 5-bp TSD

Ergebnis:hinsichtlich der Integrationsstellen besteht starke Präferenz für A oder T in den mittleren 3 Positionen

Abb.9: Schematische Darstellung der Entstehung von TSD

Tab.4: TSD-Konsensus-Sequenz

Genomische Umstrukturierung durch Rekombination von Ty-Elementen – Bsp.1

Rekombination eineszirkulären solo-LTR-Ty1-Elements mit einem Ty-Element auf Chr X erzeugt Tandem-Ty1-Element

Abb.10: Beispiel eines Rekombinations-Ereignisses zwischen Ty1-Elementen

Genomische Umstrukturierung durch Rekombination von Ty-Elementen – Bsp.2

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

auf versch. Chr duplizierte, sub-telomerische Lage einiger Ty1-Insertionen (targeting exceptions) ist Ergebnis von Rearrangements im Anschluss an Integration

Abb.11: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Rekombinations-Ereignis:

• reziproker Austausch zwischen 2 Ty1-Elementen verschiedener Chromosomen führt zur Entstehung von 2 Ty1-Elementen mit unterschiedlichen 5’- und 3’-target site sequences

• Rekombination zwischen den LTRs führte zum Verlust der internal coding sequences

• Ergebnis: Ty1-solo-LTR-Insertion nahe des rechten Telomers von Chr IAbb.12: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-

Elemente auf Chr I und VIII

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Duplikations-Ereignis:

Duplikation der telomerischen Ty1-solo-LTR-Insertion auf dem rechten Arm von Chr I sowie der dieses flankierenden Sequenzen auf das linke Telomer von Chr I

Duplikation der telomerischen Ty1-solo-LTR-Insertion auf dem rechten Arm von Chr I sowie 25 kb der dieses flankierenden Sequenzen auf den rechten Arm von Chr VIII

Abb.13: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Transpositions-Ereignis:

Insertion eines unabhängigen Ty1-Elements auf Chr VIII (~12 kb telomere–proximal to the solo Ty1 LTR)

Ty1/Ty2 neighbor-joining Baum unterstützt hohen Verwandtschaftsgrad zwischen duplizierten solo-LTRs

Abb.15: Ausschnitt aus dem Ty1/Ty2 neighbor-joining Baum

Abb.14: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Ungewöhnliche Paare von Ty-Elementen

Insertion von 2 Ty-Elementen in gegenläufiger Orientierung mit geringem Abstand zueinander

Chr XVI hat größtes Potential für genetische Instabilität, da Elemente derselben Ty-Familie beteiligt

Abb.16: Inverted Ty Pairs

Abb.17: Compound Insertion auf Chr X

• Insertion eines Ty-Elements innerhalb eines anderen

Datensätze der Untersuchung von Ty-Elementen im Genom von S. cerevisiae

lassen erkennen, … welche Mechanismen Ty-Elemente entwickelt haben, um im Genom

bestehen zu können wie Ty-Elemente die Genom-Organisation beeinflussen können wie Transposition und Rekombination das Genom im Laufe der Zeit

umstrukturiert haben

dienen als Ausgangspunkt für vergleichende Analysen mit anderen Hefe-Stämmen, verwandten Arten und komplexeren Genomen, sodass Rückschlüsse auf die Biologie anderer eukaryotischer Retrotransposons gezogen werden können

Ergebnisse der Studie von Ty-Elementen im Genom von S. cerevisiae

verschiedene Ty-Elemente entstanden durch Baseninsertionen und –verluste

Ty-Elemente sind dynamisch: manche Familien vermehren sich, andere sterben aus

Beeinflussung der Genom-Organisation…

direkt, durch Mechanismen der zielgerichteten Integration▪ Verteilungsmuster bestimmt durch▪ Orte von Pol III-Transkription bzw. telomerischem Chromatin▪ AT-reichen chromosomalen Regionen

→ stumme, transkriptional inaktive Regionen typischerweise ohne kodierende Informationen

→ lethale Mutationen werden verhindert, sodass Ty-Elemente im Genom bestehen können

indirekt, durch Rekombination zwischen Ty-Elementen

Das war‘s…Danke für eure Aufmerksamkeit!

Quellenverzeichnis

http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/biotutor_2004/viren.htm http://gydb.org/index.php/Intro http://books.google.de/books?id=MUQthlDcj3EC&pg=PA138&lpg=PA138&dq=

%22mobile+genetische+elemente%22&source=bl&ots=5VzQCrm77p&sig=Y8ahCmCKIHFV-ksQadpqDsBCVC8&hl=de&sa=X&ei=-tnWUPatPIySswbFoYDYDg&ved=0CDQQ6AEwAA#v=onepage&q=%22mobile%20genetische%20elemente%22&f=false

http://sundoc.bibliothek.uni-halle.de/diss-online/07/07H062/t3.pdf http://www.public.iastate.edu/~voytas/ http://biochimica.unipr.it/yeast/tRNA.html; http://

www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/1168/1091608193375-2811.pdf

http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0960982201001683-gr1.jpg http://online-media.uni-marburg.de/biologie/genetik/boelker/VL-

Molekulargenetik/VL-Transposition3.pdf