Marçal Pastor-Anglada

BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS

FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES

Marçal Pastor-AngladaDEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y

BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA

CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICAPROTEÓMICA

10 de Febrero de 200510 de Febrero de 2005

•MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

•ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs)

•FARMACOLOGÍA DE LOS NTs

•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS

•ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

QUIMIOTERAPIA. MECANISMOS DE ACCIÓN

•Mayoritarimente análogos de nucleósidos. Antimetabolitos

•Interferencia en la síntesis de nucleótidos.

•Acción en fase S.

•Incorporación a DNA y RNA.

•Reparación---Radiosensibilización

•Integridad mitocondrial

•Arresto en ciclo o muerte por apoptosis.Adaptado de Pastor-Anglada et al., Trends

in Pharmacological Sciences 19:424.430, 1998

GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN

Fosforilada por la dCK y TK2

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

-P

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

-PP

dFdC

dFdCMP

Desfosforilada por la 5’-NT I

Detoxificación a dFdUMP y dFdU

dCDA

dCMPdA

dFdCDP

Quinasas

Quinasas

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

-PPPdFdCTP

GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

dFdC•Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA.

•Inhibición de la timidilato sintasa.

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

-P dFdCMP •Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA.

O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

-PP dFdCDP •Inhibición de la ribonucleótido reductasa.

dFdCTP O

H O

H O

F

H N

N

N H 2

O

F

-PPP• Incorporación a DNA y RNA

•Radiosensibilización

CAPECITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN

•Inhibición TS

•Incorporación a RNA y DNA

DIANAS DEL 5-FU

H N

NH

O

O

F

5-fluorouracilo

H N

NH

NH2

O

F

H N

NH

O

O

F

Carboxil esterasa

Citidina desaminasa

Timidina fosforilasa

5’-deoxy-5-fluorouridine

5’-deoxy-5-fluorocytidine

N4-pentyloxycarbamyl-5’-deoxy-5-fluorocytidine

H N

NH

NH2

O

F

Capecitabina

5’-DFC

5’-DFUR

5-FU

H N

NH

NH2

O

F

EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A FLUOROPIRIMIDINASFLUOROPIRIMIDINAS

RESISTENCIA A GEMCITABINA. METABOLISMO

•dCK

•TK2

•Disminución de la actividad causa resistencia

•Baja actividad aumenta la sensibilidad debido a que fosforila más eficientemente el nucleósido natural dCyd

•5’-NT •La sobreexpresión causa resistencia al desfosforilar los nucleótidos a nucleósidos

•RR •Un aumento de la actividad o falta de inhibición de la ribonucleótido reductasa causa resistencia a gemcitabina.

NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIALA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIA

RESISTENCIA A GEMCITABINA: TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS??

•Mutaciones en el gen p53.

•Proteínas de la familia Bcl-2.

•Caspasa 8.

•Vía PI3’K.

•DNA y RNA polimerasas.

•Metabolismo intracelular.

•TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOSTRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS

UP-HILL DOWN-HILL

S

S S

S

S

NaS

Na

IN

OUT

IN

OUT

CNTConcentrativeNucleosideTransporter

ENTEquilibrativeNucleosideTransporter

Mecanismos de transporte de nucleósidos al interior de la célula

NH3+

CO2-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

hENT family

ei

ENT2

es

ENT1

UridineUridine

NBTI

PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY INHIBITORS (IC50) SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION

hENT1 SLC29A1 456 50% NBTI 0.4nM Dip 5nM U 0.26mM A 0.04mM Ubiquitous, plasma, perinuclearI 0.17mM C 0.58mM and mitochondrial membranes

hENT2 SLC29A2 456 NBTI 2.8M Dip 356nM U 0.25mM A 0.14mM Ubiquitous, highly abundant I 0.05mM C 5.61mM in skeletal muscleNuclebases (hypoxanthine)

ENTs (SLC29), transportadores de baja afinidad y amplia selectividadPastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001

NH3+

CO2-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 132 8

hCNT family

CNTs (SLC28), transportadores de alta afinidad, relativamente específicos

N

CNT 1-3

Na Uridine

PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY STOICHIOMETRY SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION

hCNT1 SLC28A1 650 72% and 48% 1-2Na/1Nucleoside U 40-60M T 6M Most epithelia, macrophages, (kidney, intestine) C 34 I n.t.

hCNT2 SLC28A2 658 47% 1Na/1Nucleoside U 80M I 4.5M Epithelia (liver), macrophages,brain, ilots, B,T cells, brain,heart,skel.muscle A 8M T n.t.

hCNT3 SLC28A3 691 2Na/1Nucleoside U 22M T 21M Widely distributed, not solved yet at the protein levelI 53M A 15M

Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001

Barrett andGrisham, 1995Biochemistry

Vias biosintéticas:LOS NUCLEÓSIDOS SON

MOLÉCULAS CARAS

Algunos tipos celulares, especialmente aquellos de alto

recambio, dependen esencialmente de las vías de “recuperación”

-ENTEROCITOS-CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

Los transportadores de nucleósidos en la naturaleza

Los CNTs humanos y de mamíferos

tienen ortólogos en nemátodos, insectos, protozoos, levaduras,

bacterias,....La vía de

recuperación está altamente

conservada

Role of nucleoside transporters SLC28 and SLC29 in cancer chemotherapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J., en Deoxynucleoside analogs in cancer therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The

Humana Press, Inc.Totowa, New Jersey, en prensa

Procesos celulares en los que los nucleós(t)idos están involucrados

-Precursores de ácidos nucléicos (ARN y ADN)-Activadores en vías biosintéticas (p.e. UDP)-Unidades de transferencia de energía (ATP,GTP) -Coenzimas (NAD, FAD)-Moduladores de la fisiología celular (cAMP, ATP, Ado)

La base de la quimioterapia radica en el aprovechamiento de las vías de recuperación de aquellas células que presentan elevados índices

de proliferación

LA GEMCITABINE (GEMZAR), PERO NO LA FLUDARABINA, ES UN SUBSTRATO CAPTADO

CON ALTA AFINIDAD APARENTE POR EL TRANSPORTADOR hCNT1

EJEMPLO DE SISTEMAS HETERÓLOGOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS PARA DEFINIR PERFILES FARMACOLÓGICOS

Lostao, M.P., Mata, J.F., Larrayoz, I.M., Inzillo, S.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.FEBS Letters 481:137-140, 2000

K 0.5 (M) % corriente uridina

0.5mM

Uridine 37±7 (8) 100 (8)

Cytidine 29±8 (6) 47±7 (6)

Thymidine 26±7 (4) 109±19 (4)

Gemcitabine 18±5 (8) 33±5 (8)

5’-DFUR 245±39 (7) 147±18 (7)

Vh=-50 mV

Larráyoz, I.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M., Lostao, M.P. Journal Biological Chemistry 279:8999-9007, 2004.

La capecitabina (Xeloda) es un profármaco oral de última generación utilizado en el tratamiento de tumores de colon y mama

Capecitabina 5’-desoxi-5-fluorocitidina

5’-desoxi-5-fluorouridina (5-DFUR)

5-fluorouracilo

Carboxilesterasa

HÍGADOCitidina desaminasa

HÍGADO - TUMORES?

TImidinaFosforilasa

TUMORES

5-DFUR, EL INTERMEDIARIO INMEDIATO DE 5-FU EN

TUMORES, ES SUBSTRATO DEL TRANSPORTADOR

CONCENTRATIVO DE ALTA AFINIDAD hCNT1

Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001

La expresión heteróloga de hCNT1 confiere sensibilidad a 5-DFUR, independientemente de las actividades equilibrativas

endógenas.

Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001

CHO wtCHO wt

CHO-vectorCHO-vector

CHO-hCNT1CHO-hCNT1

100010010

100

50

0

5'-DFUR (µM)

% C

EL

L S

UR

VIV

AL

WT

PC1

HC1

100010010

100

50

0

5'-DFUR (µM)

% C

EL

L S

UR

VIV

AL

-dipyridamol +dipyridamol

CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. SENSIBILIDAD A GEMCITABINA

EFECTO DE LA REINTRODUCCIÓN DE hCNT1 SOBRE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LA GEMCITABINA

HC1

NP-9

TANTO EN UNA EXPOSICIÓN A GEMCITABINA COMO EN UN PROTOCOLO DE TRIPLE EXPOSICIÓN AL FÁRMACO, LA PRESENCIA DE hCNT1 SENSIBILIZÓ LAS CÉLULAS AL TRATAMIENTO CON EL FÁRMACO

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD DE GEMCITABINA EN LOS CLONES DE NP-9 72 H DESPUÉS DE 90 MINUTOS DE INCUBACIÓN AL FÁRMACO

PC1

García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M.Clinical Cancer Research 9:5000-5008, 2003

IC50 (M) Km (M)Cytidine 4.5±0.2 3.1±0.7Thymidine 12.55±1.93 NDAZT 1004±150 963±135d4T 4525±301 15600±4700ddC 5730±222 NT3tC >>20000 NTGemcitabine ND 17±25-DFUR ND 209±51

O

HOH

HH

HH

HO

N

NH

O

O

H3C

N

NH2

ON

O

OHOH

HH

HH

HO

O

HN3

HH

HH

HO

N

NH

O

O

H3C

O

HH

HO

N

NH

O

O

H3C

O

HH

HH

HH

HO

N

N

NH2

O

NH

O

ON

O

HOH

HH

HH

H3C

F

O

FOH

FH

HH

HO

N

N

NH2

O

Thymidine AZT d4T 5-DFUR

Cytidine ddC 3tC Gemcitabine

S

O

H

H

HO

N

N

NH2

O

Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004

N

NH2

ON

O

OHOH

HH

HH

HO

O

HOH

HH

HH

HO

N

N

NH2

O

O

HH

HH

HH

HO

N

N

NH2

O

Cytidine 2’-deoxycytidine ddC

Selectividad farmacológica de hCNT1

Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M.Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004

Concentrative systems Equilibrative systems

Drugs as substrates (apparent Km)

Drugs as substrates (apparent Km)

hENT1

gemcitabine++++ (160M) citarabine ++++ fludarabine +++ cladribine ++++

hCNT1 hCNT2 hCNT3

gemcitabine ++++ (17M) 5’-DFUR (209 M) citarabine + fludarabine – cladribine –

cladribine + fludarabine – gemcitabine –

cladribine +++ fludarabine ++ gemcitabine ++

hENT2

gemcitabine ++ (740M) fludarabine++ cladribine ++ citarabinea +

(+) lowly transported; (++) moderately transported; (+++ / ++++) highly transported; (-) not transported a drug tested as inhibitor

Deoxynucleoside transporters in cancer therapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J. En Deoxynucleoside Analogs in Cancer Therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. En prensa

Pastor-Anglada, M., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Bellosillo, B., Colomer, D., Gil, J. Leukemia 18:385-393, 2004

Perfiles farmacológicos preliminares de los transportadores hCNT y hENT

LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR

EL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAREL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR

Las células de hepatoma presentan un perfil diferente de expresión de CNT y ENT.

La diferenciación de hepatocitos fetales con dexametasona induce CNT2.

Valdés, R., Ortega, M.A., Casado, F.J., Felipe, A., Gil, A., Sánchez-Pozo, A., Pastor-Anglada, M.

Gastroenterology 119:1623-1630, 2000

del Santo, B., Valdés, R., Mata, J.F., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.Hepatology 28:1504-1511, 1998

CNT2

ENT1

ENT2 Del Santo, B., Tarafa, G., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.

Journal of Hepatology 34:873-880, 2001

La expresión de estas proteínas es prácticamente ubicua o muy amplia

H&EH&E G-6PasaG-6Pasa

¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN ¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO? DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO?

HEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTEHEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTE

GSTGSTrCNT2rCNT2

Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M.

Hepatology 32:239-246, 2000

SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA GÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCERGÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCER

H&EH&E

T-SV40T-SV40

G-6PasaG-6Pasa

rCNT1rCNT1

MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40

Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M.

Hepatology 32:239-246, 2000


•evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores

•primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)

CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES

ANALISIS POR RT-PCR DE LA EXPRESIÓN DE hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2 y hCNT3 EN NPs

LAS CUATRO LÍNEAS MUESTRAN ALTOS NIVELES DE mRNA DE hENT1

TAMBIEN SE DETECTA, AUNQUE EN MENOR MEDIDA EL mRNA DE hENT2

A PESAR DE LA AUSENCIA DE ACTIVIDAD CONCENTRATIVA DETECTADA EN LOS ENSAYOS DE TRANSPORTE TODAS LAS LÍNEAS NP EXPRESAN EL mRNA DE UNO O MÁS TRANSPORTADORES CONCENTRATIVOS.

García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M.Clinical Cancer Research, 9:5000-5008, 2003

PANEL DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA TRANSPORTADORES NT

hCNT1a Extracellular No IHC

hCNT1b Intracellular No IHC

hCNT1a Extracellular

hCNT2a Intracellular No

hCNT2b Intracellular WESTERN

hCNT3 Intracellular hENT1a Intracellular IHC

hENT1b Intracellular No

hENT2 Intracellular IHCWESTERN

western ICC IHC

M.Pastor Anglada, F.J.Casado Merediz, A.Felipe Campo, Method and in vitro kit for selecting a drug for chemotherapyWO 00/52477 Balagué Center, S.A. Países: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA ; JAPON ; CANADA ; UNIÓN EUROPEA

Matrices de tejidos “Tissue array”

Analisis simultáneo de muchas muestrasAnalisis simultáneo de muchas muestrasCilindros adecuados para IHQCilindros adecuados para IHQ

2 mm................60 muestras2 mm................60 muestras1.5 mm.......... 1351.5 mm.......... 1351 mm............. 2001 mm............. 200

Controles positivos y negativos internosControles positivos y negativos internosTinción homogéneaTinción homogéneaEficiente y rápidoEficiente y rápido

Tongue

Uterus

Lung

Kidney

Liver Breast

PATRONES DE EXPRESIÓN DE

TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS

EN TUMORES GINECOLÓGICOS

A C

GF

EDC

B

hCNT1 hENT1 hENT2

hCNT1 hENT1 hENT2

hCNT1 hCNT1

Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors.Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M.International Journal of Cancer 112:959-966, 2004

Ovarian

carcinomas

Expression- + ++

hENT1 (n =90) 8 (8.8 %) 41 (45.6 %) 41 (45.6 %)

hENT2 (n= 89) 14 (15.7 %) 54 (60.7 %) 21 (23.6 %)

hCNT1 (n = 90) 30 (33.3 %) 45 (50.0 %) 15 (16.7 %)

Endometrial carcinomas

Expression- + ++

hENT1 (n = 80) 0 (0 %) 27 (33.8 %) 53 (66.2 %)

hENT2 (n = 78) 0 (0 %) 47 (60.3 %) 31 (39.7 %)

hCNT1 (n = 79) 12 (15.2 %) 60 (75.9 %) 7 (8.9 %)

Uterine cervix carcinomas

Expression- + ++

hENT1 (n = 117) 5 (4.2 %) 63 (53.9 %) 49 (41.9 %)

hENT2 (n = 117) 2 (1.7 %) 55 (47.0 %) 60 (51.3 %)

hCNT1 (n = 118) 46 (39.0 %) 33 (28.0 %) 39 (33.0 %)

SEMI-CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS NT EN TUMORES GINECOLÓGICOS


LA PÉRDIDA DE LA EXPRESIÓN DE hCNT1 SE ASOCIA CON SUBTIPOS HISTOLÓGICOS CONCRETOS DE TUMORES GINECOLÓGICOS

Expression of hCNT1 in ovarian carcinomas by hystologic type

Hystologic type Expression

- + / ++ (%)

Serous 6 25 80.6

Mucinous 5 9 64.3

Endometrioid 1 9 90.0

Clear cell 18 17 48.6

p = 0.016

Expression of hCNT1 in uterine cervix carcinomas by hystologic typeHystologic type Expression

- + / ++ (%)

Adenocarcinoma 35 29 45.3

Squamous cell 11 43 79.6

p < 0.001


•evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores

•primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)


ENT1

J J 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 220.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.9

1.0

1.1

PC

R a

rbit

rary

un

its

0

0,1

0,2

0,3

0,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

pmol

flud

a/m

g pr

ot/1

0s

HO

N

NN

N

NH2

O

HOH

OHH

HH

F 2-fluoroadenine-9-2-fluoroadenine-9--D-arabinofuranoside-D-arabinofuranoside

La sensibilidad ex-vivo a la fludarabina se correlaciona con el transporte del fármaco mediado por proteínas ENT, pero no guarda

correlación con sus niveles de ARNm

p=0.029r=0.488

p=0.006r=0.591

0.0 0.1 0.2 0.30

50

100

pmol fluda/mg prot/ 10s

% v

iab

ility

0.0 0.1 0.2 0.30

50

100

pmol fluda/mg prot/10s

%vi

abilit

y

Molina-Arcas, M., Bellosillo, B., Casado, F.J., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Fludarabine uptake mechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 101:2328-2334, 2003

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

EN

T1

pro

tein

0

2

4

6

8

10

12

EN

T2

pro

tein

ENT1 AND ENT2 PROTEIN EXPRESSION IN CLL PATIENTS

Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005

0 2 4 6 8 10 120.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

ENT2 protein

EN

T2

mR

NA

p= 0.1206

r = 0.379

0 2 4 6 8 10 120.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

ENT2 protein

pm

ol g

ua

n/m

g/1

0s

ec

p= 0.0258

r = 0.538

0 2 4 6 8 10 120.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

ENT2 protein

pm

ol f

lud

a/m

g/1

0sec

p= 0.0465

r = 0.475

0 2 4 6 8 10 1225

50

75

100

ENT2 protein

%v

iabi

lity

p= 0.0060

r = 0.693

Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005

LA PROTEINA hENT2 COMO BIOMARCADOR DE LA RESPUESTA A LA FLUDARABINA EN ENFERMOS DE LLC

LA AUSENCIA DE hENT1 SE ASOCIA CON UNA MENOR SUPERVIVENCIA EN PACIENTES CON ADENOCARCINOMA

PANCREÁTICO TRATADOS CON GEMCITABINA

The absence of human equilibrative nucleoside transporter 1 is associated with

reduced survival in patients with gemcitabine-treated pancreas adenocarcinoma Spratlin,J.,

Sangha, R., Glubrecht, D., Dabbagh, L., Young, J.D., Dumontet, C., Cass, C., Lai, R.,

Mackey, R.. Clinical Cancer Research 10:6956-6961, 2004

1.-EL PATRÓN DE EXPRESION DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS CNT Y ENT PUEDE TENER RELEVANCIA DIAGNÓSTICA, AUNQUE ANTICIPAMOS QUE SERÁ VARIABLE EN FUNCIÓN DEL TIPO DE TUMOR.

2.-ES FUNDAMENTAL ANALIZAR ESTOS PATRONES DE EXPRESIÓN EN TUMORES SÓLIDOS DE ENFERMOS QUE ESTÉN BAJO UNA TERAPIA CON DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS.

3.-LA POSIBILIDAD DE REGULAR FARMACOLÓGICAMENTE LA FUNCIÓN DE ESTAS PROTEÍNAS TAMBIEN SE APUNTA COMO UNA APLICACIÓN TERAPÉUTICA COADYUVANTE, AL PODER EVENTUALMENTE MODULAR LA BIOASEQUIBILIDAD DE FÁRMACOS.

CONCLUSIONES

OBJETIVOOBJETIVO

Utilizar la técnica de microarrays de DNA para:Utilizar la técnica de microarrays de DNA para:

Profundizar en las bases moleculares de la acción Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidosfarmácológica de los análogos de nucleósidos

Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la acción de los análogos de nucleósidosacción de los análogos de nucleósidos

Efecto del 5’DFUR en células MCF7 (tumor de mama)

Inhibición del transportador ENT1 con NBTI

100.0 102.5 105.0 107.5

25

50

75

100

5'DFUR IC50=76M

5'DFUR+NBTI IC50=312M

[5'DFUR] nM

% v

iab

ility

100.0 102.5 105.0 107.5

25

50

75

100

5FU IC50= 49M

5FU+NBTI IC50=58M

[5'FU] nM

% v

iab

ility

Caracterización de la línea MCF7Caracterización de la línea MCF7

0

3

6

9

uridina 5'DFUR

pm

ol/m

g/1

5seg

ENT1

ENT2

• Expresa los cinco transportadores de Expresa los cinco transportadores de nucleósidosnucleósidos• Presenta únicamente transporte Presenta únicamente transporte equilibrativo, principalmente ENT1equilibrativo, principalmente ENT1• 5’DFUR es transportado mayoritariamente 5’DFUR es transportado mayoritariamente a través de ENT1a través de ENT1

Citotoxicidad de 5’DFURCitotoxicidad de 5’DFUR

• 90 minuto de tratamiento90 minuto de tratamiento• Medida por contaje celularMedida por contaje celular• +/- NBTI 100nM+/- NBTI 100nM

CONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOSCONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOS

5’-DFUR 250 5’-DFUR 250 M M NBTI NBTI IC75 + NBTI IC75 + NBTI IC50 IC50

90 minutos de tratamiento90 minutos de tratamiento

+/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min)+/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min)

Efecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24hEfecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24h

8 condiciones experimentales8 condiciones experimentales

controlcontrol NBTI 100nMNBTI 100nM

5’-DFUR 2505’-DFUR 250MM 5’-DFUR 2505’-DFUR 250M + NBTI 100nMM + NBTI 100nM

4 y 24 horas 4 y 24 horas postratamientopostratamiento

arraysarrays

2 experimentos independientes2 experimentos independientes

marcaje Cy3 y Cy5marcaje Cy3 y Cy532 arrays32 arrays

4h

24h

ctrl NBTI 5’DFUR 5’DFUR+NBTI

G0/G1- 41% S- 36% G2- 23%

G0/G1- 42% S- 36% G2- 22%

G0/G1- 51% S- 34% G2- 16%

G0/G1- 52% S- 33% G2- 15%

G0/G1- 54% S- 25% G2- 21%

G0/G1- 50% S- 26% G2- 23%

G0/G1- 42% S- 38% G2- 19%

G0/G1- 53% S- 24% G2- 21%

EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 5’DFUR Y DE LA INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DEL

TRANSPORTADOR hENT1 SOBRE EL CICLO CELULAR

1- Obtención y amplificación de RNA1- Obtención y amplificación de RNA

2- Síntesis y marcaje del cDNA2- Síntesis y marcaje del cDNA

3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal)3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal)

4- Scanning4- Scanning

5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix

6- Obtención de datos6- Obtención de datos

Descartar las columnas que no interesan. Nos quedamos (por ejemplo) con:

- Flag- Bloque- Columna- Fila- Nombre- ID

- Media F635- Mediana B635- Media F532- Mediana B532

ANÁLISIS INFORMÁTICOANÁLISIS INFORMÁTICO

ONCOCHIP-CNIO

>27.000 SPOTS

>12.000 GENES

Role of hENT1 in fluropyrimidine-induced gene expression in breast cancer cells. Molina-Arcas, M., Moreno-Bueno, G., Hernández, H.L., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M., submitted

RT-PCR semicuantitativaRT-PCR semicuantitativa

Diseñar primers de los genes a validarDiseñar primers de los genes a validar- Análisis de homologia con isoformas de la misma familiaAnálisis de homologia con isoformas de la misma familia- Control endógeno GAPDH (banda 175pb)- Control endógeno GAPDH (banda 175pb)

Buscar para cada gen condiciones no saturantesBuscar para cada gen condiciones no saturantes

1,25 2,5 5 10

94ºC --- 5 min

94ºC --- 5 s55ºC --- 30 s72ºC --- 30 s

72ºC --- 7 min

30 ciclos

Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control endógeno (GAPDH)endógeno (GAPDH)

- + - +

PLK2 RRM2B

GAPDH

Muy complicado amplificar el gen sin saturar la GAPDH

Hacemos- cada gen por separado- cada condición por duplicado

PLK2

TP53I3

RRM2B

AQP3

TP53INP1

GAPDH

CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N

4 horas 24 horas

RT-PCR semicuantitativaRT-PCR semicuantitativa

4hores 24 hores0

5

10

15CTRLNBTI

5DFUR

5DFUR-NBTI

FA

S

4hores 24 hores0

5

10

CTRLNBTI

5DFUR

5DFUR-NBTI

40

45

50

p21

Real-time PCR: FAS y p21Real-time PCR: FAS y p21

Real-time PCR Real-time PCR RNA RNA

Arrays Arrays RNA amplificado RNA amplificado

Hemos perdido información al amplificar el RNA?

4h

24h

ctrl NBTI 5’DFUR 5’DFUR+NBTI

Immunocitoquímica: MDM2Immunocitoquímica: MDM2

Profundizar en las bases moleculares de la acción Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidosfarmácológica de los análogos de nucleósidos

- 90 minutos de tratamiento es un tiempo suficiente para ejercer una acción 90 minutos de tratamiento es un tiempo suficiente para ejercer una acción farmacológicafarmacológica

- El tratamiento induce parada de ciclo en fase SEl tratamiento induce parada de ciclo en fase S

- El mayor efecto se produce a las 24 horas después de 90 minutos de tratamiento. - El mayor efecto se produce a las 24 horas después de 90 minutos de tratamiento. La mayoría de genes que se inducen son dependientes de p53La mayoría de genes que se inducen son dependientes de p53

- El tratamiento con NBTI revierte el efecto sobre ciclo y la inducción de la mayoría El tratamiento con NBTI revierte el efecto sobre ciclo y la inducción de la mayoría de los genesde los genes

- En realidad estas técnicas tan sólo son generadoras de hipótesisEn realidad estas técnicas tan sólo son generadoras de hipótesis

- Se demuestra imprescindible realizar análisis funcionales de las posibles dianas Se demuestra imprescindible realizar análisis funcionales de las posibles dianas farmacológicasfarmacológicas

- El microchip se transforma en un listado discreto de genes. En nuestro caso los El microchip se transforma en un listado discreto de genes. En nuestro caso los validaremos tanto analizando el efecto de otros fármacos como determinando el validaremos tanto analizando el efecto de otros fármacos como determinando el papel de funciones transportadoras concretas sobre su funciónpapel de funciones transportadoras concretas sobre su función

José García-ManteigaSylvie DuflotIvette

Aymerich

Javier Casado

Sonia Fernández Veledo

Míriam Molina

Marçal Pastor-Anglada

Elena Guillén-Gómez

DEPARTMENT OFBIOCHEMISTRYAND MOLECULARBIOLOGY

UNIVERSITYOF BARCELONA

REGULATION OF TRANSPORT SYSTEMS RESEARCH GROUP

Pedro Cano-Soldado Isabel Huber Ruano FIS (Ministerio de Sanidad y Consumo), Plan Nacional en Biomedicina (Ministerio de Educación y Ciencia), Generalitat de Catalunya, Fundación Ramón Areces, FIPSE, Fundación “la Caixa”, Lilly, Roche Diagnostics,

Balagué Center

Marçal Pastor-Anglada

Documents

Transcript of Marçal Pastor-Anglada