Marijan TandaraAna Bajić, Martina Šunj

KLINIČKA VAŽNOST DNA FRAGMENTACIJE SPERMIJA

- naša iskustva

KBC Split

1860 Prisutnost spermija/pokretni spermiji

1929 Prvi objavljeni rad o analizi sjemena u NEJM (Macomber)

1940-tih Sjemeni parametri (MacLead and Gold)

1944 Sistematska analiza sjemena (Hotchkiss)

1980 Morfologija spermija (Kruger and Menkveld)

1986 Objektivni biokemijski markeri sazrijevanja spermija i potencijala plodnosti (Huszar Lab)

Povijesni pregled analize sjemena

1992. Palermo

Uvođenjem ICSI-a izazvao revoluciju u rješavanju muškog faktora neplodnosti !

Parametri reproduktivnog uspjeha

Jajna stanica

80%

Spermij 10%

Uterus 10%

Modificirano - Danny Sakkas

50%

50%

2000.Integritet kromatina spermija

Ispitivanje DNA fragmentacije ?

Varikocela (Saleh, 2003; Fischer, 2003; Zini, 2000)

Kemoterapija i radioterapija (Chatterjee, 2000; Deane, 2004;

Kobayashi, 2001)

Pušenje cigareta (Mak, 2000; Kunzle, 2003; Potts, 1999, Sun, 1993)

Leukocitospermija (de Laminrande, 1993; Zini, 1995, Twigg, 1998; Iwasaki,

1992;

Zini, 1993)

Povećana tjelesna težina (Kort 2006)

Testikularna hipertermija (Sailer J 1997,Banks Reproduction 2005)

Potencijalni uzroci DNA fragmentacije

Intratestikularno Posttestikularno

Etiologija oštećenja DNA spermija

Nedostatak protamina (nađen kod 5-15% neplodnih muškaraca) De Yebra et al, J Biol Chem 1993; Bianchi et al, Biol Reprod 1993; Kramer et al, Genet Test 1997, Cho, 2003

Poremećaj topoizomeraze II i tranzicijskih proteina Balhorn, J Cell Biol 1982; Kierzenbaum, Mol Reprod Dev 2001; Bissoneault, FEBS Lett 2002

Apoptoza Sakkas et al, Exp Cell Res 1999, Sakkas et al. Reprod Biomed Online 2003

Intratestikularno

Posttestikularno

PUŠENJE

ZAGAĐENJE

KARCINOM

VARIKOKELA

Produženo zadržavanje spermija

u epididimisu

LIJEKOVI

INFEKCIJA prostate sjemenih vezikula epididimisa

NEZRELI/ABNORMALNI SPERMIJI

NEPLODNOST

Oštećenjespermija

Aitken et al, Biol Reprod 1998;

Irvine et al, J Androl 2000

Lipidnaperoksidacija

DNAoštećenje

Apoptoza

Oksidativnistres

DIREKTNI TUNEL ( terminal deoxynucleotydil transferase-mediated deoxyuridin triphosphatenick-end labeling assay ) ( sdSB ) ISNT ( in situ-nick translation ) Comet Assay ( neutral pH – sdSB )

INDIREKTNI ( zahtjeva denaturaciju DNA ) SCSA ( sperm chromatin structure assay ) Comet Assay ( acidic oder basischem pH ) ( sdSB ) SCD ( sperm chromatin dispersion test )

Određivanje integriteta DNA spermija u ispitivanju muške neplodnosti

Parametri Normalni spermiogram Lošim spermiogramom

DFI (%)>30%

24%

DFI (%)<30%

29%

Tandara M. i sur. 2012

DFI%

Koncentracija Morfologija Pokretljivost Vitalnost

* Spearman´s Rho r=-0,18 r=-0,32 r=-0,41 r=-0,36

p value p=0,069 p=0,001 p<0,001 p<0,001

Tandara M. i sur.

Korelacija između DNA fragmentacije i sjemenih parametara

Reference PARAMETRI

koncentracija pokretljivost morfologija

Kodama i sur (1997) 0,49

Shen i sur (1999) 0,24 0,38 0,42

Irvine i sur (2000) 0,37 0,37 0,54

Chan i sur (2001) 0,38 0,38 0,66

Tomlinson i sur (2001) 0,24 0,20

Saleh i sur (2003) 0,31 0,04 0,47

Larson-Cook i sur (2003) 0,08 0,18 0,25

A. Agarwal i sur; Human Reprod 2003

Korelacija između DNA fragmentacije i sjemenih parametara

Variables Cijela grupa(n=206)

Groupa1 (n=108) DFI<30%

Groupa 2 (n=98) DFI30%

DFI (%) 28 (24-32) 25 (22-28) 34 (30-44)

Koncentracija(×106/ml)

27,1±14,3 28,2±12,3 25,7±16,6 p=0,374

Morfologija(%) 40,7±16,7 44,6±14,9 35,5±17,7 p=0,006

Pokretljivost(%) 28,7±18,0 35,2±17,0 20,0±15,7 p<0,0001

Vitalnost (%) 68,1±14,6 72,0±11,6 63,0±16,4(n=57)

p=0,002

Tandara M. i sur.

Deskriptivna statistika

?

??

?

?

?

?

?

Granična vrijednost DNA fragmentacije

DNA fragmentacijaGranična vrijednosti Trudnoće(%)

< 4% 22.7%> 4% 21.4%

< 15% 22.8%>15% 15.4%< 18% 23.2%>18% 10.0%< 20% 23.8%> 20% 0.0%

M. Benchaib i sur. Human Reprod 2003

Uspješnost trudnoće s obzirom na % DNA fragmentacije

Da li visoka razina oštećenja DNA spermija pogađa fertilizaciju i razvoj embrija?

DNA fragmentacija

Ebner et al.

DFI (%) Pearsonov koeficijent korelacije (r)

p vrijednost

ES (IVF/ICSI) - 0,3865 0,0199*

*statistički značajno p< 0,05

Tandara M i sur. 2012.

Korelacija kvalitete zametaka s DNA fragmentacijom

Tandara M i sur. 2012

2 pronukleusa

2 st embrio 4 st embrio 8 st embrio

blastocista

Integritet DNA spermija postaje

važan – ekspresija

genoma embria

….je preporučljiva

Za pacijente sa više od 3 uzastopna IVF neuspjeha U slučajevima kad je primijećen zastoj razvoja embrija U slučaju ponavljanih pobačaja U slučajevima neobjašnjene neplodnosti

Analiza DNA fragmentacije….

IMSI

PICSI

H V A L A !